CN110106148A - 一种组织工程化神经组织及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了属于组织工程技术领域的一种组织工程化神经组织及其构建方法。本发明使用蚕丝丝素蛋白和胶原复合材料，以原代皮层神经元为种子细胞进行三维培养，形成一种组织工程化的神经组织。其操作步骤简单，容易重复，没有特殊的工艺或设备要求。该体系下构建的神经组织产生具有丰富网络连接的神经网络。本发明使用到的丝素蛋白其机械性能适合于神经细胞接种及培养，其弹性模量与大鼠脑组织相接近。

Description

一种组织工程化神经组织及其构建方法
技术领域
本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种组织工程化神经组织及其构建方法。
背景技术
人脑是神经系统最高级部分，是中枢神经中最大和最复杂的结构，是调节机体功能的器官，也是意识、精神、语言、学习与记忆等高级神经活动的物质基础。人脑结构复杂，有着丰富的沟回褶皱、复杂的神经网络及突触联结型式。为了洞悉脑的基本单元，例如神经网络的形成和活动规律，可以使用体外的脑研究模型，来概括天然脑组织结构和功能的复杂性。体外脑模型旨在重建脑组分的基本结构并在可控的实验条件下进行脑的细胞生物学研究。
中枢神经系统(CNS)可能受到各种疾病的影响，如血管，结构，功能，传染性或退行性疾病。每年有680万人因神经系统疾病而死亡，只有少数疾病有可用的治疗方法。许多CNS靶向疗法在临床试验期间失败，部分原因是由于使用了不充分的临床前研究模型，这些模型不允许通过生理相关功能读数评估急性和慢性影响，进一步推动了人们对于体外脑模型的需要。利用组织工程策略能够构建出良好的体外组织工程化神经组织以满足临床需要。
目前对神经网络的生物学和信号处理的了解主要源自二维培养的原代脑来源的细胞。二维培养相对简单，是传统的分析方法，现在广泛认为基于组织工程策略体外三维培养构建的组织相比传统的二维培养更加能够反应体外真实微环境。近年来，诸多三维组织模型已经用于重塑脑疾病表型例如阿尔茨海默病或头小畸形症，表明这些三维组织模型可用作为研究发育生物学模型、神经电生理模型、药物筛选与评价模型。
已有关于三维组织的专利，如公开号为CN2013446628A、CN103877623A的专利，但几乎全是外周神经组织工程构建的产品，而中枢神经组织构建及其相应的方法未见专利申请。公开号为CN102228718A的专利公开了一种组织工程化神经组织及其构建方法，该技术方案使用到的胶原/Matrigel胶为水凝胶类生物材料，其质地较弱，力学性能相较神经细胞来说不适合，而且也容易降解。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种组织工程化神经组织及其构建方法。
为达到上述目的，采用如下技术方案：
一种组织工程化神经组织及其构建方法，按照如下步骤进行：
(1)制备浓度为6-12％的丝素蛋白溶液；
(2)制备多孔支架，用直径6mm的punch打孔，裁剪支架材料厚度在2-3mm，接种前进行高压灭菌；
(3)分离培养MEF细胞并进行脱细胞处理；
(4)分离神经元；
(5)细胞接种：细胞接种前，使用培养基浸泡细胞衍生的细胞外基质修饰的支架材料1小时，吸除细胞培养基；使用细胞种植液对细胞进行重悬，接种前吸干支架材料上多余的水分，使用10ul的细胞悬液在材料上进行接种，使每个支架材料上接种2x106cells/scaffold/10μl，然后置于孵箱内过夜，8小时后沿着孔板管壁添加细胞维持液；
(6)长期培养：将构建的样品从96孔板转移到24孔板中，并添加细胞维持液，确保构建体完全浸没于培养液中以获取充分的营养交换，接下来的培养需要隔天半量换液。
步骤(1)所述丝素蛋白溶液的制备方法为：称取4.24g碳酸钠溶于2L水中，煮沸，称取5g蚕茧碎片，在碳酸钠溶液煮30分钟，不断搅拌，然后取出剩余的丝素蛋白，使用蒸馏水反复洗涤至少三次，拧干，通风橱里干燥过夜，第二天将丝素蛋白在9.3M LiBr溶液中，60℃条件下溶解4小时；将丝素蛋白溶液透析48小时后，置于离心管内，4℃条件下，12000rpm离心30分钟，上清液转移到新的离心管内，测量丝素蛋白的浓度，使其达到6-12％。
步骤(2)所述制备多孔支架的方法为：称取粒径为500μm以下的盐4g，在模具中添加2ml丝素蛋白溶液，在旋转模具的同时将盐缓慢地倒入模具中丝素蛋白溶液的顶部，使盐均匀落下，轻拍除去气泡，然后盖上模具的盖子，室温下放置1-2天以凝胶化；凝胶后将模具置于超纯水中，不断搅拌2天，以置换出盐，每天更换2-3次水，最后从模具中取出支架材料。
步骤(3)所述分离培养MEF细胞并进行脱细胞处理的方法为：取孕14-16天的ICR孕鼠的胚胎，去除头部、尾部、内脏器官，分离四肢，剪碎组织，用0.05％胰酶对组织进行消化，使用含有胎牛血清的培养基进行终止消化；分别使用100目、200目筛网进行过滤，1000rpm离心细胞5min；对细胞进行重悬，使用P1-P3代的MEF进行支架材料的接种，接种前MEF细胞使用丝裂霉素进行处理，以每个支架材料1x106个细胞的密度进行接种，以90％DMEM+10％胎牛血清的培养基进行培养，培养10天以保证大量的细胞外基质分泌，使用0.5％TrixonX-100+20μM氨水试剂进行脱细胞处理5分钟，移除脱细胞液，使用PBS清洗3遍。
步骤(4)所述分离神经元的方法按照如下步骤进行：
1)提取大脑皮层组织：取60mm皿，放入3-5℃的PBS缓冲液，且置于冰板上，取出SD大鼠孕鼠羊膜囊中的胚胎置于4℃PBS缓冲溶液中，剪下胚胎的大脑，取出脑组织，提取大脑皮层，之后将提取的大脑皮层组织置于60mm皿中，吸出多余的PBS液体，机械分离组织及剪碎；
2)组织消化：将剪碎的组织中添加0.05％胰酶，置于37℃孵箱中消化30分钟；
3)分离细胞：转移至离心管中，添加DMEM液体，吹打未消散的聚团，之后添加含有血清的培养基终止消化，过滤，仅保留单细胞，对细胞悬液1000rpm离心5分钟。
步骤5)和步骤6)所述细胞种植液包括90％DMEM、10％马血清及5％胎牛血清，细胞维持液包括90％DMEM、10％马血清。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：现有技术几乎全是外周神经组织工程构建的产品，并没有关于中枢神经组织构建及其相应的方法的技术公开。本发明使用蚕丝丝素蛋白和胶原复合材料，以原代皮层神经元为种子细胞进行三维培养，形成一种组织工程化的神经组织。其操作步骤简单，容易重复，没有特殊的工艺或设备要求。该体系下构建的神经组织可以产生具有丰富网络连接的神经网络。使用到的丝素蛋白其机械性能适合于神经细胞接种及培养，其弹性模量与大鼠脑组织相接近。
附图说明
图1为通过扫描电镜观察丝素蛋白海绵内部微观结构图。
图2为大鼠脑组织的应力-应变曲线图。
图3为丝素蛋白海绵的应力-应变曲线图。
图4为MEF衍生的脱细胞支架的修饰支架材料免疫荧光染色图；
图5为支架材料上神经元的活力图。
图6为免疫荧光染色图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
实施例1
(1)提取丝素蛋白溶液：将蚕茧剪成指甲大小左右的碎片。准备2L Na2CO3溶液(4.24g碳酸钠溶于2L水中)将其煮沸，称取5g蚕茧碎片，在碳酸钠溶液煮30分钟，使用搅拌棒不断搅拌，去除丝胶蛋白。取出剩余的丝素蛋白，使用蒸馏水反复洗涤至少三次，以充分去除残余的丝胶蛋白及其他杂质。丝素蛋白拧干，通风橱里干燥过夜。第二天将丝素蛋白溶液9.3M LiBr溶液中，60℃下溶液4个小时。准备MWCO3500的透析袋，使用注射器将溶液的丝素蛋白溶液装入透析袋中，使用蒸馏水透析48小时，每隔几个小时更换一次水。将透析袋内的丝素蛋白溶液置于离心管内，4℃条件下，12000rpm离心30分钟，去除多余杂质，上清转移到新的离心管内，测量丝素蛋白的浓度，以达到6-12％。
(2)准备多孔支架：从上到下分别使用1mm、800μm、600μm、500μm孔径的筛网对NaCl颗粒进行筛分，丢弃500μm以上的颗粒。称量4g盐，在模具中添加2ml丝素蛋白溶液，在旋转模具的同时将盐缓慢地倒入模具中丝素蛋白溶液的顶部，使得盐均匀的落下，轻拍除去气泡。盖上模具的盖子，在室温下放置1-2天以凝胶化。凝胶后将模具置于装有超纯水的烧杯中，搅拌以置换出盐。不断搅拌2天，每天更换2-3次水，从模具中取出支架材料，根据需要裁剪支架，这里我们使用直径6mm的punch进行打孔，裁剪支架材料厚度在2mm左右。支架材料储存于4℃直到使用。
(3)分离培养MEF细胞并进行脱细胞处理：取孕14-16天的ICR孕鼠，断颈处死并浸泡于75％酒精中进行消毒，剖腹取出胎，使用冰PBS进行冲洗。去除头部、尾部、内脏器官等，分离四肢，使用无菌剪刀对组织进行剪碎，0.05％胰酶对组织进行消化，使用含有胎牛血清的培养基进行终止消化。分别使用100目、200目筛网进行过滤，离心细胞(1000rpm，5min)。对细胞进行重悬，这里使用P1-P3代的MEF进行支架材料的接种，接种前MEF细胞使用丝裂霉素进行处理，以每个支架材料1x106个细胞的密度进行接种，以90％DMEM+10％胎牛血清的培养基进行培养。培养10天以保证大量的细胞外基质分泌，对支架上的细胞进行脱细胞处理，使用0.5％TrixonX-100+20μM氨水的脱细胞试剂处理细胞5分钟，后移除脱细胞液，使用PBS清洗3遍。支架上的细胞外基质可以在4℃储存最多一周。
(4)分离神经元：准备一个冰板，冰板上放置多个60mm皿，向60mm皿中加入从4℃刚拿出的PBS缓冲液。选用E16-E18的SD大鼠孕鼠，断颈处死，使用75％酒精喷洒孕鼠下腹部，使用剪刀剪开皮肤和肌肉，暴露子宫，从羊膜囊中取出胚胎，置于PBS中，清洗胚胎，置于新的PBS中。使用剪刀将大脑剪下来，清洗干净后置于新的装有PBS的皿中。在解剖显微镜下，使用镊子，对皮肤和头骨进行剥离，从中取出脑组织，使用眼科镊将大脑左右半球分开，去除中脑等仅保留大脑皮层，剥离脑膜。将提取的大脑皮层组织置于一个新的60mm皿中，吸出多余的PBS液体，使用剪刀对组织进行机械分离及剪碎，组织碎块剪的越碎越好，以上这些步骤置于冰板上，并且控制时间在1小时以内。添加0.05％胰酶，对组织碎块进行消化。一般10个胚胎的皮层碎块添加大约5ml左右的胰酶，置于37℃孵箱中消化30分钟，其中15分钟拿出来拍打一下，以免组织碎块聚集成团。30分钟后，取出转移至50ml离心管中，添加30ml左右的DMEM液体，使用10ml的吸管对离心管内聚团或者未消散的团块进行吹打，可以帮助因粘稠而聚集在一起的组织分离成单细胞，而后添加含有血清的培养基进行终止消化。依次使用100目、200目的筛网对细胞悬液进行过滤，去除未消散的组织团块，仅保留单细胞。对细胞悬液进行计数，大约1个胚胎分离得到1x107个细胞。对细胞悬液进行离心，1000rpm5分钟。
(5)细胞接种：细胞接种前，使用培养基浸泡细胞衍生的细胞外基质修饰的支架材料1小时，将96孔板内支架材料中的细胞培养基吸除。使用种植液(90％DMEM+10％马血清+5％胎牛血清)对细胞进行重悬，保证每个支架材料上接种2x106cells/scaffold/10μl，使用10ul的细胞悬液在材料上进行接种，同时在细胞接种之前，吸干支架材料上多余的水分，以保证后续细胞的完全吸出以及没有过多的细胞从支架上流失。将96孔板置于孵箱内过夜以保证细胞粘附到指甲表面。8小时后沿着孔板管壁添加细胞维持培养基(90％DMEM+10％马血清)。
(6)长期培养：第二天，使用无菌镊子将构建的样品从96孔板转移到24孔板中，并添加1ml培养基/孔。确保构建体完全浸没于培养基中获取充分的营养交换。接下来的培养，需要隔天半量换液。
实施例2
1.扫描电镜观察及力学测试
通过扫描电镜观察丝素蛋白海绵内部微观结构如图1所示，通过Instron力学测试仪，对支架材料和新鲜分离1小时的大鼠脑组织分别进行线性压缩实验，得到的应力-应变曲线如图2、3所示，结果发现大鼠脑组织压缩到40％位移时载荷为0.07Kgf，丝素蛋白海绵压缩到40％位移时载荷为0.10Kgf。
2.MEF衍生的脱细胞支架的修饰支架材料免疫荧光染色
通过免疫荧光染色，表征支架材料上留存的细胞外基质蛋白组分(Fibronection、Laminin、CollagenⅠ、CollagenⅢ、CollagenⅣ、F-actin)
如图4所示
3.支架材料上神经元的活力检测
通过Live/Dead染色，对支架材料上培养7天神经元的活力进行检测，结果如图5所示，大部分神经元活力较好，神经元在丝素蛋白/胶原复合材料中粘附、轴突逐渐延伸，细胞生长情况好。
4.构建体免疫荧光染色
收集培养了7天的构建样品，PBS清洗3遍，使用4％多聚甲醛固定构建样品(室温下固定至少1小时)。而后PBS清洗3次，每次5分钟，使用0.3％TritonX-100处理30分钟，吸除TritonX-100后添加5％山羊血清进行封闭，置于37℃下封闭30分钟。吸除血清，添一抗(神经元特异性marker：Tuj1)置于4℃下孵育过夜。第二天，吸除一抗，使用PBS清洗3次，每次5分钟。吸除PBS，添加二抗，室温避光条件下孵育2小时。吸除二抗，PBS清洗3次，添加DAPI染色液，室温避光条件下孵育30分钟。而后PBS清洗3次，将构建体置与PBS溶液中，4℃下保存。对构建体进行免疫荧光染色(Tuj1，绿色)，并利用共聚焦显微镜进行三维成像，如图6所示，培养了7天的组织工程化构建体，其神经元之间可以形成具有丰富连接的复杂神经网络。
以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种组织工程化神经组织及其构建方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
(1)制备浓度为6-12％的丝素蛋白溶液；
(2)制备多孔支架，用直径6mm的punch打孔，裁剪支架材料厚度在2-3mm，接种前进行高压灭菌；
(3)分离培养MEF细胞并进行脱细胞处理；
(4)分离神经元；
(5)细胞接种：细胞接种前，使用培养基浸泡细胞衍生的细胞外基质修饰的支架材料1小时，吸除细胞培养基；使用细胞种植液对细胞进行重悬，接种前吸干支架材料上多余的水分，使用10ul的细胞悬液在材料上进行接种，使每个支架材料上接种2x106cells/scaffold/10μl，然后置于孵箱内过夜，8小时后沿着孔板管壁添加细胞维持液；
(6)长期培养：将构建的样品从96孔板转移到24孔板中，并添加细胞维持液，确保构建体完全浸没于培养液中以获取充分的营养交换，接下来的培养需要隔天半量换液。
2.根据权利要求1所述一种组织工程化神经组织及其构建方法，其特征在于，步骤(1)所述丝素蛋白溶液的制备方法为：称取4.24g碳酸钠溶于2L水中，煮沸，称取5g蚕茧碎片，在碳酸钠溶液煮30分钟，不断搅拌，然后取出剩余的丝素蛋白，使用蒸馏水反复洗涤至少三次，拧干，通风橱里干燥过夜，第二天将丝素蛋白在9.3M LiBr溶液中，60℃条件下溶解4小时；将丝素蛋白溶液透析48小时后，置于离心管内，4℃条件下，12000rpm离心30分钟，上清液转移到新的离心管内，测量丝素蛋白的浓度，使其达到6-12％。
3.根据权利要求1所述一种组织工程化神经组织及其构建方法，其特征在于，步骤(2)所述制备多孔支架的方法为：称取粒径为500μm以下的盐4g，在模具中添加2ml丝素蛋白溶液，在旋转模具的同时将盐缓慢地倒入模具中丝素蛋白溶液的顶部，使盐均匀落下，轻拍除去气泡，然后盖上模具的盖子，室温下放置1-2天以凝胶化；凝胶后将模具置于超纯水中，不断搅拌2天，以置换出盐，每天更换2-3次水，最后从模具中取出支架材料。
4.根据权利要求1所述一种组织工程化神经组织及其构建方法，其特征在于，步骤(3)所述分离培养MEF细胞并进行脱细胞处理的方法为：取孕14-16天的ICR孕鼠的胚胎，去除头部、尾部、内脏器官，分离四肢，剪碎组织，用0.05％胰酶对组织进行消化，使用含有胎牛血清的培养基进行终止消化；分别使用100目、200目筛网进行过滤，1000rpm离心细胞5min；对细胞进行重悬，使用P1-P3代的MEF进行支架材料的接种，接种前MEF细胞使用丝裂霉素进行处理，以每个支架材料1x106个细胞的密度进行接种，以90％DMEM+10％胎牛血清的培养基进行培养，培养10天以保证大量的细胞外基质分泌，使用0.5％TrixonX-100+20μM氨水试剂进行脱细胞处理5分钟，移除脱细胞液，使用PBS清洗3遍。
5.根据权利要求1所述一种组织工程化神经组织及其构建方法，其特征在于，步骤(4)所述分离神经元的方法按照如下步骤进行：
1)提取大脑皮层组织：取60mm皿，放入3-5℃的PBS缓冲液，且置于冰板上，取出SD大鼠孕鼠羊膜囊中的胚胎置于4℃PBS缓冲溶液中，剪下胚胎的大脑，取出脑组织，提取大脑皮层，之后将提取的大脑皮层组织置于60mm皿中，吸出多余的PBS液体，机械分离组织及剪碎；
2)组织消化：将剪碎的组织中添加0.05％胰酶，置于37℃孵箱中消化30分钟；
3)分离细胞：转移至离心管中，添加DMEM液体，吹打未消散的聚团，之后添加含有血清的培养基终止消化，过滤，仅保留单细胞，对细胞悬液1000rpm离心5分钟。
6.根据权利要求1所述一种组织工程化神经组织及其构建方法，其特征在于，步骤5)和步骤6)所述细胞种植液包括90％DMEM、10％马血清及5％胎牛血清，细胞维持液包括90％DMEM、10％马血清。
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