CN103230623A - 一种体外构建组织工程化神经的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种体外构建组织工程化神经的方法，采用三维微重力生物反应器，将种子细胞与神经导管在三维微重力环境下培养，培养条件为：将种子细胞悬液与神经导管放入注满完全培养基的旋转培养容器，细胞最终密度为1×10⁶/ml，37℃CO₂培养箱中培养，前24小时转速为10rpm，使细胞与神经导管充分接触，贴附；24小时后调整三维微重力生物反应器旋转速度，使神经导管悬浮于培养液中；培养7-14天后终止培养，即得到组织工程化神经。本发明方法可以使神经导管贴附的种子细胞数量更多且更均匀，有利于周围神经再生，采用皮肤源性前体细胞诱导分化的雪旺氏细胞更接近真正的雪旺氏细胞，更适合作为神经组织工程的种子细胞。

Description

一种体外构建组织工程化神经的方法

技术领域

本发明属于生物医学工程领域，具体涉及一种体外构建组织工程化神经的方法，特别涉及一种采用三维微重力生物反应器体外构建组织工程化神经的方法。

背景技术

世界上每年由于车祸、锐器、枪弹等外伤而造成周围神经挤压、牵拉、挫裂损伤的病例很多，对于短距离的周围神经缺损，可以利用神经自身的弹性和曲度，进行无张力的断端一期缝合来修补缺损。当缺损超过一定距离，无法进行无张力缝合时，必须进行神经移植。目前临床上最常用的是自体神经移植，并且作为周围神经修复的金标准。但是自体神经来源有限，移植的神经与原有神经在形态及功能上有所差别，而且势必会造成供区的失神经支配。同种异体神经或异种神经移植更是受到免疫排斥反应的限制，难以在临床上广泛开展应用。八十年代末，组织工程概念的提出及飞速发展给神经替代物的构建开辟了新的方向。组织工程的核心就是建立细胞与生物材料的三维空间复合体，即具有生命力的活体组织，用以对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代。运用带有种子细胞的组织工程化神经来修复周围神经损伤已经成为一个研究热点。

过去的方法均是将各类神经支架材料先移植入动物体内，再向其内注入种子细胞，但是直接注射法存在种子细胞流失、细胞状态未知等诸多不稳定因素，很难标准化。因此，如何获取促再生能力强，构建条件标准化的组织工程神经成为研究的热点。通过组织工程技术在体外制备生物活性良好的组织工程神经并广泛应用于临床需要解决一系列技术和工艺问题，包括：种子细胞如何高效均匀接种于支架材料上、大体积组织工程神经中心供养、组织工程神经的最佳体外培养时间和方式等。因此，生物反应器的合理应用有望解决上述产业化问题，其中三维微重力旋转培养系统具有剪切力小、传质作用好等优点，绕水平轴旋转的生物反应器在一定转速下具备模拟微重力环境的特性。由于模拟微重力环境可使细胞、组织培养摆脱重力的影响，实现更接近体内生存环境的三维培养，可能更有利于种子细胞体外增殖，细胞间的物质交换、提高种子细胞密度、促进种子细胞分泌细胞外基质。研究表明，神经干细胞与去细胞基质在模拟微重力环境下实验表皮样组织重建。胎鼠肝细胞通过应用生物反应器促进肝组织以及血管的发育。同时采用该方法培养的组织工程骨具有较传统静置培养法和即刻构建法获得的组织工程骨具有更好的成骨活性。科技文献《运用组织工程学原理构建间充质干细胞的三维培养体系》（付文玉，路艳蒙，乔东访等，潍坊医学院学报，2003年第25卷第3期，169-172）将人间充质干细胞与和人发角蛋白模拟微重力条件下培养，结果表明模拟微重力条件有利于人间充质干细胞的三维培养体系的构建。

科技文献《运用组织工程学原理构建许旺细胞三维培养体系》（黎志明，朱家恺，程钢等，中华显微外科杂志2001年2月第24卷第1期，33-35）对聚羟基乙酸细丝支架进行化学改性处理后再以层粘连蛋白进行生物学修饰，模拟微重力条件下把原代许旺细胞悬液接种在支架材料上,观察许旺细胞的粘附生长情况。结果表明模拟微重力环境有利于构建许旺细胞的三维培养体系。

目前微重力的作用机制尚未阐明,不同种类细胞对微重力的反应可能截然不同，且目前也没有文献对不同种类细胞在微重力下对结构复杂的支架贴附情况进行研究，因而开展不同种类细胞以及复杂结构支架的微重力三维培养的研究制备组织工程化神经，对临床神经缺损的修复具有指导性的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种体外构建组织工程神经的方法。特别是利用三维微重力生物反应器将种子细胞培养于支架材料上。

本发明具体技术方案为：

一种体外构建组织工程化神经的方法，采用三维微重力生物反应器，将种子细胞与神经导管在三维微重力环境下的培养，其特征在于培养条件为：将种子细胞悬液与神经导管放入注满完全培养基的旋转培养容器，细胞最终密度为1×10⁶/ml，旋转式生物反应器放入37℃CO₂培养箱中，前24小时转速为10rpm，使细胞与神经导管充分接触，贴附；24小时后逐步提高三维微重力生物反应器旋转速度，使神经导管悬浮于培养液中；培养7-14天后终止培养，即得到组织工程化神经。

由于神经导管的规格（材质、长度、内径等）不同，使其悬浮于培养液中的转速也有所不同，且随着培养时间的延长，贴附与神经导管上的细胞的数量也在不断增加，因此需要灵活调整三维微重力生物反应器旋转速度，逐步提高转速使得神经导管悬浮于培养液中。一般而言，转速范围为18-25rpm。

本发明所述种子细胞优选皮肤源性前体细胞诱导分化的雪旺氏细胞。

本发明所述神经导管由丝素蛋白、壳聚糖、聚乙醇酸、聚己内酯、胶原、聚乳酸、明胶中的一种或几种制成。神经导管内部还可以含有纤维，所述纤维由丝素蛋白、壳聚糖、聚乙醇酸、聚己内酯、胶原、聚乳酸、明胶中的一种或几种制成。优选神经导管是表面多孔的壳聚糖导管，导管内部含有聚乳酸-羟基乙酸共聚物纤维或蚕丝丝素纤维。

本发明所述所述神经导管内外表面还可以包被有层粘连蛋白和/或多聚赖氨酸。

本发明所述的方法具体包括如下步骤：

(1)种子细胞的制备

方法参照文献NATURE PROTOCOLS,2006(1):2803-2812，简述如下：取新生SpragueDawley大鼠皮肤组织，得到皮肤前体细胞球，传代纯化培养，将获得的皮肤前体细胞球机械分离，贴壁并诱导分化为雪旺氏细胞，将雪旺氏细胞体外扩增培养，冻存备用。

(2)神经导管的制备

神经导管可采用本领域技术人员常用的组织工程神经移植物，优选表面多孔的壳聚糖导管，如50-90%、孔径50-300μm的具有多孔结构、抗拉强度高的神经导管，管状本体内径为0.5-8mm，壁厚0.1-3mm。具体可参照专利申请号为CN201110324474.8，名为“组织工程神经移植物及其用途”中所述的方法制得。或者优选纳米纤维蚕丝丝素蛋白导管，具体可参照专利申请号为CN200910034583.9，公开号为CN101664346，名为“静电纺丝制备的人工神经移植物及其制备方法和专用装置”中所述的方法制得。或者优选使用表面多孔的壳聚糖导管外壳或纳米纤维蚕丝丝素蛋白导管外壳，导管内部充填入丝素蛋白纤维的复合型神经导管，丝素蛋白纤维的制备可参照专利申请号为CN200910034583.9，公开号为CN101664346，名为“静电纺丝制备的人工神经移植物及其制备方法和专用装置”中所述的方法制得，或者可使用市售聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纤维（南通华利康医疗器械有限公司，N405）。纤维的数量根据导管的内径不同而有所不同，通常按照每毫米内径200根的比例放置。

[0013]上述神经导管用层粘连蛋白(0.02mg/ml)及多聚赖氨酸(0.2mg/ml)混合液包被过夜备用。

(3)种子细胞与支架材料在三维微重力环境下的培养

将步骤（1）制备的种子细胞悬液与步骤（2）制备的神经导管放入注满完全培养基的旋转培养容器，细胞最终密度为1×10⁶/ml，三维微重力生物反应器放入37℃CO₂培养箱中，前24小时转速为10转/分钟，使细胞与神经导管充分接触，贴附。24小时后逐步提高三维微重力生物反应器旋转速度，使神经导管能悬浮到培养液中。培养期间每三天换液，更换500ml储液瓶。培养7-14天后终止培养，即得到组织工程化神经。

所述的实验操作均在无菌条件下完成。

所述种子细胞的分离培养及体外扩增均采用相应领域公认的方法。

本发明优点：

1.本发明采用复杂结构的神经导管，相对于现有技术采用的聚羟基乙酸(PGA)细丝或人发角蛋白而言，导管结构更有利于周围神经的再生，且表面积更大，可以贴附更多的种子细胞；

2.现有技术中多采用雪旺氏细胞或骨髓间充质干细胞，由于雪旺氏细胞体外培养很难达到实际移植所需的数量，且雪旺氏细胞传代后形态和功能也逐渐改变，科技文献《运用组织工程学原理构建许旺细胞三维培养体系》（黎志明，朱家恺，程钢等，中华显微外科杂志2001年2月第24卷第1期，33-35）中公开的10³/ml的细胞密度远远不能满足真正意义上神经组织工程的需要。而通过基因修饰所得到的雪旺氏细胞永生株，其分泌神经营养因子的能力显著下降。此外，雪旺氏细胞自体移植常面临二次损伤，异体移植面临免疫排斥反应，其临床前景堪忧。

骨髓间充质干细胞从发育生物学的角度讲是来自于中胚层的细胞，而雪旺氏细胞是来自外胚层的细胞分化而来，骨髓间充质干细胞分化为雪旺氏细胞属于跨胚层分化，目前仍存争议。本发明所采用的皮肤源性前体细胞（SKPs）为近年发现的存在于皮肤基底层和毛囊隆突部的一种与神经同起源于外胚层的多潜能细胞。皮肤源性前体细胞具有骨髓间充质干细胞所有优点，同时它是外胚层来源的细胞，避免了跨胚层分化的问题，皮肤源性前体细胞诱导分化的雪旺氏细胞更接近真正的雪旺氏细胞，更适合作为神经组织工程的种子细胞。

由于不同种类细胞对微重力的反应不经相同，在培养过程中，发现若采用现有技术中的转速，会导致贴附在神经导管上的细胞大量凋亡并脱落，本发明首次创立了利用皮肤源性前体细胞诱导分化的雪旺氏细胞体外构建组织工程化神经的方法，采用先低速培养再逐步高速培养的方式，使细胞先在低速下贴附在神经导管上，再进行快速生长。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1是皮肤来源前体细胞在相差显微镜下的形态和鉴定结果（A.相差显微镜下形态;B.皮肤来源前体细胞Fibronectin和Nestin免疫荧光阳性,C.皮肤来源前体细胞Vimentin和Versican免疫荧光阳性)。

图2是皮肤来源前体细胞诱导分化的雪旺氏细胞免疫荧光检测结果。

图3是用CCK-8法检测细胞在三维微重力旋转培养及传统静止培养过程中细胞活力及增殖状况。

图4是构建完成的组织工程化神经结晶紫染色后的组织学观察结果（A为三维微重力旋转培养，B为传统静止培养）。

图5是构建完成的组织工程化神经扫描电镜的观察结果（A、B是壳聚糖导管内壁，C、D是PLGA纤维表面；A、C为三维微重力旋转培养，B、D为传统静止培养）。

图6是构建完成的组织工程化神经抗S100抗体免疫荧光的观察结果（A、B是PLGA纤维表面，C、D是壳聚糖导管内壁；A、C为三维微重力旋转培养，B、D为传统静止培养）。

具体实施方式：

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

下述实施例中所用的三维微重力生物反应器由美国航空航天局（NASA）设计，型号是RWVB，由美国Synthecon公司制造。

实施例1、大鼠皮肤来源前体细胞的分离培养、纯化及鉴定

取出生后1-3d的SPF级SD大鼠，75%酒精消毒后，无菌条件下断头处死，剪取背部皮肤组织，机械剥离除去皮下组织至皮片较透明，PBS冲洗3次，将皮肤组织剪成1mm²的小组织块，浓度1mg/ml的XI型胶原酶37℃消化，每15min吸管反复吹打一次，消化30-60min，加入20ml DMEM/F12(3:1)培养基清洗组织，1200rpm离心10min弃上清，再加入1ml新鲜的DMEM/F12培养基，用1ml枪头反复吹打组织使得细胞与组织脱离，此过程反复3-4次，每次可以再加入1ml培养基。最后，1200rpm离心10min，弃上清，用含FGF2（40ng/ml）、EGF（20ng/ml）、及B27（2%）的DMEM/F12(3:1)培养基重悬细胞，显微镜下计数，以约2.5×10⁴/ml的密度将细胞种植在75cm²的培养皿中培养。细胞每三天加液1-2ml含FGF2、EGF、及B27的新鲜培养基，每8-10天传代一次，传代时将悬浮的细胞收集、离心弃上清、重悬，1mg/ml的XI型胶原酶37℃消化10-20min，反复轻柔吹打，机械分离细胞球，镜下观察至大部分细胞呈单细胞悬浮状态后，加入20ml含10%FBS的DMEM/F12(3:1)培养基清洗，1200rpm，离心10min，弃上清，完全培养基重悬，按1:2的比例传至培养瓶中继续培养。皮肤来源前体细胞在相差显微镜下的观察结果见图1A，免疫荧光检测鉴定结果见图1(B,C)。

实施例2、大鼠皮肤来源前体细胞向雪旺氏细胞的诱导分化、扩增及鉴定。

将获得的P2-P4代的大鼠皮肤来源前体细胞用1mg/ml的XI型胶原酶37℃消化10-20min，反复轻柔吹打，机械分离细胞球，将单细胞悬液按照5×10⁴/ml的密度种植在预先用Laminin（0.02mg/ml）和Poly-D-lysine(0.2mg/ml)包被的75cm²培养皿中培养，用含FGF2（40ng/ml）、EGF（20ng/ml）、B27（2%）及FBS(5%)的DMEM/F12(3:1)培养基培养3天，3天后将培养基更换为含Forskolin（5μM）、Heregulin-1(50ng/ml)、N₂(2%)及FBS(2%)的DMEM/F12(3:1)培养基培养14-21天可以获得雪旺氏细胞集落，将雪旺氏细胞集落挑取并扩增、冻存备用。皮肤来源前体细胞诱导分化的雪旺氏细胞免疫荧光检测结果见图2。

实施例3、神经导管的制备。

参照专利申请号为CN201110324474.8，名为“组织工程神经移植物及其用途”中所述的方法制得壳聚糖神经导管，将静电纺丝制得的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纤维穿入壳聚糖神经导管中（每毫米内径200根），用层粘连蛋白(0.02mg/ml)及多聚赖氨酸(0.2mg/ml)混合液包被过夜备用。所述支架材料使用Co60辐照或环氧乙烷灭菌。

实施例4、大鼠皮肤来源前体细胞分化的雪旺氏细胞与壳聚糖及聚乳酸乙醇酸共聚物神经导管分别用三维微重力旋转培养和用传统静止培养法培养。

以使用250ml培养容器为例，将200ml完全培养基通过蠕动泵缓慢注入培养容器，再加入2.5×10⁸个细胞及实施例3制得的神经导管，再以蠕动泵缓慢注满整个容器，细胞最终密度为1×10⁶/ml，排尽系统内空气后，开始旋转微重力循环灌注培养。旋转式生物反应器放入37℃CO₂培养箱中，前24小时转速为10转/分钟，使细胞与支架材料充分接触，贴附。24小时后调整旋转式生物反应器旋转速度，使支架材料能悬浮到培养液中。培养期间每三天换液，更换500ml储液瓶，7-14天后终止培养，体外构建组织工程化神经完成。

另外，将神经导管放入装有密度为1×10⁶/ml种子细胞悬液的培养皿中，并将其放入37℃CO₂培养箱中静止培养，培养期间每三天换液，与旋转培养在相同时间点终止培养并一同做以下相关检测。

实施例5、体外构建的组织工程化神经的活力检测、组织学观察及免疫荧光检测。

将实施例4构建完成的组织工程化神经PBS浸洗三次，10分钟/次。加CCK-8溶液，37℃CO₂培养箱中继续培养2小时，设单纯神经导管为空白对照，酶标仪在450nm进行吸光值测定。检测结果见图3，结果显示三维微重力旋转培养组和传统静止培养组均在培养7天时细胞数量及活力达到最佳，前者随后基本维持一定的水平，而后者随后细胞数量及活力先略有下降并维持在一定的水平。三维微重力旋转培养组天时细胞数量及活力在7天后优于传统静止培养组。

将实施例4构建完成的组织工程化神经PBS浸洗10分钟，加4%的甲醛溶液固定30分钟，PBS浸洗三次，10分钟/次。加结晶紫染液，室温染色30分钟，双蒸水浸洗至浸洗液不再有颜色，将导管剖开，甘油封片，显微镜下观察拍照。构建完成的组织工程化神经结晶紫染色后的组织学观察结果见图4，结果显示三维微重力旋转培养组细胞在神经导管表面生长良好，与传统静止培养相比贴壁细胞数量显著增多。

将实施例4构建完成的组织工程化神经PBS浸洗10分钟，加4%戊二醛固定24小时，PBS浸洗三次，10分钟/次，再加1%的锇固定2小时，PBS浸洗三次，10分钟/次，梯度乙醇脱水，室温晾干，镀铂膜，扫描电镜观察，结果见图5（A、B是壳聚糖导管内壁，C、D是PLGA纤维表面；A、C为三维微重力旋转培养，B、D为传统静止培养）结果显示三维微重力旋转培养组细胞在神经导管及纤维表面均匀生长，与传统静止培养相比贴壁细胞数量较多，形态较立体。

将实施例4构建完成的组织工程化神经PBS漂洗10分钟，加封闭液37℃封闭1小时。倾去封闭液，加兔抗S100多克隆抗体（稀释度1：400），4℃孵育24～48小时。PBS洗3次，加FITC标记的羊抗兔IgG(稀释度1：200),4℃孵育过夜。PBS洗3次，荧光封片液封片，在荧光显微镜下采图，结果见图6（A、B是PLGA纤维表面，C、D是壳聚糖导管内壁；A、C为三维微重力旋转培养，B、D为传统静止培养）。结果显示三维微重力旋转培养组在神经导管及纤维表面生长皮肤来源前体细胞分化的雪旺氏细胞，经过三维微重力刺激后其形态和蛋白标志物均未发生变化，而且S100免疫荧光阳性的细胞数量较传统静止培养显著增多。

Claims (6)

1.一种体外构建组织工程化神经的方法，采用三维微重力生物反应器，将种子细胞与神经导管在三维微重力环境下的培养，其特征在于培养条件为：将种子细胞悬液与神经导管放入注满完全培养基的旋转培养容器，细胞最终密度为1×10⁶/ml，旋转式生物反应器放入37℃CO₂培养箱中，前24小时转速为10rpm，使细胞与神经导管充分接触，贴附；24小时后逐步提高三维微重力生物反应器旋转速度，使神经导管悬浮于培养液中；培养7-14天后终止培养，即得到组织工程化神经。

2.如权利要求1所述的体外构建组织工程化神经的方法，其特征在于所述种子细胞为皮肤源性前体细胞诱导分化的雪旺氏细胞。

3.如权利要求1所述的体外构建组织工程化神经的方法，其特征在于所述神经导管由丝素蛋白、壳聚糖、聚乙醇酸、聚己内酯、胶原、聚乳酸、明胶中的一种或几种制成。

4.如权利要求3所述的体外构建组织工程化神经的方法，其特征在于所述神经导管内部还含有纤维，所述纤维由丝素蛋白、壳聚糖、聚乙醇酸、聚己内酯、胶原、聚乳酸、明胶中的一种或几种制成。

5.如权利要求4所述的体外构建组织工程化神经的方法，其特征在于所述神经导管是表面多孔的壳聚糖导管，导管内部含有聚乳酸-羟基乙酸共聚物纤维和/或蚕丝丝素纤维。

6.如权利要求1-5之一所述的体外构建组织工程化神经的方法，其特征在于所述神经导管内外表面包被有层粘连蛋白和/或多聚赖氨酸。

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