CN113621555A - 一种皮肤成纤维细胞的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种皮肤成纤维细胞的制备方法，属于生物细胞技术领域。一种皮肤成纤维细胞的制备方法，包括以下步骤：S01，标本处理：将皮肤标本处理，去除脂肪组织、结缔组织；S02，分离：将处理后的标本，使用中性蛋白酶处理，去除表皮，得真皮组织；S03，消化：将真皮组织，使用胰酶进行消化，得组织液；S04，离心：将组织液离心，去除上清，得细胞悬浮液；S05，培养：将细胞悬浮液转移至培养皿，加入培养液，进行培养；S06，传代：培养至融合度75～85％，进行传代培养。本发明步骤简单，不易发生污染，细胞成活率高，纯化效果好，细胞损失少。
Description
技术领域
本发明涉及生物细胞技术领域，尤其涉及一种皮肤成纤维细胞的制备方法。
背景技术
成纤维细胞，是真皮组织的主要组成成分，在构建人工皮肤和组织创伤修复中发挥着重要作用；对成纤维细胞的培养研究，为细胞水平上研究伤口愈合的机制提供了有力工具。
目前，对于皮肤成纤维细胞的培养、制备，采用的方法为：对获取到的标本组织进行消化处理，分离出真皮细胞后，离心筛选，进行培养。
但是,分离表皮与真皮时，由于表皮组织较为致密、不易消化；经长时间的消化处理后，细胞受损较重，导致难以生长，死亡率高。虽然说，减少消化时间并增加细胞收集频率，可降低细胞的死亡率；但，仍存在着细胞的大量死亡，并且操作繁琐。且，因细胞活性较差，细胞贴壁率低，生长速度慢。
同时，在培养的细胞中参杂有较多的表皮细胞，最终成品纯净度受到影响；需要增加步骤，进行处理。进一步导致成本增加和工序复杂度增加。
发明内容
本发明的目的是，提出一种皮肤成纤维细胞的制备方法，优化操作步骤，减少细胞死亡率，并提高培养质量、产品纯净度，以解决现有技术中的问题。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种皮肤成纤维细胞的制备方法，包括以下步骤：
S01，标本处理：将皮肤标本处理，去除脂肪组织、结缔组织；
S02，分离：将处理后的标本，使用中性蛋白酶处理，去除表皮，得真皮组织；
S03，消化：将真皮组织，使用胰酶进行消化，得组织液；
S04，离心：将组织液离心，去除上清，得细胞悬浮液；
S05，培养：将细胞悬浮液转移至培养皿，加入培养液，进行培养；
S06，传代：培养至融合度75～85％，进行传代培养。
优选的，在步骤S01标本处理中，皮肤标本使用75％酒精浸泡3～5分钟后，PBS反复漂洗3～5次，剪除脂肪组织、结缔组织。
优选的，在剪除脂肪组织、结缔组织后，将剩余部分剪为条状。
优选的，在步骤S02分离中，使用0.25％中性蛋白酶，在4℃环境下，处理12～16小时，去除表皮，得真皮组织。
优选的，在步骤S03消化中，将真皮组织平铺在培养皿中，进行消化。
优选的，在步骤S03消化中，使用0.05％的胰酶，在4℃环境下，消化12～16小时。
优选的，在步骤S05培养中，将培养皿置于5％CO2浓度，90％湿度的培养箱中，进行培养。
优选的，在培养过程中，每天更换一次培养液。
优选的，在步骤S06传代中，按1:5～10比例传代。。
与现有技术相比，本发明提供了一种皮肤成纤维细胞的制备方法，具备以下有益效果：
1、本发明，步骤简单，操作过程中不易发生污染，细胞成活率高，纯化效果好；且，细胞损失少，更有利于对一些组织来源较少的细胞培养。
2、本发明，将处理后的标本剪为条状，增加表面积，便于后续分离处理；且，条状结构便于对其进行移动、放置；使用温和的中性蛋白酶分离表皮与真皮，获得较为完好的真皮组织，产生的细胞损失少，对真皮组织细胞的损伤小；且，可完整去除表皮，避免在细胞培养时混杂有表皮细胞，引起对其生长的干扰；分切为条状结构状态下，更便于操作分离表皮。
3、本发明，设置为低温、低浓度环境中进行消化处理，可避免因剧烈的消化过程对细胞产生较大的损伤，进一步保证细胞的活性，可获得更多的有效细胞。
4、本发明，使用胰酶，将真皮组织平铺在培养皿中消化，加快消化速度，减少对细胞的损伤；以优选的条件环境，更利于细胞培养过程。
该装置中未涉及部分均与现有技术相同或可采用现有技术加以实现，本发明，步骤简单，不易发生污染，细胞成活率高，纯化效果好；细胞损失少，更有利于对一些组织来源较少的细胞培养；处理标本增加表面积，便于后续分离及移动、放置；中性蛋白酶分离表皮与真皮，细胞损失少，细胞损伤小，避免混杂干扰；低温、低浓度环境消化，进一步保证细胞的活性；使用胰酶平铺消化，加快速度，减少对细胞的损伤；以优选的条件环境，更利于细胞培养过程。
附图说明
图1为本发明的流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
参照图1，一种皮肤成纤维细胞的制备方法，包括以下步骤：
S01，标本处理：将皮肤标本处理，去除脂肪组织、结缔组织。
具体的，采集皮肤组织标本，放入含有培养液的小瓶中，密封，带入超净台内操作。
在一些实施例中，将皮肤标本使用75％酒精浸泡3～5分钟，杀灭残留细菌，并清洗掉培养液；之后，PBS反复漂洗3～5次；之后，使用医用剪刀剪除脂肪组织、结缔组织，在除操作中保持细致，尽量保证无残留。
进一步的，在一些实施例中，在剪除脂肪组织、结缔组织后，将剩余部分剪为条状。
以增加标本的表面积，更便于后续分离处理过程。且，条状结构便于对其进行移动、放置。
S02，分离：将处理后的标本，使用中性蛋白酶处理，去除表皮，得真皮组织。
获得组织细胞的纯度高，细胞损失少；且，对细胞的伤害少，保证细胞活性。
在一些实施例中，使用0.25％中性蛋白酶，在4℃环境下，处理12～16小时，去除表皮，得真皮组织。
常规的酶消化法，其步骤多、过程复杂，对细胞贴壁有影响，多次离心导致细胞受到损伤、数量丢失。相对于此，优化处理方案，使用温和的中性蛋白酶进行处理。
中性蛋白酶，将表皮与真皮之间的连接断开，获得较为完好的真皮组织；产生的细胞损失少，对真皮组织细胞的损伤小；且，可完整地去除表皮，避免在细胞培养时混杂有表皮细胞，引起对成纤维细胞生长的干扰。
同时，分切为条状结构状态下，更便于操作分离表皮。
S03，消化：将真皮组织，使用胰酶进行消化，得组织液。
在一些实施例中，使用0.05％的胰酶，在4℃环境下，消化12～16小时。
相对于常规的37℃消化环境，设置为低温、低浓度环境中进行消化处理；可避免因剧烈的消化过程对细胞产生较大的损伤，进一步保证细胞的活性，可获得更多的有效细胞。
在一些实施例中，将真皮组织平铺在培养皿中，进行消化。
平铺状态下，拥有更多的与胰酶的接触面积，可加快消化速度，进一步减少对细胞的损伤。
S04，离心：将组织液离心，去除上清，得细胞悬浮液。
S05，培养：将细胞悬浮液转移至培养皿，加入培养液，进行培养。
在一些实施例中，将培养皿置于5％CO2浓度，90％湿度的培养箱中进行培养。以优选的条件环境，更利于细胞培养过程。
进一步的，在一些实施例中，在培养过程中，每天更换一次培养液。
S06，传代：培养至融合度75～85％，进行传代培养。
在一些实施例中，按1:5～10比例传代。
本发明中，步骤简单，操作过程中不易发生污染，细胞成活率高，纯化效果好；且，细胞损失少，更有利于对一些组织来源较少的细胞培养；将处理后的标本剪为条状，增加表面积，便于后续分离处理；且，条状结构便于对其进行移动、放置；使用温和的中性蛋白酶分离表皮与真皮，获得较为完好的真皮组织，产生的细胞损失少，对真皮组织细胞的损伤小；且，可完整去除表皮，避免在细胞培养时混杂有表皮细胞，引起对其生长的干扰；分切为条状结构状态下，更便于操作分离表皮；设置为低温、低浓度环境中进行消化处理；可避免因剧烈的消化过程对细胞产生较大的损伤，进一步保证细胞的活性，可获得更多的有效细胞；使用胰酶，将真皮组织平铺在培养皿中消化，加快消化速度，减少对细胞的损伤；以优选的条件环境，更利于细胞培养过程。。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种皮肤成纤维细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S01，标本处理：将皮肤标本处理，去除脂肪组织、结缔组织；
S02，分离：将处理后的标本，使用中性蛋白酶处理，去除表皮，得真皮组织；
S03，消化：将真皮组织，使用胰酶进行消化，得组织液；
S04，离心：将组织液离心，去除上清，得细胞悬浮液；
S05，培养：将细胞悬浮液转移至培养皿，加入培养液，进行培养；
S06，传代：培养至融合度75～85％，进行传代培养。
2.根据权利要求1所述的一种皮肤成纤维细胞的制备方法，其特征在于，在步骤S01标本处理中，皮肤标本使用75％酒精浸泡3～5分钟后，PBS反复漂洗3～5次，剪除脂肪组织、结缔组织。
3.根据权利要求2所述的一种皮肤成纤维细胞的制备方法，其特征在于，在剪除脂肪组织、结缔组织后，将剩余部分剪为条状。
4.根据权利要求1所述的一种皮肤成纤维细胞的制备方法，其特征在于，在步骤S02分离中，使用0.25％中性蛋白酶，在4℃环境下，处理12～16小时，去除表皮，得真皮组织。
5.根据权利要求1所述的一种皮肤成纤维细胞的制备方法，其特征在于，在步骤S03消化中，将真皮组织平铺在培养皿中，进行消化。
6.根据权利要求1所述的一种皮肤成纤维细胞的制备方法，其特征在于，在步骤S03消化中，使用0.05％的胰酶，在4℃环境下，消化12～16小时。
7.根据权利要求1所述的一种皮肤成纤维细胞的制备方法，其特征在于，在步骤S05培养中，将培养皿置于5％CO2浓度，90％湿度的培养箱中，进行培养。
8.根据权利要求7所述的一种皮肤成纤维细胞的制备方法，其特征在于，在培养过程中，每天更换一次培养液。
9.根据权利要求1所述的一种皮肤成纤维细胞的制备方法，其特征在于，在步骤S06传代中，按1:5～10比例传代。
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