CN109481673A - 促进脑损伤神经修复的组合物及其应用与评价方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种促进脑损伤神经修复的组合物及其应用与评价方法。所述促进脑损伤神经修复的组合物包括EGFR抗体药物和神经干细胞。本发明还公开了该组合物在制备修复脑损伤的产品中的应用。所述产品至少具有缓解脑损伤后的髓鞘蛋白分子的抑制作用，促进神经干细胞向神经元细胞分化，以及促进神经轴突生长，最终达到修复脑损伤的功能。通过体外模拟实验，发现本发明提供的促进脑损伤神经修复的组合物可以缓解脑损伤后的髓鞘蛋白分子的抑制作用，通过EGFR抗体药物改善损伤微环境，具有良好的促进神经干细胞向神经元细胞分化的能力，以及促进神经轴突生长，最终促进了脑损伤的恢复。

Description

促进脑损伤神经修复的组合物及其应用与评价方法
技术领域
本发明具体涉及一种促进脑损伤神经修复的组合物，特别涉及一种用于促进颅脑损伤神经修复的组合物及其在脑损伤修复中的应用与评价方法，属于神经干细胞技术领域。
背景技术
脑损伤包括外伤性颅脑损伤和脑卒中等，是临床上常见的疾病，具有高发病率、高死亡率、高致残率等，但没有有效的治疗手段来改善脑损伤神经功能障碍。
干细胞替代疗法作为新型疗法在再生医学领域具有很好的应用前景。神经干细胞具有自我更新以及向神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞多向分化的潜能。但是由于移植到损伤部位的神经干细胞向神经元细胞分化较少，导致修复效果不理想。其中中枢神经神经后微环境恶化，存在大量的抑制分子，如髓鞘相关抑制分子，于是如何调节损伤微环境，调控神经干细胞在脑损伤部位的分化是关键问题。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种促进脑损伤神经修复的组合物及其在脑损伤修复中的应用与评价方法，以克服现有技术中的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种促进脑损伤神经修复的组合物在制备修复脑损伤的产品中的应用。其中，所述促进脑损伤神经修复的组合物包括EGFR(表皮生长因子受体)抗体药物和神经干细胞。
优选的，所述EGFR抗体药物包括西妥昔。
在一些实施例中，所述产品至少具有缓解脑损伤后的髓鞘蛋白分子的抑制作用以及促进神经干细胞向神经元细胞分化的功能。
在一些实施例中，所述产品至少具有缓解脑损伤后的髓鞘蛋白分子的抑制作用以及促进神经轴突生长的功能。
本发明实施例还提供了前述促进脑损伤神经修复的组合物，其包括EGFR抗体药物和神经干细胞。
本发明实施例还提供了一种修复脑损伤的功能产品，其包含前述的促进脑损伤神经修复的组合物。
本发明实施例还提供了一种促进脑损伤神经修复的组合物的评价方法，其包括：
构建体外模拟脑组织；
将促进脑损伤神经修复的组合物负载到所述体外模拟脑组织上，并在适合培养神经干细胞的环境中进行培养。
与现有技术相比，本发明提供的促进脑损伤神经修复的组合物包括神经干细胞和EGFR抗体药物，通过构建体外模拟脑组织，发现该组合物可缓解脑损伤后的髓鞘蛋白分子的抑制作用，通过EGFR抗体药物改善损伤微环境，具有良好的促进神经干细胞向神经元细胞分化的能力，以及促进神经轴突生长，最终促进了脑损伤的恢复。
附图说明
图1a为本发明一典型实施例提供的体外模拟脑组织的扫描电镜显微镜(SEM)照片以及体外模拟脑组织的总体形貌图；
图1b为本发明一典型实施例提供的体外模拟脑组织担载神经干细胞的SEM照片；
图2为本发明一典型实施例中髓鞘蛋白对体外模拟脑组织上培养的神经干细胞分化的影响中TUj-1和GFAP免疫荧光染色照片；
图3为本发明一典型实施例培养基中含有髓鞘蛋白的情况下，担载0.5μg、1μg、2μgEGFR抗体西妥昔的体外模拟脑组织培养神经干细胞7天后向神经元细胞分化的情况照片；
图4为本发明一典型实施例培养基中含有髓鞘蛋白的情况下，担载0.5μg、1μg、2μgEGFR抗体西妥昔的体外模拟脑组织培养神经干细胞7天后向星形胶质细胞分化的情况照片。
具体实施方式
髓鞘相关抑制分子信号通路中表皮生长因子受体(EGFR)的磷酸化具有重要作用。EGFR抗体可阻断其信号通路，促进神经再生和脊髓损伤修复，但是在脑损伤修复中的研究还未见报道。
鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，其主要涉及一种包括表皮生长因子受体(EGFR)抗体药物和神经干细胞的组合物。通过构建体外模拟脑组织，研究该组合物对神经干细胞的影响，发现该组合物可缓解脑损伤后的髓鞘蛋白分子的抑制作用以及促进神经干细胞向神经元细胞分化。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
本发明实施例的一个方面提供的促进脑损伤神经修复的组合物在制备修复脑损伤的产品中的应用。
在上述应用中，所述促进脑损伤神经修复的组合物包括EGFR抗体药物和神经干细胞。
作为优选实施方案之一，所述EGFR抗体药物包括西妥昔。
在上述应用中，所述产品至少具有缓解脑损伤后的髓鞘蛋白分子的抑制作用以及促进神经干细胞向神经元细胞分化的功能。
在上述应用中，所述产品至少具有缓解脑损伤后的髓鞘蛋白分子的抑制作用以及促进神经轴突生长的功能。
在上述应用中，所述产品至少具有修复脑损伤的功能。
本发明实施例的另一个方面提供了一种促进脑损伤神经修复的组合物，其包括表皮生长因子受体(EGFR)抗体药物和神经干细胞。
优选的，所述EGFR抗体药物包括西妥昔。
本发明实施例还提供了一种修复脑损伤的功能产品，其包含前述的促进脑损伤神经修复的组合物。
本发明实施例还提供了一种促进脑损伤神经修复的组合物的评价方法，其包括：
构建体外模拟脑组织；
将促进脑损伤神经修复的组合物负载到所述体外模拟脑组织上，并在适合培养神经干细胞的环境中进行培养。
进一步的，所述适合培养神经干细胞的环境还包含有髓鞘蛋白分子。
进一步的，所述体外模拟脑组织的构建方法包括：将胶原原材料溶解于0.2～1mol/L醋酸中并于4℃温度中静置过夜，混合均匀后加入2～10mol/L碱液中和，得到的均匀液体转移入截留分子量为3000～5000的透析袋中，用去离子水透析4～6天，透析期间每3～6h换一次去离子水，透析后的溶液放入直径为4～10mm的模具中，将模具处于-80℃过夜，冷冻干燥，得到体外模拟脑组织。
进一步的，所述体外模拟脑组织具有多孔结构，其中所含孔洞的平均孔径为50～150μm，孔隙率为85％～90％。
进一步的，所述的“将促进脑损伤神经修复的组合物负载到所述体外模拟脑组织上”包括：将EGFR抗体化学交联到体外模拟脑组织上，将神经干细胞种植到体外模拟脑组织中。
在上述应用中，所述体外模拟脑组织包括主要由复数个孔道结构有序排列组成的三维结构。
以下通过典型实施例并结合附图进一步详细说明本发明的技术方案。然而，所选的实施例仅用于说明本发明，而不限制本发明的范围。
1、体外模拟脑组织的构建
将胶原原材料溶解于0.2～1mol/L醋酸中并于4℃温度中静置过夜，混合均匀后加入2～10mol/L碱液中和，得到的均匀液体放入截留分子量为3000～5000的透析袋中，用去离子水透析4～6天，透析期间每3～6h换一次去离子水，透析后的溶液放入直径为4～10mm的模具中，将模具处于-80℃过夜，冷冻干燥，得到体外模拟脑组织。
2、大鼠端脑来源神经干细胞的分离培养
出生12小时内的SD大鼠乳鼠分离出端脑，剪碎，加胰酶替代物消化5～10分钟左右，用钝头粗口滴管轻轻吹打，直到组织团块消失，离心弃掉胰酶替代物，加入神经干细胞增殖培养基(含有20μg/mL EGF和20μg/mL bFGF)，转移到培养瓶中成球培养。
3、髓鞘蛋白的提取
提取成年大鼠端脑，通过非连续性蔗糖梯度离心法得到髓鞘蛋白。具体，将端脑剪碎，在0.3mol/L蔗糖溶液中匀浆，然后缓慢滴加到0.85mol/L蔗糖溶液上端。27000g高速离心1h，在0.3mol/L蔗糖溶液与0.85mol/L蔗糖溶液交界处收集髓鞘蛋白。样品在去离子水中静置40～60min，于12000g离心收集样品。如此反复两次后，得到最终样品。放置于-80℃待用。
4、髓鞘蛋白对神经干细胞分化的影响
采用胰酶替代物消化神经干细胞球10～20min，得到神经干细胞单细胞种植到体外模拟脑组织中。在培养基中加入1～5μg/mL髓鞘蛋白。
5、EGFR抗体药物对神经干细胞分化的影响
将1～2μg EGFR抗体西妥昔化学交联到体外模拟脑组织上，将神经干细胞单细胞种植到体外模拟脑组织中。在培养基中加入1～5μg/mL髓鞘蛋白。
6、NSCs分化的免疫荧光染色
在分化培养基中培养7天后，用4％多聚甲醛室温固定15～30min，PBS浸洗2～3次；100％FBS室温封闭1h，PBS洗1次；孵育抗TUj-1一抗，4℃过夜，PBS洗3次；二抗和Hoechst孵育37℃，20～40min，PBS洗3次；PBS洗2～3次，最后观察拍照。
实验结果显示：
1、体外模拟脑组织可模拟脑组织进行体外前脑神经干细胞三维培养
请参阅图1a和图1b，图1a为体外模拟脑组织扫描电镜显微镜(SEM)图片，内插图为体外模拟脑组织的总体形貌。图1b为体外模拟脑组织担载神经干细胞的SEM照片。
由图1a和图1b可见，体外模拟脑组织材料的孔径为20～30μm，孔隙率为90％。体外模拟脑组织可很好地模拟脑组织，神经干细胞可长入体外模拟脑组织内部。
2、体外细胞培养中加入髓鞘蛋白可模拟脑损伤环境，抑制神经干细胞向神经元分化
请参阅图2，图2为髓鞘蛋白对体外模拟脑组织上培养的神经干细胞分化的影响，为TUj-1和GFAP免疫荧光染色照片。
从图2中可以看出，髓鞘蛋白的加入可抑制神经干细胞向神经元细胞分化，而提高其向星形胶质细胞分化。由此可见，髓鞘蛋白的加入可模拟脑损伤后的抑制环境。
3、EGFR抗体西妥昔可促进抑制环境中的神经干细胞向神经元细胞分化
请参阅图3，图3为培养基中含有髓鞘蛋白的情况下，担载EGFR抗体西妥昔的体外模拟脑组织培养神经干细胞7天后向神经元细胞分化的情况。
由图3可见，体外模拟脑组织加入0.5μg、1μg、2μg EGFR抗体西妥昔时，1μg西妥昔的加入可缓解髓鞘蛋白的作用，显著促进神经干细胞向神经元细胞分化。
4、EGFR抗体西妥昔可降低抑制环境中的神经干细胞向星形胶质细胞分化
请参阅图4，图4为培养基中含有髓鞘蛋白的情况下，担载EGFR抗体西妥昔的体外模拟脑组织培养神经干细胞7天后向星形胶质细胞分化的情况。
由图4可见，体外模拟脑组织加入0.5μg、1μg、2μg EGFR抗体西妥昔时，可降低神经干细胞向星形胶质细胞分化的比例。
综合分析以上结果，可以看到，本案发明人成功构建了一种用于促进颅脑损伤神经修复的组合物，并将其成功应用于脑损伤修复中。该组合物包括神经干细胞和EGFR抗体药物，通过体外模拟实验，发现该组合物可缓解脑损伤后的髓鞘蛋白分子的抑制作用，通过EGFR抗体药物改善损伤微环境，具有良好的促进神经干细胞向神经元细胞分化的能力，最终促进了脑损伤的恢复。
应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种促进脑损伤神经修复的组合物在制备修复脑损伤的产品中的应用，所述的组合物包括EGFR抗体药物和神经干细胞。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述EGFR抗体药物包括西妥昔。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述产品至少具有缓解脑损伤后的髓鞘蛋白分子的抑制作用以及促进神经干细胞向神经元细胞分化的功能。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述产品至少具有缓解脑损伤后的髓鞘蛋白分子的抑制作用以及促进神经轴突生长的功能。
5.一种促进脑损伤神经修复的组合物，其特征在于包括EGFR抗体药物和神经干细胞。
6.根据权利要求5所述的促进脑损伤神经修复的组合物，其特征在于：所述EGFR抗体药物包括西妥昔。
7.一种修复脑损伤的功能产品，其特征在于包含权利要求4-5中任一项所述的促进脑损伤神经修复的组合物。
8.一种促进脑损伤神经修复的组合物的评价方法，其特征在于包括：
构建体外模拟脑组织；
将促进脑损伤神经修复的组合物负载到所述体外模拟脑组织上，并在适合培养神经干细胞的环境中进行培养。
9.根据权利要求8所述的评价方法，其特征在于：所述适合培养神经干细胞的环境还包含有髓鞘蛋白分子。
10.根据权利要求8所述的评价方法，其特征在于，所述体外模拟脑组织的构建方法包括：将胶原原材料溶解于0.2～1mol/L醋酸中并于4℃温度中静置过夜，混合均匀后加入2～10mol/L碱液中和，得到的均匀液体转移入截留分子量为3000～5000的透析袋中，用去离子水透析4～6天，透析期间每3～6h换一次去离子水，透析后的溶液放入直径为4～10mm的模具中，将模具处于-80℃过夜，冷冻干燥，得到体外模拟脑组织。
11.根据权利要求10所述的评价方法，其特征在于：所述体外模拟脑组织具有多孔结构，其中所含孔洞的平均孔径为50～150μm，孔隙率为85％～90％。
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