BR112015017174B1

BR112015017174B1 - Enxerto de nervo de tecido manipulado para reparo de defeito de nervo periférico e método de preparação do mesmo

Info

Publication number: BR112015017174B1
Application number: BR112015017174-5A
Authority: BR
Inventors: Xiaosong Gu; Fei Ding; Yun Gu; Chengbin Xue; Yumin Yang; Yongjun WANG; Leilei Gong
Original assignee: Nantong University
Priority date: 2013-01-25
Filing date: 2013-05-27
Publication date: 2020-09-24
Also published as: EA038957B1; EA201591373A1; AU2013375655A1; EP2949349B1; CN103041450B; CN103041450A; EP2949349A4; WO2014114043A1; BR112015017174A2; EP2949349A1; US20150352255A1; AU2013375655B2; US9492589B2

Abstract

preparação de enxertos de nervo de tecido manipulado com matriz extracelular modificada para reparo de lesão de nervo periférico. um enxerto de nervo de tecido manipulado para o reparo de um defeito de nervo periférico compreende um conduto nervoso e uma matriz celular (ecm), em que a matriz celular é obtida pela descelularização depois que células autólogas ou alogênicas são secretadas e formadas. o método de preparação do enxerto de nervo de tecido manipulado compreende construir um enxerto de nervo de tecido manipulado que contém células de suporte e construção de um enxerto de nervo de tecido manipulado com uma matriz celular modificada.

Description

ENXERTO DE NERVO DE TECIDO MANIPULADO PARA REPARO DE DEFEITO DE NERVO PERIFÉRICO E MÉTODO DE PREPARAÇÃO DO MESMO

CAMPO TÉCNICO

[001] A presente invenção, que pertence ao campo técnico de biomateriais médicos usados por transplante no corpo humano, se refere à preparação de enxertos de nervo de tecido manipulado com matriz extracelular (ECM) para reparo de lesão de nervo periférico.

ANTECEDENTES

[002] Com o progresso da modernização social e aceleração do ritmo da vida diária das pessoas, um número crescente de acidentes, que resultam do transito, indústria, esportes, guerras locais, eventos violentos e desastres naturais (por exemplo, terremotos), levará à lesão de nervos periféricos. Quando o defeito do nervo formado a meia e longa distância não pode ser tratado com uma sutura de ponta-com-ponta na clínica, o enxerto de nervo periférico deve ser aplicado para ligar o defeito do nervo. Embora enxertos de nervos tenham sido pesquisados e desenvolvidos par mais de cem anos, grandes esforços ainda são dispendidos no desenvolvimento de enxertos de nervo ideais para substituir enxertos autólogos de nervos na prática clínica. Apesar de ser um padrão ouro para o reparo de nervo periférico, o enxerto autólogo de nervo não pode ser amplamente usado na clínica devido às suas várias limitações, tais como suprimento deficiente de doadores de nervo, não combinação entre o nervo lesado e o nervo doado na estrutura e tamanho, assim como morbidade do sítio doador e deformidades secundárias.

[003] A emergência e o avanço do campo da manipulação de tecido fornecem uma oportunidade única para gerar um tecido manipulado para enxertos de nervo como uma alternativa promissora aos enxertos de nervo autólogos. Os enxertos de tecido manipulado existentes incluem principalmente dois tipos importantes. Um tipo é o nervo alogênico acelular, isto é, enxerto de nervo acelular (ANG), no qual as células no tecido alogênico são removidas, mas a arquitetura neural original é mantida. O ANG atinge os requisitos básicos para enxertos de nervo na manipulação do tecido nervoso periférico e se torna um tecido para enxerto de nervo de tecido manipulado derivado de ECM modificada. Por exemplo, um artigo de pesquisa indicou que ANG induz a diferenciação de BMSCs de rato adulto em células de Schwann (He Hongyun, Deng Yihao, Ke Xiaojie, et al, Morphologic Study of Bone Marrow Stromal Cells of Rat Differentiating into Schwann Cells By Acellularnerve Grafts. Chinese Journal of Neuroanatomy, 2007; 23(6)). Outro estudo investiga os efeitos protetores de ANG implantado em neurônios motores do corno anterior da medula espinhal (Liu Jinchao, Lin Xiaoping, Ke Xiaojie, et al. The Protective Effects of Acellularnerve Matrix Allografts on the Motor Neurons of the Anterior Horn of Spinal Cord Progress of Anatomical Sciences, 2005(3): 206-209) e indica que o uso de ANGs para ligar defeitos de nervos periféricos tem tido excelentes efeitos de proteção da sobrevida do corpo celular dos neurônios motores. Embora haja um grande número de estudos sobre a tecnologia de preparação de ANGs obtendo um progresso mais rápido, vários métodos de preparação têm procedimentos complicados e a estrutura delicada e as propriedades mecânicas dos biomateriais será impactada durante o processamento.

[004] Outro tipo é baseado em um conduto nervoso preparado com um molde apropriado e que possui ECM ou células de apoio revestidas em suas superfícies interna e externa. Por exemplo, um artigo de pesquisa relata o uso de um enxerto de ligação feito de célula embainhante olfatória (OECs)-células de Schwann (SCs) derivadas de ECM e ácido poli(DL lactídeo-co-glicolídeo) (PLGA) para proteger os neurônios dos órgãos alvos periféricos e da medula espinhal depois de lesão do nervo ciático (You Hua, Jiao Shusheng, Feng Shuainan, et al, The Protective Effects of Tissue Engineering Artificial Nerves on Peripheral Target Organs and Spinal Cord Neurons after Sciatic Nerve Defect Chinese Journal of Trauma, 2010 Vol.26 No.3 P.265-269). Como outro exemplo, uma patente chinesa (um pedido no. CN03134541.7 e uma publicação de pedido No. CN1589913) intitulada "A tissue engineering peripheral nerve used for repairing peripheral nerve defect and its preparation method", descreve um nervo de tecido manipulado usado para o reparo de um defeito do nervo periférico. O nervo de tecido manipulado consiste em um conduto nervoso feito de materiais biodegradáveis adicionados com células da glia ou células-tronco que possuem a habilidade de diferenciar em células da glia, que são usadas como sementes de células, e modificados com microesferas para a liberação controlada de fatores neurotróficos e com moléculas de ECM.

[005] Atualmente, as células de suporte usadas nos nervos de tecido manipulado incluem células de Schwann e várias células-tronco, que são células alogênicas e podem causar imunogenicidade, o que não é adequado para aplicações clínicas. Por outro lado, o destino in vivo e os efeitos biológicos das células de suporte depois que elas são implantadas no corpo não estão totalmente claros e elas podem ser inativadas no ambiente do corpo, falhando assim na obtenção dos efeitos biológicos esperados. Todos os problemas acima limitam o desenvolvimento de enxertos de nervo de tecido manipulado.

SUMÁRIO

[006] A presente invenção tem como objetivo manipular enxertos de nervo de tecido manipulado com ECM modificada derivada de célula para reparo de lesão de nervo periférico. Os enxertos de nervo são benéficos para a adesão celular e provavelmente para promover a regeneração do axônio, superando assim as desvantagens das tecnologias existentes. A presente invenção é baseada nos métodos de manipulação de tecido e adota um reator celular rotacional para cultivar células de suporte em um conduto nervoso e filamentos luminais e depois aplica a descelularização para estimular a secreção de ECM pelas células de suporte, gerando assim enxertos de nervo de tecido manipulado modificado de ECM derivado de células de suporte para reparo de lesão de nervo periférico. A presente invenção pode superar as limitações do enxerto de nervo autólogo, evita a imunogenicidade de enxertos de nervo alogênicos, fornece ECM benéfico à adesão celular neural e estabelece um ambiente adequado para o crescimento axonal de novo. Portanto, a presente invenção auxilia a promoção da regeneração do nervo e restauração da função e será desenvolvida em uma terapia clínica possível.

[007] O esquema técnico da presente invenção é o seguinte.

[008] Um enxerto de nervo de tecido manipulado para o reparo de lesão nervosa consiste em um conduto nervoso e uma ECM que é secretada pelas células de suporte autólogas ou alogênicas e obtido pela descelularização. As células de suporte podem estar isoladas ou em combinação com células de Schwann, fibroblastos derivados da pele, células-tronco cutâneas, células-tronco mesenquimais da medula óssea ou células-tronco pluripotentes induzidas. O conduto nervoso é feito de materiais biodegradáveis e é, preferivelmente, feito isoladamente ou com uma combinação de fibroína da seda, quitosana, colágeno, ácido poliláctico ou ácido poliglicólico.

[009] O conduto nervoso pode ser simplesmente um enxerto de nervo de tecido manipulado comumente preparado e usado na técnica. Um conduto nervoso baseado em quitosana com superfície porosa é preferível, que tenha uma porosidade de 50 a 90%, um tamanho de poro de 50 a 300 μm, alta resistência à tração, diâmetro interno de 0,5 a 8 mm e espessura da parede de 0,1 a 3 mm e pode ser preparado com relação ao método descrito na patente (pedido No. CN20110324474.8, intitulado "Tissue Engineering Nerve Graft and its Functions"). Outro conduto nervoso em escala manométrica baseado em fibroína da seda, pode ser preparado especificamente com referência ao método descrito na patente (pedido No. CN200910034583.9 e pedido No. CN101664346, intitulado "Artificial Nerve Graft Prepared by Electrospinning, Its Preparation Method, and Related Devices"). O terceiro conduto nervoso de escolha tem uma estrutura de compósito, que consiste em um conduto nervoso baseado em quitosana com superfície porosa ou um conduto nervoso baseado em fibroína de seda (ou qualquer conduto nervoso que possa ser preparado com referência às patentes acima) com a introdução de 120 filamentos de fibroína de seda como cargas luminais.

[0010] A presente invenção também fornece um método de preparação do enxerto de nervo de tecido manipulado modificado por uma matriz celular natural para o reparo de defeitos do nervo periférico, que prepara um enxerto de nervo de tecido manipulado que contém células de suporte e depois é descelularizado para obter um enxerto de nervo de tecido manipulado descelularizado. O enxerto de nervo de tecido manipulado que contém células de suporte pode ser preparado através de cultura celular para fazer com que as células de suporte se tornem aderidas a superfície interna e externa de um conduto nervoso, onde um método de cultura celular em microgravidade tridimensional é preferido. A presente invenção usa um sistema de cultura tridimensional em microgravidade RCMW tipo Synthecon.

[0011] O esquema técnico preferido para a preparação de enxertos de nervo de tecido manipulado que contêm células de suporte e enxertos descelularizados é o seguinte:

[0012] (1) Preparação de enxertos de nervo de tecido manipulado que contêm células de suporte. 100 ml de um meio completo são lentamente colocados em um frasco de cultura e depois 2,5 x 107 células e um conduto nervoso estéril são adicionados, seguidos pelo processamento com uma bomba peristáltica para assegurar a densidade celular final de 1 x 105/ml. Depois, o ar é evacuado do frasco de cultura, uma cultura de circulação de perfusão em microgravidade rotacional é iniciada com um biorreator rotatório colocado em uma incubadora com CO2 a 37°C para assegurar o contato total e a adesão das células sobre o conduto nervoso suspenso em uma solução de cultura pelo ajuste da velocidade de rotação depois de 24 h. Depois de cultivar por 2 dias, o meio é trocado para um meio de diferenciação para promover a secreção de ECM e deixado cultivar por mais duas semanas antes que o conduto nervoso revestido com as células de suporte seja removido. A composição otimizada do meio de diferenciação é H-DMEM + FBS 15% + HRG 50 ng/ml + forsklin 2 μg + Vc 50 μg/ml.

[0013] (2) Preparação de enxertos de nervo de tecido manipulado modificado com ECM. O enxerto de nervo de tecido manipulado que contém célula de suporte é submetido à descelularização. Ele é lavado com salina tamponada com fosfato (PBS), colocado em água deionizada estéril a 37°C para tratamento hipotônico por 10 minutos, seguido pela lise da célula em um detergente não iônico por 10-15 minutos a 37°C, e então adicionado em um detergente não iônico com a adição de DNase I (4 mg/ml) para uma digestão por 30 min a 37°C para remover o DNA. O produto acelular é mantido a -80°C para o uso. A composição otimizada do detergente não iônico é salina tamponada com fosfato consistindo em TritonX-100 0,5% e amônia aquosa 20 mM.

[0014] As células de suporte usadas nos procedimentos acima estão sozinhas ou em combinação com células de Schwann, fibroblastos derivados da pele, células-tronco cutâneas, células-tronco mesenquimais da medula óssea e células-tronco pluripotentes induzidas, enquanto que o conduto nervoso é feito com materiais biodegradáveis, que estão sozinhos ou são uma combinação de fibroína da seda, quitosana, colágeno, ácido poliláctico e ácido poliglicólico. Um conduto nervoso baseado em quitosana com superfície porosa é preferido, tendo uma porosidade de 50 a 90%, um tamanho de poro de 50 a 300 μm, alta resistência à tração, diâmetro interno de 0,5 a 8 mm e espessura da parede de 0,1 a 3 mm e pode ser preparado com relação ao método descrito na patente (pedido No. CN20110324474.8, intitulado "Tissue Engineering Nerve Graft and its Functions"). Outro conduto nervoso em escala manométrica baseado em fibroína da seda, pode ser preparado especificamente com referência ao método descrito na patente (pedido No. CN200910034583.9 e pedido No. CN101664346, intitulado "Artificial Nerve Graft Prepared by Electrospinning, Its Preparation Method, and Related Devices"). O terceiro conduto nervoso de escolha tem uma estrutura de compósito, que consiste em um conduto nervoso baseado em quitosana com superfície porosa ou um conduto nervoso baseado em fibroína de seda (ou qualquer conduto nervoso que possa ser preparado com referência às patentes acima) com a introdução de 120 filamentos de fibroína de seda como cargas luminais.

[0015] A presente invenção tem as seguintes vantagens:

[0016] (1) A ECM é geralmente composta por colágeno (Col), laminina (LN), fibronectina (FN), ácido hialurônico e proteoglicano (tal como sulfato de condroitina, proteoglicano sulfato de heparan). ECM fornece suporte mecânico e resistência física para a integridade de tecidos, órgãos e o organismo completo. Evidencias mostram que LN, FN e Col podem fornecer "adesividade" adequada o crescimento do nervo, fazem com que os axônios cresçam ao longo de uma ponte de matriz e guiam o crescimento direcionado das fibras nervosas. Um ou mais componentes de ECM, tais como LN e FN, têm sido amplamente adotados na técnica atual de manipulação de tecido. A ECM comercialmente disponível, sintetizada, entretanto, é cara e seus componentes são relativamente únicos. A ECM natural derivada de célula, obtida na presente invenção depois da descelularização de células cultivadas, pode manter vários componentes importantes e a estrutura de ECM e é mais benéfica para a adesão de células nervosas e tem certo efeito de guia na regeneração axonal orientada, promovendo assim a regeneração do nervo. Além disso, ela tem um preço mais barato do que ECM sintetizada e mais fácil de ser aceita pelos pacientes.

[0017] (2) As células de suporte usadas nos enxertos de nervo com tecido manipulado incluem células de Schwann e várias células-tronco. A maioria dessas células são células alogênicas, que podem causar a imunogenicidade durante o implante. A ECM contida nos enxertos de nervo de tecido manipulado desenvolvidos na presente invenção é obtida depois da descelularizar células cultivadas, levando assim a menos ou nenhuma imunogenicidade. Os enxertos de nervo de tecido manipulado são adequados para uma grande população de usuários.

[0018] (3) Os enxertos de nervo de tecido manipulado desenvolvidos pela presente invenção são preparados por um método de cultura celular tridimensional em microgravidade, que permite que as células de suporte sejam uniformemente aderidas às superfícies interna e externa de filamentos luminais e a ECM obtida depois da descelularização também é uniformemente distribuída sobre as superfícies interna e externa de filamentos luminais, facilitando assim a regeneração do nervo.

[0019] (4) Os enxertos de nervo de tecido manipulado desenvolvidos pela presente invenção não contêm substancias tóxicas exógenas, que podem ser provavelmente introduzidas durante o processo de preparação e também possuem excelente biocompatibilidade e biodegradabilidade, assim como boa propriedade mecânica. A parede dos condutos nervosos exibe uma estrutura 3D microporosa, que facilita o transporte de nutrientes requeridos pelo desenvolvimento do nervo. Os filamentos de fibroína de seda incluídos na luz do conduto são preparados pela fiação eletrostática, possuindo uma ampla área superficial específica para servir como um espaço requerido para o desenvolvimento das células nervosas.

[0020] São mostrados abaixo os detalhes da presente invenção pelo uso das Figuras e exemplos de trabalho.

LEGENDAS DAS FIGURAS

[0021] Fig. 1 - (A) Microfotografia de luz de células de Schwann. (B) Microfotografia da imuno-histoquímica de células de Schwann, que são imunopositivas para S100 (semelhante a um fuso cinza) com os núcleos marcados por Hoechst33342 (ponto cinza).

[0022] Fig. 2 - (A) Microfotografia de luz de fibroblastos (100x). (B) Microfotografia da imuno-histoquímica de fibroblastos, que são imunopositivos para seu marcador (cinza) com os núcleos marcados por Hoechst33342 (branco).

[0023] Fig. 3 - (A) Microfotografia de luz de células-tronco cutâneas (100x). (B) Microfotografia da imuno-histoquímica de esferas de células-tronco cutâneas (100x), que são imunopositivas para Versican (a) e Nestin (b) com núcleos marcados por Hoechst33342 (c) e (d) é a fusão de (a), (b) e (c). (C) Microfotografia da imuno-histoquímica de esferas de células-tronco cutâneas (100x), que são imunopositivas para Vimentin (a) e Nestin (b) com núcleos marcados por Hoechst33342 (c) e (d) é a fusão de (a), (b) e (c).

[0024] Fig. 4 - é a diferenciação induzida de células-tronco em células de Schwann. Microfotografia de luz (100x) (A) e ampliação local (B) que mostra colônias de célula de Schwann que se formam pela diferenciação induzida de células-tronco cutâneas.

[0025] Fig. 5 - Microfotografia da imuno-histoquímica de células de Schwann formadas pela diferenciação induzida de células-tronco cutâneas (100x). As células de Schwann diferenciadas são imunopositivas para S100 (A) com núcleos marcados por Hoechst33342 (B). (C) é a fusão de (A) e (B).

[0026] Fig. 6 - Citometria de fluxo de células-tronco mesenquimais de medula óssea e imuno-histoquímica com moléculas de CD.

[0027] Fig. 7 - Micrografia da imuno-histoquímica de ECM. (A) Micrografia de luz de ECM sobre a superfície do material depois da descelularização. (B) ECM é imunopositiva para anti-FN. (C) ECM é imunopositiva para anti-LN. (D) é a fusão de (B) e (C).

[0028] Fig. 8 - Efeitos de ECM sobre o crescimento dos neurônios. (A) Micrografia da imuno-histoquímica de neurônios cultivados em ECM, onde o grupo ECM se refere a neurônios cultivados sobre ECM cultivada e um grupo N-ECM se refere a neurônios cultivados sobre ECM obtida depois da descelularização de células de suporte. (B) vitalidade celular de neurônios. (C) Imagens de Western blot que mostram a expressão da molécula de adesão da célula neural (NCAM) e da proteína associada ao crescimento do axônio (GAP43).

[0029] Fig. 9 - Micrografia eletrônica de varredura (SEM) de um enxerto de nervo de tecido manipulado com ECM modificada. (A) SEM da superfície interna de um conduto nervoso contendo células de suporte. As células de suporte são uniformemente distribuídas sobre a superfície interna. (B) SEM da superfície interna de um conduto nervoso tratado pela descelularização. ECM é gerada e visível. (C) SEM de filamentos de fibroína da sede dentro da luz do conduto nervoso que contêm células de suporte. (D) SEM de filamentos de fibroína da sede dentro da luz do conduto nervoso tratado pela descelularização.

[0030] Fig. 10 - Micrografia da imuno-histoquímica de ECM sobre a superfície de filamentos de fibroína dentro da luz de um conduto nervoso tratado pela descelularização. (A) Imunopositiva para anti-FN. (B) Imunopositiva para anti-FN. (C) filamentos de fibroína de seda. (D) é a fusão de (A), (B) e (C).

[0031] Fig. 11 - Rebrotamento de axônios marcados com NF (escala gráfica, 200 μm) para um grupo com material em uma semana (A) ou 2 semanas (C) depois do enxerto e para um grupo com ECM em uma semanas (B) ou 2 semanas (D) depois do enxerto.

[0032] Fig. 12 - Histograma para comparações estatísticas de fibras nervosas regeneradas entre os grupos indicados.

[0033] Fig. 13 - Micrografia SEM do corte transversal de um nervo regenerado na porção média (escala gráfica, 5 μm) para um grupo com material (A) e um grupo com ECM (B).

DETALHES DO ESQUEMA

[0034] A menos que definido de outra maneira, todas as expressões usadas na presente invenção possuem o mesmo significado como comumente usado pelos pesquisadores no campo da manipulação de tecido.

[0035] A presente invenção será descrita adicionalmente com referência aos exemplos de trabalho. As descrições desses exemplos de trabalho são usadas apenas para ilustração da presente invenção, mas não pretendem limitar o escopo da presente invenção de maneira nenhuma.

[0036] Nos exemplos a seguir, vários processos e métodos que não estão descritos em detalhes são métodos convencionais conhecidos no campo da manipulação de tecidos.

Exemplo de trabalho 1: Cultura e purificação de células Schwann

[0037] Ratos SD recém-nascidos (1 dia de idade) são mortos e desinfetados com álcool. Os nervos ciáticos de ambos os lados são removidos e colocados em uma placa em banho de gelo para remover os epineuros e adesões. Depois da digestão com colagenase/pancreatina, a centrifugação é realizada e o sobrenadante é descartado. Depois, as células são suspensas novamente em um meio completo e semeadas em um disco de cultura revestido com PDL para uma cultura por 24 h. Posteriormente, um meio completo contendo citarabina (10 μΜ) é reposto para uma cultura por 48 h e depois um meio completo contendo HRG (50 ng/ml) e Forsklin (2 μΜ) é reposto para cultura contínua com o meio que é trocado a cada 3 dias até a fusão celular, seguida pela digestão com pancreatina e centrifugação para obter precipitados celulares, que são suspensos novamente usando 1 ml de meio completo contendo Thyl.1 (1:1000) e para permitir a incubação sobre gelo por 2 h. A centrifugação é realizada e o sobrenadante é descartado. As células são suspensas novamente usando uma mistura de DMEM e complemento (3:1), incubadas por 1 h a 37°C, limpas duas vezes usando o meio completo depois da centrifugação e re-inoculadas no disco de cultura. O meio é trocado em dias alternados e as células podem ser usadas depois do crescimento para revestir o recipiente (a cultura celular e a identificação são mostradas na Fig. 1).

Exemplo de trabalho 2: Cultura de fibroblastos derivados da pele

[0038] Ratos SD recém-nascidos (1 dia de idade) são mortos e desinfetados com álcool. As peles do dorso são retiradas e colocadas em uma solução de dissecção pré-resfriada para remover o tecido subcutâneo (gordura, camada da fascia hipodérmica e vasos sanguíneos). Depois de lavar três vezes com PBS, as peles são cortadas em pedaços (<1mm x 1mm), usando uma lamina cirúrgica e completamente digeridas usando colagenase tipo I (1 mg/ml). O sobrenadante é descartado. As células são suspensas novamente em meio completo e semeadas em um disco de cultura. Depois que 90% das células estão fundidas, as células são subcultivadas. Pode ocorrer contaminação pelo epitélio durante o processo da cultura primária e a maioria das células do parênquima (células epiteliais e endoteliais) morrerá gradativamente depois de várias subculturas. Portanto, as células usadas na presente invenção são células que foram subcultivadas por mais de três gerações (cultura celular e ia identificação são como mostrado na Fig.2).

Exemplo de trabalho 3: Cultura de células-tronco cutâneas e diferenciação direcionada para células de Schwann.

[0039] Esse é conduzido como descrito previamente (Jeffrey A Biernaskie, Ian A McKenzie, Jean G Toma & Freda D Miller, Skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny NATURE PROTOCOLS, 2006(1): 2803-2812). Em resumo, ratos SD recém-nascidos (1 dia de idade) são mortos e desinfetados com álcool. As peles do dorso são retiradas e colocadas em uma solução de dissecção pré-resfriada para remover o tecido subcutâneo (gordura, camada da fascia hipodérmica e vasos sanguíneos). Depois de lavar três vezes com PBS, as peles são cortadas em pedaços (<1mm x 1mm), usando uma lamina cirúrgica e completamente digeridas usando pancreatina 0,1% ou colagenase tipo XI (1 mg/ml) por 45 a 60 min a 37°C e depois a digestão é finalizada através de um meio completo. A centrifugação é conduzida e o sobrenadante descartado. A cultura em suspensão é realizada em DMEMJ/F12 (3:1) contendo um anticorpo secundário 0,1%, fungizona 40 μg/ml, FGF2 40 ng/ml e suplemento B27 2%. As esferas celulares resultantes são subcultivadas para obter uma quantidade suficiente de células-tronco cutâneas. A cultura celular e a identificação são mostradas na Fig. 3).

[0040] As células-tronco cutâneas são diferenciadas em células de Schwann através das seguintes etapas. As células-tronco cutâneas são cultivadas em um médio de diferenciação I (DMEM/F12 (3:1) contendo um anticorpo secundário 0,1%, fungizona 40 μg/ml, FGF2 40 ng/ml, suplemento B27 2% e FBS 10%) por 3 dias e depois são cultivadas em um meio de diferenciação II (DMEM/F 12(3:1) contendo um anticorpo secundário 0,1%, forskolin 5 μm, heregulina-1β 50 ng/ml, suplemento N2 2% e FBS 1%) por duas ou três semanas, formando assim colônias de célula de Schwann (Fig. 4.A). As células de Schwann (SKP-SCs) diferenciadas a partir das células-tronco cutâneas proliferam depois da amplificação da colônia (Fig. 4.B). Os resultados da imuno-histoquímica mostram que as células são imunopositivas para S100 (Fig. 5).

Exemplo de trabalho 4: Cultura de células-tronco mesenquimais de medula-óssea

[0041] Ratos SD adultos são mortos por desarticulação, imersos por 5 min em álcool 75%. O fêmur e osso fetal são retirados em condições assépticas e as cavidades medulares são expostas e lavadas com solução de cultura basal IMDM para coletar a medula óssea. A medula óssea obtida é repetidamente bombeada com um injetor e preparada em uma suspensão de célula única, que é filtrada através de uma peneira de 200 mesh, colocada em uma centrífuga horizontal para centrifugação (1000 rpm x 5 min.). Depois o sobrenadante é descartado. As células são semeadas em uma densidade de 4 x 105/cm2 em uma solução de cultura completa IMDM (contendo soro fetal bovino 10%) para cultura. A troca de toda a solução é realizada depois de 24 h e as células não aderidas à parede são removidas. Depois, a troca de metade da dose da solução é realizada a cada 3 dias. A modalidade celular e a situação do crescimento são observadas diariamente sob um microscópio invertido. Quando as células recobrem o fundo do disco de cultura e estão fundidas em 90%, as células são subcultivadas (a cultura celular e a identificação são mostradas na Fig. 6).

Exemplo de trabalho 5: Descelularização de células de suporte.

[0042] As células de suporte (por exemplo, células de Schwann) são cultivadas em um disco de cultura. Quando as células recobrem o fundo do disco de cultura e estão fundidas em 90%, as células são cultivadas por duas semanas em um meio de diferenciação (H-DMEM + FBS 15% + HRG 50 ng/ml + forskolin 2 μm + Vc 50 μg/ml) para estimular a secreção de ECM. Depois de lavar com PBS, as células são descelularizadas e submetidas ao tratamento hipotônico por 10 min em água estéril deionizada a 37°C. Os extratos celulares (PBS contendo TritonX-100 0,5% e amônia aquosa 20 mM) são adicionados para romper as células por 10 a 15 min a 37°C e Dnase I (4 mg/ml) é adicionada para digestão por 30 min a 37°C para remover o DNA. A ECM obtida é como mostrada na Fig. 7. Os componentes parciais de ECM são identificados por imuno-histoquímica de LN e FN. A ECM é fixada por 30 min em temperatura ambiente com paraformaldeído 4% e para permitir a reação com anticorpos primários, isto é, anticorpo anti-laminina de camundongo (LN) e anti-fibronectina de coelho (FN), respectivamente, por uma noite a 4°C, seguida pela incubação com anticorpos secundários, isto, é, anticorpo de cabra anti-IgG de coelho conjugado com FTIC (1:200) e anticorpo de cabra anti-IgG de camundongo conjugado com TRITC (1:200), respectivamente, por 2 h em temperatura ambiente e detecção sob microscopia fluorescente confocal (DMR, Leica) (Figs. 7 B-D).

Exemplo de trabalho 6: ECM natural é benéfica para o crescimento do axônio

[0043] Neurônios ganglionares da raiz dorsal são semeados em um disco de cultura revestido com ECM derivada de células de suporte acelulares, como obtidas no Exemplo de trabalho 5 ou com ECM comercialmente disponível (SIGMA, produto Mo. E0282) para uma cultura de 48 h, a vitalidade celular dos neurônios é detectada pelo método MTT, enquanto que o crescimento do axônio é observado por imuno-histoquímica e a expressão de GAP43 e CAM é detectada por Western Blotting. Os resultados são mostrados na Fig. 8. Não há diferença estatística na viabilidade celular dos neurônios sobre os dois tipos de ECM. Os resultados da imuno-histoquímica, entretanto, mostram que o axônio do neurônio é obviamente mais longo cultivado sobre ECM acelular derivado de células de suporte do que sobre a ECM adquirida e o Western Blotting mostra que a expressão de GAP43 ou NCAM nos neurônios cultivados sobre a ECM acelular derivada de células de suporte é maior do que aquela dos neurônios cultivados sobre a ECM adquirida, respectivamente (Fig. 8).

Exemplo de trabalho 7: Preparação de enxertos de nervo de tecido manipulado contendo células de suporte.

[0044] Condutos nervosos de quitosana e filamentos de fibroína de seda são tratados assepticamente, 120 pedaços de monofilamentos de fibroína de seda são inseridos na luz de um conduto nervoso de quitosana como cargas luminais para dar um compósito ao conduto nervoso. 100 ml de um meio completo (DMEM + FBS 2% + HRG 50 ng/ml + forskolin 2 μM) são lentamente colocados em um recipiente de cultura através de uma bomba peristáltica e depois 2,5 x 107 células e um conduto nervoso estéril são adicionados, seguido pelo processamento com uma bomba peristáltica para assegurar a densidade celular final de 1 x 105/ml. Depois que o ar é exaurido do recipiente de cultura, uma cultura de perfusão de circulação em microgravidade é iniciada com o biorreator colocado em uma incubadora a 37°C, CO2 para assegurar o contato total e a adesão das células sobre o conduto nervoso pelo ajuste da velocidade de rotação de 10 rpm nas primeiras 24 h de pois tornar o conduto nervoso suspenso em uma solução de cultura pelo ajuste da velocidade de rotação depois de 24 h. Depois de cultivar por 2 dias, o meio é substituído por um meio de diferenciação (H-DMEM + FBS 15% + HRG 50 ng/ml + forskolin 2 μΜ + Vc 50 μg/ml) a cada 3 dias para promover a secreção de ECM e depois deixado cultivar por mais duas semanas antes que o conduto nervoso revestido pelas células de suporte seja removido, resultando no enxerto de nervo de tecido manipulado.

[0045] SEM mostra que as células de suporte estão uniformemente distribuídas sobre ambas as superfícies do conduto nervoso e dos filamentos de fibroína de seda (Figs. 9A e 9C). Para realizar a observação por SEM o enxerto de nervo de tecido manipulado é fixado com ácido glutárico 4%, lavado três vezes com PBS, fixado com ácido ósmico 1% em temperatura ambiente por 2 h, lavado duas vezes com PBS, desidratado em concentrações graduadas (30, 50, 70, 80, 95 e 100%) de etanol por 10 min, respectivamente, e depois incubado pela alteração do meio com uma mistura de álcool etílico e álcool butílico terciário (1:1) e álcool butílico terciário puro por 10 min de cada vez. Depois da liofilização e de um spray de platina, a amostra é observada com microscopia eletrônica de varredura (TCS SP2, Leica).

Exemplo de trabalho 8: Construção de enxertos de nervo de tecido manipulado com ECM modificada derivada de células de suporte

[0046] Os enxertos de nervo de tecido manipulado que contêm células de suporte, como preparados no Exemplo de trabalho 7, são submetidos à descelularização. Eles são lavados com PBS, colocados em água deionizada estéril a 37°C para tratamento hipotônico, seguido pela lise da célula em um detergente não iônico (que consiste em TritonX-100 0,5% e amônia aquosa 20 mM) por 10 a 15 min. a 37°C e em um detergente não iônico mais Dnase I (4 mg/ml) para digestão por 30 in a 37°C para remover o DNA.

[0047] SEM mostra que os componentes de ECM derivados de células de suporte estão uniformemente distribuídos sobre ambas as superfícies do conduto nervoso e dos filamentos de fibroína de seda (Figs. 9B e 9D). O enxerto de nervo de tecido manipulado com ECM modificada preparado é congelado a -80°C antes do uso. Os componentes de ECM reservados depois da descelularização são observados, respectivamente, sob SEM e detectados por imuno-histoquímica, em que a detecção por SEM é igual àquela do exemplo 7 e um método imuno-histoquímico é o mesmo como aquele do exemplo 5. Os resultados são mostrados na Fig. 10.

Exemplo de trabalho 9: Reparo de defeitos de nervo ciático de ratos com os enxertos de nervo de tecido manipulado com ECM modificada derivada de célula.

[0048] Os defeitos de nervo ciático de rato são reparados com enxertos de nervo de tecido manipulado com ECM modificada derivada de célula e a restauração da função é detectada usando uma série de métodos, tais como a imuno-histoquímica, microscopia por transmissão de elétron (TEM), eletrofisiologia, avaliação morfológica de músculos-alvo.

[0049] O modelo de lesão de nervo ciático de rato com um defeito com 10 mm de extensão é estabelecido. Os animais são divididos aleatoriamente em dois grupos: um grupo está usando enxertos de nervo de tecido manipulado com ECM modificada derivada de célula para o reparo dos defeitos de nervo ciático de ratos, chamado de grupo ECM e o outro grupo está usando enxertos de nervo de tecido manipulado comum (sem modificação de ECM) para o reparo de defeitos de nervo ciático de ratos, chamado de grupo de material. Uma ou duas semanas depois da cirurgia, os animais são perfundidos por via transcardíaca e os segmentos de nervo regenerados são então coletados e cortado em seções. A imuno-histoquímica com NF mostra que o crescimento do nervo no grupo ECM é mais rápido do que o grupo de material.

[0050] Fibras nervosas positivas para NF no grupo ECM são relativamente densas e distribuídas mais uniformemente (Fig. 11A-D) e as comparações estatísticas são mostradas na Fig. 12. Os nervos ciáticos de todos os animais são expostos sob anestesia apropriada três meses depois da cirurgia e a detecção eletrofisiológica é realizada. A amplitude do potencial de ação muscular composto médio (CMAP) é de 4,63 ± 0,13 mN e 6,89 ± 2,85 mV no grupo de material e no grupo ECM, respectivamente e há uma diferença significativa (P<0,05) entre os dois grupos. TEM mostra que com três meses depois da cirurgia, algumas das fibras nervosas mielinizadas regeneradas estão distribuídas dispersamente na porção média com menos fibras nervosas desmielinizadas nos dois grupos (Figs. 13A e B). As espessuras das bainhas de mielina dos nervos são respectivamente de 0,63 ± 0,27 μm e 0,82 ± 0,39 μm no grupo de material e no grupo de ECM, respectivamente e há uma diferença significativa (P<0,05) entre os dois grupos.

Claims

Enxerto de nervo de tecido manipulado para reparo de defeito de nervo periférico, caracterizado pelo fato de que consiste em um conduto nervoso e uma ECM e que tem as características de que a ECM é secretada por células autólogas ou alogênicas e obtida através da descelularização,
em que envolve o uso de células de suporte, que estão sozinhas ou em combinação com fibroblastos derivados da pele, células-tronco cutâneas, células-tronco mesenquimais de medula óssea ou células-tronco pluripotentes induzidas, e
em que o conduto nervoso é feito de materiais biodegradáveis, que estão sozinhos ou como uma combinação de materiais biodegradáveis que são um ou mais de fibroína de seda, quitosana, colágeno, ácido poliláctico ou ácido poliglicólico.
Método de preparação de um enxerto de nervo de tecido manipulado, como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o enxerto de nervo de tecido manipulado é preparado pela descelularização do enxerto de nervo que contêm células de suporte para gerar ECM secretado pelas células de suporte e depois o enxerto de nervo com ECM modificada,
em que as células de suporte estão sozinhas ou em combinação com fibroblastos derivados da pele, células-tronco cutâneas, células-tronco mesenquimais de medula óssea ou células-tronco pluripotentes induzidas, e
em que o conduto nervoso é feito de materiais biodegradáveis, que estão sozinhos ou como uma combinação de materiais biodegradáveis que são um ou mais de fibroína de seda, quitosana, colágeno, ácido poliláctico ou ácido poliglicólico.
Método de preparação do enxerto de nervo de tecido manipulado de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o enxerto de nervo que contém células de suporte é formado através de uma cultura rotacional tridimensional em microgravidade.
Método de preparação do enxerto de nervo de tecido manipulado de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a preparação do enxerto de nervo que contém células de suporte e a construção do enxerto de nervo de tecido manipulado descelularizado:
- (1) Preparação de enxertos de nervo de tecido manipulado que contêm células de suporte; o meio completo é lentamente colocado em um frasco de cultura e depois 2,5 x 107 células e um conduto nervoso estéril é adicionado, seguido pelo processamento com uma bomba peristáltica para assegurar a densidade celular final de 1 x 105/ml; depois, o ar é evacuado do frasco de cultura, uma cultura de circulação de perfusão em microgravidade rotacional é iniciada com um biorreator rotatório colocado em uma incubadora com CO2 a 37°C para assegurar o contato total e a adesão das células sobre o conduto nervoso suspenso em uma solução de cultura pelo ajuste da velocidade de rotação de 10 rpm nas primeiras 24 h e depois para tornar o conduto nervoso suspenso em uma solução de cultura pelo ajuste da velocidade de rotação depois de 24 h; depois de cultivar por 2 dias, o meio é trocado para um meio de diferenciação para promover a secreção de ECM e deixado cultivar por mais duas semanas antes que o conduto nervoso revestido com as células de suporte seja removido;
- (2) Construção de enxertos de nervo de tecido manipulado descelularizado; o enxerto de nervo de tecido manipulado que contém célula de suporte é submetido à descelularização; ele é lavado com salina tamponada com fosfato (PBS), colocado em água deionizada estéril a 37°C para tratamento hipotônico por 10 minutos, seguido pela lise da célula em um detergente não iônico por 10 a 15 min a 37°C e então adicionado em um detergente não iônico com a adição de DNase I (4 mg/ml) para uma digestão por 30 min a 37°C para remover o DNA; o produto acelular é mantido a -80°C para o uso.