CN109439619A - 一种犬类真皮成纤维细胞原代培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种犬类真皮成纤维细胞原代培养方法，由以下步骤组成：（1）剪取成年犬胸腹处皮肤组织；（2）清洗皮肤组织，去除皮下脂肪和结缔组织，然后将皮肤组织剪碎并转移至离心管内；（3）向离心管内加入1mLⅡ型胶原酶溶液并剪成糊状，加入5mLⅡ型胶原酶混匀，置于培养箱内至组织浆液完全消化；（4）取出离心管进行离心，弃上清液，加入培养基重悬，重悬液用细胞筛过滤，所得过滤液再次离心，弃上清液，加入细胞培养液重悬，然后转移到六孔板内，加入培养液；（5）置于培养箱中静置培养48h，每天更换一次新鲜培养液，直至获得犬类真皮成纤维原代细胞。本方法操作难度低，培养程序简单且培养效率较高。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种犬类真皮成纤维细胞原代培养方法。
背景技术
成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞，来源于中胚层，体积较大，轮廓清晰，为突起的纺锤状或星状结构，通常处于相对休眠状态，主要合成胞外基质和胶原，对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损及骨创伤的修复有着十分重要的作用，创伤后，成纤维细胞则会进入增殖活跃期，通过分泌各种细胞因子及其自身分化而参与修复过程。目前，关于人皮肤成纤维细胞研究较多，培养技术也较为成熟。公开号为CN106591223A的中国发明专利公开了一种人皮肤成纤维细胞分离与原代培养方法，该方法利用胰蛋白酶在3-6℃将人包皮小块消化过夜，去除角质层后再进行培养直至获得人皮肤成纤维细胞；公开号为CN107779429A的中国发明专利公开了一种人皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法，该方法将分散酶II和胶原酶IV消化作用的温度由4℃提高到37℃，两种酶的活性均得到提高，通过水浴震荡使两种酶与对应底物的接触面积增大，有利于酶促反应的进行，从而大大缩短了两种酶消化的时间，提高了成纤维细胞分离培养的速度；同时降低了酶对组织细胞的损伤，提高了细胞的贴壁率，得到的原代成纤维细胞培养6-8天即进行传代。
由于不同的物种之间组织存在差异，因此细胞培养方法也略有不同。作为重要的试验载体，犬皮肤成纤维细胞在生物医学研究中有着重要的意义，其稳定培养是获得相关试验成功的基础。国内外已有关于犬皮肤成纤维细胞培养的报道，但这些方法在实际操作中有些较为复杂，有些成功率较低。公开号为CN105441377A的中国发明专利公开了一种动物皮肤成纤维细胞原代分离方法，该方法取损伤的皮肤区域，将清洗并剪碎，接着倒入1%双抗的PBS，离心后，接种培养，虽然该方法成功增加了细胞数量，同时更利于细胞爬出，但是分离出的细胞活性较低，不利于后续的传代培养。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种操作难度低，培养程序简单，培养效率高的犬类真皮纤维细胞原代培养方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种犬类真皮成纤维细胞原代培养方法，由以下步骤组成：
（1）用无菌手术剪剪取成年犬胸腹处1cm×1cm皮肤组织一块，置于75%酒精浸泡消毒过的密封袋内迅速带入超净台；
（2）在超净台内，用双抗PBS溶液清洗皮肤组织，用无菌剪刀和镊子去除皮下脂肪和结缔组织，用上述双抗PBS溶液继续清洗2-4次，然后将皮肤组织剪碎并转移至5mL离心管内；
（3）向5mL离心管内加入1mLⅡ型胶原酶溶液并将皮肤组织剪成糊状，将组织浆液转移至15mL离心管内，加入5mLⅡ型胶原酶混匀，置于37℃、5% CO2培养箱内消化，间隔2h观察消化情况直至组织浆液完全消化；
（4）取出离心管进行离心，弃上清液，加入培养基重悬，重悬液用细胞筛过滤，所得过滤液再次离心，弃上清液，加入细胞培养液重悬，然后转移到六孔板内，加入培养液；
（5）置于37℃、5% CO2培养箱中静置培养48h，然后用培养基清洗培养板去除杂质，每天更换一次新鲜培养液，继续培养直至获得犬类真皮成纤维原代细胞。
优选地，步骤（2）所述双抗PBS溶液使用前在4℃条件下预冷。
优选地，步骤（2）所述双抗为青霉素和链霉素。
优选地，步骤（2）所述双抗PBS溶液中青霉素和链霉素的浓度均为100U/mL。
优选地，步骤（3）所述Ⅱ型胶原酶溶液的质量浓度为0.2%。
优选地，步骤（4）所述离心的转速为600-800r/min。
优选地，步骤（4）所述离心时间为4-6min。
优选地，步骤（4）所述细胞筛过滤次数为两次，第一次用100目细胞筛，第二次用200目细胞筛。
优选地，步骤（4）和步骤（5）中所述培养基为DMEM培养基。
优选地，步骤（4）和步骤（5）中所述细胞培养液为含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM细胞培养液。
本发明具有如下有益效果：
（1）本发明的犬类真皮成纤维细胞原代培养方法省去了传统的采用胰蛋白酶预消化以减少上皮细胞污染的过程，在培养过程中，将皮肤组织充分剪碎后直接使用Ⅱ型胶原酶消化、离心过滤进行细胞培养，避免了胰蛋白酶对细胞的消化损伤过大导致的细胞活性的降低，细胞的生长曲线及目测形态都表现出了良好的细胞活性，且上皮细胞的污染可以通过后续的传代操作消除。
（2）本发明解决了贴壁法成功率不高的难题，提高了原代培养操作的成功率，缩短了实验周期且进一步精简了操作，将多酶消化、皮条消化等步骤简化为组织剪碎后组织浆液一步消化，提高了消化效率，消化后离心所得到的原代细胞表现出较强的细胞活性。由于操作简便，不同部位采集的皮肤无论皮下组织及脂肪是否丰富，只需要稍加修剪即可，具有很高的原代培养成功率。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供了一种犬类真皮成纤维细胞原代培养方法，由以下步骤组成：
（1）用无菌手术剪剪取成年犬胸腹处1cm×1cm皮肤组织一块，置于75%酒精浸泡消毒过的密封袋内迅速带入超净台；
（2）在超净台内，用4℃预冷双抗PBS溶液清洗皮肤组织，用无菌剪刀和镊子去除皮下脂肪和结缔组织，用上述双抗PBS溶液继续清洗2次，然后将皮肤组织剪碎并转移至5mL离心管内；
（3）向5mL离心管内加入1mLⅡ型胶原酶溶液并将皮肤组织剪成糊状，将组织浆液转移至15mL离心管内，加入5mLⅡ型胶原酶混匀，置于37℃、5% CO2培养箱内消化，间隔2h观察消化情况直至组织浆液完全消化；
（4）取出离心管以600 r/min进行离心4min，弃上清液，加入培养基重悬，重悬液用细胞筛过滤，所得过滤液再次以600 r/min进行离心4min，弃上清液，加入细胞培养液重悬，然后转移到六孔板内，加入培养液；
（5）置于37℃、5% CO2培养箱中静置培养48h，然后用培养基清洗培养板去除杂质，每天更换一次新鲜培养液，继续培养直至获得犬类真皮成纤维原代细胞。
本实施例步骤（2）所述双抗为青霉素和链霉素。
本实施例步骤（2）所述双抗PBS溶液中青霉素和链霉素的浓度均为100U/mL。
本实施例步骤（3）所述Ⅱ型胶原酶溶液的质量浓度为0.2%。
本实施例步骤（4）所述细胞筛过滤次数为两次，第一次用100目细胞筛，第二次用200目细胞筛。
本实施例步骤（4）和步骤（5）中所述培养基为DMEM培养基。
本实施例步骤（4）和步骤（5）中所述细胞培养液为含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM细胞培养液。
实施例2
本实施例提供了一种犬类真皮成纤维细胞原代培养方法，由以下步骤组成：
（1）用无菌手术剪剪取成年犬胸腹处1cm×1cm皮肤组织一块，置于75%酒精浸泡消毒过的密封袋内迅速带入超净台；
（2）在超净台内，用4℃预冷双抗PBS溶液清洗皮肤组织，用无菌剪刀和镊子去除皮下脂肪和结缔组织，用上述双抗PBS溶液继续清洗3次，然后将皮肤组织剪碎并转移至5mL离心管内；
（3）向5mL离心管内加入1mLⅡ型胶原酶溶液并将皮肤组织剪成糊状，将组织浆液转移至15mL离心管内，加入5mLⅡ型胶原酶混匀，置于37℃、5% CO2培养箱内消化，间隔2h观察消化情况直至组织浆液完全消化；
（4）取出离心管以700 r/min进行离心5min，弃上清液，加入培养基重悬，重悬液用细胞筛过滤，所得过滤液再次700 r/min进行离心5min，弃上清液，加入细胞培养液重悬，然后转移到六孔板内，加入培养液；
（5）置于37℃、5% CO2培养箱中静置培养48h，然后用培养基清洗培养板去除杂质，每天更换一次新鲜培养液，继续培养直至获得犬类真皮成纤维原代细胞。
本实施例步骤（2）所述双抗为青霉素和链霉素。
本实施例步骤（2）所述双抗PBS溶液中青霉素和链霉素的浓度均为100U/mL。
本实施例步骤（3）所述Ⅱ型胶原酶溶液的质量浓度为0.2%。
本实施例步骤（4）所述细胞筛过滤次数为两次，第一次用100目细胞筛，第二次用200目细胞筛。
本实施例步骤（4）和步骤（5）中所述培养基为DMEM培养基。
本实施例步骤（4）和步骤（5）中所述细胞培养液为含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM细胞培养液。
实施例3
本实施例提供了一种犬类真皮成纤维细胞原代培养方法，由以下步骤组成：
（1）用无菌手术剪剪取成年犬胸腹处1cm×1cm皮肤组织一块，置于75%酒精浸泡消毒过的密封袋内迅速带入超净台；
（2）在超净台内，用4℃预冷双抗PBS溶液清洗皮肤组织，用无菌剪刀和镊子去除皮下脂肪和结缔组织，用上述双抗PBS溶液继续清洗4次，然后将皮肤组织剪碎并转移至5mL离心管内；
（3）向5mL离心管内加入1mLⅡ型胶原酶溶液并将皮肤组织剪成糊状，将组织浆液转移至15mL离心管内，加入5mLⅡ型胶原酶混匀，置于37℃、5% CO2培养箱内消化，间隔2h观察消化情况直至组织浆液完全消化；
（4）取出离心管以800 r/min进行离心6min，弃上清液，加入培养基重悬，重悬液用细胞筛过滤，所得过滤液再次以800 r/min进行离心6min，弃上清液，加入细胞培养液重悬，然后转移到六孔板内，加入培养液；
（5）置于37℃、5% CO2培养箱中静置培养48h，然后用培养基清洗培养板去除杂质，每天更换一次新鲜培养液，继续培养直至获得犬类真皮成纤维原代细胞。
本实施例步骤（2）所述双抗为青霉素和链霉素。
本实施例步骤（2）所述双抗PBS溶液中青霉素和链霉素的浓度均为100U/mL。
本实施例步骤（3）所述Ⅱ型胶原酶溶液的质量浓度为0.2%。
本实施例步骤（4）所述细胞筛过滤次数为两次，第一次用100目细胞筛，第二次用200目细胞筛。
本实施例步骤（4）和步骤（5）中所述培养基为DMEM培养基。
本实施例步骤（4）和步骤（5）中所述细胞培养液为含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM细胞培养液。
对实施例1、实施例2和实施例3进行多次实验，并进行相关指标的比较和数据统计，结果如下表1所示：
表1
| 项目 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 |
| 细胞活率（%） | 95±1 | 96±1 | 95±1 |
| 单次实验获得细胞总数 | （5.6±0.5）×10<sup>7</sup> | （5.8±0.5）×10<sup>7</sup> | （5.7±0.5）×10<sup>7</sup> |
| 细菌污染统计（40X视野范围内个数） | 无 | 无 | 无 |
| 真菌污染 | 无 | 无 | 无 |
| 其他细胞污染 | 无 | 无 | 无 |
| 细胞分离度 | 良好 | 良好 | 良好 |
| 能否传代 | 能 | 能 | 能 |
从上表1可以看出，实施例1、实施例2和实施例3的犬类真皮成纤维细胞原代培养方法的细胞活率达到95%以上，所得细胞无细菌污染，无真菌污染，能够正常传代且细胞分离度良好。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (10)
1.一种犬类真皮成纤维细胞原代培养方法，其特征在于，由以下步骤组成：
（1）用无菌手术剪剪取成年犬胸腹处1cm×1cm皮肤组织一块，置于75%酒精浸泡消毒过的密封袋内迅速带入超净台；
（2）在超净台内，用双抗PBS溶液清洗皮肤组织，用无菌剪刀和镊子去除皮下脂肪和结缔组织，用上述双抗PBS溶液继续清洗2-4次，然后将皮肤组织剪碎并转移至5mL离心管内；
（3）向5mL离心管内加入1mLⅡ型胶原酶溶液并将皮肤组织剪成糊状，将组织浆液转移至15mL离心管内，加入5mLⅡ型胶原酶混匀，置于37℃、5% CO2培养箱内消化，间隔2h观察消化情况直至组织浆液完全消化；
（4）取出离心管进行离心，弃上清液，加入培养基重悬，重悬液用细胞筛过滤，所得过滤液再次离心，弃上清液，加入细胞培养液重悬，然后转移到六孔板内，加入培养液；
（5）置于37℃、5% CO2培养箱中静置培养48h，然后用培养基清洗培养板去除杂质，每天更换一次新鲜培养液，继续培养直至获得犬类真皮成纤维原代细胞。
2.根据权利要求1所述的一种犬类真皮成纤维细胞原代培养方法，其特征在于：步骤（2）所述双抗PBS溶液使用前在4℃条件下预冷。
3.根据权利要求1所述的一种犬类真皮成纤维细胞原代培养方法，其特征在于：步骤（2）所述双抗为青霉素和链霉素。
4.根据权利要求1所述的一种犬类真皮成纤维细胞原代培养方法，其特征在于：步骤（2）所述双抗PBS溶液中青霉素和链霉素的浓度均为100U/mL。
5.根据权利要求1所述的一种犬类真皮成纤维细胞原代培养方法，其特征在于：步骤（3）所述Ⅱ型胶原酶溶液的质量浓度为0.2%。
6.根据权利要求1所述的一种犬类真皮成纤维细胞原代培养方法，其特征在于：步骤（4）所述离心的转速为600-800r/min。
7.根据权利要求1所述的一种犬类真皮成纤维细胞原代培养方法，其特征在于：步骤（4）所述离心时间为4-6min。
8.根据权利要求1所述的一种犬类真皮成纤维细胞原代培养方法，其特征在于：步骤（4）所述细胞筛过滤次数为两次，第一次用100目细胞筛，第二次用200目细胞筛。
9.根据权利要求1所述的一种犬类真皮成纤维细胞原代培养方法，其特征在于：步骤（4）和步骤（5）中所述培养基为DMEM培养基。
10.根据权利要求1所述的一种犬类真皮成纤维细胞原代培养方法，其特征在于：步骤（4）和步骤（5）中所述细胞培养液为含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM细胞培养液。
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