KR20050049470A - 항 수초 관련 당단백질 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 수초 관련 당단백질(MAG)에 대한 변형 항체, 상기 항체를 포함하는 약제 조성물 및 상기 항체를 신경 질환/장애의 치료 및/또는 예방에 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

항 수초 관련 당단백질 항체{ANTI-MYELIN ASSOCIATED GLYCOPROTEIN(MAG) ANTIBODIES}
본 발명은 수초 관련 당단백질(myelin associated glycoprotein: MAG)에 결합하여 그 작용을 중화시키는 변형 항체, 상기 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 항체를 포함하는 약제 조성물 및 상기 항체를 신경 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하는 방법에 관한 것이다. 이하, 본 발명의 특징, 목적 및 장점을 상세히 설명한다.
뇌졸중(stroke)은 서방에서 사망 및 심신 장애의 주요한 원인이 되고 있다. t-PA 이외에 뇌졸중의 치료로서 승인된 요법이 없는 실정인데, t-PA는 뇌출혈을 피하기 위해서 CT 스캔 이후 개시점으로부터 3 시간 이내에 반드시 투여되어야 한다. 종래, 대부분의 급성 뇌졸중 치료(즉, 신경보호)를 위한 치료제들은 주로 글루타메이트 수용체 및 급성 세포 사멸과 연관된 것으로 알려진 글루타메이트 수용체의 다운스트림 신호 전달 경로를 표적화하는 것과 관계가 있다. 그러나, 이러한 종래 기술은 임상 시험 결과 성공적이지 못한 것으로 입증되었으며, 용량에 의존하는 부작용을 수반하는 경우가 많다 (Hill & Hachinski, The Lancet, 352: (suppl III) 10-14 (1998)). 그러므로, 혈류가 멈춘 이후에 세포 사멸 양상을 개선시키기 위한 새로운 방법이 필요한 실정이다.
뇌졸중이 개시된 후에, 다수의 환자에 있어서 어느 정도의 자발적인 기능 회복이 관찰되었는데, 이는 뇌가 손상된 후에 보수 및/또는 리모델링할 수 있는 (제한된 것이기는 하지만) 능력을 갖는다는 것을 시사한다. 따라서, 이러한 회복 능력을 증진시키는 가능성을 가진 치료제라면, 대뇌 허혈이 시작된 이래 많은 시간이 경과한 후에도 (수일) 조치가 가능할 것이다. 급성 신경보호 작용을 제공할 수 있고 기능 회복을 증진시킬 수 있는 치료제라면, 종래의 신경 보호 방법에 비해서 탁월한 장점들을 제공할 수 있을 것이다.
기능 회복의 근거가 되는 메카니즘은 현재 알려져 있지 않다. 손상된 또는 손상되지 않은 신경돌기(axon)의 급성장이 가능성 있는 메카니즘의 하나로 제안된 바 있다. 그러나, 생체내 연구 결과 척수 손상 또는 뇌졸중을 신경영양 인자로 치료하는 방법이 기능 회복 및 축색돌기 성장도를 증진시키는 것으로 밝혀졌다 할지라도, 그 결과가 축색돌기 성장도와 기능 회복 정도간의 직접적인 관계를 입증하는 것은 아니다 (Jakeman 등, 1998, Exp. Neurol. 154: 170-184, Kawamata 등, 1997, Proc Natl Acad. Sci. USA., 94:8179-8184, Ribotta 등, 2000, J Neurosci. 20: 5144-5152). 또한, 축색돌기의 급성장에는 성장 가능한 뉴런이 필요하다. 광범위한 세포 사멸과 관련된 뇌졸중과 같은 질병의 경우에는, 뇌졸중 개시 이후에 투여된 치료제에 의해 제공되는 기능 회복 증진 효과가 축색돌기 급성장 이외의 다른 메카니즘, 예를 들면 내생 줄기 세포의 분화, 장황한 경로의 활성화, 수용체 분포 변화 또는 뉴런 또는 신경교의 흥분 가능성을 통해서 일어나는 것일 수도 있다 (Fawcett & Asher, 1999, Brain Res. Bulletin, 49: 377-391, Horner & Gage, 2000, Nature 407 963-970).
중추 신경계(CNS)가 손상된 후에, 중추 신경계의 보수 능력에 제한이 따르는 이유중 하나는 축색돌기 급성장(신경돌기 생장)을 억제하는 효과를 갖는 CNS 환경 내부의 분자인 것으로 생각된다. CNS 수초가 억제 효과가 있는 분자들을 함유하는 것으로 생각된다 (Schwab ME 및 Caroni P (1988) J. Neurosci. 8, 2381-2193). 2종의 수초 단백질, 즉, 수초 관련 당단백질(MAG) 및 Nogo를 복제한 결과 신경 돌기 생장의 추정되는 억제제인 것으로 확인되었다 (Sato S. 등 (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 163, 1473-1480; Mckerracher L 등 (1994) Neuron 13, 805-811; Mukhopadhyay G 등 (1994) Neuron 13, 757-767; Torigoe K 및 Lundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254-262; Schafer 등 (1996) Neuron 16, 1107-1113; WO9522344; WO9701532; Prinjha R 등 (2000) Nature 403, 383-384; Chen MS 등 (2000) Nature 403, 434-439; GrandPre T 등 (2000) Nature 403, 439-444; US005250414A;WO 200005364A1; WO0031235).
수초 관련 당단백질은 세포 표면 막간(transmembrane) 분자로서, 5종의 세포외 면역글로블린 도메인, 단일의 막간 도메인 및 세포내 도메인으로 이루어진 수초의 표면상에서 형질발현된다. MAG의 형질발현은 CNS 및 말초신경계(PNS)내의 수초화 신경교에 국한된다. MAG는 시험관내 신경돌기 생장의 억제 및 신경필라멘트 포스포릴화를 비롯한 뉴런 세포골격에 대한 효과를 조정하는 뉴런 수용체(들)과 상호작용하는 것으로 생각된다. MAG의 길항물질들은 손상 이후 축색돌기 급성장을 촉진하는데 유용한 것으로 주장된 바 있지만 (WO 9522344, WO 9701352 및 WO9707810), 상기 특허 공보의 청구항들은 생체내 데이터에 의해 지지되지 않는 것들이다. 더욱이, MAG가 생체내 CNS 뉴런으로부터의 축색돌기 급성장의 억제제로서 작용한다는 것에 대해서는 증명되어 있지 않다(Li CM 등 (1994) Nature 369, 747-750; Montag, D 등 (1994) Neuron 13, 229-246; Lassmann H 등 (1997) GLIA 19, 104-110; Li C 등 (1998) J. Neuro. Res. 51, 210-217; Yin X 등 (1998) J. Neurosci. 18, 1953-1962; Bartsch U 등 (1995) Neuron 15 1375-1381; Li M 등 (1996) 46, 404-414).
일반적으로, 항체는 이황화 결합에 의해 함께 연결된 2개의 중쇄(heavy chain)와 2개의 경쇄(light chain)를 포함한다. 각각의 경쇄는 이황화 결합에 의해 각각의 중쇄에 연결된다. 각각의 중쇄는 한쪽 말단에 가변부(variable domain)를 갖고, 가변부에는 다수의 불변부(constant domain)가 후속한다. 각각의 경쇄는 한쪽 말단에 가변부를 갖고 다른 한쪽 말단에 불변부를 갖는다. 경쇄 가변부는 중새의 가변부와 정렬된다. 경쇄 불변부는 중쇄의 제 1 불변부와 정렬된다. 경새 및 중쇄의 불변부는 항체-항원 결합에 직접적으로 관여하지 않는다.
각 쌍의 경쇄와 중쇄의 가변부는 항원 결합 부위를 형성한다. 경쇄와 중쇄상의 가변부는 동일한 일반 구조를 가지며, 각각의 가변부는 서열이 상대적으로 유지되는 4개의 영역으로 된 골격(framework)을 포함하는데, 그 영역들은 초가변(hypervariable)영역으로도 언급되는 3개의 상보성 결정 영역(complementarity determining region: CDR)에 의해 연결된다. 상기 4개의 골격 영역은 주로 베타 시트 형태를 가지며, CDR은 베타 시트 구조를 연결하고, 경우에 따라서는 베타 시트 구조의 일부분을 형성하는 고리를 이룬다. CDR은 골격 영역에 근접하며, 다른 도메인에서 유래한 CDR과 함께 항원 결합 부위를 형성하는데 기여한다. 항체의 CDR 및 골격 영역은 Kabat 등의 논문에 기재된 방법에 의하여 결정된다 ("Sequences of proteins of immunological interest" US Dept. of Health and Human Service, US Government Printing Office, 1987).
현재, 항-MAG 모노클로날 항체(문헌 [Poltorak 등 (1987) Journal of Cell biology 105, 1893-1899, DeBellard 등 (1996) Mol. Cell. Neurosci. 7, 89-101; Tang 등 (1997) Mol. Cell. Neurosci. 9, 333-346; Torigoe K 및 Lundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254-262]에 개시되어 있고 시판되고 있음(MAB1567 (Chemicon))은, 래트(뇌졸중 모델)의 병소상 대뇌 허혈 이후에 뇌내로 직접 투여하거나 정맥내로 투여할 경우에, 신경 보호 작용을 제공하고 기능 회복을 증진시키는 것으로 밝혀져 있다. 그러므로, 항-MAG 항체는 급성 신경보호 효과를 제공하기 위한 것일뿐만 아니라 뇌졸중 이후의 기능 회복을 촉진시키기 위한 치료제를 제공한다. 상기 항체는 쥐의 항체이다. 쥐의 항체는 대개 진단용 시약으로서 사용되지만, 몇몇의 경우에만 그 항체의 치료제로서의 유용성이 입증된 바 있다. 이와 같이 쥐의 항체의 용도가 제한되는 이유중 하나는 쥐의 모노크로날(monoclonal)을 인체에 반복해서 투여할 경우 당해 분자에 대항하여 통상 인체의 면역 반응이 유발되기 때문이다. 이와 같은 쥐의 모노클로날의 바람직하지 못한 고유 특성을 극복하기 위해서, 인체 항체의 영역을 통합시키고자 고안된 "변형(altered)" 항체가 개발되었으며, 당분야에 익히 알려져 있다. 예를 들면 인간화된 항체는 인간 이외의 원천에서 유래한 상보성 결정 영역(CDR)을 함유하며, 그 구조의 나머지는 대부분 인간 항체로부터 유도된다.
신경퇴화 과정은 급성 질병, 예를 들면 뇌졸중, 외상성 뇌 손상, 척수 손상 등뿐만 아니라 만성 질병, 예를 들면 알츠하이머병, 전두측두 치매증(tauopathies), 말초 신경병, 파킨슨병, 헌팅톤병 및 다발성 경화증을 비롯한 다수의 신경 질환/장애의 기초가 되고 있다. 그러므로, 항-MAG 모노클로날 항체는, 상기 질병/장애와 관련된 세포 사멸을 개선시키고 기능 회복을 촉진함으로써 상기 질병/장애의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 저널 및 특허 공보는 기재된 그대로 본문중에 참고 인용하였다.
발명의 개요
본원의 제 1 발명은, MAG에 결합하여 MAG를 중화시키며 이하에 기재된 바와 같은 1종 이상의 CDR을 포함하는 변형 항체 또는 이의 기능성 단편을 제공한다. 상기 CDR은 Kabat의 문헌(Kabat 등 (1991) Sequences of proteins of immunological interest; 제5판; US Department of Health and Human Services; NIH publication No 91-3242)에 기술된 바와 같이 동정한다. CDR은 Kabat등의 문헌에 정의된 바와 같은 것이 바람직하지만, Chothia 및 Lesk의 문헌(Chothia 등, (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, p 877-883)에 정의된 바와 같은 단백질 구조 및 중첩 원리에 따르면, 추가의 잔기들도 항원 결합 영역의 일부분이 될 수 있는 것으로 사료되므로, 이것 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
경쇄 CDR(상보성 결정 영역)
CDR Kabat의 정의
L1 KSSHSVLYSSNQKNYLA (서열 번호 1)
L2 WASTRES (서열 번호 2)
L3 HQYLSSLT (서열 번호 3)
중쇄 CDR
CDR Kabat의 정의
H1 NYGMN (서열 번호 4)
H2 WINTYTGEPTYADDFTG (서열 번호 5)
H3 NPINYYGINYEGYVMDY (서열 번호 6)
본원의 제 2 발명은 전술한 바와 같은 CDR을 가진 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체에 관한 것이다. 경쟁적 저해 검정법을 사용하여 항원에 관한 에피토프를 맵핑(mapping)한다. 따라서, 본 발명에 의하면, 전술한 바와 같은 CDR을 가진 변형된 항체가 MAG, 바람직하게는 인간 MAG에 결합하는 것을 경합적으로 저해하는 항-MAG 항체(변형 또는 비변형 항체)가 제공된다.
본원의 제 3 발명은 및 CDRH3중에서 선택된 하나 이상의 CDR을 포함하는 중쇄 가변부 및/또는 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3중에서 선택된 하나 이상의 CDR을 포함하는 경쇄 가변부를 포함하는 변형 항체 또는 이의 기능성 단편을 제공한다.
본원의 제 4 발명은 하기 (a) 및/또는 (b)를 포함하는 변형 항-MAG 항체 또는 이의 기능성 단편을 제공한다:
(a) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3을 차례로 포함하는 중쇄 가변부(VH), 및/또는
(b) CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 차례로 포함하는 경쇄 가변부(VL).
본원의 제 5 발명은 본 발명에 의한 변형 항-MAG 항체 또는 이의 기능성 단편과 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체를 포함하는 약제 조성물을 제공한다.
본원의 제 6 발명은, 인체에서 뇌졸중 및 기타 신경 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 뇌졸중 및 기타 신경 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 인체에 본 발명에 의한 항-MAG 항체 또는 이의 기능성 단편을 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본원의 제 7 발명은, 본 발명에 의한 항-MAG 항체 또는 이의 기능성 단편을, 뇌졸중 및 기타 신경 질환을 치료하기 위한 약제를 제조하는데 사용하는 방법을 제공한다.
본원의 제 8 발명은, 뇌졸중 또는 기타 신경 질환에 걸려 있거나 뇌졸중 또는 기타 신경 질환이 발병할 위험이 있는 인체에 있어서 신경퇴화를 억제하고/하거나 기능 회복을 촉진시키는 방법으로서, 상기 인체에 본 발명에 의한 항-MAG 항체 또는 이의 기능성 단편을 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본원의 제 9 발명은, 본 발명에 의한 항-MAG 항체 또는 이의 기능성 단편을 뇌졸중 또는 기타 신경 질환에 걸려 있거나 뇌졸중 또는 기타 신경 질환이 발병할 위험이 있는 인체에 있어서 신경퇴화를 억제하고/하거나 기능 회복을 촉진시키기 위한 약제를 제조하는데 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 특징과 장점들은 이하의 상세한 설명 및 바람직한 실시예를 통해서 더욱 상세하게 설명하기로 한다.
도 1은 마우스/인간 키메라 항-MAG 항체 중쇄의 서열이다(서열 번호 27).
도 2는 마우스/인간 키메라 항-MAG 항체 경쇄의 서열이다(서열 번호 28).
도 3은 마우스/인간 키메라 항-MAG 항체 중쇄의 서열이다(서열 번호 29).
도 4는 키메라 항-MAG 항체가 래트 MAG에 결합하는 양상을 도시한 그래프이다.
도 5는 인간화된 항-MAG 항체 서열이다.
도 6은 인간화된 항-MAG 항체가 래트 MAG에 결합하는 양상을 도시한 그래프이다.
도 7은 인간화된 항-MAG 항체가 래트 MAG에 결합하는 양상을 도시한 그래프이다.
도 8은 인간화된 항-MAG 항체가 인간 MAG에 결합하는 양상을 도시한 그래프이다.
도 9는 마우스 및 인간화된 항-MAG 항체와 MAG 결합에 대한 경합 ELISA 분석 결과이다.
항-MAG 항체
본 발명의 변형 항체는 모노클로날 항체(mAb)인 것이 바람직하며, 키메라, 인간화된 또는 변경된 항체인 것이 바람직하고, 그 중에서도 인간화된 항체인 것이 바람직하다.
변형 항체는 천연 항체 또는 그 단편의 구조를 갖는 것이 바람직하다. 그러므로, 항체는 완전 항체, (Fab1)2 단편, Fab 단편, 경쇄 이합체 또는 중쇄 이합체를 포함할 수 있다. 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4; 또는 IgM; IgA, IgE 또는 IgD 또는 이들의 변형된 변종일 수 있다. 항체 중쇄의 불변부는 이에 따라서 선택될 수 있다. 경쇄 불변부는 카파(kappa) 또는 람다(lamda) 불변부일 수 있다. 또한, 항체는 모든 부류의 eg IgG 이합체, Fc 수용체와 결합하지 않거나 Clq 결합을 조정하는(블로킹 항체) Fc 변이체를 포함할 수 있다. 또한, 항체는 항원 결합부와 비-면역글로불린부를 포함하는 WO86/01533호에 개시된 바와 같은 유형의 키메라 항체일 수도 있다. 항원 결합부는 항체 경쇄 가변부 또는 중쇄 가변부이다. 통상적으로, 항원 결합부는 경쇄 및 중쇄 가변부들을 모두 포함한다. 비-면역글로불린부는 대개 비-면역글로불린 단백질로서, 결합 특이성이 알려진 효소, 독소 또는 단백질일 수 있다. 이러한 유형의 키메라 항체의 2가지 부분은 분해 가능한 연결자(linker) 서열에 의해서 연결될 수 있다. 전술한 바와 같은 CDR을 갖는 면역부착소(immunoadhesin)도 본 발명의 범위내에 포함된다.
상기 불변부는 요구되는 기능에 따라서 선택된다. 통상, IgG1은 보체에 대한 결합을 통해서 분해 가능성을 나타내고/나타내거나 ADCC(항체 의존성 세포 독성)를 조정할 것이다. 비-세포독성 블로킹 항체가 필요할 경우에는, IgG4가 바람직할 것이다. 그러나, IgG4 항체는 제조시 불안정성을 나타낼 수 있으므로, 일반적으로 보다 안정한 IgG1을 변형시키는 것이 더 바람직할 수도 있다. 이와 같은 변형을 위해 제안된 방법들이 EP0307434호에 개시되어 있으며, 바람직한 변형 방법은 235 및 237 위치에서의 변형과 관련된 것이다. 그러므로, 본 발명은 본 발명에 의한 항체의 분해형 또는 비분해형을 제공한다.
바람직한 실시예에서, 변형 항체는 IgG 부류, 더욱 바람직하게는 IgG1이다.
그러므로, 본 발명의 항체의 바람직한 실시예는 전술한 바와 같은 CDR을 가진 전장(full length) 비분해성 IgG1 항체이다. 가장 바람직한 실시예는, 서열 번호 13 및 16에 해당하는 CDR을 갖는 전장 비분해성 IgG1 항체 및 서열 번호 15 및 18에 해당하는 CDR을 갖는 전장 비분해성 IgG1 항체이다.
본 발명의 다른 특징에 의하면, CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 바람직한 폴리뉴클레오타이드 서열은 다음과 같다.
경쇄 CDR
CDR
L1 (서열 번호 7)
L2 TGGGCCAGCACCCGCGAGAGC (서열 번호 8)
L3 CACCAGTACCTGAGCAGCCTGACC (서열 번호 9)
중쇄 CDR
CDR
H1 AACTACGGCATGAAC (서열 번호 10)
H2 (서열 번호 11)
H3 (서열 번호 12)
본 발명의 또 다른 특징에 의하면, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3중에서 선택된 하나 이상의 CDR을 포함하고, 더욱 바람직하게는 서열내 상기 3종의 CDR을 모두 포함하는 변형 항-MAG 항체의 경쇄 가변부를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다.
본 발명의 또 다른 특징에 의하면, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3중에서 선택된 하나 이상의 CDR을 포함하고, 더욱 바람직하게는 서열내 상기 3종의 CDR을 모두 포함하는 변형 항-MAG 항체의 중쇄 가변부를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다.
특히 바람직한 실시예에 있어서, 본 발명의 항-MAG 항체는 인간화된 항체이다.
따라서, 본 발명은 하기 아미노산 서열중 하나를 포함하는 중쇄 가변부를 포함하는 MAG에 결합하거나 상기 MAG를 중화시키는 인간화된 항체 또는 이의 기능성 단편을 제공한다:
본 발명의 또 다른 특징에 의하면, 서열 번호 13, 14 또는 15에 해당하는 중쇄 가변부와 함께 아미노산 서열로서 하기 서열 번호 16, 17, 18 또는 19를 포함하는 경쇄 가변부를 포함하는 MAG에 결합하는 인간화된 항체 또는 이의 기능성 단편이 제공된다.
본 발명의 또 다른 특징에 의하면, 서열 번호 13, 14 또는 15를 포함하는 중쇄 가변 단편 및 인간 중쇄의 불변부 또는 그 단편; 및 서열 번호 16, 17, 18 또는 19를 포함하는 경쇄 가변 단편 및 인간 경쇄의 불변부 또는 그 단편을 포함하는 인간화된 항체가 제공된다.
상기 인간화된 항체의 바람직한 실시예는 IgG 부류, 더욱 바람직하게는 IgG1이다.
본 발명의 바람직한 항체는 다음과 같은 부분들을 포함한다:
서열 번호 13을 포함하는 중쇄 가변부와 서열 번호 16을 포함하는 경쇄 가변부;
서열 번호 13을 포함하는 중쇄 가변부와 서열 번호 17을 포함하는 경쇄 가변부;
서열 번호 13을 포함하는 중쇄 가변부와 서열 번호 18을 포함하는 경쇄 가변부;
서열 번호 13을 포함하는 중쇄 가변부와 서열 번호 19를 포함하는 경쇄 가변부;
서열 번호 14를 포함하는 중쇄 가변부와 서열 번호 16을 포함하는 경쇄 가변부;
서열 번호 14를 포함하는 중쇄 가변부와 서열 번호 17을 포함하는 경쇄 가변부;
서열 번호 14를 포함하는 중쇄 가변부와 서열 번호 18을 포함하는 경쇄 가변부;
서열 번호 14를 포함하는 중쇄 가변부와 서열 번호 19를 포함하는 경쇄 가변부;
서열 번호 15를 포함하는 중쇄 가변부와 서열 번호 16을 포함하는 경쇄 가변부;
서열 번호 15를 포함하는 중쇄 가변부와 서열 번호 17을 포함하는 경쇄 가변부;
서열 번호 15를 포함하는 중쇄 가변부와 서열 번호 18을 포함하는 경쇄 가변부;
서열 번호 15를 포함하는 중쇄 가변부와 서열 번호 19를 포함하는 경쇄 가변부.
이외에도, 본 발명은 서열 번호 13, 14 및 15를 포함하는 중쇄 가변부와 서열 번호 16, 17, 18 및 19를 포함하는 경쇄 가변부를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
아미노산 서열 번호(SEQ ID NO) 13을 암호화하는 바람직한 폴리뉴클레오타이드 서열은 다음과 같다:
아미노산 서열 번호(SEQ ID NO) 14를 암호화하는 바람직한 폴리뉴클레오타이드 서열은 다음과 같다:
아미노산 서열 번호(SEQ ID NO) 15를 암호화하는 바람직한 폴리뉴클레오타이드 서열은 다음과 같다:
아미노산 서열 번호(SEQ ID NO) 16를 암호화하는 바람직한 폴리뉴클레오타이드 서열은 다음과 같다:
아미노산 서열 번호(SEQ ID NO) 17을 암호화하는 바람직한 폴리뉴클레오타이드 서열은 다음과 같다:
아미노산 서열 번호(SEQ ID NO) 18을 암호화하는 바람직한 폴리뉴클레오타이드 서열은 다음과 같다:
아미노산 서열 번호(SEQ ID NO) 19를 암호화하는 바람직한 폴리뉴클레오타이드 서열은 다음과 같다:
본 명세서에서 사용한 "중화하는"이란 용어는, 전체적인 중화이든지 부분적인 중화이든지, MAG가 뉴런에 결합하여 신경돌기 생장을 억제하는 것을 포함하는 작용을 의미한다.
"변형 항체"라는 용어는, 선택된 숙주 세포내의 형질발현에 의해서 얻을 수 있는, 변형된 면역글로불린 암호화 영역에 의해 암호화된 단백질을 의미한다. 이와 같은 변형 항체로서는, 유전학적으로 조작된 항체(예: 키메라, 변경, 인간화 또는 벡터화 항체) 또는 면역글로불린 불변부의 일부 또는 전부가 결여된 항체 단편, 예를 들면 Fv, Fab 또는 F(ab)2 등을 들 수 있다.
"변형 면역글로불린 암호화 영역"이라는 용어는, 변형 항체를 암호화하는 핵산 서열을 의미한다. 변형 항체가 CDR-이식 항체 또는 인간화된 항체일 경우에, 비-인간 면역글로불린으로부터 상보성 결정 영역(CDR)을 암호화하는 서열을 인간 가변 골격 서열을 포함하는 제 1 면역글로불린 파트너내로 삽입한다. 경우에 따라서, 상기 제 1 면역글로불린 파트너를 제 2 면역글로불린 파트너에 기능적으로 연결시킨다.
"제 1 면역글로불린 파트너"라는 용어는, 인간 골격 또는 인간 면역글로불린 가변부를 암호화하는 핵산 서열을 의미하며, 이때 자연적인 (또는 천연의) CDR-암호화 영역은 공여 항체의 CDR 암호화 영역에 의해 대체된다. 인간 가변부는 면역글로불린 중쇄, 경쇄 (또는 경쇄와 중쇄 모두), 또는 이들의 동족체나 기능적 단편일 수 있다. 항체(면역글로불린)의 가변부내에 위치한 CDR 영역은 당분야에 공지된 방법에 의해서 결정할 수 있다. 예를 들면 문헌 [Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제 4 판, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)]을 참조할 수 있다. 또한, CDR 영역/구조를 동정하는데 유용한 컴퓨터 프로그램들도 알려져 있다.
"제 2 면역글로불린 파트너"라는 용어는, 제 1 면역글로불린 파트너가 골격내로 또는 임의의 통상적인 연결 서열에 의해서 (즉, 기능적으로 연결됨) 융합되어 있는, 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 또 다른 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 제 2 면역글로불린 파트너는 면역글로불린 유전자인 것이 바람직하다. 제 2 면역글로불린 파트너는 당해 항체 자체에 대한(즉, 상동성- 제 1 및 제 2 변형 항체가 동일원에서 유래함), 또는 추가의 항체에 대한(즉, 이질성) 전체 불변부를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 제 2 면역글로불린 파트너는 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄(또는 단일의 폴리펩타이드의 부분으로서의 중쇄와 경쇄)일 수 있다. 제 2 면역글로불린 파트너가 특정한 면역글로불린 부류 또는 이소타입(isotype)에 국한되는 것은 아니다. 또한, 제 2 면역글로불린 파트너는 예를 들면 Fab 또는 F(ab)2에서 발견되는 것과 같은 면역글로불린 불변부의 일부분(즉, 적절한 인간 불변부 또는 골격부의 불연속 부분)을 포함할 수 있다. 또한, 이와 같은 제 2 면역글로불린 파트너는, 예를 들면 파지 디스플레이 라이브러리의 일부분으로서 숙주 세포의 표면상에 노출된 막 통합 단백질을 암호화하는 서열, 또는 예를 들면 양고추냉이 퍼옥시다제, β-갈락토시다제 등과 같은 분석 또는 진단용 단백질을 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.
용어 Fv, Fc, Fd, Fab 또는 F(ab)2는 그들의 표준적인 의미로 사용된 것이다(문헌 [Harlow 등, Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)] 참조).
본 명세서에서 사용한, "유전학적으로 조작된(engineered) 항체"라는 용어는 일종의 변형 항체, 즉, 선택된 수용 항체의 경쇄 및/또는 중쇄 가변부의 일부분이 선택된 에피토프에 대한 특이성을 갖는 하나 이상의 공여 항체로부터 유래한 동족체 부분으로 치환되어 있는 전장 합성 항체(예를 들면, 항체 단편과 달리 키메라, 변경 또는 인간화된 항체)를 의미한다. 예를 들면, 이와 같은 분자들은 변형되지 않은 경쇄(또는 키메라 경쇄)와 관련된 인간화된 중쇄 또는 그 반대의 경우를 특징으로 하는 항체를 포함할 수 있다. 또한, 유전학적으로 조작된 항체는 수용 항체 경쇄 및/또는 중쇄 가변 골격부를 암호화하는 핵산 서열을 공여 항체 결합 특이성을 보유하도록 변형시킨 것을 특징으로 할 수도 있다. 이러한 항체는 수용 항체에서 유래한 하나 이상의 CDR(바람직하게는 모든 CDR)을 본 명세서에 기재된 바와 같은 공여 항체에서 유래한 CDR로 치환시킨 것을 포함할 수 있다.
"키메라 항체"라는 용어는, 수용 항체에서 유래한 경쇄 및 중쇄 불변부와 관련된 공여 항체에서 유래한 천연의 가변부(경쇄 및 중쇄)를 함유하는, 일종의 유전학적으로 조작된 항체를 의미한다.
"인간화된 항체"라는 용어는, 이의 CDR이 비-인간 공여체 면역글로불린에서 유래한 것이고, 면역글로불린으로부터 유래한 당해 분자의 나머지 부분은 하나 이상의 인간 면역글로불린에서 유래한 것인, 일종의 유전학적으로 조작된 항체를 의미한다. 또한, 골격 지지 잔기를 변형시켜서 결합 친화도를 보존하도록 할 수도 있다(문헌 [Queen 등, Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989)], [Hodgson 등, Bio/Technology, 9: 421 (1991)] 참조). 적합한 인간 수용 항체는 통상의 데이터베이스, 예를 들면 KABAT?? 데이터베이스, Los Alamos 데이터베이스 및 Swiss Protein 데이터베이스로부터, 공여 항체의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열에 대한 상동성에 따라서 선택된 것일 수 있다. 공여 항체의 골격부에 대한 상동성(아미노산 기준)을 특징으로 하는 인간 항체가 공여체 CDR의 삽입을 위한 중쇄 가변부 및/또는 중쇄 가변 골격부를 제공하는데 적합할 수 있다. 불변 또는 가변 골격부를 공여할 수 있는 적합한 수용 항체도 유사한 방식으로 선택할 수 있다. 수용 항체 중쇄 및 경쇄가 동일한 수용 항체로부터 유래한 것일 필요는 없다. 종래, 이와 같은 인간화된 항체를 제조하기 위한 몇가지 방법이 알려진 바가 있으며, 예컨대 EP-A-0239400호 및 EP-A-0549451호를 참조할 수 있다.
"변경된(reshaped) 인간 항체"라는 용어는 제 1 인간 모노클로날 공여 항체에서 유래한 하나 이상의 CDR이 제2의 인간 수용 항체내의 CDR로 치환되어 있는 변형 항체를 말한다. 6개의 CDR이 모두 치환되는 것이 바람직하다. 제 1 인간 공여체 모노클로날 항체에서 유래한 전체 항원 결합 영역(예: Fv, Fab 또는 F(ab')2)이 제 2의 인간 수용 모노클로날 항체내의 상응하는 영역으로 치환되는 것이 더욱 바람직하다. 제 1 인간 공여체의 Fab 영역이 제 2 인간 수용 항체의 적절한 불변부에 기능적으로 연결되어 전장 모노클로날 항체를 형성하는 것이 가장 바람직하다.
"벡터화 항체"라는 용어는 혈액 뇌 방벽(blood brain barrier: BBB)을 통한 수송을 향상시키기 위한 시약이 부착되어 있는 항체를 의미한다. 이에 관해서는 문헌 [Pardridge, Advanced Drug Delivery Review 36, 299-321, 1999]를 참조할 수 있다. 시약의 부착은 화학적인 것이거나, 부착 부분이 항체내로 유전학적으로 조작된 것일 수도 있다. 예를 들면 항인슐린 수용 항체 또는 항트랜스페린 수용 항체와 같은 뇌 모세관 내피 세포에 대한 항체를 사용하여 키메라를 만드는 것이다. 이에 관해서는, 문헌 [Saito 등 (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 10227-31; Pardridge 등 (1995) Pharm. Res. 12 807-816; Broadwell 등 (1996) Exp. Neurol. 142 47-65; Bickel 등 (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90, 2618-2622; Friden 등 (1996), J. Pharm. Exp. Ther. 278 1491-1498], 미국 특허 제 5181207호, 5154924호, 5833988호 및 5527527호를 참조할 수 있다. 일단 수용체에 결합되면, 양쪽 특이적 항체의 두 성분은 모두 소포체를 통한 이동(transcytosis) 과정에 의해서 BBB를 교차하여 통과한다. 다른 경우에, 시약은 인슐린, 트랜스페린 또는 저밀도 지질단백질과 같은 세포 포면 수용체에 결합하는 리간드일 수 있다. 이에 관해서는 문헌 [Descamps 등 (1996) Am. J. Physiol. 270 H1149-H1158; Duffy 등 (1987) Brain Res. 420 32-38; Dehouck 등 (1997) J. Cell Biol. 1997 877-889]를 참조할 수 있다. 천연의 펩타이드, 예를 들면 페네트라틴 및 SynB1과 SynB3등 BBB를 통한 수송을 향상시키는 것으로 알려진 펩타이드도 사용할 수 있다. 이에 관해서는 문헌 [Rouselle 등 (2000) Mol. Pharm. 57, 679-686 및 Rouselle 등 (2001) Journal of Pharmacology and Experimental therapeutics 296, 124-131]을 참조할 수 있다.
"공여(donor) 항체"라는 용어는 변형된 면역글로불린 암호화 영역 및 그 결과로 발현된 변형 항체에 공여 항체의 중화 활성 및 항원 특이성을 구비하도록 하기 위하여, 가변부, CDR 또는 기타 이의 기능성 단편이나 동족체의 아미노산 서열을 제 1 면역글로불린 파트너에 공여하도록 하는 항체(모노클로날 또는 재조합 항체)를 의미한다.
"수용체(acceptor) 항체"라는 용어는 공여 항체와는 이형이며 이의 중쇄 및/또는 경쇄 골격부 및/또는 중쇄 및/또는 경쇄 불변부를 암호화하는 아미노산 서열의 전부(또는 일부, 바람직하게는 전부)를 제 1 면역글로불린 파트너에 제공하는 항체(모노클로날 또는 재조합 항체)를 의미한다. 수용 항체는 인간 항체인 것이 바람직하다.
CDR은 항체의 상보성 결정 영역 아미노산 서열로서 정의되며, 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 과변이부(hypervariable region)이다. 이에 관해서는 문헌 [Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제4판, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)]을 참조할 수 있다. 면역글로불린의 가변부에는 3종의 중쇄와 3종의 경쇄 CDR(또는 CDR 영역)이 있다. 따라서, 본 명세서에서 언급한 CDR은 3종의 모든 중쇄 CDR 또는 3종의 모든 경쇄 CDR (또는 경우에 따라서는 모든 중쇄와 모든 경쇄 CDR)을 말하는 것이다. 항체의 구조 및 단백질 중첩은 다른 잔기들이 항원 결합 영역의 일부로 고려됨을 의미하며, 이러한 사실을 당업자라면 익히 파악하고 있을 것이다. 이에 관해서는, 문헌 [Clothia 등, (1989) COnformations of immunoglobluin hypervariable regions; Nature 342, p 877-883]을 참조할 수 있다. 편의상, 서열 번호 13-26에서 Kabat에 의해 정의된 CDR에는 밑줄을 그었다.
CDR은 항원 또는 에피토프에 대한 항체의 결합에 필요한 대부분의 접촉 잔기들을 제공한다. 본 발명에서 중요한 CDR은 공여 항체 가변 중쇄 및 경쇄 서열로부터 유도되며, 이것에는 천연 CDR의 동족체로서 CDR이 유도된 공여 항체와 동일한 항원 결합 특이성 및/또는 중화 활성을 공유하거나 유지하는 동족체도 포함된다.
"기능성 단편"이란 용어는, 당해 단편이 유도된 항체와 동일한 항원 결합 특이성 및/또는 중화 활성을 보유하는 일부의 중쇄 또는 경쇄 가변 서열(예를 들면, 면역글로불린 가변부로부터 아미노 말단 또는 카르복시 말단 위치에서 소수 삭제가 된 것)을 의미한다.
"동족체"라는 용어는, 하나 이상의 아미노산이 변형되어 있는 아미노산 서열을 의미하며, 여기서 이와 같은 변형은 화학적인 것이거나, 소수의 아미노산(즉, 10개 이하)의 치환 또는 재배열일 수 있고, 이와 같은 변형에 의해서 아미노산 서열은 생물학적 특성, 예를 들면 변형되지 않은 서열의 항원 특이성 및 높은 친화도를 보유할 수 있다. 예를 들면, 특정한 엔도뉴클레아제 제한 부위가 CDR 암호화 영역 내부 또는 주위에서 형성될 경우에, 치환을 통해서 (잠재) 돌연변이를 유발할 수 있다. 본 발명은 본 발명에 의한 항체의 동족체를 사용하는 방법도 포함한다. 아미노산 또는 핵산 서열을 조금 변화시켜서 원래의 단백질과 실질적으로 유사한 성질을 보유하는 원래의 단백질의 대립형질을 유도할 수 있다는 사실이 잘 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 항체의 동족체에는, 중쇄 및 경쇄의 과변이부내 CDR이 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 앞에서 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3로서 정의한 바와 같은 CDR과 상동성이고 MAG 중화 활성을 보유하는 동족체들이 포함된다. 서열들을 최적으로 정렬시킨 경우 유사한 위치에서의 아미노산 잔기들이 80% 동일하다면, 그 아미노산 서열들은 상동성을 갖는다고 할 수 있으며, 이때 간격 또는 삽입부는 상이한 잔기들로서 계수한다. 또한, 본 발명은 골격부가 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상 상기 서열 번호 1-5에 기재된 골격부와 상동성을 갖는 것인 본 발명의 항체의 동족체들도 포함한다. 서열들을 최적으로 정렬시킨 경우 유사한 위치에서의 아미노산 잔기들이 80% 동일하다면, 그 아미노산 서열들은 상동성을 갖는다고 할 수 있으며, 이때 간격 또는 삽입부는 상이한 잔기들로서 계수한다.
또한, 동족체는 대립형질 변이(allelic variation)로 일어날 수도 있다. "대립형질 변이 또는 변형"은 핵산 서열에서의 변형이다. 이와 같은 변이 또는 변형은 유전 암호의 축퇴에 기인한 것이거나, 소정의 특성을 제공하도록 의도적으로 조작된 것일 수도 있다. 이와 같은 변이 또는 변형은 임의의 암호화된 아미노산 서열에서 변형을 일으키거나 그렇지 않을 수 있다.
"유효 시약(effector agent)"이라는 용어는 변형 항체가 결합되어 있고/있거나, 공여 항체 또는 공여 항체의 다른 단편의 천연 또는 합성 경쇄 또는 중쇄가 통상의 수단에 의해 결합될 수 있는 비단백질 담체 분자를 의미한다. 이와 같은 비단백질 담체로서는, 진단 분야에서 사용되는 통상의 담체, 예컨대 폴리스티렌 또는 기타 플라스틱 비이드, 폴리사카라이드, 예컨대 BIAcore[Pharmacia] 시스템에서 사용되는 것, 또는 의약 분야에 유용하고 인체 및 동물에 투여하는데 안전한 기타 비단백질 물질을 들 수 있다. 그 밖의 유효 시약으로서는, 중금속 원자와 킬레이트 결합하기 위한 거대환체 또는 방사성 동위원소를 들 수 있다. 또한, 이와 같은 유효 시약은 에틸렌 글리콜과 같이 변형 항체의 반감기를 증가시키는데 유용한 것일 수도 있다.
MAG에 대하여 특이적인 중화 항체가 문헌 [Poltorak 등 (1987) Journal of Cell Biology 105, 1893-1899, Debellard 등 (1996) Mol. Cell. Neurosci. 7, 89-101; Tang 등 (1997) Mol/ Cell. Neurosci. 9, 333-346; Torigoe K 및 Lundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254-262]을 참조할 수 있으며, 또한 시판되고 있다(MAB1567 (Chemicon)).
다른 예로서, 비-인간 종(예를 들면, 소, 양, 원숭이, 닭, 설치류(쥐와 래트) 등)을 면역화시킴으로써 항체, 변형 항체 및 단편을 작제하여, 인간 MAG에 대하여 교차 반응성이 있는 항체를 생성할 수 있는 임의의 종, 예를 들면 인간 또는 닭으로부터 유래한 천연의 MAG와 함께 제공하였을 때 바람직한 면역글로불린을 생성할 수도 있다. 통상의 하이브리도마 기법을 사용하여 비-인간 mAb를 MAG에 분비하는 하이브리도마 세포주를 제공한다. 이어서, 이와 같은 하이브리도마를 384-웰 또는 96-웰 평판에 피복된 MAG을 사용하여 결합에 대해 검색하는데, 이때 스트렙트아비딘으로 피복된 평판에는 바이오틴화된 MAG가 결합한다. 그렇지 않을 경우에는, 바이오틴화된 MAG를 사용하는 동종성 유로퓸-APC 결합 면역검정법을 이용한다.
천연의 인간 항체는 "제노마우스(Xenomouse)"(Abgenix)와 같은 인간 항체 마우스에서 생성할 수 있는데, 여기서는 마우스 면역글로불린 유전자가 제거되고 인간 면역글로불린을 암호화하는 유전자를 마우스 염색체내로 삽입한다. 마우스를 통상의 방식에 따라 면역화시킨 인간 유전자로부터 유도된 항체 반응을 진행시킨다. 따라서, 마우스가 인간 항체를 생성하므로, 양성 하이브리도마를 선별한 후에 인간화시킬 필요성이 없다. 이에 관해서는 문헌 [Green L.L, J. Immunol Methods 1999 Dec 10; 231 (1-2):11-23]을 참조할 수 있다.
또한, 본 발명은 MAG에 대한 mAB로부터 유도된 Fab 단편 또는 F(ab')2 를 사용하는 방법에 관한 것이다. 이러한 단편은 생체내에서 보호성있는 시약으로서 유용하다. Fab 단편은 경쇄 전체와 중쇄의 아미노 말단 부분을 함유하며, F(ab')2 단편은 이황화 결합에 의해 결합된 2개의 Rab 단편으로 이루어진다. Fab 단편과 F(ab')2 단편은 통상의 수단에 의해서, 예를 들면 mAb를 적절한 단백질 분해 효소, 파파인 및/또는 펩신을 사용하여 분해사는 방법에 의해서, 또는 재조합 방법에 의해서 얻을 수 있다. Fab 및 F(ab')2 단편은 그 자체로서 치료제 또는 예방제로서, 그리고 본 명세서에 개시된 바와 같은 재조합 항체 또는 인간화된 항체를 형성하는데 유용한 가변부와 CDR 서열을 포함하는 서열의 공여체로서 유용하다.
또한, Fab 및 F(ab')2 단편은 결합 파지 라이브러리를 통해(문헌 [Winter 등, Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)] 참조), 또는 면역글로불린 연쇄 재편성을 통해(문헌 [Marks 등, Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)]) 작제할 수도 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참고 인용하였다.
따라서, MAG에 대하여 특이적인 인간 항체 단편(Fv, scFv, Fab)은 인간 항체 단편 파지 디스플레이 라이브러리를 사용해서 분리시킬 수 있다. 인간 항체 단편 단백질을 열거한 박테리오파지 입자의 라이브러리를 MAG 단백질에 대하여 패닝(panning)한다. MAG와 결합하는 항체 단편을 나타내는 파지를 라이브러리로부터 보호 유지시키고 클로닝에 의해 증폭시킨다. 이어서, 인간 항체 유전자를 특이적인 박테리오파지로부터 절제하여 인간 IgG 불변부를 함유하는 인간 IgG 형질발현 작제물내로 삽입하여, MAG에 대하여 특이적인 분리된 박테리오파지로부터 유도된 가변부를 가진 완전한 인간 IgG 분자를 형성한다.
공여 항체는 서열들, 예를 들면 가변 중쇄 펩타이드 서열 및/또는 경쇄 펩타이드 서열, 골격 서열, CDR 서열, 기능성 단편 및 이의 동족체, 그리고 이들을 암호화하는 핵산 서열을 제공할 수 있는데, 이러한 서열들은 공여 항체의 항원 결합 특이성을 특징으로 하는 다양한 변형 항체를 작제하고 수득하는데 유용하다.
유전자 코드의 축퇴성을 고려하여, 가변 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열, CDR 서열, 그리고 공여체의 항체의 항원 특이성을 공유하는 이들의 기능성 단편과 동족체를 암호화하는 다양한 코드 서열을 작제할 수 있다. 가변쇄 펩타이드 서열 또는 CDR을 암호화하는 분리된 핵산 서열 또는 이것의 단편을 사용하여 변형 항체, 예를 들면 키메라 항체 또는 인간화된 항체, 또는 제 2의 면역글로불린 파트너와 조합할 경우에는 유전학적으로 조작된 항체를 생성할 수 있다.
변형된 면역글로불린은 키메라 항체 및 인간화된 항체를 비롯한 유전학적으로 조작된 항체를 포함하는 변형된 항체를 암호화할 수 있다. 바람직한 변형 면역글로불린 암호화 영역은, 제 1 면역글로불린 파트너(인간 골격주 또는 인간 면역글로불린 가변부) 항-MAG 항체, 바람직하게는 고친화도 항체의 항원 특이성을 가진 펩타이드를 암호화하는 CDR-암호화 영역을 함유한다.
상기 제 1 면역글로불린 파트너는 제 2 면역글로불린 파트너와 기능적으로 연결되는 것이 바람직하다. 제 2 면역글로불린 파트너는 앞에서 정의한 바와 같고, 예를 들면 Fc 영역과 같은 당해 제 2 항체 영역을 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 제 2 면역글로불린 파트너는 골격 서열에 또는 연결자 서열에 의해 경쇄 또는 중쇄 불변부가 융합되어 있는 또 다른 면역글로불린을 암호화하는 서열도 포함할 수 있다. MAG의 단편 또는 동족체에 대한 유전학적으로 조작된 항체를 설계하면 결합을 증가시킬 수 있다.
또한, 제 2 면역글로불린 파트너는 상기 유효 시약, 예를 들면 통상의 수단에 의해 제 2 면역글로불린 파트너가 기능적으로 연결될 수 있는 비-단백질 담체 분자와 결합될 수도 있다.
제 2 면역글로불린 파트너들, 예를 들면 항체 서열들과 유효 시약 사이의 융합 또는 연결은 적당한 수단, 예컨대 통상의 공유 결합 또는 이온 결합, 단백질 융합 또는 헤테로-양쪽성 가교제, 예를 들면 카르보디이미드, 글루타르알데히드 등에 의해서 이루어질 수 있다. 이와 같은 기법이 당분야에 잘 알려져 있으며, 통상의 화학 및 생화학 교재에서도 쉽게 찾아볼 수 있다.
또한, 제 2 면역글로불린 파트너와 유효 시약 사이에 필요한 양의 공간을 단순히 제공하는 통상의 연결자 서열을 변형된 면역글로불린 코드화 영역내로 작제할 수도 있다. 이와 같은 연결자의 구성은 당업자에게 잘 알려진 것이다. 본 발명의 다른 특징에 의하면, MAG 작용기에 결합하여 이를 중화시키는 전술한 바와 같은 하나 이상의 CDR을 가진 이중체(2가 또는 이중특이성), 삼중체, 사중체 및 기타 다가의 scRV 단백질 종이 제공된다.
또 다른 실시예에서, 본 발명의 항체는 그것에 부착된 또 다른 시약을 함유할 수 있다. 예를 들면 재조합 DNA 기술 절차를 사용하여 완전 항체 분자의 Fc 단편 또는 CH2-CH3 도메인이 효소 또는 다른 검출 가능한 분자(즉, 폴리펩타이드 유효 시약 또는 리포터 분자)로 치환되어 있는 본 발명의 유전삭적으로 조작된 항체를 생성할 수 있다.
또한, 제 2 면역글로불린 파트너는, 항-MAG 항체의 항원 특이성을 갖는 CDR 함유 서열에 대하여 상동성인 비-면역글로불린 펩타이드, 단백질 또는 이들의 단편에 기능적으로 연결될 수도 있다. 형성된 단백질은 형질발현시에 항-MAG 항원 특이성과 비면역글로불린의 특성을 나타낼 수 있다. 이러한 융합 파트너의 특성은 예를 들면, 또 다른 결합 또는 수용체 도메인과 같은 기능적인 특성, 또는 융합 파트너 자체가 치료제 단백질인 경우에는 치료제로서의 특성, 또는 또 다른 항원 특성일 수 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 단백질은, 전장 중쇄 및 경쇄 또는 임의의 불연속 단편, 예를 들면 Fab 또는 F(ab')2 단편, 중쇄 이합체 또는 최소 재조합 단편, 예컨대 Fv 또는 단일쇄 항체(SCA) 또는 선택된 공여체 mAb와 동일한 특이성을 가진 다른 분자를 가진 완전 항체 분자를 포함할 수 있다. 이와 같은 단백질은 변형된 항체 형태로, 또는 비융합된 형태로 사용될 수 있다.
제 2 면역글로불린 파트너가 공여 항체와 상이한 항체로부터 유도되더라도(예를 들면 면역글로불린 골격부 또는 불변부의 이소타입 또는 부류), 유전학적으로 조작된 항체가 얻어진다. 유전학적으로 조작된 항체는, 수용 항체와 같은 하나의 원천으로부터 유도된 면역글로불린(Ig) 불변부와 골격부, 그리고 수용 항체로부터 유도된 하나 이상의 (바람직하게는 모든) CDR을 포함할 수 있다. 또한, 핵산 또는 아미노산 위치에서, 또는 공여체 CDR 영역에서 변형, 예를 들면 mAB 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역 골격부의 삭제, 치환 또는 부가를 실시하여 공여 항체 항원 결합 특이성을 보유할 수 있도록 한다.
이와 같은 유전학적으로 조작된 항체는 하나 이상의 중쇄 또는 경쇄 CDR 또는 항-MAG mAb의 가변 중쇄 및/또는 경쇄중 하나 (또는 둘다)를 사용하도록 구성된다. 유전학적으로 조작된 항체는 전술한 바와 같이 중화시킬 수 있다.
상기 유전학적으로 조작된 항체는, 선택된 인간 면역글로불린 또는 아형의 골격부를 함유하는 인간화된 항체, 또는 항-MAG 항체 기능성 단편에 융합된 인간 중쇄 및 경쇄 불변부를 함유하는 키메라 항체를 포함할 수 있다. 적합한 인간(또는 다른 동물) 수용 항체는 통상의 데이터베이스, 예를 들면 KABAT?? 데이터베이스, 로스 알라모스 데이터베이스, 스위스 프로틴 데이터베이스로부터, 공여 항체의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열에 대한 상동성에 준하여 선택된 것일 수 있다. 공여 항체의 골격부에 대하여 (또는 아미노산 기준) 상동성임을 특징으로 하는 인간 항체가 공여체 CDR의 삽입을 위한 중쇄 불변부 및/또는 중쇄 가변 골격부를 제공하는데 적합할 수 있다. 경쇄 불변부 또는 가변 골격부를 제공할 수 있는 적합한 수용 항체도 유사한 방식으로 선택할 수 있다. 수용 항체 중쇄 및 경쇄는 동일한 수용 항체로부터 유도될 필요는 없음을 알아야 한다.
이질성 골격부와 불변부는 인간 면역글로불린 부류 및 이소타입, 예를 들면 IgG(아형 1 내지 4), IgM, IgA 및 IgE로부터 선택되는 것이 바람직하다. 그러나, 수용 항체는 인간 면역글로불린 단백질 서열만을 포함할 필요는 없다. 예를 들면, 인간 면역글로불린의 DNA 서열 암호화 부분이 폴리펩타이드 유효 시약 또는 리포터(reporter) 분자와 같은 비-면역글로불린 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열에 융합되어 있는 유전자를 작제할 수 있다.
인간화된 항체에 있어서, 인간 중쇄 및 경쇄의 가변부는 하나 이상의 CDR 치환에 의해서 유전학적으로 조작되는 것이 바람직하다. 6개의 모든 CDR 또는 6개 이하의 CDR의 조합을 사용할 수 있다. 6개의 CDR을 모두 치환시키는 것이 바람직하다. 경쇄로서 인간 수용 항체로부터 유도된 변형되지 않은 경쇄를 사용해서, 인간 중쇄에서만 CDR을 치환시킬 수도 있다. 다른 예로서, 통상의 항체 데이터베이스에 근거하여 다른 인간 항체로부터 양립되는 경쇄를 선택할 수도 있다. 유전학적으로 조작된 항체의 나머지 부분은 적당한 수용체 인간 면역글로불린으로부터 유도될 수 있다.
따라서, 유전학적으로 조작된 인간 항체는 천연의 인간 항체 또는 그 단편으로 된 구조를 갖는 것이 바람직하며, 효과적인 치료 용도에 필요한 성질들을 겸비하는 것이 바람직하다.
당업자라면, 유전학적으로 조작된 항체를, 공여 항체의 특이성과 고친화도에 영향을 미치는 일 없이 가변부 아미노산들을 변화시킴으로써(즉, 동족체), 더욱 변형시킬 수 있다는 사실을 잘 알 것이다. 중쇄 및 경쇄 아미노산은 골격부 또는 CDR 또는 양 부분에서 다른 아미노산으로 치환될 수 있을 것으로 생각된다.
또한, 불변부를 변형시켜서 본 발명의 분자의 선택성을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 예를 들면, 이합체화, Fc 수용체에의 결합 또는 보체를 결합하고 활성화시키는 능력 등이다. 이에 관해서는 문헌[Angal 등, Mol. Immunol, 30:105-108 (1993), Xu 등, J. Biol. Chem., 269: 3469-3474 (1994), Winter 등, EP 307,434-B]를 참조할 수 있다.
키메라 항체인 변형 항체는 골격부를 포함한 전체 비-인간 공여 항체 중쇄 및 경쇄 가변부와 함께, 다른 종, 바람직하게는 2가지 사슬 모두에 대하여 인간으로부터 유도된 면역글로불린 불변부를 제공한다는 점에서, 전술한 바와 같은 인간화된 항체와는 구별된다.
적합한 공여체 mAb의 가변 경쇄 서열 및/또는 중쇄 서열 및 CDR, 그리고 이들을 암호화하는 핵산 서열을 다음과 같은 절차에 따라서 본 발명의 변형 항체, 바람직하게는 인간화된 항체에 이용하는 것이 바람직하다. 이와 동일하거나 유사한 기법을 사용하여 본 발명의 다른 실시예를 실시할 수도 있다.
선택된 공여체 mAB를 생성하는 하이브리도마는 통상의 방식으로 복제되며, 이의 중쇄 및 경쇄 가변부는 당업자에게 알려진 통상의 기법, 예를 들면 문헌 [Sambrook 등, Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 제 2 판, Cold Spring Harbor labortory (1989)]에 기재된 기법에 따라서 얻을 수 있다. 적어도 CDR 암호화 영역 및 동여체 mAb 결합 특이성을 보호 유지하는데 필요한 수용체 mAb 경쇄 및/또는 중쇄 가변 도메인 골격부, 그리고 인간 면역글로불린으로부터 유도된 항체 사슬의 면역글로불린 유도부를 함유하는 가변 중쇄 및 경쇄 영역은 폴리뉴클레오타이드 프라이머 및 역전사 효소를 사용하여 얻을 수 잇다. CDR 암호화 영역은 공지의 데이터베이스를 사용하여 다른 항체와의 비교를 통해서 동정한다.
이어서, 마우스/인간 키메라 항체를 제조하여 결합 능력에 대하여 분석한다. 이와 같은 키메라 항체는 전체 비-인간 공여 항체 VH 및 VL 영역과 함께 중쇄 및 경쇄에 대한 인간 Ig 불변부를 함유한다.
인간 항체로부터 유도된 중쇄 가변부의 상동성 골격부는 컴퓨터화된 데이터베이스, 예컨대 KABAT?瑛? 사용하여 동정할 수 있으며, 공여 항체에 대하여 상동성을 갖는 인간 항체를 수용 항체로서 선택할 수 있다. 적합한 경쇄 가변 골격부도 유사한 방식으로 구성할 수 있다.
인간화된 항체는 키메라 항체로부터 유도하거나, 또는 바람직하게는 선택된 중쇄 및 경쇄 골격 내에 중쇄 및 경쇄로부터 유도된 공여체 mAb CDR을 암호화하는 영역을 적절히 삽입함으로써 합성할 수 있다. 다른 방법으로, 인간화된 항체는 표준 돌연변이 기법을 사용하여 만들 수 있다. 따라서, 결과적으로 얻은 인간화된 항체는 인간 골격부와 공여체 mAb CDR 암호화 영역을 함유한다. 골격 잔기에 대해서는 후속 작업이 필요할 수 있다. 인간화된 항체는 재조합 숙주 세포, 예를 들면 COS, CHO 또는 골수종 세포에서 형질발현시킬 수 있다.
통상의 형질발현 벡터 또는 재조합 플라스미드는, 상기 암호화 서열을 숙주 세포에서의 복제와 형질발현 및/또는 숙주 세포로부터의 분비를 조절할 수 있는 통상의 통제 조절 서열과 기능상 관련된 항체로 치환시킴으로써 생성된다. 조절 서열로서는, 프로모터 서열, 예를 들면 CMV 프로모터, 및 다른 공지의 항체로부터 유도될 수 있는 신호 서열을 들 수 있다. 마찬가지로, 상보되는 항체 경쇄 또는 중쇄를 암호화하는 DNA 서열을 가진 제 2 형질발현 벡터를 제조할 수 있다. 이러한 제 2 형질발현 벡터는 암호화 서열 및 선택가능한 마터에 관해서는 제 1 형질발현 벡터와 동일하므로, 각각의 폴리펩타이드 사슬이 기능적으로 형질발현될 수 있도록 한다. 다른 예로서, 변형된 항체에 대한 중쇄 및 경쇄 암호화 서열이 단일의 벡터에 존재할 수도 있다.
선택된 숙주 세포는 통상의 기법에 의해서 제 1 및 제 2 벡터로 동시에 형질감염되어 (또는 단일의 벡터에 의해 간단히 형질감염되어), 재조합 또는 합성 경쇄와 중쇄를 포함하는 본 발명의 형질감염된 숙주 세포를 생성한다. 이어서, 형질감염된 세포를 통상의 기법에 의해 배양하여 본 발명의 유전학적으로 조작된 항체를 생성한다. 재조합 중쇄 및/또는 경쇄의 결합을 포함하는 인간화된 항체를 ELISA 또는 RIA와 같은 적절한 분석법에 의해서 배양물로부터 선별한다. 마찬가지로, 통상의 기법을 사용해서 다른 변형된 항체와 분자를 작제할 수 있다.
상기 방법 및 본 발명의 조성물의 작제에 사용된 클로닝 및 서브클로닝 단계에 적합한 벡터는 당업자에 의해 선택될 수 있다. 예를 들면, 통상의 pUC 계열의 클로닝 벡터를 사용할 수 있다. 일종의 벡터, pUC19는 Amersham(버킹햄셔, 영국) 또는 파마시아(업살라, 스웨덴)과 같은 공급업체로부터 입수할 수 있다. 또한, 용이하게 복제할 수 있는 벡터에는 클로닝 부위와 선택가능한 유전자(예: 항생제 내성)가 풍부하여 조작이 용이하므로, 클로닝에 사용할 수 있다. 따라서, 클로닝 벡터의 선택은 본 발명에 있어서 제한적인 요소가 아니다.
마찬가지로, 항체의 형질발현에 필요한 벡터도 통상의 벡터로부터 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 또한, 벡터는 선택된 숙주 세포에서 이질성 DNA 서열의 복제와 형질발현을 좌우하는 선택된 조절 서열(예를 들면 CMV 프로모터)도 함유한다. 이러한 벡터는 항체 또는 변형 면역글로불린 암호화 영역을 암호화하는 상기 DNA 서열을 함유한다. 또한, 벡터는 즉석 조작을 위해 바람직한 제한 부위를 삽입함으로써 변형된 선택된 면역글로불린 서열을 포함할 수도 있다.
또한, 형질발현 벡터는 이질성 DNA 서열, 예를 들면 포유류 디하이드로폴레이트 리덕타제 유전자(DHFR)의 형질발현을 증폭시키는데 적합한 유전자를 특징으로 한다. 기타 바람직한 벡터 서열로서는, 예를 들면 소 성장 호르몬 (BGH) 및 베타글로빈 프로모터 서열(betaglopro)로부터 유도된 것과 같은 폴리 A 신호 서열을 들 수 있다. 본 발명에 유용한 형질발현 백터는 당업자에게 잘 알려진 기법에 의해서 합성할 수 있다.
이와 같은 벡터의 성분들, 예를 들면 리플리콘(replicon), 선택된 유전자, 촉진자, 프로모터, 신호 서열등은 시판 제품을 입수하거나, 천연 원천으로부터 얻거나, 또는 선택된 숙주 세포에서의 재조합 DNA 생성물의 형질발현 및/또는 분비를 통제하는데 유용한 공지의 절차에 의해서 합성할 수 있다. 포유류, 박테리아, 곤충, 효모 및 균류 형질발현에 대하여 여러 가지 유형의 다른 적절한 형질발현 벡터가 당분야에 공지되어 있으며, 목적에 맞게 선택할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 이것의 변형된 면역글로불린 분자의 암호화 서열을 함유하는 재조합 플라스미드로 형질감염된 세포주에 관한 것이다. 클로닝 및 당해 클로닝 벡터의 다른 조작에 유용한 숙주 세포도 통상적인 것이다. 그러나, E. 콜리의 다양한 균주로부터 유도된 세포를 본 발명의 변형 항체의 작제에 있어서 클로닝 벡터의 복제 및 다른 단계에 사용하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 항체의 형질발현에 사용하는데 적합한 숙주 세포 또는 세포주는 포유류 세포, 예컨대 NS0, Sp2/0, CHO, COS, 섬유아세포(예: 3T3) 및 골수종 세포인 것이 바람직하고, CHO 또는 골수종 세포인 것이 더욱 바람직하다. 인간 세포를 사용하여, 분자를 인간의 글리코실화 패턴으로 변형시킬 수도 있다. 다른 방법으로, 다른 진핵 세포주를 사용할 수 있다. 적합한 포유류 숙주 세포 및 형질전환, 배양, 증식, 선별 및 생성물 생성과 정제 방법이 당분야에, 예를 들면 상기 Sambrook 등의 문헌에 기재되어 있다.
박테리아 세포가 본 발명의 재조합 Fab의 형질발현에 적합한 숙주 세포로서 유용함을 입증할 수 있다(Pluckthun, A., Immunol. Rev., 130: 151-188 (1992) 참조). 그러나, 박테리아 세포에서 형질발현된 단백질은 중첩되지 않거나 부적절하게 중첩된 형태로, 또는 비글리코실화된 형태로 존재하는 경향이 있기 때문에, 박테리아 세포에서 생성된 재조합 Fab는 항원 결합능의 보유 여부에 대해 선별해야할 필요가 있다. 박테리아 세포에서 형질발현된 분자가 적절하게 중첩된 형태로 존재할 경우 그 박테리아 세포는 바람직한 숙주가 될 수 있다. 예를 들면, 형질발현에 사용된 다양한 E. 콜리 균주는 생명공학 분야에서 숙주 세포로서 잘 알려져 있다. 다양한 B. 서브틸리스(subtilis), 스트렙토마이세스(streptomyces), 그타 바실러스 등의 균주도 이 방법에 사용할 수 있다.
필요에 따라서, 당업자에게 알려져 있는 효모 세포의 균주도 숙주 세포로서이용할 수 있으며, 또한 곤충 세포, 예를 들면 드로소필라(Drosophila)와 레피도프테라(Lepidoptera) 및 바이러스 형질발현 시스템도 이용할 수 있다. 이에 관해서는 문헌 [Miller 등, Genetic Engineering, 8: 277-298, Plenum Press(1986)] 및 여기에 참고 인용된 자료를 참고할 수 있다.
벡터의 작제를 위한 일반적인 방법, 본 발명의 숙주 세포를 생성하는데 필요한 방법 및 상기 숙주 세포로부터 본 발명의 변형 항체를 생성하는데 필요한 배양 방법은 모두 통상의 기법을 따른다. 마찬가지로, 본 발명의 항체는, 일단 생성된 다음에는, 당분야에 알려진 통상의 절차, 예를 들면 황산암모늄 침전, 친화 컬럼, 컬럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등에 따라서 세포 배양 내용물로부터 정제할 수 있다. 이와 같은 기법은 당분야에 잘 알려져 있으며, 본 발명의 보호 범위를 한정하는 것은 아니다. 예를 들면, 변형 항체의 제조 방법이 WO99/58679 및 WO96/16990호에 개시되어 있다.
또 다른 항체의 형질발현 방법은, 예컨대 미국 특허 제 4,873,316호에 개시된 바와 같이 유전자 도입 동물에서의 형질발현을 이용하는 것이다. 이 방법은 동물에게 유전자 도입되었을때 암컷으로 하여금 모유에서 바람직한 재조합 단백질을 생성하도록 하는 동물의 카제인 프로모터를 사용하는 형질발현 체계와 관련된 것이다.
바람직한 방법에 의해서 일단 형질발현된 후에는, 항체를 적적한 분석법을 통해서 시험관내 활성에 대해 조사한다. 통상의 ELISA 분석 포맷을 사용하여 항체의 MAG에 대한 결합을 정성적으로, 또한 정량적으로 해석할 수 있다. 또한, 다른 시험관내 분석법을 사용하여 중화 효율을 입증한 후에, 인체에 대한 임상 시험을 수행하여 청소(clearance) 메카니즘에도 불구하고 체내에 항체가 지속되는지를 평가한다.
본 발명의 치료제는 필요에 따라서 예방제로서, 또는 손상후에 투여될 수 있다. 치료 용량과 지속 기간은 본 발명의 분자의 인체 순환계내에서의 상대적인 지속기간과 관련이 있으며, 치료하고자 하는 상태 및 환자의 전신 건강 상태에 따라서 당업자에 의해 용이하게 조정될 수 있다.
본 발명의 치료제의 투여 방식은 제제를 숙주에 전달하는 임의의 적당한 경로를 통해 이루어질 수 있다. 본 발명의 길항물질과 항체 및 약제 조성물은 특히 비경구 투여, 즉, 피하, 근육내, 정맥내 또는 비내 투여하는데 특히 유용하다.
본 발명의 치료제는 본 발명의 길항물질 또는 항체를 유효량의 활성 성분으로서 약학적으로 허용되는 담체내에 함유하는 조성물의 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 예방제에 있어서, 유전학적으로 조작된 항체를 함유하고, 바람직하게는 생리학적 pH로 완충된 수성 현탁액 또는 용액을 즉석 주사 가능한 제형으로 제공하는 것이 바람직하다. 비경구 투여용 조성물은 통상 약학적으로 허용되는 담체, 바람직하게는 수성 담체에 용해된 본 발명의 길항물질 또는 항체의 용액 또는 이들의 칵테일을 포함할 것이다. 다양한 수성 담체를 사용할 수 있는데, 그 예로서는 0.9% 염수, 0.3% 글리신 등을 들 수 있다. 이러한 용액은 멸균되며, 통상적으로 입자상 물질이 존재하지 않는다. 이러한 용액은 통상의 멸균 기법(예: 여과)을 사용하여 멸균시킬 수 있다. 조성물은 필요에 따라서 생리학적 조건에 근접하도록 약학저긍로 허용되는 보조 물질, 예를 들면 pH 조정제 및 완충제 등을 함유할 수 있다. 이와 같은 약학 제제내에서 본 발명의 길항물질 또는 항체의 농도는 다양하게 변화하는데, 즉, 약 0.5 중량% 이하 내지 대개는 최소 약 1 중량%에서부터 15 또는 20 중량%에 이르며, 액체 용량, 점도 등에 준하여 선택된 특정한 투여 방식에 따라서 선택될 것이다.
따라서, 근육내 주사에 사용하기 위한 본 발명의 약제 조성물은 멸균 완충수 1 ml, 및 약 1 ng 내지 약 100 mg, 예를 들면 약 50 ng 내지 약 30 mg 또는 그 이상, 바람직하게는 약 5 mg 내지 약 25 mg의 본 발명에 의한 길항물질 또는 항체를 함유하도록 제조할 수 있다. 마찬가지로, 정맥내 주입에 사용하기 위한 본 발명의 약제 조성물은 멸균 링거 용액 약 250 ml, 및 약 1 mg 내지 약 30 mg, 바람직하게는 약 5 mg 내지 약 25 mg의 본 발명에 의한 유전학적으로 조작된 항체를 함유하도록 제조될 수 있다. 비경구 투여용 조성물을 제조하기 위한 실용적인 방법이 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들면 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 제15판, Mack Publishing Company, 이스턴, 펜실베니아]에 보다 상세하게 설명되어 있다.
본 발명의 치료제는, 약학 제제내에서, 단위 투여 제형으로 존재하는 것이 바람직하다.적절한 치료학적 유효량은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 인체의 뇌졸중 및 기타 신경 질환을 효과적으로 치료하기 위해서, 1회 용량으로서 체중 70 kg 당 본 발명의 길항물질 또는 항체를 700 mg에 이르는 양으로 비경구, 바람직하게는 정맥내 또는 근육내 투여할 수 있다. 이와 같은 용량은 필요에 따라서 전문의에 의해 적절하게 선택된 시간 간격을 두고 반복 투여될 수 있다.
본 발명의 항체는 사용전에 적합한 담체중에 저장 및 재구성되도록 친액성화시킬 수 있다. 이러한 기법은 통상의 면역글로불린에 효과적인 것으로 밝혀졌으며, 공지의 친액성화 및 재구성 기법을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 특징에 따라서, 본 발명의 항-MAG 항체 또는 이것의 기능성 단편과 약학적으로 허용되는 담체를 포함하여, 뇌졸중 및 기타 신경 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 특징에 의하면, 본 발명의 항-MAG 항체 또는 이것의 기능성 단편과 약학적으로 허용되는 담체를 포함하여, 뇌졸중 또는 기타 신경 질환에 걸려 있거나, 이러한 질병이 발병할 위험이 있는 환자에서 신경퇴화를 억제하고/하거나 기능 회복을 촉진하기 위한 약제 조성물이 제공된다.
이하에서는, 실시예에 의거하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
실시예 1- 뇌졸중 모델에서 항-MAG 항체
재료 및 방법
항-MAG 모노클로날 항체
항-MAG 모노클로날 항체는 케미콘(Chemicon)으로부터 입수한 항-병아리 MAG 항체 MAB 1567이었다. 상기 항체는 다음과 같은 특징을 갖는다:
항원: 수초 관련 당단백질(인간, 마우스, 래트, 소, 병아리, 개구리)
이소타입: IgG1
중화 활성: 문헌 [Debellard 등 (1996) Mol. Cell. Neurosci. 7, 89-101; Tang 등 (1997) Mol. Cell. Neurosci. 9, 333-346; Torigoe K 및 Lundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254-262].
대조군 IgG1 mab는 R+D 시스템즈로부터 구입하였다.
대뇌내실 카뉼라 삽입(연구 1에만 해당됨)
할로탄으로 마취시킨 상태에서, 좌측 대뇌실에 대뇌내실(i.c.v.) 카뉼라를 삽입하였다(위치: 중앙선에서 1.6 mm, 대천문으로부터 0.8 mm 꼬리쪽, 두개 표면으로부터 4.1 mm, 앞니 바(bar) 0점하 -3.2 mm, Paxinos 및 Waston의 문헌(1986) 참조). 모든 래트를 가이드 또는 더미 카뉼라에 손상이 가지 않도록 단독으로 수용하였다. 수술한지 7일 경과후, 안지오텐신 II에 대한 집중적인 음용 반응에 의해서 카뉼라가 정확한 위치에 삽입되었음을 확인하였다(100 ng, Simpson 등, 1978). 9일 경과후에. 동물들을 대뇌 허혈 상태로 만들었다.
일시적인 국소 대뇌 허혈
체중이 각각 300-350 g인 수컷 스프래그 도우리 래트에서 일시적인(90분) 국소 대뇌 허혈을 일으켰다. 동물을 먼저 5% 할로탄, 60% 아산화질소 및 30% 산소의 혼합물을 사용하여 마취시키고, 안면 마스크상에 놓은 후에, 1.5% 할로에탄으로 마취 상태를 유지시켰다. 전술한 바와 같은 (Zea Longa 등, 1989) 강내 장착 기법을 사용해서 중앙 대뇌 동맥 폐색(MCAO) 작업을 실시하였다. 동물들을 수술 절차 전반에 걸쳐서 정상체온으로 유지시키고, 단독으로 수용하기 전에 인큐베이터에서 1 시간동안 회복시켰다. 접종후에 신경학적 수치가 3 1h인 동물들만을 연구에 포함시켰다(5점 채점 시스템을 사용하여 분석함: 0, 기능 장애 없음; 1, 반대측 반사; 2, 파지(grip) 기능 약화; 3, 원형 회전; 4, 부동 상태; 5, 사망). 동물들을 1주에 이르는 기간동안 유지시켜 두고, 1주째에 동물들을 심장을 경유해서 0.9% 염수, 이어서 100 mM 인삼염 완충액중의 4% 포름알데히드를 관류시켜서 사망시켰다. 이어서, 뇌를 4℃에서 4% 파라포름알데히드에 48 시간동안 고정시키고, 이때 두개로부터 뇌를 제거하여 래트 뇌 기질을 사용해서 2 mm 블록으로 절단하였다. 이어서, 2 mm 단편을 Shandon Citadel 1000 조직 처리 장치를 사용해서 파라핀에 매립하고, 마이크로톰을 사용해서 6㎛ 단편으로 절단한 후에, 폴리-L-리신으로 피복된 슬라이드상에 장착시켰다. 이어서, 단편들을 크레실 패스트 바이올렛(Cresyl Fast Violet: CFV) 염색법에 사용할 수 있도록 처리하였다.
투여 섭생
항-MAG 모노클로날 항체와 마우스 IgG1 이소타입 대조군 항체를 0.9% 멸균 염화나트륨에 대해서 밤새 투석하고, 적당히 농축시켰다.
연구 1: 항-MAGmab 2.5 ㎍ 또는 마우스 IgG 2.5 ㎍을 대뇌실을 통해서 중앙 대뇌 동맥 폐색(MCAO)후 1, 24 및 72 시간이 경과한 다음에 투여한 동물(매회 투여당 5 ㎕).
연구 2: 항-MAGmab 200 ㎍ 또는 마우스 IgG 200 ㎍을 대뇌실을 통해서 중앙 대뇌 동맥 폐색(MCAO)후 1 및 24 시간이 경과한 다음에 투여한 동물(매회 투여당 5 ㎕).
연구원은 각각의 투여 용액의 정체를 알지 못한 상태로 실시하였다.
신경학적 평가 방법
대뇌 허혈 상태로 도입시키기 전에, 연구 1에 해당하는 래트를 평균대 걷기및 점착 라벨 테스트를 받게 하였다. 2가지 테스트에서 모두 요건에 부합되지 않는 동물들은 후속 연구에서 제외시켰다. 훈련시킨 후에, 나머지 동물을 능력에 따라서 2개의 군으로 분류하였다. 신경학적 평가 전반에 걸쳐서, 연구원은 동물의 치료군에 대해서는 알지 못하도록 하였다.
양측성 점착 라벨 테스트
양측성 점착 라벨 테스트(Schallert 등, Pharmacology Biochemistry and Behaviour 16: 455-462 (1983))를 사용하여 반대측 무시/동측 편애에 관해 평가하였다. 이것은, 뇌졸중 환자에서 관찰되는 촉감 상실을 모델링한 것이다(Rose 등, 1994). 본 테스트는 종래 문헌[Hunter 등, Neuropharmacology 39: 806-816 (2000); Virley 등 Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism, 20: 563-582 (2000)]에 상세히 설명되어 있다. 요컨대, 둥근 점착 라벨지를 앞발의 제모된 영역 주위에 균등한 압력을 가해서 무작위한 배치 순서에 따라(좌우) 견고하게 부착시켰다. MCAO에 앞서 6일동안 훈련 기간을 거친 다음에, 6일째 데이터를 처치전 기준선으로 사용하였다(0일). MCAO 이후 24시간 및 7일이 경과하였을때 동물을 2회 시험하였다. 데이터는 2회 시험의 평균치를 나타낸 것이다. 라벨 접촉 및 제거에 대한 대기 시간을 기록하고 로그순위(logrank) 테스트를 사용하여 분석하였다(Cox, J. Royal Statistical Society B34:187-220 (1972)).
평균대 걷기
문헌 [Virley 등, Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism, 20: 563-582 (2000)]에 기술된 바와같이, 100 cm 높이의 평균대(직경 2.3 cm, 바닥으로부터 48 cm 이격)를 교차하여 이동한 거리에 준하여, 평균대 걷기를 뒷발과 앞발 조화의 척도로서 사용하였다. 래트는 출발점부터 종료점까지 평균대를 교차하도록 훈련시켰다. 테스트를 위해서, 각각의 래트를 MCAO 이후 24 시간 및 7일이 경과하였을때 2회 시험하였으며, 데이터는 2회 시험의 평균치를 나타낸 것이다. 통계학적 분석은 ANOVA에 이은 학생의 t-테스트에 의해 수행하였다.
27-포인트 신경학적 수치(연구-1)
본 연구는, 종래 개시된 바와 같이, 신경학적 상태, 예를 들면 발의 위치, 시각에 의한 앞발의 도착, 평행봉, 반대측 회전, 경사면, 정당 반사, 반대측 반사, 운동력 및 전체적인 상태를 평가하기 위한 일련의 테스트로 이루어지며(hunter 등, Neuropharmacology 39: 806-816 (2000)), 여기에 파지 강도 측정 시험을 추가하였다(우수하고 정당한 앞발 파지의 경우 2득점, 파지가 약한 경우 1 득점). 총 득점은 보통의 동물의 경우 27점이다.
연구 2에 대해서는, 본 테스트를 다음과 같이 더 변형시켰다: 파지 강도- 보통 득점 3, 우수-2, 약함-1, 매우 약함-0; 운동력- 보통 득점 4, 탁월함-3, 매우 우수함-2, 우수함-1, 완만함-0; 전체 상태- 보통 득점 4, 탁월함-3, 매우 우수함-2, 우수함-1, 완만함-0; 원형 회전- 없음- 득점 5, 1측면 선호-4득점, 큰 원-3, 중간 크기 원-2, 작은 원-1, 연속 회전-0). 총 득점은 보통의 동물의 경우 32점이다.
2가지 연구에서, 동물들은 모두 MCAO 이후 1 시간, 24 시간, 48 시간 및 7일이 경과한 시점에서 테스트하였으며, 건강한 보통의 동물의 득점은 각각 27 점과 32 점이었다. 데이터는 중간치로서 보고하였으며, 통계학적 분석에는 Kruskil Wallis ANOVA를 사용항였다.
병소 평가
연구 1- 각 동물에 대하여, 뇌에서 미리 정한 3개의 위치로부터 얻은 단편에 대하여 병소 면적을 평가하였다(각각 대천문으로부터 0, -2.0 및 -6.0 mm). 크레실 패스트 바이올렛 염색법을 사용해서 뉴런 손상을 평가하고, 옵티마스 6.1 촬영 패키지를 사용해서 손상 영역을 측정하였다. 데이터는 평균 면적(mm2)±sem으로 나타내었다.
연구 2- 각 동물에 대하여, 뇌에서 미리 정한 7개의 위치로부터 얻은 단면에 대하여 병소 영역을 평가하였다(대천문으로부터 +3 mm 내지 -8 mm). 크레실 패스트 바이올렛 염색법을 사용해서 뉴런 손상을 평가하고, 옵티마스 6.1 촬영 패키지를 사용해서 손상 영역을 측정하였다. 데이터는 평균 면적(mm2)±sem으로 나타내었다.
결과
연구 1- 항-MAG mab의 대뇌내실(i.c.v.) 투여
신경학적 수치
2가지 치료군에서 모든 동물들은 MCAO 이후 1 시간 경과후에 신경학적 수치면에서 현저한 손상을 나타내었다(각 군에서 평균 수치 12). 이때 2가지 치료군 사이에 현저한 차이는 없었다. 그러나, MCAO 이후 24시간(p=0.02), 48 시간(p=0.005) 및 7일(p=0.006) 경과후에, 항-MAG mab(2.5㎍, MCAO후 1, 24 및 72 시간)로 치료한 동물들은 대조군 IgG로 치료한 동물들에 비해서 총 신경학적 수치가 현저하게 향상된 것으로 나타났다. MCAO 이후 24시간, 48시간 및 7일 경과후에 IgG1 치료군에서 평균 신경학적 수치는 각각 15, 14 및 18이었으며, 이에 반하여 항-MAG mab로 치료한 동물들에 있어서는 19.5, 21.5 및 22이었다. 총 득점을 비롯한 각각의 행동을 더욱 분석한 결과, 이와 같이 현저하게 향상된 결과는 주로 다음과 같은 테스트에서의 활동이 향상된 데 기인한 것이엇다: 발 위치(24시간, p=0.045; 48시간, p=0.016; 7일, p=0.008), 파지 강도(24시간, p=0.049; 48 시간, p=0.0495; 7일, p=0.243), 활동성(24시간, p=0.199; 48 시간, p=0.012; 7 일, p=0.067), 평행봉(24 시간, p=0.065; 48 시간, p=0.005; 7일, p=0.016), 경사면(24시간, p=0.006; 48 시간, p=0.006; 7일, p=0.169), 시각에 의한 앞발 도착(48시간, p=0.049; 7일, p=0.049) 및 원형회전도(24시간, p=0.417; 48시간, p=0.034; 7일, p=0.183).
평균대 걷기
수술 이전에, 모든 동물들을 평균대(100 cm)를 교차하도록 훈련시켰다. 외과수술후 24 시간 경과후, 항-MAG(50±18 cm) 및 IgG1(22±14 cm)로 치료한 동물들은 모두 처리전의 수치에 비해서, 평균대상의 이동 거리가 현저하게 손상된 것으로 나타났다. 그다지 현저한 것은 아니지만, 항-MAG로 치료한 동물들은 MCAO 이후 24 시간 경과후 IgG1 치료한 동물들의 이동 거리의 2배를 이동한다는 잠에서 IgG1 치료 동물에 비해 개선된 결과를 나타내었다. 그러나, 외과수술후 7일 경과후, 2가지 치료군은 모두 경시적으로 개선된 결과를 나타내었지만, IgG로 치료한 동물들의 활동은 기준선에 비해 현저하게 손상된 상태로 유지되었다(55±15cm; p=0.005). 그러나, 이와는 달리 MCAO 이후 7일 경과후에, 항-MAG mab(2.5㎍. 24 시간 및 72 시간, MCAO후 i.c.v.)로 치료한 동물들의 활동은 기준선으로부터 현저한 차이를 보였다(75±15 cm; p=0.07). 이 데이터는 항-MAG mab에 의한 치료 방법이 평균대 걷기 테스트에서 IgG1 치료 대조군의 마우스에 비해서 기능 회복을 촉진시킨다는 것을 입증한다.
점착 라벨
수술하기 전에, 각각의 치료균의 동물들을 각 앞발 위치에서 라벨에 빠르게 접촉시키고 떼어냈다. 치료전에는 2가지 치료군 사이에 현저한 차이가 없었다(표 1). MCAO 이후 24 시간 및 7일 경과후, 각 치료군에서 왼발을 접촉시키려는 잠재성은 상대적으로 변화없이 유지되었지만, 오른발을 접촉시키는 대기 시간은 현저하게 증가하였다. 그러나, 항-MAG 치료 동물과 IgG1 치료 동물 사이에 제거 시간상의 현저한 차이는 없었다. MCAO 이후 24 시간이 경과한 후에, 왼발과 오른발에서 라벨을 제거하는 대기 시간은 2가지 치료군에서 모두 기준선에 비해 현저한 상승을 나타내었다. 그러나, 항-MAG로 치료한 동물들의 경우에는, 왼발에서 제거하는 대기 시간이 IgG1 치료 동물의 그것에 비해 상당히 더 짧았다(p=0.03). 또한, 항-MAG로 치료한 동물들의 경우에 오른발에서 라벨을 제거하는 대기 시간은 IgG1으로 치료한 동물들에 비해서 감소한 것으로 나타났다(p=0.08)(표 1). 7일째, 각 앞발에 대한 제거 시간에 대한 대기 시간이 24시간 시점에서의 그것에 비해 감소된 점에 비추어볼때, IgG1으로 치료한 동물들에서는 어느 정도 기능 회복이 나타났다(표 1). 이러한 데이터는, 래트를 항-MAG mab로 치료할 경우 tMCAO이후에 점착 라벨 테스트에서 기능 회복을 촉진시킨다는 것을 시사한다.
점착 라벨 데이터
일 치료제 접촉 시간(평균±sem) 제거 시간(평균±sem)
왼쪽 앞발 오른쪽 앞발 왼쪽 앞발 오른쪽 앞발
0 항-MAG 2.4±0.2 3.6±0.5 12±2 12±2
0 IgG1 3.3±0.6 4.2±0.7 10±1 9±1
1 항-MAG 5.9±3.7 109.6±27.5 *61±26 96±26
1 IgG1 3.6±0.5 71.8±31.7 130±21 156±19
7 항-MAG 3.8±1 36.4±10.2 54±23 80±30
7 IgG1 2.8±0.3 64±28 23±8 87±20
*p=0.03 항-MAG 대 IgG1 로그순위 테스트를 사용함.
병소 면적 측정
항-MAG mab를 대뇌실내 투여한 결과, tMCAO 이후 7일 경과후에 조사하였을때, 동량의 마우스 IgG1으로 치료한 동물에 비해서, 조사한 3가지 뇌의 위치중 2개에서 병소 면적이 현저하게 감소한 것으로 나타났다(표 2).
tMCAO 이후 7일 경과후에 평균 병소 면적 ± sem(mm2)
치료제 대천문에서 0 mm wrt 대천문에서 -2 mm wrt 대천문에서 -6 mm wrt
항-MAG mab(n=8) *9±2 $4±3 #3±1
마우스 IgG1 (n=9) 14±1 12±1 5±1
(*p=0.02, $p=0.03, #p=0.06, 항-MAG 대 IgG1, 편도식, 쌍을 이루지 않은 학생의 T-테스트).
연구 2- 정맥내 투여
신경학적 수치
MCAO 이후 1 시간 및 24 시간 경과후, 2가지 치료군의 동물들은 신경학적 수치면에서 현저한 손상을 나타내었다. 이 시점에서 2가지 치료군 사이에 현저한 차이는 존재하지 않았으며, 항-MAG mab와 IgG1으로 치료한지 24시간 경과후에 평균 수치는 각각 20 및 18이었다(p=0.5). MCAO 이후 48시간 경과후에, 항-MAG mab(200 ㎍, 정맥내, MCAO 이후 1 시간 및 24 시간후)로 치료한 동물들은 발의 위치(p=0.048) 및 파지 강도(p=0.033)면에서 현저한 향상을 나타내었다. 대뇌 허혈 개시후 7일 경과후에 항-MAG mab로 치료한 동물들은 계속해서 향상된 결과를 나타내었으며(발의 위치 p=0.041; 파지 강도, p=0.048; 활동성, p=0.05), 총 신경학적 수치면에서 마우스 IgG1(평균치 23, p=0.047)으로 치료한 동물들에 비해서 현저하게 향상되었다(평균치 25).
병소 면적 측정
MCAO 이후 정맥내 투여시 항-MAG 항체는 7개의 예정된 뇌의 위치(대천문으로부터 +3 내지 -8 mm w.r.t.)중 5개의 위치에서, MCAO 이후 7일 경과후에, 병소 면적이 이소타입 대조군에 비해 현저하게 감소되었다.
뇌 위치wrt대천문 평균 병소 면적 ±SEM(mm2)-항-MAG 치료군 평균 병소 면적±SEM(mm2)-마우스 IgG1 치료군
3 mm *0.38±0.27 1.77±0.45
1 mm *5.82±1.65 9.627±1.14
-1 mm 8.98±2.58 12.07±1.57
-2 mm 7.28±1.92 10.04±1.87
-4 mm *5.57±1.06 10.38±1.39
-6 mm *1.36±0.51 4.43±1.95
-8 mm *0.27±0.27 1.93±0.56
* p<0.05- 쌍을 이루지 않은 편도식 학생의 T-테스트.
결론
래트에서 일시적인 중앙 대뇌 동맥 폐색후에, CSF내로 직접 또는 정맥내 경로를 통해 투여된 항-MAG 모노클로날 항체는, 2가지 경우에 모두 대조 치료군의 동물에 비해서 세포 사멸 영역을 감소시키고, 기능 회복을 향상시켰다. 본 연구에서 관찰된 신경보호 정도는 위와 같은 효과가 뉴런 스페어링(sparing)의 경우에는 나타나지 않는 것이기 때문에 신경돌기 성장에 기인한 것이 아님을 시사한다. MCAO 이후 24 시간 및 48 시간후에 관찰되는 기능 회복의 향상은 대조 처리군의 동물에 비해서 상기 항체에 의해 제공되는 신경보호 정도를 반영하는 것으로 생각된다. 그러나, 경시적으로 동물들은 더욱 더 향상된 결과를 나타내었으며, 이는 MAG 활성을 차단하는 것이 경시적으로 기능 회복을 증가시킬 수도 있음을 시사한다.
위와 같은 연구는 MAG의 작용을 차단하는 것이 뇌졸중 래트 모델에서 신경 보호 효과를 제공할 뿐만 아니라 기능 회복을 증진시킬 수 있으므로, 항-MAG 항체는 뇌졸중 발병후에 급성 신경보호 및/또는 기능 회복의 촉진을 위한 치료제를 제공한다는 증거를 제공한다. 정맥내 경로를 통해서 투여된 소량의 항체 및 그에 따른 헐청중 항체의 낮은 농도는 항체 제조에 대한 혈액 뇌 장벽의 구속에 기인하여 뇌내 항체 농도가 극히 낮다는 것을 시사한다. 그러나, 예외적으로 이 경우에도 여전히 신경 보호 효과 및 기능 회복의 향상 효과가 관찰되었다. 또한, 항-MAG 항체는 세포 또는 신경 섬유의 퇴화가 나타나는 다른 신경 질환, 예컨대 척수 손상, 외상성 뇌 손상, 말초 신경병, 알츠하이머병, 전두측두 치매증, 말초 신경병, 파킨슨병, 헌팅톤병 및 다발성 경화증을 치료하는데도 유용하다. 후술하는 실시예에서, 기재된 키메라 항체 및 인간화된 항체는 실시예 1의 항체의 CDR이다.
실시예 2- 키메라 항체
변형 항체는 제 1 종으로부터 유도된 불변부에 결합된 제 2 종으로부터 유도된 가변부를 포함하는 키메라 항체를 포함한다. 본 발명의 마우스-인간 키메라 항-AMG 면역글로불린 사슬의 실시예가 도 1, 도 2 및 도 3에 도시되어 있다. 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM, IgD 불변부를 사용한 마우스-인간 키메라 역시, 마우스 가변부와 비-인간 종으로부터 유도된 중쇄 또는 경쇄 불변부를 결합한 키메라와 같은 방식으로 생성할 수 있다.
도 1(서열 번호 27)은 쥐의 항-MAG 중쇄 가변부가 기능성 면역글로불린 분비 신호 서열과, 그리고 인간 IgG1 불변부의 변형된 형태와 결합되어 있는 키메라 면역글로불린 중쇄의 아미노산 서열을 나타낸 것으로서, Kabat 잔기 248과 250이 알라닌으로 변이되어 FcγRI 및 상보되는 단백질 C1q에 대한 결합의 유효 시약 작용을 불가능하게 한 것이다(Duncan, A.R. 및 Winter, G. Localization of the C1q binding site on antibodies by surface scanning. Nature 332, 738-740, 1988. Duncan, A.R., Woolf, J.M., Partridge, L.J., Burton, D.R. 및 Winter, G. Localisation of the binding site for human FcR1 on IgG. Nature 332, 563-564, 1988). 경우에 따라 이와 같은 변이를 만들어서 특정한 치료 효과를 달성하기 위해, 예를 들면 세균용해 유효 시약 메카니즘을 활성화시키는 일 없이 항원의 작용에 결합하여 차단시키는 효과를 달성하기 위해 변형 항체의 특성을 요구에 따라 맞출 수 있다.
도 2(서열 번호 28)은 쥐의 항-MAG 경쇄 가변부가 기능성 면역글로불린 분비 신호 서열과, 그리고 인간 카파(kappa) 불변부와 결합되어 있는 키메라 면역글로불린 경쇄의 서열을 나타낸 것이다.
이와 유사하게, 항-MAG 가변부는 유효 시약 작용을 불가능하게 하는 변이가 없는 면역글로불린 불변부와 결합될 수 있다. 도 3(서열 번호 29)은 쥐의 항-MAG 중쇄 가변부가 기능성 면역글로불린 분비 신호 서열과, 그리고 인간 IgG1 불변부의 야생형과 결합되어 있는 키메라 면역글로불린 중쇄의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 1 내지 도 3에 나타낸 정보로부터, 당해 키메라 항체들을 암호화하는 cDNA 삽입부는 당업자에게 잘 알려진 표준 분자 생물학적 기법에 의해 제조할 수 있다. 간략히 말해서, 유전자 코드를 사용해서 소정의 아미노산을 암호화하는 뉴클레오타이드 코돈을 동정하여 키메라 단백질을 암호화하는 실질적인 cDNA 서열을 생성한다. cDNA 삽입물을 특정한 유기체에서 형질발현시키고자 하는 경우에는, 공지의 코돈 사용 경향에 따라서 특히 바람직한 코돈을 선택할 수 있다. 이어서, 바람직한 코돈을 나타내는 합성 올리고뉴클레오타이드를 중첩시키는 것을 포함한, 템플레이트의 PCR 증폭 방법을 사용해서 바람직한 뉴클레오타이드 서열을 합성한다. 또한, 결과로서 얻은 생성물을 PCR 또는 돌연변이에 의해 변형시켜서 제한 부위를 부착시킴으로써, 형질발현 또는 추가의 조작을 위해 적합한 플라스미드로의 클로닝을 용이하게 할 수 있다.
실시예 3- ELISA에서 래트 MAG에 결합하는 키메라 항체
CHO 세포의 일시적인 형질감염에 의해서 본 발명의 경쇄 및 중쇄 CDR을 함유하는 키메라 항-MAG 항체를 생성하였다. 이를 위해서, 트랜스패스트(transfast) 형질감염 시약(Promega; E2431)을 사용하여 제조 업자의 지침에 따라서 형질감염을 수행하였다. 간단히 말해서, 약 106 개의 CHO 세포를 6-웰 배양 평판의 웰마다 평판 배양하였다. 다음날, 적절한 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 포유류 형질발현 벡터 DNA를 배지(Optimem1과 Glutamax; Gibco #51985-026)에서 1:1 비율(총 DNA 5㎍)로 혼합하였다. 트랜스패스트 형질감염 시약을 첨가하고, 용액을 융합성 세포층을 가진 웰에 옮겼다. 세포 배양기에서 37℃하에 1 시간 경과후, DNA/트랜스패스트 혼합물위에 Optimem 배지 2 ml를 피복하고, 배양기에 48-72 시간동안 방치하였다. 상청액을 수득해서 원심분리에 의해 정제하고, 0.2㎛ 필터에 통과시켰다. CHO 세포 배양 상청액중의 항체 농도를 ELISA에 의해 측정한 결과 약 0.5 ㎍/ml인 것으로 추정되었다. MAG 결합에 대해서는, 시판되는 래트MAG-Fc를 사용하였다. 인간 Fc와의 융합에 기인하여, 항-인간 IgG 2차 항체를 사용한 경우에 결합된 키메라 항체는 검출할 수 없었다. 그 대신에, 항-인간 카파 경쇄 특이성 항체를 사용하였다. 도 4는 상기 키메라 항체가 1/64의 희석율하에서도 MAG에 결합한다는 사실을 입증한다. 관련이 없는 모방 형질감염 세포로부터 얻은 인간화된 항체와 배양 상청액은 위와 같은 분석에서 어떠한 신호도 발생하지 않았다.
절차:
ELISA 미소역가 평판(Nunc Maxisorp)을 PBS중의 래트 MAG-Fc 융합 단백질(R&D 시스템즈; 538-MG) 1 ㎍/ml로 4℃하에 밤새 피복하였다. 평판을 PBS로 2회 세척한 후에, 실온에서 1 시간동안 PBS/BSA(1% w/v)로 차단하였다. 일시적으로 형질감염된 CHO 세포로부터 얻은 배양 상청액을 0.2 ㎛ 필터에 통과시키고, 순수한 상태의 상청액으로부터 희석율 1/64에 이르기까지 PBS/BSA중에서 순차적으로 희석시켰다. 샘플 희석액을 실온에서 1 시간동안 방치하였다. 이어서, 평판을 PBS/Tween 20(0.1% v/v)로 3회 세척하였다. 검출 항체는 PBS/BSA중에 희석율 1/2000으로 희석된 염소 항-인간 카파 경쇄 특이성 퍼옥시다제 접합체(Sigma A-7164)이었다. 검출 항체를 1 시간동안 실온에서 항온 처리하고, 평판을 전술한 바와 같이 세척하였다. 기질 용액(Sigma Fast OPD P-9187)을 첨가하고 적절한 발색이 검출될 때까지 항온 처리한 후에, 3M H2SO4를 사용하여 분석을 종료하였다. 발색은 490 nm에서 판독하였다.
실시예 4- 인간화된 항체
변형 항체는 인간 불변부에 결합된 인간화된 가변부로 이루어진 인간화된 항체를 포함한다. 본 발명의 인간화된 항-MAG 면역글로불린 사슬의 예가 도 5에 도시도어 있다. 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM, IgD 불변부를 사용한 인간화된 항체 역시 생성할 수 있다.
도 5(서열 번호 30)은 인간화된 항-MAG 중쇄 가변부가 기능성 면역글로불린 분비 신호 서열과, 그리고 인간 IgG1 불변부의 변형된 형태와 결합되어 있는 인간화된 면역글로불린 중쇄의 아미노산 서열의 일례를 나타낸 것으로서, Kabat 잔기 248과 250이 알라닌으로 변이되어 FcγRI 및 상보되는 단백질 C1q에 대한 결합의 유효 시약 작용을 불가능하게 한 것이다(Duncan, A.R. 및 Winter, G. Localization of the C1q binding site on antibodies by surface scanning. Nature 332, 738-740, 1988. Duncan, A.R., Woolf, J.M., Partridge, L.J., Burton, D.R. 및 Winter, G. Localisation of the binding site for human FcR1 on IgG. Nature 332, 563-564, 1988). 경우에 따라 이와 같은 변이를 만들어서 특정한 치료 효과를 달성하기 위해, 예를 들면 세균용해 유효 시약 메카니즘을 활성화시키는 일 없이 항원의 작용에 결합하여 차단시키는 효과를 달성하기 위해 변형 항체의 특성을 요구에 따라 맞출 수 있다.
도 5(서열 번호 31)은 인간화된 항-MAG 경쇄 가변부가 기능성 면역글로불린 분시 신호 서열과, 그리고 인간 카파(kappa) 불변부와 결합되어 있는 인간화된 면역글로불린 경쇄의 서열의 일례를 나타낸 것이다.
이와 유사하게, 항-MAG 가변부는 유효 시약 작용을 불가능하게 하는 변이가 없는 면역글로불린 불변부와 결합될 수 있다. 도 5(서열 번호 32)은 인간화된 항-MAG 중쇄 가변부가 기능성 면역글로불린 분비 신호 서열과, 그리고 인간 IgG1 불변부의 야생형과 결합되어 있는 인간화된 면역글로불린 중쇄의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 5에 나타낸 정보로부터, 당해 인간화 항체들을 암호화하는 cDNA 삽입부는 당업자에게 잘 알려진 표준 분자 생물학적 기법에 의해 제조할 수 있다. 간략히 말해서, 유전자 코드를 사용해서 소정의 아미노산을 암호화하는 뉴클레오타이드 코돈을 동정하여 키메라 단백질을 암호화하는 실질적인 cDNA 서열을 생성한다. cDNA 삽입물을 특정한 유기체에서 형질발현시키고자 하는 경우에는, 공지의 코돈 사용 경향에 따라서 특히 바람직한 코돈을 선택할 수 있다. 이어서, 바람직한 코돈을 나타내는 합성 올리고뉴클레오타이드를 중첩시키는 것을 포함한, 템플레이트의 PCR 증폭 방법을 사용해서 바람직한 뉴클레오타이드 서열을 합성한다. 또한, 결과로서 얻은 생성물을 PCR 또는 돌연변이에 의해 변형시켜서 제한 부위를 부착시킴으로써, 형질발현 또는 추가의 조작을 위해 적합한 플라스미드로의 클로닝을 용이하게 할 수 있다.
실시예 5: ELISA에서 래트 및 인간 MAG에 결합하는 인간화된 항-MAG
1) 9개의 중쇄 및 경쇄 조합에 대한 표준화된 양의 배양 상청액의 래트 MAG-Fc 융합 단백질에 대한 직접 결합 ELISA
CHO 세포의 일시적인 형질감염에 의해서 본 발명의 경쇄 및 중쇄 CDR을 함유하는 인간화된 항-MAG 항체를 생성하였다. 이를 위해서, 트랜스패스트(transfast) 형질감염 시약(Promega; E2431)을 사용하여 제조 업자의 지침에 따라서 형질감염을 수행하였다. 간단히 말해서, 약 106 개의 CHO 세포를 6-웰 배양 평판의 웰마다 평판 배양하였다. 다음날, 적절한 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 포유류 형질발현 벡터 DNA를 배지(Optimem1과 Glutamax; Gibco #51985-026)에서 1:1 비율(총 DNA 5㎍)로 혼합하였다. 트랜스패스트 형질감염 시약을 첨가하고, 용액을 융합성 세포층을 가진 웰에 옮겼다. 세포 배양기에서 37℃하에 1 시간 경과후, DNA/트랜스패스트 혼합물위에 Optimem 배지 2 ml를 피복하고, 배양기에 48-72 시간동안 방치하였다. 상청액을 수득해서 원심분리에 의해 정제하고, 0.2㎛ 필터에 통과시켰다. 9개의 중쇄 및 경쇄 가변부의 조합을 하기 표 4에 기재된 바와 같은 서열로부터 제조하였으며, IgG1 중쇄 불변부는 서열 번호에 따른 함수로서 선택하였다.
서열 번호(V-영역) 설명 다른 명칭
13 인간화된 Vh BVh1
14 인간화된 Vh BVh2
15 인간화된 Vh BVh3
16 인간화된 VI CVI1
17 인간화된 VI CVI2
18 인간화된 VI CVI3
19 인간화된 VI CVI4
항체 농도는 ELISA에 의해 측정하였으며, 분석에 사용된 상청액의 양은 초기 농도 250 또는 500 ng/ml(배양 상청액의 농도에 좌우됨)로 표준화시켰다. 항원으로서는, 시판되는 래트MAG-Fc(R&D 시스템즈; 538-MG)를 사용하였다. 이러한 항원과 인간 Fc의 융합에 기인하여, 결합된 키메라 항체는 일반적인 항-인간 IgG 2차 항체를 사용하여서는 검출될 수 없다. 대신에, 항-인간 카파 경쇄 특이성 항체를 사용하였다. 도 6은 본 연구에서 조사한 9종의 인간화된 항체가 모두 약 4 ng/ml 이하에서 매우 유사한 결합 곡선을 따라 래트 MAG에 결합한다는 것을 보여준다. 비교용으로 사용된 키메라 항체는 본 연구에서 조사한 인간화된 항체 군 내부에 포함되는 결합 특성을 나타내었다. 절대적인 것은 아니지만, 이러한 결과는 본 연구에서 조사한 인간화된 항체의 친화도가 비교용으로 사용된 비-인간화된 키메라 항체의 친화도 범위내에서 매우 유사하다는 것을 시사한다.
절차:
96-웰 Nunc Maxisorp 평판을 PBS중의 래트 MAG-Fc 융합 단백질(1 ㎍/ml; R&D 시스템즈; 제품 번호 538-MG)로 4℃하에 밤새 피복하였다. 평판을 Tween 20을 함유한 PBS(0.1% v/v; PBST)로 2회 세척한 후에, 실온에서 1 시간동안 BSA(1% w/v)를 함유하는 PBS로 차단하였다. 다양한 양의 배양 상청액을 차단 완충액중에 순차적으로 희석시켜서 약 500 또는 250 ng/ml의 초기 농도로 차단된 웰에 첨가하였다. 상청액의 항체 농도는 각각의 배양 상청액에 존재하는 인간화된 항체의 양을 측정하는 별도의 분석법에 근거한 것이다. 키메라 마우스-인간(비-인간화된) 항체도 비교용으로 포함시켰다. 항체 샘플을 실온에서 1시간동안 항온 처리하고 평판 배양한 후에, PBST로 3회 세척하였다. 2차 항체 (염소 항-인간 카파 경쇄 특이성 퍼옥시다제 접합체(Sigma A-7164))를 첨가하고, 차단 완충액중에 1/5000으로 희석시킨 후에, 실온에서 1시간동안 항온 처리하였다. 웰을 전술한 바와 같이 3회 세척하고, 기질(제조업자의 지침에 따라 용해시킨 OPD 정제, 시그마 P-9187)을 첨가하여 결합을 분석하였다. 발색을 모니터하고, 3M H2SO4를 사용하여 분석을 종료하였다. 발색은 490 nm에서 판독하였다.
2) 2종의 정제된 인간화된 항-MAG 항체 중쇄 조합의 래트 MAG-Fc 융합 단백질에 대한 직접 결합 ELISA 분석
중쇄와 경쇄 가변부 조합 BVh1/CVI1 및 BVh3/CVI3(도 5) 및 돌연변이된 IgG1 불변부, 예를 들면 서열 번호 30(BVh1/CVI1 돌연변이된 IgG1, 당업자라면 BVH3/CVI3 등가물에 대한 서열을 용이하게 유도할 수 있을 것이다)으로 이루어진 2종의 인간화된 항체를, 실시예 3에 기술된 일시적인 형질감염의 대규모화된 실시예에 의해 제조하고 단백질 A 친화 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 정제된 항체 재를 PBS에 대해 투석하고, 농도를 OD280 해독법에 의해서 측정하였다. 항체 농도는 5000 ng/ml로 조정하였으며, 래트 MAG-Fc 결합 ELISA에 일련의 희석액으로 사용하였다. 도 7은 정제된 항체가 래트 MAG-Fc에 결합하며, 본 연구에서 시험한 중쇄 및 경쇄 가변부의 조합이 모두 매우 유사하다는 것을 보여준다.
방법:
96-웰 Nunc Maxisorp 평판을 PBS중의 래트 MAG-Fc 융합 단백질(2.5 ㎍/ml; R&D 시스템즈; 제품 번호 538-MG)로 4℃하에 밤새 피복하였다. 평판을 Tween 20을 함유한 PBS(0.1% v/v; PBST)로 2회 세척한 후에, 실온에서 1 시간동안 BSA(1% w/v)를 함유하는 PBS로 차단하였다. 정제된 인간화된 항체를 차단 완충액중에 5 ㎍/ml의 초기 농도로 조정한후에 순차적으로 희석시켰다. 항체 샘플을 실온에서 1시간동안 항온 처리하고 평판 배양한 후에, PBST로 3회 세척하였다. 2차 항체 (염소 항-인간 카파 경쇄 특이성 퍼옥시다제 접합체(Sigma A-7164))를 첨가하고, 차단 완충액중에 1/5000으로 희석시킨 후에, 실온에서 1시간동안 항온 처리하였다. 웰을 전술한 바와 같이 3회 세척하고, 기질(제조업자의 지침에 따라 용해시킨 OPD 정제, 시그마 P-9187)을 첨가하여 결합을 분석하였다. 발색을 모니터하고, 3M H2SO4를 사용하여 분석을 종료하였다. 발색은 490 nm에서 판독하였다.
결과:
골격부 변이가 없거나 다소 있는 정제된 2종의 인간화된 항체 모두 래트 MAG에 대해 매우 유사한 결합을 나타내었다. 이러한 결과는 도 7에서 확인할 수 있다.
3) 2종의 인간화된 중쇄 및 경쇄 조합에 대한 배양 상청액의 표준화된 양을 사용한 경우 CHO 세포에서 형질발현된 인간 MAG에 대한 결합
실시예 5 2)에 기재된 것과 동일한 인간화된 가변부 중쇄 및 경쇄 조합을 CHO 세포 표면상에서 형질발현된 인간 MAG에 대한 배양 상청액과 같은 방식으로 테스트하였다. 각 항체에 사용된 배양 상청액의 양은 ELISA에 의해 측정한 항체 농도에 근거하여 표준화하였다. 이를 위해서, 96-웰 평판(Nunc Maxisorp)을 염소 항-인간 IgG(감마) 사슬(시그마 I-3382; 중탄산염 완충수중 pH 9.6; 2 ㎍/ml)로 4℃에서 밤새 피복하였다. 다음날, 평판을 세척 완충액(PBST)으로 2회 세척하고, 적어도 75㎕의 차단 완충수(BSA 1% w/v를 함유하는 PBS)를 첨가하여 차단시켰다. 항체 샘플 용액을 차단 완충액중에 2벌씩 순차적으로 희석하였다(순수한 상태에서 또는 1/2에서 희석 시작). Ab 표준물질은 특이성과 무관하고 기지의 농도를 갖는 정제된 인간화된 IgG1 항체였다.
또한, 표준 용액을 500 ng/ml에서 시작하여 평판을 교차해서 순차적으로 희석시켰다. 모든 항체 용액을 실온에서 1시간동안 항온 처리하였다. 전술한 바와 같이, 평판을 3회 세척한 다음에, 염소 항-인간 경쇄(카파) 특이성 퍼옥시다제 (유리된 것과 결합된 것) 접합체(Sigma A-7164))를 첨가하고, 실온에서 1 시간동안 차단 완충액중에 희석시켰다. 평판을 전술한 바와 같이 다시 3회 세척하고, 기질(제조업자의 지침에 따라 용해시킨 OPD 정제, 시그마 P-9187)을 첨가하여 결합을 분석하였다. 발색을 모니터하고, 3M H2SO4 25㎕를 사용하여 분석을 종료하였다. 발색은 490 nm에서 판독하였다.
도 8은 본 연구에서 시험한 2종의 항체가 인간 MAG를 인식하고 있으며 그들의 결합 특성면에서 매우 유사하다는 것을 보여준다. CHO/-는 MAG 형질발현이 없는 CHO 세포의 음성 대조군이다.
Eu 세포에 근거한 ELISA에 대한 방법
96-웰 평판(Costar 3595)에 웰당 100 ㎕의 세포 현탁액을 충전시켰다(1, 2, 3 또는 4일째에 분석을 수행하기 위해 추천할만한 세포수는 하기 표 5에 기재하였다.
일수 세포수/ml
1 3×105
2 1×105
3 5×104
4 1×104
배지를 제거하고 평판을 실온에서 1시간동안 FCS(10%), BSA(1%), NaN3(1%; 차단 완충액)을 함유하는 DMEM/F12(Sigma D6421)로 차단시켰다. 이어서, 차단 용액을 제거하고, 샘플을 첨가하였다(차단 완충액 50㎕중의 용액/웰). 샘플을 4℃에서 1 시간동안 항온 처리하였다. 이어서, 스카트론(Skatron) 평판 세척기를 사용해서 평판을 PBS로 3회 세척하였다. 세척후에, 세포를 0.5% 파라포름알데히드(PBS중 희석)를 사용해서 4℃에서 20분동안 고정시키고, 전술한 바와 같이 재차 세척하였다. 50 ㎕/웰의 비율로 유로퓸-접합된 2차 항체를 유로퓸 완충액(50 mM Tris 염기, 150 mM NaCl, 0.5% BSA, 0.1 g/l, Tween 20, 7.86 mg/l DTPA, pH 7.3)에 희석시켜서 첨가한 다음에, 4℃에서 1 시간동안 항온 처리하였다. 전술한 바와 같이 평판을 세척하고, 웰당 200 ㎕의 Delphia 증강 용액을 첨가하였다. 용액을 실온에서 5-10분동안 항온 처리하였다. 웰을 빅터(Victor)상에서 24시간 후에 판독하였다.
4) 2종의 정제된 인간화된 항체와 비-인간화된 마우스 모노클로날 항체의 래트 MAG-Fc 융합 단백질에 대한 결합에 관한 경합적 ELISA 분석
방법:
96-웰 Nunc Maxisorp 평판을 PBS중의 래트 MAG-Fc 융합 단백질(2.5 ㎍/ml; R&D 시스템즈; 제품 번호 538-MG)로 4℃하에 밤새 피복하였다. 평판을 Tween 20을 함유한 PBS(0.1% v/v; PBST)로 2회 세척한 후에, 실온에서 1 시간동안 BSA(1% w/v)를 함유하는 PBS로 차단하였다. 정제된 인간화된 항체를 차단 완충액중에 200 ng/ml의 초기 농도로 조정한 후에 6000 내지 0 ng/ml 범위의 차단 완충액중에 혼합된 경합 분자와 동일한 부피로 혼합하였다. 경합 분자는, 동일한 농도로 존재하는 모체 마우스 모노클로날 항체(항-MAG) 또는 관련이 없는 모노클로날 항체(INN1)이었다(BVh1/CVI1 단독). 항체/경합 분자 용액을 실온에서 1 시간동안 항온 처리한 후에, PBST로 3회 세척하였다. 2차 항체 (염소 항-인간 카파 경쇄 특이성 퍼옥시다제 접합체(Sigma A-7164))를 첨가하고, 차단 완충액중에 1/5000으로 희석시킨 후에, 실온에서 1시간동안 항온 처리하였다. 웰을 전술한 바와 같이 3회 세척하고, 기질(제조업자의 지침에 따라 용해시킨 OPD 정제, 시그마 P-9187)을 첨가하여 결합을 분석하였다. 발색은 490 nm에서 판독하였다.
결과:
정제된 항체 제제는 원래의 마우스 모노클로날 항체와 동등하게 경합하였지만, 특이성이 무관한 마우스 모노클로날에 대해서는 그렇지 않았다 - 도 9 참조. 이것은 본 실시예에서 테스트한 원래의 마우스 모노클로날 항체와 인간화된 항체가 동일한 에피토프를 인식하고 래트 MAG에 대해 매우 유사한 친화도를 갖는다는 것을 시사한다.
SEQUENCE LISTING <110> Glaxo Group Limited Ellis, Jonathan H Germaschewski, Volker <120> Antibodies <130> SAL/PG4912 <140> PCT/EP03/08749 <141> 2003-07-17 <150> GB 0218230.1 <151> 2002-08-06 <150> GB 0218232.7 <151> 2002-08-06 <150> GB 0218234.3 <151> 2002-08-06 <150> GB 0218229.3 <151> 2002-08-06 <160> 32 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Light chain CDR <400> 1 Lys Ser Ser His Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Light chain CDR <400> 2 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Light chain CDR <400> 3 His Gln Tyr Leu Ser Ser Leu Thr 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Heavy chain CDR <400> 4 Asn Tyr Gly Met Asn 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Heavy chain CDR <400> 5 Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp 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CDRH3 <400> 12 aaccccatca actactacgg catcaactac gagggctacg tgatggacta c 51 <210> 13 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Humanised antibody heavy chain variable region <400> 13 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Pro Ile Asn Tyr Tyr Gly Ile Asn Tyr Glu Gly Tyr Val 100 105 110 Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 14 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Humanised antibody heavy chain variable region <400> 14 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser 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Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Pro Ile Asn Tyr Tyr Gly Ile Asn Tyr Glu Gly Tyr Val 100 105 110 Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 16 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Humanised antibody light chain variable region <400> 16 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser His Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln 85 90 95 Tyr Leu Ser Ser Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val 115 <210> 17 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Humanised antibody light chain variable region <400> 17 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser His Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ile Asn Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln 85 90 95 Tyr Leu Ser Ser Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val 115 <210> 18 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Humanised antibody light chain variable region <400> 18 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser His Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 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tgggtctgag ttgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcact aactacggca tgaactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaacacct acaccggcga gcccacctac 180 gccgacgact tcaccggccg gtttgtcttc tccttggaca cctctgtcag cacggcatat 240 ctgcagatca gcagcctaaa ggctgaggac actgccgtgt attactgtgc gagaaacccc 300 atcaactact acggcatcaa ctacgagggc tacgtgatgg actactgggg ccagggcaca 360 ctagtcacag tctcctca 378 <210> 21 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Polynucleotide sequence encoding the amino acid sequence SEQ ID N O: 14 <400> 21 caggtgcagc tggtgcaatc tgggtctgag ttgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcact aactacggca tgaactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaacacct acaccggcga gcccacctac 180 gccgacgact tcaccggccg gtttgtcttc tccttggaca cctctgtcag cacggcatat 240 ctgcagatca gcagcctaaa ggctgaggac actgccgtgt atttctgtgc gagaaacccc 300 atcaactact acggcatcaa ctacgagggc tacgtgatgg actactgggg ccagggcaca 360 ctagtcacag tctcctca 378 <210> 22 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Polynucleotide sequence encoding the amino acid sequence SEQ ID N O: 15 <400> 22 caggtgcagc tggtgcaatc tgggtctgag ttgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcact aactacggca tgaactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaacacct acaccggcga gcccacctac 180 gccgacgact tcaccggccg gtttgtcttc tccttggaca cctctgtcag cacggcatat 240 ctgcagatca gcagcctaaa ggctgaggac actgccacct atttctgtgc gagaaacccc 300 atcaactact acggcatcaa ctacgagggc tacgtgatgg actactgggg ccagggcaca 360 ctagtcacag tctcctca 378 <210> 23 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Polynucleotide sequence encoding the amino acid sequence SEQ ID N O: 16 <400> 23 gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca agagcagcca cagcgtgctg tacagcagca accagaagaa ctacctggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg 180 gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcaccagta cctgagcagc 300 ctgacctttg gccaggggac caagctggag atcaaacgta cggtg 345 <210> 24 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Polynucleotide sequence encoding the amino acid sequence SEQ ID N O: 17 <400> 24 gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca agagcagcca cagcgtgctg tacagcagca accagaagaa ctacctggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg 180 gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 atcatcaacc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcaccagta cctgagcagc 300 ctgacctttg gccaggggac caagctggag atcaaacgta cggtg 345 <210> 25 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Polynucleotide sequence encoding the amino acid sequence SEQ ID N O: 18 <400> 25 gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca agagcagcca cagcgtgctg tacagcagca accagaagaa ctacctggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg 180 gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagcc tgcacaccga agatgtggca gtttattact gtcaccagta cctgagcagc 300 ctgacctttg gccaggggac caagctggag atcaaacgta cggtg 345 <210> 26 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Polynucleotide sequence encoding the amino acid sequence SEQ ID N O: 19 <400> 26 gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca agagcagcca cagcgtgctg tacagcagca accagaagaa ctacctggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg 180 gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 atcatcaacc tgcacaccga agatgtggca gtttattact gtcaccagta cctgagcagc 300 ctgacctttg gccaggggac caagctggag atcaaacgta cggtg 345 <210> 27 <211> 475 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Mouse/human chimeric anti-MAG antibody heavy chain <400> 27 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Glu Thr Asn Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Asp Phe Thr Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Asn Pro Ile Asn Tyr Tyr Gly Ile Asn Tyr Glu 115 120 125 Gly Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 130 135 140 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 145 150 155 160 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 165 170 175 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 180 185 190 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 195 200 205 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 210 215 220 Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 225 230 235 240 Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 245 250 255 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 260 265 270 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 275 280 285 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 290 295 300 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 305 310 315 320 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 325 330 335 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 340 345 350 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 355 360 365 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 370 375 380 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 385 390 395 400 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 405 410 415 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 420 425 430 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 435 440 445 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 450 455 460 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 475 <210> 28 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Mouse/human chimeric anti-MAG antibody light chain <400> 28 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Asn Ile Met Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val 20 25 30 Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser His Ser Val 35 40 45 Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Thr Ile Ile Asn Val His Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys His Gln Tyr Leu Ser Ser Leu Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 130 135 140 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 145 150 155 160 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 165 170 175 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 180 185 190 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 195 200 205 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 210 215 220 Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 29 <211> 475 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Mouse/human chimeric anti-MAG antibody heavy chain <400> 29 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Glu Thr Asn Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Asp Phe Thr Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Asn Pro Ile Asn Tyr Tyr Gly Ile Asn Tyr Glu 115 120 125 Gly Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 130 135 140 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 145 150 155 160 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 165 170 175 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 180 185 190 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 195 200 205 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 210 215 220 Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 225 230 235 240 Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 245 250 255 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 260 265 270 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 275 280 285 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 290 295 300 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 305 310 315 320 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 325 330 335 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 340 345 350 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 355 360 365 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 370 375 380 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 385 390 395 400 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 405 410 415 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 420 425 430 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 435 440 445 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 450 455 460 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 475 <210> 30 <211> 475 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Humanised anti-MAG antibody <400> 30 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Asp Phe Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Pro Ile Asn Tyr Tyr Gly Ile Asn Tyr Glu 115 120 125 Gly Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 130 135 140 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 145 150 155 160 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 165 170 175 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 180 185 190 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 195 200 205 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 210 215 220 Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 225 230 235 240 Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 245 250 255 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 260 265 270 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 275 280 285 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 290 295 300 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 305 310 315 320 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 325 330 335 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 340 345 350 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 355 360 365 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 370 375 380 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 385 390 395 400 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 405 410 415 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 420 425 430 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 435 440 445 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 450 455 460 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 475 <210> 31 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Humanised anti-MAG antibody <400> 31 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val 20 25 30 Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser His Ser Val 35 40 45 Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys His Gln Tyr Leu Ser Ser Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 130 135 140 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 145 150 155 160 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 165 170 175 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 180 185 190 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 195 200 205 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 210 215 220 Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 32 <211> 475 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Humanised anti-MAG antibody <400> 32 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Asp Phe Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Pro Ile Asn Tyr Tyr Gly Ile Asn Tyr Glu 115 120 125 Gly Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 130 135 140 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 145 150 155 160 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 165 170 175 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 180 185 190 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 195 200 205 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 210 215 220 Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 225 230 235 240 Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 245 250 255 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 260 265 270 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 275 280 285 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 290 295 300 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 305 310 315 320 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 325 330 335 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 340 345 350 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 355 360 365 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 370 375 380 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 385 390 395 400 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 405 410 415 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 420 425 430 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 435 440 445 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 450 455 460 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 475

Claims (26)

  1. 수초 관련 당단백질(MAG)에 결합하여 MAG를 중화시키는 변형 항체 또는 이의 기능성 단편으로서, 다음과 같은 상보성 결정 영역(CDR)중 하나 이상을 포함하는 변형 항체 또는 이의 기능성 단편:
    경쇄 CDR
    CDR Kabat에 따름 L1 KSSHSVLYSSNQKNYLA L2 WASTRES L3 HQYLSSLT
    중쇄 CDR
    CDR Kabat에 따름 H1 NYGMN H2 WINTYTGEPTYADDFTG H3 NPINYYGINYEGYVMDY
  2. CDRH1, CDRH2 및 CDRH3중에서 선택된 하나 이상의 CDR을 포함하는 중쇄 가변부, 및/또는 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3중에서 선택된 하나 이상의 CDR을 포함하는 경쇄 가변부를 포함하는 변형 항체 또는 이의 기능성 단편.
  3. 과변이부 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3을 서열내에 포함하는 중쇄 가변부(VH); 및/또는 과변이부 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 서열내에 포함하는 경쇄 가변부(VL)를 포함하는 변형 항-MAG 항체 또는 이의 기능성 단편.
  4. 제 3항에 있어서, 모노클로날 항체인 항-MAG 항체.
  5. 제 4항에 있어서, 인간화된 항-MAG 항체.
  6. 제 5항에 있어서, 하기 아미노산 서열 번호 13, 14 및 15중 어느 하나를 포함하는 중쇄 가변부를 포함하는 항-MAG 항체 또는 이의 기능성 단편:
  7. 제 6항에 있어서, 하기 아미노산 서열 번호 16, 17, 18 또는 19를 포함하는 경쇄 가변부를 추가로 포함하는 항-MAG 항체 또는 이의 기능성 단편:
  8. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 서열 번호 13, 14 또는 15를 포함하는 중쇄 가변 단편과 인간 중쇄의 불변부 또는 이의 단편; 및 서열 번호 16, 17, 18 또는 19를 포함하는 경쇄 가변 단편 및 인간 경쇄의 불변부 또는 이의 단편을 포함하는항-MAG 항체.
  9. 제 1항 내지 제 9항중 어느 한 항에 있어서,
    서열 번호 13을 포함하는 중쇄 가변부와 서열 번호 16을 포함하는 경쇄 가변부;
    서열 번호 13을 포함하는 중쇄 가변부와 서열 번호 17을 포함하는 경쇄 가변부;
    서열 번호 13을 포함하는 중쇄 가변부와 서열 번호 18을 포함하는 경쇄 가변부;
    서열 번호 13을 포함하는 중쇄 가변부와 서열 번호 19를 포함하는 경쇄 가변부;
    서열 번호 14를 포함하는 중쇄 가변부와 서열 번호 16을 포함하는 경쇄 가변부;
    서열 번호 14를 포함하는 중쇄 가변부와 서열 번호 17을 포함하는 경쇄 가변부;
    서열 번호 14를 포함하는 중쇄 가변부와 서열 번호 18을 포함하는 경쇄 가변부;
    서열 번호 14를 포함하는 중쇄 가변부와 서열 번호 19를 포함하는 경쇄 가변부;
    서열 번호 15를 포함하는 중쇄 가변부와 서열 번호 16을 포함하는 경쇄 가변부;
    서열 번호 15를 포함하는 중쇄 가변부와 서열 번호 17을 포함하는 경쇄 가변부;
    서열 번호 15를 포함하는 중쇄 가변부와 서열 번호 18을 포함하는 경쇄 가변부; 및
    서열 번호 15를 포함하는 중쇄 가변부와 서열 번호 19를 포함하는 경쇄 가변부를 포함하는 항체로부터 선택된 인간화된 항체.
  10. 서열 번호 13을 포함하는 중쇄 가변부를 암호화하는 하기 폴리뉴클레오타이드:
  11. 아미노산 서열 번호 14를 암호화하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열:
  12. 아미노산 서열 번호 15를 암호화하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열:
  13. 아미노산 서열 번호 16을 암호화하는 하기 폴리뉴클레오타이드:
  14. 아미노산 서열 번호 17을 암호화하는 하기 폴리뉴클레오타이드:
  15. 아미노산 서열 번호 18을 암호화하는 하기 폴리뉴클레오타이드:
  16. 아미노산 서열 번호 19를 암호화하는 하기 폴리뉴클레오타이드:
  17. 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께 제 1항 내지 제 8항중 어느 한 항의 변형 항-AMG 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 약제 조성물.
  18. 뇌졸중 및 다른 신경 질환/장애의 치료 또는 예방이 필요한 인간에게 변형 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 제 1항 내지 제 8항중 어느 한 항에 따른 항-MAG 항체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 인간의 뇌졸중 및 다른 신경 질환/장애를 치료 또는 예방하는 방법.
  19. 뇌졸중 및 다른 신경 질환/장애의 치료 또는 예방용 약제를 제조하는데 있어서, 변형 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 제 1항 내지 제 8항중 어느 한 항에 따른 항-MAG 항체의 용도.
  20. 뇌졸중 및 다른 신경 질환/장애에 걸려있거나, 발병할 위험이 있는 환자에서 신경 퇴화를 억제하고/하거나 기능 회복을 촉진하는 방법으로서, 상기 억제 또는 촉진이 필요한 환자에게 필요한 변형 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 제 1항 내지 제 6항중 어느 한 항에 따른 항-MAG 항체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  21. 뇌졸중 및 다른 신경 질환/장애에 걸려있거나, 발병할 위험이 있는 환자에서 신경 퇴화를 억제하고/하거나 기능 회복을 촉진하기 위한 약제를 제조하는데 있어서, 변형 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 제 1항 내지 제 8항중 어느 한 항에 따른 항-MAG 항체의 용도.
  22. 인간에게 치료적 유효량의 항-MAG 항체를 비경구 투여하는 단계를 포함하여 인간의 뇌졸중 또는 다른 신경 질환/장애를 치료 또는 예방하는 방법.
  23. 제 22항에 있어서, 항-MAG 항체가 정맥내로 투여되는 방법.
  24. 제 18항, 제 20항 또는 제 24항에 있어서, 다른 신경 질환/장애가 외상성 뇌 손상, 척수 손상, 알츠하이머병, 전두측두 치매증(tauopathies), 말초 신경병, 파킨슨병, 헌팅톤병 및 다발성 경화증으로 이루어진 군중에서 선택된 방법.
  25. 인간 신경돌기를 제 1항 내지 제 8항중 어느 한 항의 항-MAG 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는 신경돌기의 급성장을 촉진하는 방법.
  26. 제 25항에 있어서, 시험관내에서 수행되는 방법.
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