CN110358723A - 一种成年小鼠心脏成纤维细胞的培养方法 - Google Patents

一种成年小鼠心脏成纤维细胞的培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种成年小鼠心脏成纤维细胞的培养方法，包括步骤：取SPF级8～12周龄的小鼠，颈椎脱臼后杀菌；取出小鼠的心脏，放入盛有预冷无钙HBSS的培养皿中，挤出心脏中残留的血液，去除心脏心房、左右心耳、心包膜，保留心室，转移到新的盛有预冷无钙HBSS的培养皿中，将心脏剪碎，转移至离心管中，待心脏组织沉淀后，将HBSS用移液器吸出；离心管中加入胶原酶消化液消化，然后重悬获得细胞悬液；铺板至第一培养皿中，静置培养；然后重悬细胞、离心弃上清，用培养基重悬细胞铺板至第二培养皿中，原有的第一培养皿加入新的培养基，即得。该培养方法简单易行，稳定性好，重复性高，形态均一，所得成纤维细胞生长良好。

Description

一种成年小鼠心脏成纤维细胞的培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其是一种成年小鼠心脏成纤维细胞的培养方法。
背景技术
心脏成纤维细胞通常被称为心脏网络的支持细胞，并且发挥了许多基本功能，这些功能是心脏的正常生长及病理状况时心室重塑的基础。心脏组织重塑受多种细胞类型的调节，包括心肌细胞，成纤维细胞，内皮细胞，平滑肌细胞和造血细胞。
目前人们大多选择乳鼠(1～3日龄)的心脏成纤维细胞来研究人类心脏疾病，但是由于乳鼠和成年小鼠心脏成纤维细胞的特点并不一定完全相同，所以用成年小鼠心脏成纤维细胞建造模型研究人类心脏疾病如心肌肥大、心室重构、心肌纤维化、心衰等更加有意义。
使用Langendoff灌流装置和流式分选是目前比较成熟的提取成年小鼠心脏成纤维细胞的方法，但是这些方法对实验试剂、仪器及操作手法等要求较高，程序繁琐，细胞污染的可能性也较高，所以寻找一种简单快捷的成年小鼠心脏成纤维细胞的提取培养方法至关重要。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种成年小鼠心脏成纤维细胞的培养方法，该方法简便、快捷、高效且成本更低。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种成年小鼠心脏成纤维细胞的培养方法，包括如下步骤：
(1)取SPF级8～12周龄的小鼠，颈椎脱臼后转入超净工作台杀菌；快速打开小鼠胸腔，取出小鼠的心脏，放入盛有预冷无钙HBSS的培养皿中，挤出心脏中残留的血液，去除心脏心房、左右心耳、心包膜，保留心室，得到处理后的小鼠心脏；
(2)将步骤(1)处理后的小鼠心脏转移到新的盛有预冷无钙HBSS的培养皿中，将心脏剪碎，将HBSS和剪碎的心脏组织共同转移至离心管中，待心脏组织沉淀后，将HBSS用移液器吸出；
(3)向步骤(2)所得盛有心脏组织沉淀的离心管中加入胶原酶消化液；将离心管置于恒温摇床中震荡消化，然后转移至生物安全柜中，用移液器反复吹打，直至无明显沉淀，获得细胞悬液；
(4)将步骤(3)所得细胞悬液离心并弃上清，加入培养基重悬细胞，铺板至第一培养皿中，置于CO2培养箱内静置培养；然后重悬细胞、离心弃上清，用培养基重悬细胞铺板至第二培养皿中，原有的第一培养皿加入新的培养基；
(5)将步骤(4)所得第一培养皿和第二培养皿放入培养箱中继续培养，然后取出第二培养皿，重悬细胞、去上清后加入新的培养基继续培养；第一培养皿和第二培养皿中所得即为成年小鼠的心脏成纤维细胞。
作为上述方案的进一步优化，所述步骤(3)中胶原酶消化液为DMEM高糖培养基加入0.1％Ⅱ型胶原酶和10％胎牛血清配制而成。
作为上述方案的进一步优化，所述步骤(4)和(5)中培养基均为含100U/ml的青霉素、100U/ml的链霉素和10％胎牛血清的高糖DMEM培养基。
作为上述方案的进一步优化，所述步骤(2)中剪碎后的心脏的大小为1mm3。
作为上述方案的进一步优化，所述步骤(3)中，胶原酶消化液的用量为心脏组织体积的5～7倍。需要说明的是，该胶原酶消化液仅使用了Ⅱ型胶原酶1种试剂，且该试剂简单易得，成本低；本申请的发明人经多次试验发现，胶原酶消化液采用上述用量时，能充分的使心脏组织裂解，且不会过度消化损伤细胞。
作为上述方案的进一步优化，所述步骤(3)中，恒温摇床的条件为：37℃、250～300rpm，消化时间为15～20min。
作为上述方案的进一步优化，所述步骤(4)中CO2培养箱的参数为：37℃，5％体积浓度。
作为本发明的另一个方面，本发明还提供了一种成年小鼠心脏成纤维细胞传代的培养方法，包括如下步骤：
1)当上述培养方法获得的成年小鼠的心脏成纤维细胞(即原代细胞)密度至90％以上时，取出成年小鼠的心脏成纤维细胞，用PBS溶液清洗，加入EDTA-胰蛋白酶溶液消化45s～60s；
2)当步骤1)消化中的细胞出现回缩、间隙增大时，加入培养基终止消化，用移液器吹打细胞脱落，吸取细胞悬液至离心管，室温离心，按照数量比1：2传代即可。
作为上述方案的进一步优化，所述步骤1)中EDTA-胰蛋白酶溶液的质量浓度为0.25％。
作为上述方案的进一步优化，所述步骤2)中培养基为含100U/ml的青霉素、100U/ml的链霉素和10％胎牛血清的高糖DMEM培养基。
综上所述，本发明的有益效果为：
(1)本发明与用Langendoff灌流装置分离心脏成纤维细胞相比，简化了实验流程，降低了细胞污染的可能性；消化液仅使用了0.1％Ⅱ型胶原酶、10％FBS和DMEM高糖培养基，试剂简单易得，极大地降低了实验成本；
(2)本发明提供的小鼠心脏成纤维细胞培养方法简单易行，稳定性好，重复性高，形态均一，生长良好，具有典型心脏成纤维细胞的形态及特点。
附图说明
图1是普通倒置相差显微镜(40×)下成年小鼠心脏成纤维细胞原代培养第2天的照片；
图2是普通倒置相差显微镜(200×)下成年小鼠心脏成纤维细胞原代培养第2天的照片；
图3是普通倒置相差显微镜(40×)下成年小鼠心脏成纤维细胞原代培养第4天的照片；
图4是普通倒置相差显微镜(200×)下原代培养第4天成年小鼠心脏成纤维细胞；
图5是传代后成年小鼠心脏成纤维细胞标志物Vimentin抗原发红色荧光反应、DAPI标记的细胞核发蓝色荧光反应在荧光显微镜(400×)下的结果照片；
图6是传代后，成年小鼠心脏成纤维细胞Western blot的结果图；其中Vimentin为心脏成纤维细胞标志物，用来鉴定细胞，CollagenⅠ表达阳性说明该细胞符合成纤维细胞的特点，GAPDH作为内参。
具体实施方式
目前主要对乳鼠或仔猪等出生1～3天内动物的心肌成纤维细胞研究较多，但对成年动物的心脏成纤维细胞少有报导。由于研究成年动物心脏成纤维细胞特点更加符合实际情况，所以用成年小鼠心脏成纤维细胞建造模型研究人类心脏疾病如心肌肥大、心室重构、心肌纤维化、心衰等更加有意义。本发明提供了一种简单的成年小鼠心脏成纤维细胞的培养方法，该方法操作简单、成本低、并且培养得到的成年小鼠心脏成纤维细胞纯度高。
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，本发明中的试剂浓度均为质量浓度。如无特别说明，本发明中的实验方法均为常规方法。
实施例1
本发明的成年小鼠心脏成纤维细胞的培养方法的一种实施例，通过该方法获取原代培养的成年小鼠心脏成纤维细胞，并进行原代细胞培养，该方法具体包括以下步骤：
步骤(1)：取SPF级8～12周龄的小鼠，颈椎脱臼后转入超净工作台中，用75％乙醇浸泡1min；用无菌眼科直剪快速打开小鼠胸腔，取出小鼠的心脏，放入盛有预冷无钙HBSS的10cm培养皿中，挤出心脏中残留的血液，去除心脏心房、左右心耳、心包膜等，保留心室；
步骤(2)：用无菌镊子将心脏转移到新的盛有预冷无钙HBSS的10cm培养皿中，用无菌眼科弯剪将心脏剪碎至1mm3大小，用10ml电动移液器将HBSS和剪碎的心脏组织共同转移至50ml离心管中，待心脏组织沉淀后，小心将HBSS用移液器吸出；用培养基配制胶原酶消化液，并用0.22μm滤器进行过滤除菌；
步骤(3)：在50ml离心管中加入消化液，用量为心脏组织体积的5～7倍；将离心管置于37℃，250～300rpm的恒温摇床中震荡消化15～20min，然后转移至生物安全柜中，用1ml移液器反复吹打，直至无明显沉淀，获得细胞悬液；
步骤(4)：将细胞悬液室温，1000rpm离心5min，弃上清，加入培养基重悬细胞，铺板至10cm培养皿①中，置于37℃、5％体积浓度的CO2培养箱内静置培养；90min后，用10ml电动移液器吸取上清吹打细胞20～30次，室温离心上清，1000rpm，5min；弃上清，用培养基重悬细胞铺板至新的6cm培养皿②中，原有的10cm培养皿①加入新的培养基；
步骤(5)：将培养皿①②放入培养箱中继续培养，90min后，取出培养皿②，用1ml移液器吸取上清吹打细胞15～20次，弃上清，在培养皿中加入新的培养基继续培养；培养皿①②中所得即为成年小鼠的心脏成纤维细胞，成年小鼠的心脏成纤维细胞的形态参见图1～4。
2天后用PBS冲洗2次，洗去未贴壁的杂细胞，细胞换液。以后每2～3天细胞换液。
其中，步骤(2)中胶原酶消化液为0.1％Ⅱ型胶原酶、10％胎牛血清，用DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)高糖培养基配制而成；
上述步骤(2)、(4)和(5)中培养基为含100U/ml的青霉素、100U/ml的链霉素和10％胎牛血清的高糖DMEM培养基。
实施例2
本发明中成年小鼠心脏成纤维细胞传代培养方法的一种实施例，包括步骤：当实施例1获得的原代细胞密度至90％以上时，取出原代细胞，用PBS溶液清洗两次，在10cm培养皿加入2mL0.25％EDTA-胰蛋白酶溶液，37℃消化45s～60s，当细胞出现回缩、间隙增大时，加入4mL培养基终止消化，用移液器吹打细胞脱落，吸取细胞悬液至50mL离心管，室温，1000rpm离心3min，1：2传代。
实施例3
对实施例2制备的传代后的细胞用成纤维细胞标志物Vimentin(红光)、细胞核染料DAPI(蓝光)进行鉴定，鉴定的具体步骤如下：
1、细胞传代后2～3天，弃96孔板培养基，用PBS冲洗2遍后，每孔加4％多聚甲醛室温静置固定15min；
2、弃多聚甲醛，PBS冲洗2次；
3、每孔加50μl0.5％的TritonX-100/PBS(通透液)室温静置10～15min；
4、弃通透液，PBS清洗2次；
5、每孔加50μl1％BSA/PBS室温封闭1h；
6、弃封闭液，按1：200比例稀释Vimentin一抗于1％BSA/PBS中，每孔加50μl，4℃冰箱孵育过夜；
7、第二天，弃Vimentin一抗，PBS清洗2次；
8、CY3标记荧光二抗以1：300比例稀释于PBS中，每孔加50μl，室温避光孵育2h；
9、弃Cy3荧光二抗，用PBS冲洗2次，每孔加50μl DAPI(1：20000稀释于PBS中)，室温避光孵育10～15min；
10、弃DAPI，PBS清洗2次，使用EVOS f1倒置荧光显微镜拍照，Image-Pro plus统计分析。
其中，Vimentin(波形蛋白)为成纤维细胞细胞骨架特异性染料，只要细胞有Vimentin表达，则可说明该细胞为成纤维细胞。DAPI：4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，经常用于活细胞和固定细胞的染色。
鉴定结果参见图5，Vimentin染色阳性(红色)且DAPI染色阳性(蓝色)的细胞阳性率达95％以上。
实施例4
对实施例2制备的传代后的细胞进行Western blot实验。
结果参见图6，Collagen Ⅰ和Vimentin表达阳性更加能说明该细胞符合心脏成纤维细胞的特点。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种成年小鼠心脏成纤维细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取SPF级8～12周龄的小鼠，颈椎脱臼后转入超净工作台杀菌；快速打开小鼠胸腔，取出小鼠的心脏，放入盛有预冷无钙HBSS的培养皿中，挤出心脏中残留的血液，去除心脏心房、左右心耳、心包膜，保留心室，得到处理后的小鼠心脏；
(2)将步骤(1)处理后的小鼠心脏转移到新的盛有预冷无钙HBSS的培养皿中，将心脏剪碎，将HBSS和剪碎的心脏组织共同转移至离心管中，待心脏组织沉淀后，将HBSS用移液器吸出；
(3)向步骤(2)所得盛有心脏组织沉淀的离心管中加入胶原酶消化液；将离心管置于恒温摇床中震荡消化，然后转移至生物安全柜中，用移液器反复吹打，直至无明显沉淀，获得细胞悬液；
(4)将步骤(3)所得细胞悬液离心并弃上清，加入培养基重悬细胞，铺板至第一培养皿中，置于CO2培养箱内静置培养；然后重悬细胞、离心弃上清，用培养基重悬细胞铺板至第二培养皿中，原有的第一培养皿加入新的培养基；
(5)将步骤(4)所得第一培养皿和第二培养皿放入培养箱中继续培养，然后取出第二培养皿，重悬细胞、去上清后加入新的培养基继续培养；第一培养皿和第二培养皿中所得即为成年小鼠的心脏成纤维细胞。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中胶原酶消化液为DMEM高糖培养基加入0.1％Ⅱ型胶原酶和10％胎牛血清配制而成。
3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(4)和(5)中培养基均为含100U/ml的青霉素、100U/ml的链霉素和10％胎牛血清的高糖DMEM培养基。
4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中剪碎后的心脏的大小为1mm3。
5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中，胶原酶消化液的用量为心脏组织体积的5～7倍。
6.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中，恒温摇床的条件为：37℃、250～300rpm，消化时间为15～20min。
7.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(4)中CO2培养箱的参数为：37℃，5％体积浓度。
8.一种成年小鼠心脏成纤维细胞传代的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)当权利要求1～7任一项获得的成年小鼠的心脏成纤维细胞密度至90％以上时，取出成年小鼠的心脏成纤维细胞，用PBS溶液清洗，加入EDTA-胰蛋白酶溶液消化45s～60s；
2)当步骤1)消化中的细胞出现回缩、间隙增大时，加入培养基终止消化，用移液器吹打细胞脱落，吸取细胞悬液至离心管，室温离心，按照数量比1：2传代即可。
9.根据权利要求8所述的培养方法，其特征在于，所述步骤1)中EDTA-胰蛋白酶溶液的质量浓度为0.25％。
10.根据权利要求8所述的培养方法，其特征在于，所述步骤2)中培养基为含100U/ml的青霉素、100U/ml的链霉素和10％胎牛血清的高糖DMEM培养基。
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