RU125073U1 - Клеточный имплантат для закрытия дефектов и восстановления иннервации в тканях и органах - Google Patents
Клеточный имплантат для закрытия дефектов и восстановления иннервации в тканях и органах Download PDFInfo
- Publication number
- RU125073U1 RU125073U1 RU2011135395/15U RU2011135395U RU125073U1 RU 125073 U1 RU125073 U1 RU 125073U1 RU 2011135395/15 U RU2011135395/15 U RU 2011135395/15U RU 2011135395 U RU2011135395 U RU 2011135395U RU 125073 U1 RU125073 U1 RU 125073U1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- implant
- cellular
- tissue
- tissues
- Prior art date
Links
- 239000007943 implant Substances 0.000 title claims abstract description 84
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 title claims abstract description 52
- 230000030214 innervation Effects 0.000 title claims abstract description 16
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 claims abstract description 83
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims abstract description 50
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims abstract description 50
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims abstract description 50
- 229960005188 collagen Drugs 0.000 claims abstract description 50
- 230000001413 cellular Effects 0.000 claims abstract description 33
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 24
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 claims abstract description 20
- 210000001508 Eye Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- 210000003583 Retinal Pigment Epithelium Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims abstract description 18
- 230000001537 neural Effects 0.000 claims abstract description 16
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 230000000735 allogeneic Effects 0.000 claims abstract description 13
- 210000000981 Epithelium Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 238000011099 tissue engineering Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 9
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 claims abstract description 7
- 210000003491 Skin Anatomy 0.000 claims description 12
- 210000002510 Keratinocytes Anatomy 0.000 claims description 11
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 11
- 210000002919 epithelial cells Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 3
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 claims description 2
- 238000002316 cosmetic surgery Methods 0.000 claims description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 abstract description 22
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 abstract description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 17
- 230000004913 activation Effects 0.000 abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 6
- 210000003050 Axons Anatomy 0.000 abstract description 5
- 230000005012 migration Effects 0.000 abstract description 5
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 abstract description 5
- 238000001035 drying Methods 0.000 abstract description 4
- 230000035784 germination Effects 0.000 abstract description 2
- 230000004083 survival Effects 0.000 abstract description 2
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 abstract description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 12
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 12
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 11
- 200000000019 wound Diseases 0.000 description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002609 media Substances 0.000 description 9
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 7
- 101700033006 EGF Proteins 0.000 description 6
- 102100010813 EGF Human genes 0.000 description 6
- 229940116977 Epidermal Growth Factor Drugs 0.000 description 6
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 6
- 210000002569 neurons Anatomy 0.000 description 6
- 230000001172 regenerating Effects 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 230000002421 anti-septic Effects 0.000 description 5
- 239000000512 collagen gel Substances 0.000 description 5
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 5
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 1-[(1S,2R,3R,4S,5R,6R)-3-carbamimidamido-6-{[(2R,3R,4R,5S)-3-{[(2S,3S,4S,5R,6S)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-(methylamino)oxan-2-yl]oxy}-4-formyl-4-hydroxy-5-methyloxolan-2-yl]oxy}-2,4,5-trihydroxycyclohexyl]guanidine Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 229960002743 Glutamine Drugs 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M NaHCO3 Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 4
- 229940064005 Antibiotic throat preparations Drugs 0.000 description 3
- 229940083879 Antibiotics FOR TREATMENT OF HEMORRHOIDS AND ANAL FISSURES FOR TOPICAL USE Drugs 0.000 description 3
- 229940042052 Antibiotics for systemic use Drugs 0.000 description 3
- 229940064004 Antiseptic throat preparations Drugs 0.000 description 3
- 229940042786 Antitubercular Antibiotics Drugs 0.000 description 3
- 210000002808 Connective Tissue Anatomy 0.000 description 3
- 210000002615 Epidermis Anatomy 0.000 description 3
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000018233 Fibroblast growth factor family Human genes 0.000 description 3
- 108050007372 Fibroblast growth factor family Proteins 0.000 description 3
- 229940093922 Gynecological Antibiotics Drugs 0.000 description 3
- 206010022114 Injury Diseases 0.000 description 3
- 210000001178 Neural Stem Cells Anatomy 0.000 description 3
- 210000000538 Tail Anatomy 0.000 description 3
- 210000002435 Tendons Anatomy 0.000 description 3
- 229940024982 Topical Antifungal Antibiotics Drugs 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 229940079866 intestinal antibiotics Drugs 0.000 description 3
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 3
- 229940005935 ophthalmologic Antibiotics Drugs 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000001228 trophic Effects 0.000 description 3
- 210000003403 Autonomic Nervous System Anatomy 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 210000001772 Blood Platelets Anatomy 0.000 description 2
- 210000004958 Brain cells Anatomy 0.000 description 2
- 108060005980 Collagenase family Proteins 0.000 description 2
- 102000020504 Collagenase family Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 102000003974 Fibroblast Growth Factor 2 Human genes 0.000 description 2
- 108090000379 Fibroblast Growth Factor 2 Proteins 0.000 description 2
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 2
- 210000004392 Genitalia Anatomy 0.000 description 2
- 206010061255 Ischaemia Diseases 0.000 description 2
- 210000003734 Kidney Anatomy 0.000 description 2
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 2
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 229940049954 Penicillin Drugs 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 210000000578 Peripheral Nerves Anatomy 0.000 description 2
- 206010072170 Skin wound Diseases 0.000 description 2
- 229960005322 Streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 206010068760 Ulcers Diseases 0.000 description 2
- 108010076089 accutase Proteins 0.000 description 2
- 238000009227 behaviour therapy Methods 0.000 description 2
- 229960000626 benzylpenicillin Drugs 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- 230000001143 conditioned Effects 0.000 description 2
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000001605 fetal Effects 0.000 description 2
- 230000037320 fibronectin Effects 0.000 description 2
- -1 gold ions Chemical class 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003902 lesions Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic Effects 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004014 plasticizer Substances 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating Effects 0.000 description 2
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 2
- KGAGDPCLSPRTNF-RGCQKQKKSA-N (6aS,11bR)-7,11b-dihydro-6H-indeno[2,1-c]chromene-3,4,6a,9,10-pentol;2',4',5',7'-tetrabromo-3',6'-dihydroxyspiro[2-benzofuran-3,9'-xanthene]-1-one Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2C[C@]2(O)[C@H]1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2.O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C(O)C(Br)=C1OC1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 KGAGDPCLSPRTNF-RGCQKQKKSA-N 0.000 description 1
- 210000000577 Adipose Tissue Anatomy 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 210000002469 Basement Membrane Anatomy 0.000 description 1
- 102000000131 Beta tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108050008483 Beta tubulin Proteins 0.000 description 1
- 210000001185 Bone Marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 Brain Anatomy 0.000 description 1
- 102100016492 CD34 Human genes 0.000 description 1
- 108060001251 CD34 Proteins 0.000 description 1
- 102000014823 Calbindins Human genes 0.000 description 1
- 108060001061 Calbindins Proteins 0.000 description 1
- 206010007882 Cellulitis Diseases 0.000 description 1
- 210000003169 Central Nervous System Anatomy 0.000 description 1
- 210000001612 Chondrocytes Anatomy 0.000 description 1
- 210000004240 Ciliary Body Anatomy 0.000 description 1
- 229940096422 Collagen Type I Drugs 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 102000004266 Collagen Type IV Human genes 0.000 description 1
- 108010042086 Collagen Type IV Proteins 0.000 description 1
- 210000000795 Conjunctiva Anatomy 0.000 description 1
- 102000001045 Connexin 43 Human genes 0.000 description 1
- 108010069241 Connexin 43 Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 229940110715 ENZYMES FOR TREATMENT OF WOUNDS AND ULCERS Drugs 0.000 description 1
- 210000000959 Ear, Middle Anatomy 0.000 description 1
- 210000001671 Embryonic Stem Cells Anatomy 0.000 description 1
- 210000002889 Endothelial Cells Anatomy 0.000 description 1
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000003238 Esophagus Anatomy 0.000 description 1
- 210000000416 Exudates and Transudates Anatomy 0.000 description 1
- 102100012318 F3 Human genes 0.000 description 1
- 208000001034 Frostbite Diseases 0.000 description 1
- 101700054771 GCA Proteins 0.000 description 1
- 102100012570 GFAP Human genes 0.000 description 1
- 101700069447 GFAP Proteins 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229960002897 Heparin Drugs 0.000 description 1
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N Heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 1
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 210000003494 Hepatocytes Anatomy 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010074224 Hyaluronoglucosaminidase Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 229940047122 Interleukins Drugs 0.000 description 1
- 210000000867 Larynx Anatomy 0.000 description 1
- 101700061402 MTRX Proteins 0.000 description 1
- 210000002901 Mesenchymal Stem Cells Anatomy 0.000 description 1
- 210000003716 Mesoderm Anatomy 0.000 description 1
- 210000003699 Muscle, Striated Anatomy 0.000 description 1
- 210000000492 Nasal Septum Anatomy 0.000 description 1
- 210000001989 Nasopharynx Anatomy 0.000 description 1
- 210000004126 Nerve Fibers Anatomy 0.000 description 1
- 210000000944 Nerve Tissue Anatomy 0.000 description 1
- 102000008730 Nestin Human genes 0.000 description 1
- 108010088225 Nestin Proteins 0.000 description 1
- 210000004279 Orbit Anatomy 0.000 description 1
- 101700083667 PAX6 Proteins 0.000 description 1
- 102000007354 PAX6 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 102100019163 POU5F1 Human genes 0.000 description 1
- 101710026246 POU5F1 Proteins 0.000 description 1
- 208000007542 Paresis Diseases 0.000 description 1
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 102000018210 Recoverin family Human genes 0.000 description 1
- 108010076570 Recoverin family Proteins 0.000 description 1
- 101710017884 Segment-8 Proteins 0.000 description 1
- 210000004927 Skin cells Anatomy 0.000 description 1
- 210000000278 Spinal Cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000002536 Stromal Cells Anatomy 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- 210000003437 Trachea Anatomy 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 210000003932 Urinary Bladder Anatomy 0.000 description 1
- 102100014870 VIM Human genes 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 description 1
- 210000002268 Wool Anatomy 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000028600 axonogenesis Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000002497 edematous Effects 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 229940020899 hematological Enzymes Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 101700045377 mvp1 Proteins 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001272 neurogenic Effects 0.000 description 1
- 230000035771 neuroregeneration Effects 0.000 description 1
- 230000000508 neurotrotrophic Effects 0.000 description 1
- 230000001264 neutralization Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000000790 osteoblast Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000000946 synaptic Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic Effects 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000000989 vascularization Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Images
Abstract
Клеточный имплантат представляет собой объемную трехмерную тканеинженерную конструкцию, содержащую основу - матрицу-носитель и клеточные элементы: аллогенные клетки мезенхимы, эпителия и нейральные клетки. Основа имплантата выполнена из многокомпонентной коллагеновой структуры, которая, в зависимости от метода сушки, может иметь различные формы: в виде геля, губки или сетчатой формы. Внутри коллагеновой структуры матрицы-носителя расположен, по крайней мере, один слой из биосовместимого полимера в форме сетки. В объеме коллагеновой структуры распределены клетки мезенхимы человека и нейральные прогениторные клетки, выделенные из ретинального пигментного эпителия глаза. Сверху поверхность имплантата покрыта клетками эпителия человека. Используемая в составе клеточного имплантата популяция из 3-х типов клеток является сбалансированной по биологической совместимости, что обеспечивает синергизм в действии клеток имплантата по их влиянию на миграцию и пролиферацию собственных клеток пациента и создает оптимальные условия для активации процессов регенерации тканей. За счет особенностей клеточного состава и структуры заявленного имплантата обеспечивается его хорошая приживляемость в зоне дефекта, быстрое прорастание имплантата новообразуемой тканью и регенерация поврежденных аксонов. Технический результат, получаемый при использовании заявленного клеточного имплантата, заключается в повышении эффективности лечения путем комплексного воздействия на зону повреждения, полноценного замещения и регенерации дефектов тканей и органов с восстановлением в них структурной целостности, иннервации и функций.
Description
Полезная модель относится к медицине, медицинским и клеточным технологиям, а именно к тканеинженерным конструкциям, предназначенным для восстановления структуры и функций тканей и органов. Клеточный имплантат может быть использован для хирургического лечения травматических повреждений кожных покровов, мягких тканей, частей органов, например, при ожогах, отморожениях, флегмонах мягких тканей, оперативных вмешательствах, а также для лечения трофических язв и других поражений тканей и органов, протекающих на фоне длительной ишемии, нейрональной дегенерации, атрофии или нарушении целостности периферических нервов.
Разработка живых эквивалентов тканей (тканеинженерных конструкций) и их использование в виде имплантатов при хирургической пластике является одним из наиболее перспективных способов восстановления целостности поврежденных или утраченных тканей и органов. Основной принцип лечения путем трансплантации клеточных имплантатов заключается в доставке к месту повреждения малодифференцированных донорских клеток, которые способны закрывать дефекты тканей и органов, оказывать индуктивные и стимулирующие влияния на миграцию и пролиферацию собственных клеток пациента, активизировать репаративные процессы в тканях, что приводит к восстановлению утраченной или поврежденной ткани в месте трансплантации.
К настоящему времени разработаны тканеинженерные конструкции для восполнения дефектов в тканях различного генеза. Однако их применение не всегда эффективно, главным образом, из-за недостаточности нейрорегенерации.
Как известно, для успешного протекания регенерационных процессов необходим высокий уровень нейротрофических и нейроростовых факторов, который отсутствует в области травматических или трофических поражений. Существующие клеточные имплантаты обладают, в основном, ранозаживляющим действием и не позволяют добиться восстановления местных нарушений иннервации в тканях. Данная проблема может быть преодолена за счет включения в состав имплантатов нейральных клеток, которые обладали бы способностью дифференцироваться в нейральном направлении и вызывать рост и регенерацию аксонов в поврежденной ткани.
Сдерживающим фактором в получении эффективных клеточных имплантатов, пригодных для восстановления иннервации и дефектов в тканях и органах, является отсутствие приемлемого источника нейральных стволовых клеток.
Известна биологическая конструкция для возможной имплантации в организм человека при терапии болезненных состояний или состояний при повреждении тканей, содержащая мезодермальные клетки, которые культивируют без помощи каркаса или чужеродного матрикса с высокой плотностью посева на единицу площади сосуда для культивирования в диапазоне от 3,33×105 до 3×106 клеток на см2, что приводит к возникновению трехмерного подобного ткани формирования или организации клеток. Мезодермальные клетки выбирают из клеток фибробластов, включая фибробласты кожи, остеобластов, жировых стромальных клеток и хондроцитов (Патент RU 2335538, C12N 5/06, 10.04.2008).
Недостатком известной биологической конструкции является относительно быстрое вымывание имплантируемых клеток с транссудатом из раны, что не позволяет добиться полной активации регенераторного потенциала имплантата.
Известен универсальный гетерогенный коллагеновый матрикс для имплантации, представляющий собой упругоэластичную массу, полученную из двух источников коллагена, причем один источник является тканью позвоночного животного одного класса, а второй - животного другого класса, например, класса млекопитающих и класса птиц, и состоящий из двух фаз: твердой - в виде микрогранул из коллагена ткани млекопитающих и жидкой - из денатурированного коллагена ткани птиц. В состав матрикса включены также эмбриональные клетки нервной ткани. Универсальный матрикс предназначен для восстановления повреждений мягких тканей и органов путем имплантации. Эмбриональные нервные ткани способны приживляться и устанавливать синаптические контакты с нейронами реципиента (Патент RU 2249462, A61K 38/39, 10.04.2005).
Недостатками данного имплантата являются, с одной стороны, морально-этические аспекты при извлечении эмбриональных нервных клеток человека, а с другой стороны присутствие коллагена ткани птиц повышает процент отторжения имплантата.
В силу ряда биологических и технологических ограничений эмбриональные стволовые клетки и эмбриональные ткани человека не могут быть рассмотрены в качестве потенциальных перспективных нейральных имплантатов. Кроме того, такой подход не принимается общественностью цивилизованных стран, осуждается религиозными и общественными деятелями.
Известна также имплантируемая нейроэндопротезная система для замещения дефектов головного и спинного мозга и вегетативной нервной системы млекопитающего при реконструктивных нейрохирургических операциях, представляющая собой упругоэластичную клеточно-биополимерную биологически активную массу, полученную из гетерогенного коллагенсодержащего матрикса для имплантации и биокомпозиции клеточных препаратов из различных типов аутологичных клеток пациента, в частности, нейральных стволовых клеток, нейроглиальных обкладочных клеток, эндотелиальных клеток с маркером CD34+и очищенных мононуклеаров. Указанная биосистема может дополнительно содержать стимуляторы клеточной регенерации и факторы роста нервов и сосудов (Патент RU 2394593, A61K 38/39, опубл. 20.07.2010).
К недостаткам известной нейроэндопротезной системы относится то, что она не является универсальной, поскольку предназначена для восстановления узкоспециализированной ткани: для восполнения дефектов нервной ткани в центральной и вегетативной нервной системе.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является клеточный имплантат - активный биологический комплекс для органогенеза, представляющий собой многокомпонентную трехмерную коллагеновую структуру, содержащую аллогенные клетки мезенхимы, клетки эпителия человека и, по крайне мере, один слой из биосовместимого полимера в виде сетчатой матрицы внутри коллагеновой структуры. Коллагеновая структура формирует трехмерную основу имплантата - матрицу-носитель и может быть выполнена в различных формах, например, в виде геля, губок или сетчатой формы. Коллагеновая структура может включать белки внеклеточного матрикса, факторы роста, антисептики и другие компоненты, необходимые для роста клеток новой ткани. Клетки мезенхимы, в частности фибробласты человека, распределены в объеме коллагеновой структуры и служат компонентом активации и формирования процесса регенерации и/или репарации соединительной ткани. Клетки эпителия, в качестве которых используются постнатальные кератиноциты кожи человека, являются компонентом активации и формирования процесса регенерации и/или репарации эпителиальной ткани. Данный имплантат предназначен для регенеративной и репаративной реконструкции любых биологических структур, имеющих мезенхимо-эпителиальное или мезодермальное и эктодермальное происхождение, в частности, дефектов пищевода, стенки мочевого пузыря, кожных покровов, гортани, трахеи, почек, внутренних половых органов, конъюнктивы и орбиты глаза, носовой перегородки, носоглотки и среднего уха и т.п. (Патент RU 2254146, A61L 27/24, опубл. 20.06. 2005).
К недостаткам ближайшего аналога относится отсутствие в структуре имплантируемой конструкции клеточных компонентов активации и формирования процесса регенерации и/или репарации нервной ткани, что не позволяет восстановить рост поврежденных аксонов нервных клеток и иннервацию в зоне дефекта.
Задачей, на решение которой направлена предлагаемая полезная модель, является разработка универсального имплантата для замещения и регенерации поврежденных или утраченных тканей и органов с восстановлением в них иннервации, включая восстановление поверхностной тактильной чувствительности.
Технический результат, получаемый при использовании заявленного клеточного имплантата, заключается в повышении эффективности лечения путем комплексного воздействия на зону повреждения, полноценного замещения и регенерации дефектов тканей и органов с восстановлением в них структурной целостности, иннервации и функций.
Технический результат достигается тем, что клеточный имплантат для закрытия дефектов и восстановления иннервации в тканях и органах, выполненный в виде объемной трехмерной тканеинженерной конструкции, включает аллогенные клетки мезенхимы, клетки эпителия и матрицу-носитель, основа которой выполнена из многокомпонентной коллагеновой структуры, внутри которой расположен, по крайней мере, один слой из биосовместимого полимера в форме сетки, при этом клетки мезенхимы расположены внутри матрицы-носителя, клетки эпителия на ее поверхности, а в структуру матрицы-носителя дополнительно включены нейральные прогениторные клетки человека, выделенные из ретинального пигментного эпителия глаза.
Для достижения указанного технического результата заявленный имплантат выполнен, как и в прототипе, из многокомпонентной коллагеновой структуры, образующую объемную трехмерную матрицу-носитель, внутри которой расположен, по крайней мере, один слой из биосовместимого полимера в форме сетки; содержит клеточные элементы- клетки мезенхимы, расположенные внутри матрицы-носителя, и клетки эпителия, нанесенные на ее поверхность. В качестве клеток мезенхимы в состав имплантата входят аллогенные фибробласты человека, а клеток эпителия - аллогенные клетки эпидермиса кожи человека (кератиноциты).
В отличие от прототипа, в коллагеновую структуру матрицы-носителя имплантата дополнительно включены нейральные прогениторные клетки человека, выделенные из ретинального пигментного эпителия глаза, которые распределены внутри матрицы-носителя.
Используемые для создания тканеинженерной конструкции нейральные прогениторные клетки человека, выделенные из ретинального пигментного эпителия глаза, предрасположены к направленной пролиферации, миграции, изменению фенотипа и к проявлению клетками пронейральных свойств (RU 2409663, C12N 5/071, опубл. 20.01.2011). Это позволило создать имплантат с действенным компонентом активации и формирования процесса регенерации и/или репарации нервной ткани, обеспечивающим регенерацию и рост поврежденных аксонов нервных клеток в зоне дефекта, что необходимо для формирования полноценной новой ткани.
Кроме того, используемая в составе клеточного имплантата популяция из 3-х типов клеток (клеток мезенхимы, клеток эпителия и нейрональных прогениторных клеток, выделенных из ретинального пигментного эпителия глаза), является сбалансированной по биологической совместимости, что обеспечивает синергизм в действии клеток имплантата по их влиянию на миграцию и пролиферацию собственных клеток пациента и создает оптимальные условия для активации процессов регенерации тканей. За счет особенностей клеточного состава и структуры заявленного имплантата обеспечивается его хорошая приживляемость в зоне дефекта, быстрое прорастание имплантата новообразуемой тканью и регенерация поврежденных аксонов.
Следует также отметить, что источником нейральных прогениторных клеток человека является ретинальный пигментный эпителий глаза, что снимает многие этические проблемы, связанные с использованием эмбриональных тканей человека.
Сравнение предлагаемого клеточного имплантата для восстановления дефектов и иннервации в тканях и органах с другими тканеинженерными конструкциями, известными в области медицины, показало его соответствие критериям полезной модели. Все элементы заявляемого клеточного имплантата являются однозначно идентифицируемыми, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «промышленная применимость». При анализе уровня техники заявителем не выявлены технические решения, относящиеся к клеточным имплантатам для восстановления дефектов и иннервации в тканях и органах, которым присущи все существенные признаки заявленной полезной модели, что свидетельствует о соответствии критерию «новизна».
Кроме того, для решения поставленной задачи включение в структуру основы имплантанта нейральных прогениторных клеток человека, выделенных из ретинального пигментного эпителия глаза, не является очевидным решением для специалистов в области медицины, медицинских технологий и биоинженерии.
Применение предлагаемого клеточного имплантата для закрытия дефектов и восстановления иннервации в тканях и органах позволит получить следующие преимущества:
- повысить регенеративную способность имплантата с восстановлением поверхностной дискриминационной тактильной чувствительности раневой поверхности мягких тканей;
- снизить объем оперативного вмешательства при лечении ожогов, трофических язв и длительно не заживающих ран; травмах при сопутствующих парезах, травмах периферических нервов, длительно существующей ишемии, и повысить функциональные возможности (чувствительность) восстановленного кожного покрова и, тем самым, улучшить физиологический и психологический уровни восприятия жизни пациентов;
- обеспечить адекватное постоянное закрытие обширных поверхностей и повысить эффективность лечения и реабилитации пациентов с обширными глубокими ожогами;
- проводить безоперационное местное лечение ран у людей пожилого и старческого возраста с тяжелыми сопутствующими заболеваниями и у людей в тяжелом состоянии, у которых по медицинским показаниям не может быть выполнена операция аутодермопластики.
Полезная модель иллюстрируется графическими материалами, где на фиг.1 представлен общий вид клеточного имплантата.
Имплантат представляет собой трехмерную тканеинженерную конструкцию, образованную многокомпонентной коллагеновой структурой матрицы-носителя (1), внутри которой расположен, по крайней мере, один слой из биосовместимого полимера в форме сетки (2). В объеме коллагеновой структуры распределены клетки мезенхимы человека (3) и нейральные прогениторные клетки, выделенные из ретинального пигментного эпителия глаза (5). Сверху поверхность имплантата покрыта клетками эпителия человека (4).
Детальное описание полезной модели.
Клеточный имплантат для закрытия дефектов и восстановления иннервации в тканях и органах представляет собой объемную трехмерную тканеинженерную конструкцию, содержащую основу - матрицу-носитель и клеточные элементы: аллогенные клетки мезенхимы, эпителия и нейральные клетки.
Основа имплантата выполнена из многокомпонентной коллагеновой структуры, которая, в зависимости от метода сушки, может иметь различные формы: в виде геля, губки или сетчатой формы. Предпочтительно коллагеновая структура содержит 0,1-0,15% раствор коллагена в 0,1% уксусной кислоте.
Коллагеновая структура матрицы-носителя содержит компоненты, необходимые как для поддержания клеточных элементов имплантата, так и для роста клеток новой ткани: десятикратный концентрат культуральной среды «199» в количестве от 7% до 40% от объема, предпочтительно от 10% до 20%; глутамин в количестве от 0,1 до 1 мг/мл геля, предпочтительно от 0,1 до 0,4 мг/мл; бикарбонат натрия в количестве от 0,1 до 1 мг/мл геля, предпочтительно от 0,25 до 0,4 мг/мл; фосфатный буфер в количестве от 0,01 до 0,1 мг/мл от объема, предпочтительно от 0,01 до 0,05 мг/мл.
Дополнительно в коллагеновую структуру имплантата могут быть включены белки внеклеточного матрикса, в качестве которых могут быть использованы фибронектин, и/или ламинин и/или белок в концентрации от 0,1 до 100 мкг/мл, предпочтительно в концентрации от 1 до 5 мкг/мл.
Коллагеновая структура имплантата может также дополнительно содержать факторы роста. В качестве факторов роста могут быть использованы эпидермальный фактор роста, и/или фактор роста фибробластов, и/или трансформирующий фактор роста α и β и/или фактор роста, выделяемый тромбоцитами, и/или фактор роста гепатоцитов в концентрациях от 1-300 нг/мл, предпочтительно в концентрации от 1 до 100 нг/мл.
Коллагеновая структура имплантата дополнительно может содержать также антисептики, такие как, например, ионы серебра, меди и золота; антибиотики, такие как, например, гентамицин в концентрации от 0,08 до 0,4 мг/мл геля, предпочтительнее в концентрации от 0,1 до 0,2 мг/мл, и/или любые другие антибиотики широкого спектра действия.
При необходимости коллагеновая структура может включать в себя пластификатор, обычно в количестве от 0,05 до 10 мас.%. Пластификатор выбирают, как правило, из группы полиэтиленгликоля, сорбита, глицерина и т.п.
Коллагеновая структура имплантата выполняет функцию носителя клеток и биологически активных компонентов. В готовом виде она имеет трехмерную форму и обладает характеристиками, соответствующими естественному микроокружению фибробластов, эпителиальных клеток и нейральных клеток in vivo. Белки внеклеточного матрикса и факторы роста способствуют процессам миграции, дифференцировки, пролиферации и активизации основных функций клеточных элементов имплантата, что, в свою очередь, позволяет добиваться ускорения процессов регенерации поврежденных тканей и органов.
Внутри коллагеновой структуры матрицы-носителя расположен, по крайней мере, один слой из биосовместимого полимера в форме сетки.
Указанный сетчатый слой может быть выполнен, например, из викриловой сетки с размерами ячеек от 1 до 5 мм, а предпочтительно от 1 до 3 мм или ее равноценного заменителя по свойствам: биосовместимость и эластичность.
Сетчатый слой, размещенный, в толще коллагеновой структуры, выполняет каркасную функцию, препятствует процессу сжатия имплантата и значительно упрощает процедуру его перенесения на рану пациента.
В качестве аллогенных клеток мезенхимы в составе имплантата используют фибробласты человека, выделенные из донорской кожи или мезенхимные стволовые клетки, выделенные из костного мозга, жировой ткани или иного донорского материала. Клетки мезенхимы предварительно культивируют in vitro и равномерно распределяют внутри коллагеновой структуры. Аллогенные клетки мезенхимы являются компонентом активации и формирования процесса регенерации и/или репарации соединительной ткани и кровеносной системы, а также клеток мезодермы, из которых образуются поперечно-полосатая мускулатура, например почки, внутренние половые органы и т.п.
В качестве аллогенных клеток эпителия в состав имплантата входят клетки эпидермиса кожи человека - кератиноциты, выделенные из биоптатов кожи реципиента, или донора после пластических операций, или их смесь. Клетки эпителия предварительно культивируют in vitro и наносят в виде суспензии на поверхность коллагеновой структуры. Аллогенные клетки эпидермиса являются компонентом активации и формирования процесса регенерации эпителиальных тканей.
В качестве нейральных прогениторных клеток в состав имплантата входят дедифференцированные клетки, выделенные из ретинального пигментного эпителия глаза. Нейральные прогениторные клетки предварительно культивируют in vitro, и равномерно распределяют внутри коллагеновой структуры. Нейральные прогениторные клетки, выделенные из ретинального пигментного эпителия глаза, являются компонентом активации и формирования процесса регенерации и/или репарации нервной ткани.
Таким образом, предлагаемый клеточный имплантат предоставляет в зоне трансплантации все условия, необходимые для производства ткани, делая возможным размножение, созревание и связывание необходимых для этого клеток с желаемой гистологией, при этом нейральные факторы работают в тандеме с факторами васкуляризации, что создает важные предпосылки для стимуляции трофики в поврежденном органе и ткани.
Заявленный клеточный имплантат можно производить серийно в промышленном масштабе для создания банка эквивалентов донорских тканей.
В случае, если клеточный имплантат был изъят из криохранилища, необходимо проверить жизнеспособность клеток, прошедших криоконсервирование, например, путем окрашивания пробы клеток трипановым синим или другим красителем, позволяющем отличить жизнеспособные клетки от погибших. При этом количество жизнеспособных клеток должно быть не менее 70% от их общего количества. Перед проведением дальнейших манипуляций клеточный имплантат необходимо в течение 30-40 минут выдержать при 37°C.
Пример 1. Приготовление клеточного имплантата для закрытия дефектов и восстановления иннервации в тканях и органах.
А. Приготовление раствора коллагена.
Коллаген I типа получают из сухожилий хвостов лабораторных крыс весом 200 г. Ампутированные хвосты погружают в 70% этанол на 1-2 ч. Все дальнейшие операции проводят в стерильных условиях. С помощью пинцета и ножниц отделяют сухожилия и помещают их в 0.1%-ный раствор уксусной кислоты. Для приготовления 1 л раствора коллагена используют сухожилия из 10 хвостов.
Экстракцию коллагена проводят при +4°C в течение 48 ч, после чего раствор центрифугируют при 2500 об/мин (2 ч, +4°C). Затем супернатант сливают в стерильную посуду и хранят при +4°C. Массовую долю коллагена в полученном растворе определяют при помощи высушивания до постоянного веса.
Б. Получение культур клеток постнатальных фибробластов кожи человека и кератиноцитов кожи человека.
Фибробласты культивируют на среде (полная ростовая среда): DMEM (Панэко, Россия), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS, HyClone, USA). 0,32 мг/мл глутамина. Пересев осуществляют при достижении монослоя, при помощи растворов Версена и трипсин-Версена.
Кератиноциты культивируют на среде (полная ростовая среда для кератиноцитов): DMEM/F12 (Панэко, Россия), 10% FBS (HyClone, USA), EGF 10 ng/ml, инсулин 5 µg/ml, трансферрин 5 µg/ml, изопротеринол 10 mM, глугамин 0,32 mg/ml. Пересев на коллагеновые микроносители осуществляют по достижению монослоя, при помощи растворов Версена и трипсин-Версена.
Г. Получение культуры нейральных прогениторных клеток из клеток ретинального пигментного эпителия глаза человека.
Выделение клеток ретинального пигментного эпителия осуществляют из трупных тканей глазных яблок человека. Для этого предварительно выделенное целое цилиарное тело глаза обрабатывают в течение 10 минут ферментным препаратом Accutase (Sigma, USA) при температуре 37°C. Механически удаляют строму и эпителий и разбивают ткань на отдельные клетки путем длительного пипетирования. Далее проводят ферментативную обработку гиалуронидазой (Hialuronidase (Sigma, USA)) и коллагеназой (Collagenase IV(Sigma, USA)) в течение 8 минут при температуре 37°C. Тройную отмывку от ферментов и получение суспензии отдельных клеток осуществляют кратковременным пипетированием.
Культивирование клеток проводят на двух средах: безсывороточной и сывороточной. При культивировании в безсывороточной среде используют среду NeuroCult с добавлением NeuroCult proliferation supplement (StemCell Technologies Inc, USA), и 20 ng/ml EGF(Sigma, USA), 20 ng/ml FGF-2(Sigma, USA), and 2 µg/ml Hepari (Sigma, USA) n, 0.1 g/l penicillin/streptomycin (Sigma, USA). Посев клеток осуществляют в 24-луночных платах в количестве 5×104 клеток /1.5 ml, и культивируют при температуре 37°C и атмосфере с 5% CO2. Частичную замену среды производят каждые два дня.
В сывороточной среде DMEM/F12 клетки ретинального пигментного эпителия культивируют с добавление 2% N2 (Sigma, USA), 20 ng/ml EGF (Sigma, USA), 20 ng/ml FGF-2(Sigma, USA), 2 µg/ml Heparin(Sigma, USA), 2 mM L-Glutamine(Sigma, USA), 0.1 g/l penicillin/streptomycin (Sigma, USA) and 1% fetal bovine serum (FBS), в 24-луночных платах в количестве 5×104 клеток / 1.5 ml, при 37°Cи атмосфере с 5% CO2. Частичную замену среды производят каждые два дня. Полученные нейросферы пассируют каждые 1-2 недели после образования при помощи ферментов Accutase.
Полученную клеточную культуру анализируют с использованием маркеров клеточного фенотипа и дифференцировки: nestin, vimentin, beta-tubulin III, neurofilaments, Ki-67, GFAP, recoverin calbindin, Th, CRALB, Cx43, Рах6, Oct4, Nanog.
Д. Изготовление клеточного имплантата.
Коллагеновый гель получают простым смешиванием всех его компонентов при температуре 0-(+4)°C.
Стерильный 0,34М раствор NaOH соединяют с концентрированной (×10) культуральной средой 199 в соотношении 1:2 и на каждые 100 мл смеси добавляют 100 мг глутамина, 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) (HyClone, USA) и 9 мл 7,5%-ного раствора бикарбоната натрия. В случае необходимости заменяют 10% FBS на среду DMEM равного объема. При необходимости к основным компонентам коллагенового геля вносят матриксные белки, факторы роста, антибиотики и/или антисептики.
В случае лечения раневых поверхностей значительной площади или наличия сопутствующего заболевания, препятствующего процессу восстановления дефекта, в состав коллагеновой структуры имплантата дополнительно могут быть внесены ростовые факторы, влияющие на активность клеток, в том числе: эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста фибробластов (FGF), трансформирующий фактор роста α и β (TGF), фактор роста, выделяемый тромбоцитами (PDGF), фактор роста гепатоцитов (HGF) или их сочетания в концентрациях от 1-300 нг/мл, а предпочтительно от 1 до 100 нг/мл.
Полученную смесь соединяют с охлажденным раствором коллагена в уксусной кислоте в соотношении 1:4 на ледяной бане для предотвращения преждевременной полимеризации. Получают коллагеновую структуру имплантата в форме коллагенового геля.
При желании коллагеновая структура имплантата может быть получена в форме губки. Для этого коллагеновый гель, изготовленный так, как описано выше, подвергают сублимационной сушке до сохранения содержания воды в пределах от 2 до 6%.
Сетчатую форму коллагеновой структуры имплантата получают путем заливки коллагенового геля в специальные формы с последующей сушкой при комнатной температуре.
По завершении процесса изготовления коллагеновой структуры имплантата в нее вносят суспензию фибробластов с концентрацией 75-100 тыс.кл./мл, суспензию нейральных стволовых клеток с концентрацией 75-100 тыс.кл./мл и ресуспендируют.
В емкости, предназначенные для изготовления имплантата, размещают полимерную сетку заданного размера и разливают еще не застывший гель со смесью клеток. Гель полимеризуют при 37°C в течение 10-20 мин. После полимеризации геля, для создания полноценного имплантата, на поверхность наносят суспензию кератиноцитов в концентрации 2*105 кл/см2 и культивируют в полной ростовой среде для кератиноцитов. Через 3 суток на поверхности геля образуется монослой эпителиальных клеток.
Полученный клеточный имплантат может быть подвержен криоконсервации в жидком азоте и оставлен для сохранения при отрицательных температурах на срок до 1 года.
Пример 2. Использования клеточного имплантата для замещения и регенерации тканей.
Экспериментальные исследования по изучению влияния трансплантации клеточного имплантата на регенерационные процессы в поврежденных тканях были проведены в опытах на лабораторных животных.
2.1. Оценка регенеративной способности клеточного имплантата на модели кожной раны у крыс.
Модель кожной раны получают следующим образом: с кожи на спине крысы в месте предполагаемого разреза удаляют шерсть (круг диаметром 6-7 см), и операционное поле обрабатывают антисептическим 2%-м раствором йода и 70%-ым этиловым спиртом. Далее хирургическим методом вырезают круглый участок кожи диаметром 3 см. Во избежание стягивания кожи, к краям раны изнутри подшивают стерильное кольцо диаметром 3,5 см, сделанное из поливинхлорида. После чего сверху рану накрывают толстым слоем стерильной марли, пропитанной антисептическим раствором, и фиксировали ее к коже клеем БФ-6, во избежание механического удаления повязки. Животных помещают в отдельные клетки.
Через 3 дня, животным под наркозом на поверхность раны наносят исследуемый клеточный имплантат. После чего опять накладывают защитную повязку. Через 10 дней крыс выводят из эксперимента, вырезают раны вместе с подлежащими тканями, фиксируют в течение ночи в растворе нейтрального 10% формалина и делают гистологические срезы по стандартной методике. Срезы окрашивают гематоксилин-эозином. Количество регенерирующихся аксонов подсчитывают с использованием электронной микроскопии.
Результаты испытаний показали, что при трансплантации клеточного имплантата под действием коллагеновой структуры имплантата с фибробластами происходит стимуляция контракции соединительной ткани и синтеза коллагена. Аллогенные фибробласты и кератиноциты продуцируют цитокины, в том числе интерлейкины, факторы роста фибронектин, коллаген IV типа, ламинин, тромбопластин и другие вещества, суммарный эффект действия которых выражается в стимуляции процессов регенерации поврежденных тканей. Нейральные клетки из ретинального пигментного эпителия глаза создают условия для регенерации нервных волокон. Аллогенные кератиноциты также создают условия для краевой эпителизации за счет формирования базальной мембраны. В дальнейшем аллогенный эпителий замещается гистотипическим.
2.2. Оценка регенеративной способности клеточного имплантата в тестах «открытое поле» и «условный рефлекс двустороннего избегания».
В сравнительных испытаниях на лабораторных животных исследуют заявленный клеточный имплантат, содержащий клетки ретинального пигментного эпителия глаза, и известный аналог - универсальный гетерогенный коллагеновый матрикс для имплантации, содержащий эмбриональные клетки мозга. Для этого имплантаты трансплантируют трем группам животных (две группы опытные и одна контрольная). Оценку влияния исследуемых имплантатов на регенерацию нервной ткани проводят в поведенческих тестах и морфологическими методами.
В поведенческих тестах «открытое поле» и «условный рефлекс двустороннего избегания» оценивают функциональное состояние нервной системы животных после трансплантации. Результаты испытаний показали, что животные в группе с трансплантированными клетками ретинального пигментного эпителия глаза обучаются лучше, чем в группе с трансплантацией клеток мозга.
Количественный морфологический анализ показал, меньше всего нормальных и больше всего отечных нейронов в опытной группе, которой трансплантировали известный аналог. Наиболее сохраненные нейроны в группе с трансплантированными клетками ретинального пигментного эпителия глаза, где выявлено наибольшее число нормальных и наименьшее количество сморщенных клеток.
Таким образом, в экспериментах in vitro было показано, что применение предлагаемого клеточного имплантата для восстановления дефектов и иннервации в тканях и органах позволит повысить эффективность лечения благодаря комплексному воздействию на зону повреждения с восстановлением в них структурной целостности, иннервации и функций.
Claims (5)
1. Клеточный имплантат для закрытия дефектов и восстановления иннервации в тканях и органах, выполненный в виде объемной трехмерной тканеинженерной конструкции, включающий аллогенные клетки мезенхимы, клетки эпителия и матрицу-носитель, основа которой выполнена из многокомпонентной коллагеновой структуры, внутри которой расположен, по крайней мере, один слой из биосовместимого полимера в форме сетки, при этом клетки мезенхимы расположены внутри матрицы-носителя, а клетки эпителия нанесены на ее поверхность, отличающийся тем, что в коллагеновую структуру матрицы-носителя дополнительно включены нейральные прогениторные клетки, выделенные из ретинального пигментного эпителия глаза.
2. Имплантат по п.1, где коллагеновая структура выполнена в виде геля, губки или сетчатой формы.
3. Имплантат по п.1, где коллагеновая структура содержит компоненты, необходимые для поддержания и роста клеток.
4. Имплантат по п.1, где клетками мезенхимы являются фибробласты человека, выделенные из донорского материала.
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU125073U1 true RU125073U1 (ru) | 2013-02-27 |
Family
ID=
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2557890C1 (ru) * | 2014-06-11 | 2015-07-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Центральный научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии имени Н.Н. Приорова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "ЦИТО им. Н.Н. Приорова" Минздрава России) | Способ экспериментального хирургического лечения травматических повреждений спинного мозга с одновременным ускорением его регенерации |
RU2729937C1 (ru) * | 2019-11-15 | 2020-08-13 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр глазных болезней имени Гельмгольца" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ГБ им. Гельмгольца" Минздрава России) | Способ субретинальной трансплантации клеток ретинального пигментного эпителия (РПЭ), дифференцированных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, при атрофии ретинального пигментного эпителия в эксперименте |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2557890C1 (ru) * | 2014-06-11 | 2015-07-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Центральный научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии имени Н.Н. Приорова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "ЦИТО им. Н.Н. Приорова" Минздрава России) | Способ экспериментального хирургического лечения травматических повреждений спинного мозга с одновременным ускорением его регенерации |
RU2729937C1 (ru) * | 2019-11-15 | 2020-08-13 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр глазных болезней имени Гельмгольца" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ГБ им. Гельмгольца" Минздрава России) | Способ субретинальной трансплантации клеток ретинального пигментного эпителия (РПЭ), дифференцированных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, при атрофии ретинального пигментного эпителия в эксперименте |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2733838C2 (ru) | Способы получения тканей | |
US7319035B2 (en) | Biological scaffolding material | |
US20190247541A1 (en) | Preparation of artificial tissues by means of tissue engineering using fibrin and agarose biomaterials | |
US10071185B2 (en) | Compartmental extract compositions for tissue engineering | |
CN109152864B (zh) | 一种用于制备三维软骨类器官块的方法 | |
BR112015017174B1 (pt) | Enxerto de nervo de tecido manipulado para reparo de defeito de nervo periférico e método de preparação do mesmo | |
US20070286880A1 (en) | Inoculated spongiform scaffold for transplantation and tissue regeneration | |
KR102041360B1 (ko) | 탈세포화된 세포외 기질을 포함하는 직접교차분화 촉진용 조성물 및 이의 용도 | |
Penolazzi et al. | Extracellular matrix from decellularized wharton’s jelly improves the behavior of cells from degenerated intervertebral disc | |
Nosrati et al. | Stem cell-based therapeutic strategies for corneal epithelium regeneration | |
US20200078492A1 (en) | Process for obtaining a functional dermal substitute of decellurized amniotic membrane from the placenta combination with keratinocytes and its use as an agent for tissue regeneration of the skin | |
Jiang et al. | Using human epithelial amnion cells in human de-epidermized dermis for skin regeneration | |
Shirakata et al. | An exploratory study on the efficacy of rat dedifferentiated fat cells (rDFATs) with a poly lactic-co-glycolic acid/hydroxylapatite (PLGA/HA) composite for bone formation in a rat calvarial defect model | |
US7560275B2 (en) | Compositions and methods for generating skin | |
WO2013014435A1 (en) | Micro organ comprising mesenchymal and epithelial cells | |
RU2574017C1 (ru) | Средство для лечения ожогов и ран на основе цитокинов и факторов роста, секретируемых мезенхимными клетками человека, способ получения средства и способ лечения ожогов и ран | |
KR20170108325A (ko) | 성체줄기세포의 연골세포 분화용 조성물 및 분화 방법 | |
Chen et al. | Three-dimensional poly lactic-co-glycolic acid scaffold containing autologous platelet-rich plasma supports keloid fibroblast growth and contributes to keloid formation in a nude mouse model | |
RU125073U1 (ru) | Клеточный имплантат для закрытия дефектов и восстановления иннервации в тканях и органах | |
Yildirimer et al. | Tissue‐Engineered Human Skin Equivalents and Their Applications in Wound Healing | |
Myers et al. | Skin engineering and keratinocyte stem cell therapy | |
CN101327223B (zh) | 一种治疗骨坏死的药物及细胞支架 | |
KR20090094664A (ko) | 비점막 상피세포를 이용한 각막 또는 결막 조직 시트 | |
US20210220518A1 (en) | Producing method of the collagen-laminin matrix for healing ulcers, burns and wounds of a human skin | |
ES2353990B1 (es) | Elaboracion de tejidos artificiales mediante ingenieria tisular utilizando biomateriales de fibrina y agarosa. |