CN112574946A - 一种原代分离培养土狗多个组织来源的成纤维细胞及其永生化的构建方法 - Google Patents
一种原代分离培养土狗多个组织来源的成纤维细胞及其永生化的构建方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种原代分离培养土狗多个组织来源的成纤维细胞及其永生化的构建方法，属于细胞培养技术领域。本发明以土狗的心脏组织、肺尖部或腿部肌肉组织为材料经过胰酶和/或胶原酶II的酶解，分离，获得的具有典型的成纤维细胞形态学特征的心肌成纤维细胞、肺成纤维细胞、成肌纤维细胞。将原代分离培养的心肌成纤维细胞、肺成纤维细胞、成肌纤维细胞经SV40T病毒液转染后经过嘌呤霉素筛选培养和传代，得到永生化心肌成纤维细胞、肺成纤维细胞、成肌纤维细胞。与原代培养的细胞相比，永生化构建的细胞增长速度更快、活力显著提高，为犬类在科学研究、疾病研究等方面提供材料基础。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种原代分离培养土狗多个组织来源的成纤维细胞及其永生化的构建方法。
背景技术
成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞，细胞形态多为梭形样、多角形样、成纤维样。成纤维细胞参与胶原纤维的形成、参与创伤修复、还具有合成和分泌蛋白质的功能。成纤维细胞具有较强的分裂增殖能力，适应性强，是较容易培养的动物细胞类型。原代培养常用酶消化法或组织贴块法来获取成纤维细胞。常见的成纤维细胞包括心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)、肺成纤维细胞(lung fibroblasts,LFs)和成肌纤维细胞(myofibroblasts,MFs)。心肌成纤维细胞是心脏组织的重要组成部分，占心脏组织细胞总数的60％-70％。CFs可分泌各种生长因子，可调节细胞外基质的合成和降解，对心脏的结构、功能、稳态维持具有重要作用。在心肌损伤或受应激时，各来源成纤维细胞迁移至受损区，成纤维细胞过度增殖，心脏细胞外基质持续合成，过度沉积，会导致心肌纤维化，从而引发心脏压力负荷过重、心肌肥厚、心肌缺血等各种疾病。因此，明确心肌成纤维细胞在发育及心脏疾病的作用，可为治疗心脏疾病提供新的思路。LFs是肺组织的主要组成部分，能分泌多种细胞因子，与肺内其他细胞如肺泡上皮细胞、肺泡巨噬细胞、血管内皮细胞等相互作用，在肺成纤维化、慢性阻塞性肺疾病等肺部疾病中起着重要作用。而各种间质性肺疾病常表现为肺纤维化，但其发病机制仍需进一步研究。MFs主要来自于组织中成纤维细胞的分化，兼具成纤维细胞和平滑肌肌细胞的特征。在正常组织修复及损伤组织愈合过程中，成肌纤维细胞可促进细胞外基质持续分泌，因此，在伤口愈合和组织纤维化中起重要作用。
犬在人们生活中扮演了着多重角色，不仅是比较受欢迎的宠物，也可训练成为导盲犬等工作犬，还是重要的临床药物试验的动物模型。目前，犬类的细胞系仅有MDCK细胞，扩充别的细胞系，对动物种子资源的保存、对犬类在科学研究、疾病研究等方面都具有重要的意义。目前，关于土狗的多组织来源的成纤维细胞的原代分离培养方法还没有一套标准的构建方法，同时分离的成纤维细胞还存在活性低的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种原代分离培养土狗多个组织来源的成纤维细胞的方法，具有操作简便，分离的土狗成纤维细胞细胞活性高的特点。
本发明的目的还在于提供一种永生化土狗多个组织来源的成纤维细胞的构建方法，可连续传代40代左右。
本发明提供了一种原代分离培养土狗多个组织来源的成纤维细胞的方法，包括以下步骤：
1)将土狗的心脏组织、肺尖部或腿部肌肉组织剪碎，得到的组织糜；
2)将所述组织糜经过酶液消化后灭酶，静置，过筛，收集筛下物；所述酶液为含胶原酶II和/或胰酶的溶液；
3)将所述筛下物固液分离，清洗，得土狗心肌成纤维细胞、肺成纤维细胞或成肌纤维细胞。
优选的，步骤2)中心脏组织来源的组织糜进行酶液消化时，酶液为含胶原酶II和胰酶的溶液；
胶原酶II溶液和胰酶溶液的体积比为1～3:1；所述胶原酶II的质量浓度为0.1％～0.25％；所述胰酶的质量浓度为0.05％～0.25％。
优选的，步骤2)中肺尖部来源的组织糜进行酶液消化时，酶液为含胰酶的溶液；所述胰酶的溶液的质量浓度为0.05％～0.25％。
优选的，步骤2)中腿部肌肉组织来源的组织糜进行酶液消化时，酶液为含胶原酶II的溶液；所述胶原酶II的溶液的质量浓度为0.1％～0.25％。
优选的，步骤2)中所述组织糜和酶液的体积比为1:3～5。
优选的，步骤2)中灭酶的方法为含体积浓度10％～20％FBS、质量浓度1％～2％双抗的DMEM细胞完全培养液；所述双抗为青霉素和链霉素。
优选的，步骤2)中组织糜进行酶液消化时，所述酶液的反应条件为36～38℃消化20～60min。
本发明提供了所述方法制备的土狗多个组织来源的成纤维细胞的永生化构建方法，包括以下步骤：
A.将转染质粒溶液和转染试剂混合，得到的混合液转染293T细胞，收集上清液，除杂，得到病毒液；
B.将所述病毒液调节至与培养液体积比例为1:5，转染土狗心肌成纤维细胞、肺成纤维细胞或成肌纤维细胞，培养，得到转染后的土狗心肌成纤维细胞、肺成纤维细胞或成肌纤维细胞；
C.将所述转染后的土狗心肌成纤维细胞、肺成纤维细胞或成肌纤维细胞用含嘌呤霉素的培养基进行筛选培养，再用嘌呤霉素浓度减半的培养基继续筛选培养，得到细胞群；
D.将所述细胞群经消化传代，得到永生化的土狗心肌成纤维细胞、肺成纤维细胞或成肌纤维细胞。
优选的，步骤C中心肌成纤维细胞以嘌呤霉素浓度为1.5μg/ml进行筛选，肺成纤维细胞以嘌呤霉素的浓度为1μg/ml进行筛选，成肌纤维细胞以嘌呤霉素的浓度为2μg/ml进行筛选。
优选的，步骤A中所述转染质粒溶液为每500μl OPTI-MEM中含6μg pCL-Eco、6μgpCL-Ampho、6μg SV40 T和2μg pLP-Vsvg；
所述转染试剂为每500μl OPTI-MEM中含80μl LipofectamineTM2000转染试剂。
优选的，步骤A中所述293T细胞的细胞汇合度为50％～60％。
本发明提供的原代分离培养土狗多个组织来源的成纤维细胞的方法，以土狗的心脏组织、肺尖部或腿部肌肉组织为材料经过胰酶和/或胶原酶II的酶解，分离，获得的心肌成纤维细胞、肺成纤维细胞或成肌纤维细胞经过形态学观察和物种鉴定以及同工酶的检测，结果表明分离培养的心肌成纤维细胞、肺成纤维细胞或成肌纤维细胞具有典型的成纤维细胞形态学特征，来源狗源细胞，经过生长曲线绘制，表明各种细胞均呈S型生长，符合细胞基本生物学特征；经过活力检测及细胞表面抗原鉴定，表明制备的心肌成纤维细胞、肺成纤维细胞、成肌纤维细胞均具有活力强、纯度高的特点。
本发明提供的所述方法制备的土狗多个组织来源的成纤维细胞的永生化构建方法，本发明采用SV40 T病毒转染多个组织来源的成纤维细胞，经过嘌呤霉素的筛选，得到的细胞克隆斑经连续传代培养，得到永生化的土狗多种组织来源的心肌成纤维细胞、肺成纤维细胞和成肌纤维细胞。经过活力检测，结果表明永生化后细胞活力明显高于原代细胞，说明永生化处理有利于细胞活力提升。
附图说明
图1为不同组织来源的成纤维细胞形态图，其中图1A为心肌成纤维细胞，图1B为肺成纤维细胞，图1C为成肌纤维细胞；
图2为不同组织来源的成纤维细胞的生长曲线，其中图2A为心肌成纤维细胞，图2B为肺成纤维细胞，图2C为成肌纤维细胞；
图3为不同组织来源的成纤维细胞的细胞活力，其中图3A为心肌成纤维细胞，图3B为肺成纤维细胞，图3C为成肌纤维细胞；
图4为不同组织来源的成纤维细胞的免疫荧光检测结果，图4A为心肌成纤维细胞，图4B为肺成纤维细胞，图4C为成肌纤维细胞；
图5为MDCK细胞的电泳图，其中图5A为提取的DNA电泳图，图5B为PCR扩增电泳图；
图6为心肌成纤维细胞的电泳图，其中图6A为提取的DNA电泳图，图6B为PCR扩增电泳图，其中左图为土狗成纤维细胞F2代扩增电泳图，右图为土狗成纤维细胞F20代扩增电泳图；
图7为肺成纤维细胞的电泳图，其中图7A为提取的DNA电泳图，图7B为PCR扩增电泳图，其中左图为土狗成纤维细胞F2代扩增电泳图，右图为土狗成纤维细胞F20代扩增电泳图；
图8为成肌纤维细胞的电泳图，其中图8A为提取的DNA电泳图，图8B为PCR扩增电泳图，其中左图为土狗成纤维细胞F2代扩增电泳图，右图为土狗成纤维细胞F20代扩增电泳图；
图9为不同种类的成纤维细胞的coxΙ基因序列比对结果，其中图9A为心肌成纤维细胞，图9B为肺成纤维细胞，图9C为成肌纤维细胞；
图10为心肌成纤维细胞中同工酶的检测结果，其中图10A为乳酸脱氢酶检测结果，图10B为苹果酸脱氢酶检测结果，其中泳道从左往右加样细胞来源：Hela、3T3-L1、F2、F20、MDCK；
图11为肺成纤维细胞中同工酶的检测结果，其中图11A为乳酸脱氢酶检测结果，图11B为苹果酸脱氢酶检测结果，其中泳道从左往右加样细胞来源：Hela、3T3-L1、F2、F20、MDCK；
图12为成肌纤维细胞中同工酶的检测结果，其中图12A为乳酸脱氢酶检测结果，图12B为苹果酸脱氢酶检测结果，其中泳道从左往右加样细胞来源：Hela、3T3-L1、F2、F20、MDCK。
具体实施方式
本发明提供了一种原代分离培养土狗多个组织来源的成纤维细胞的方法，包括以下步骤：
1)将土狗的心脏组织、肺尖部或腿部肌肉组织剪碎，得到的组织糜；
2)将所述组织糜经过酶液消化后灭酶，静置，过筛，收集筛下物；所述酶液为含胶原酶II和/或胰酶的溶液；
3)将所述筛下物固液分离，清洗，得土狗心肌成纤维细胞、肺成纤维细胞和成肌纤维细胞。
本发明将土狗的心脏组织、肺尖部或腿部肌肉组织剪碎，得到的组织糜。在本发明中，土狗的心脏组织、肺尖部或腿部肌肉组织的获得方法优选将土狗处死，在无菌条件下分别剪下心脏组织心室部分、肺尖部分或腿肌组织，消毒、清洗后剔除表面包膜、筋膜等，剪碎得到组织糜。所述消毒的方法优选采用体积浓度70％或75％的酒精浸泡5～10s。所述清洗优选采用含2％双抗的1×PBS进行。所述双抗是指青霉素和链霉素混合液。所述清洗的次数优选为3～4次。本发明对所述剪碎的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的剪碎方法即可。
得到组织糜后，本发明将所述组织糜经过酶液消化后灭酶，静置，过筛，收集筛下物；所述酶液为含胶原酶II和/或胰酶的溶液。
在本发明中，心脏组织来源的组织糜进行酶液消化时，酶液优选为含胶原酶II和胰酶的溶液。胶原酶II溶液和胰酶溶液的体积比优选为1～3:1，更优选2:1；所述胶原酶II的质量浓度优选为0.1％～0.25％，更优选0.2％；所述胰酶的质量浓度优选为0.05％～0.25％，更优选0.25％。所述组织糜和酶液的体积比优选为1:3～5，更优选为1:4。肺尖部来源的组织糜进行酶液消化时，酶液为含胰酶的溶液；所述胰酶的溶液的质量浓度优选为0.05％～0.25％，更优选0.25％。所述组织糜和酶液的体积比优选为1:3～5，更优选为1:4。腿部肌肉组织来源的组织糜进行酶液消化时，酶液优选为含胶原酶II的溶液；所述胶原酶II的溶液的质量浓度优选为0.1％～0.25％，更优选0.2％。所述组织糜和酶液的体积比优选为1:3～5，更优选为1:4。所述消化的温度优选为37℃。所述消化的时间优选为20～60min。在消化期间，优选多次晃动离心管，使组织块充分消化。
在本发明中，灭酶的方法优选为含体积浓度10％～20％FBS、质量浓度1％～2％双抗的DMEM细胞完全培养液；所述双抗为青霉素和链霉素混合液。所述静置的时间优选为10～20min，更优选为15min。所述过筛依次包括过200目筛和400目筛。筛下物经过离心和清洗得到成纤维细胞。所述离心的转速优选为1000rpm，所述离心的时间优选为10min。所述清洗用溶液优选为DMEM基础培养基。所述离心和清洗优选操作两次。本发明对所述方法涉及的试剂和药品的来源均没有特殊限制，采用本领域所熟知的商品途径购买即可。
在本发明中，得到不同组织来源的成纤维细胞后，优选进行培养。将制备的细胞悬液接种至T25培养瓶中，于5％CO2、37℃条件下培养。每隔48h换液，直至细胞汇合度达到80％～90％后用于传代或后续实验。
在本发明中，制备的不同来源的成纤维细胞包括心肌成纤维细胞、肺成纤维细胞和成肌纤维细胞。经形态学观察和生长曲线的绘制，发现制备的上述三种成纤维细胞呈长梭形样或成纤维样贴壁生长，细胞生长状态良好，折光性强，细胞均呈S型生长，符合细胞基本生物学特征。经过活力测定，发现细胞活力较强。经过免疫荧光法测定，表明三种细胞均阳性表达Vimentin，说明分离得到的及永生化后的细胞是成纤维细胞。同时经过物种鉴定和同工酶鉴定，结果表明原代分离培养的三种成纤维细胞均为狗源细胞，并且制备过程中也未与人、小鼠细胞未产生交叉污染。
本发明提供了所述方法制备的土狗多个组织来源的成纤维细胞的永生化构建方法，包括以下步骤：
A.将转染质粒溶液和转染试剂混合，得到的混合液转染293T细胞，收集上清液，除杂，得到病毒液；
B.将所述病毒液调节至与培养液体积比为1:5转染土狗不同组织来源的成纤维细胞，培养，得到转染后的不同组织来源的成纤维细胞；
C.将所述转染后的不同组织来源的成纤维细胞用含嘌呤霉素的培养基进行筛选培养，再用嘌呤霉素浓度减半的培养基继续筛选培养，得到细胞群；
D.将所述细胞群经消化传代，得到永生化的不同组织来源的成纤维细胞。
本发明将转染质粒溶液和转染试剂混合，得到的混合液转染293T细胞，收集上清液，除杂，得到病毒液。
在本发明中，所述转染质粒溶液优选为每500μl OPTI-MEM中含6μg pCL-Eco、6μgpCL-Ampho、6μg SV40 T和2μgpLP-Vsvg。所述转染试剂优选为每500μl OPTI-MEM中含80μlLipofectamineTM2000转染试剂。所述转染质粒质量和转染试剂的体积比优选为优选1:4。所述293T细胞的细胞汇合度优选为50％～60％，更优选为50％。转染后每隔24h更换新鲜的DMEM细胞完全培养基进行培养。所述DMEM细胞完全培养基优选为含体积浓度10％～20％FBS、质量浓度1％～2％双抗的DMEM培养基，FBS体积比例更优选10％，双抗体积比例更优选1％。
转染后，本发明将所述转染后的不同组织来源的成纤维细胞用含嘌呤霉素的培养基进行筛选培养，再用嘌呤霉素浓度减半的培养基继续筛选培养，得到细胞群。
在本发明中，所述培养基优选为DMEM完全培养液。所述嘌呤霉素经过系列浓度梯度的嘌呤霉素筛选F2代土狗心肌成纤维细胞、肺成纤维细胞和成肌纤维细胞，经筛选7d(每天更换培养液)后，以7d内杀死所有细胞的最低嘌呤霉素浓度作为最佳筛选浓度。结果表明不同组织来源的成纤维细胞对嘌呤霉素的耐受性稍有差异：心肌成纤维细胞优选以嘌呤霉素浓度为1.5μg/ml进行筛选，肺成纤维细胞优选以嘌呤霉素的浓度为1μg/ml进行筛选，成肌纤维细胞优选以嘌呤霉素的浓度为2μg/ml进行筛选。所述筛选培养的时间优选为7d。所述筛选培养期间每隔24h更换依次含嘌呤霉素的培养基。所述继续筛选培养优选培养至形成克隆细胞斑，即细胞群。
得到细胞群后，本发明将所述细胞群经消化传代，得到永生化的不同组织来源的成纤维细胞
在本发明中，所述消化的方法优选为0.25％胰酶消化2～3min，DMEM完全培养液终止消化。优选每隔10代冻存一次细胞，优选传至40～50代。将传代得到的永生化细胞F20进行形态学观察及生长曲线的绘制，结果表明永生化细胞呈长梭形样或成纤维样贴壁生长，细胞生长状态良好，折光性强；同时细胞均呈S型生长，符合细胞基本生物学特征，且永生化后细胞比原代培养的细胞增长速度更快；经活力测定，永生化后细胞活力较原代细胞明显提升；通过免疫荧光法鉴定结果表明，永生化后细胞均阳性表达Vimentin，说明永生化后的细胞是成纤维细胞。经过物种鉴定和同工酶鉴定，永生化构建的细胞为狗源细胞，且与人、小鼠细胞未产生交叉污染。
下面结合实施例对本发明提供的一种原代分离培养土狗多个组织来源的成纤维细胞及其永生化的构建方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.试剂配制如下：
0.2％胶原酶II：称取0.06g胶原酶II，于30ml DMEM中溶解，过0.22μM滤器，-20℃保存，备用。
100ml DMEM完全培养液：89ml DMEM基础培养基+10ml胎牛血清+1ml双抗。
1ml细胞冻存液：100μl DMSO+900μl FBS。
DMEM培养基、FBS、胰酶、双抗购于gibco公司；胶原酶II、DMSO购于sigma公司；PBS购于索莱宝公司。
2.原代分离培养土狗成纤维细胞
(1)土狗组织采集：
土狗于剪剖室内处死，无菌剪剪下心脏组织心室部分、肺尖部分、腿肌组织各约1～2g，于70％或75％酒精中浸泡5～10s，再于含2％双抗的1×PBS中清洗3次。
(2)组织前处理：
将步骤1中采集的各组织在生物安全柜内于含2％双抗的1×PBS中再清洗1次，剔除表面包膜、筋膜，无菌剪剪碎。
(3)酶消化法获取土狗成纤维细胞：
将步骤(2)中剪碎的心脏组织置于50ml离心管内，加入约3～5倍体积的混合消化液(0.2％胶原酶II、0.25％胰酶，体积比为2：1)，37℃水浴消化1h，期间多次晃动离心管，使组织块充分消化，用含10％FBS、1％双抗的DMEM细胞完全培养液终止消化，静置10min，依次过200和400目细胞筛，收集筛下悬液1000rpm离心10min，DMEM基础培养基重悬清洗一次，1000rpm离心10min，1ml DMEM细胞完全培养液重悬，获得细胞。
将步骤2中剪碎的肺组织置于50ml离心管内，加入约3～5倍体积的0.25％胰酶消化液，37℃水浴消化30min，期间多次晃动离心管，使组织块充分消化，用含10％FBS、1％双抗的DMEM细胞完全培养液终止消化，静置10min，依次过200和400目细胞筛，收集筛下悬液1000rpm离心10min，DMEM基础培养基重悬清洗一次，在1000rpm离心10min，1ml DMEM细胞完全培养液重悬，获得细胞。
将步骤2中剪碎的腿肌组织置于50ml离心管内，加入约3～5倍体积的0.2％胶原酶II消化液，37℃水浴消化30min，期间多次晃动离心管，1000rpm离心10min，去除胶原酶消化液，加入约3～5倍体积的0.25％胰酶消化液继续水浴消化20min，用含10％FBS、1％双抗的DMEM细胞完全培养液终止消化，静置10min，依次过200和400目细胞筛，悬液1000rpm离心10min，DMEM基础培养基重悬清洗一次，1000rpm离心10min，1ml DMEM细胞完全培养液重悬，获得细胞。
(4)土狗成纤维细胞培养：
将步骤(3)中获得的细胞悬液接种至T25培养瓶中，于5％CO2浓度、37℃培养箱内培养。每隔48h换液，直至细胞汇合度达到80％～90％后进行传代或冻存。
实施例2
嘌呤霉素筛选浓度实验
将实施例1制备的土狗心肌成纤维细胞、肺成纤维细胞、成肌纤维细胞F2代细胞分别以1×104/孔布板于24孔板，以0、0.5μg/ml、1μg/ml、1.5μg/ml、2μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml嘌呤霉素进行梯度筛选，每个浓度3个重复孔，每天更换含不同浓度嘌呤霉素的培养液，连续筛选7d，倒置显微镜下观察，最终以7d内杀死所有细胞的最低嘌呤霉素浓度作为最佳筛选浓度。
结果表明，心肌成纤维细胞的嘌呤霉素最佳筛选浓度为1.5μg/ml，肺成纤维细胞的嘌呤霉素最佳筛选浓度为1μg/ml，成肌纤维细胞的嘌呤霉素最佳筛选浓度为2μg/ml。
实施例3
不同293T细胞的状态下制备的SV40 T病毒液
将新复苏、复苏后传代3次、连续传代20次以上的293T细胞分别布板于100mm培养皿，在细胞密度汇合至50％～60％进行病毒转染，转染质粒与转染试剂比例为1:4，病毒液和细胞培养液的体积比为1:5。
结果表明，复苏后传代3次的293T细胞下获取的病毒液感染实施例1中F2代成纤维细胞能力最强，嘌呤霉素筛选后形成细胞群。
实施例4
不同293T细胞的密度下制备的SV40 T病毒液
293T细胞复苏后传代3次，布板于100mm培养皿，在细胞密度汇合至20％～30％、50％～60％、80％～90％进行病毒转染，转染质粒与转染试剂比例1:4，同时病毒液和细胞培养液的体积比为1:5。
结果表明，在细胞密度汇合至50％～60％时转染，获取的病毒液感染实施例1中F2代成纤维细胞能力最强，嘌呤霉素筛选后形成细胞群。
实施例5
转染质粒与转染试剂的比例确定
293T细胞复苏后传代3次，布板于100mm培养皿，在细胞密度汇合至50％～60％进行病毒转染。所用转染质粒与转染试剂比例1:2、1:4、1:8，同时病毒液和细胞培养液的体积比为1:5。
结果表明，所用质粒与转染试剂比例为1:4时获取的SV40 T病毒液感染实施例1中F2代成纤维细胞能力最强，嘌呤霉素筛选后形成细胞群。
实施例6
土狗成纤维细胞永生化构建方法
1.材料及药品来源
293T细胞购于中国科学院昆明细胞库；病毒质粒SV40 T、包装质粒pCL-Eco、pCL-Ampho、pLP-Vsvg由中国科学院昆明动物研究所郑萍老师组惠赠；OPTI-MEM购于gibco公司；LipofectamineTM 2000购于Invitrogen公司；嘌呤霉素购于索莱宝公司。
2.实验方法
SV40 T病毒获取：将复苏传代两次的293T细胞布板于100mm培养皿，细胞密度汇合至50％～60％进行转染，6h后去除转染液，换新鲜DMEM完全培养液，分别于转染24h、72h收集上清液，过0.45μM滤器获得病毒液，4℃保存，转染体系见表1。
表1转染体系
SV40 T病毒感染原代土狗成纤维细胞：实施例1中分别取1×106/ml的第2代土狗心肌成纤维细胞、肺成纤维细胞、成肌纤维细胞，分别布板于100mm培养皿，待细胞密度汇合至50％～60％时，将2ml SV40病毒液加入细胞中进行病毒感染，24h后更换新鲜DMEM细胞完全培养液，继续培养24h。
嘌呤霉素筛选稳转土狗成纤维细胞：经SV40病毒感染的土狗成纤维细胞，恢复培养24h后，心肌成纤维细胞以1.5μg/ml嘌呤霉素进行筛选，肺成纤维细胞以1μg/ml嘌呤霉素进行筛选，成肌纤维细胞以2μg/ml嘌呤霉素进行筛选。每隔24h更换含嘌呤霉素的DMEM完全培养液，连续筛选7d后，将嘌呤霉素浓度减半继续培养直至形成克隆细胞斑。
筛选细胞克隆斑连续传代培养：将嘌呤霉素筛选得到的细胞克隆斑消化传代，每隔10代冻存一个批次的细胞，留一份继续传代培养。
实施例7
土狗成纤维细胞形态学观察
待实施例1制备的第2代(F2)土狗心肌成纤维细胞、肺成纤维细胞、成肌纤维细胞以及实施例6制备的第20代(F20)永生化的土狗心肌成纤维细胞、肺成纤维细胞、成肌纤维细胞密度汇合至80％左右时，将F2、F20及筛选得到的细胞克隆群于倒置显微镜下观察拍照，获得如图1所示细胞形态图。
由图1结果显示，各组织来源细胞均呈长梭形样或成纤维样贴壁生长，细胞生长状态良好，折光性强。
实施例8
土狗成纤维细胞生长曲线的绘制
从实施例1中取F2代、实施例6中F20代土狗心肌成纤维细胞、肺成纤维细胞、成肌纤维细胞，待密度汇合至80％左右时，用1×PBS清洗2次，0.25％胰酶消化3min，终止消化，1000rpm离心3min，1ml培养液重悬细胞；
从细胞悬液中取100ul，与100μl 0.4％台盼蓝溶液(购于gibco公司)混合，计数板计数；
以每孔5×103细胞布板24孔培养板，每孔1ml，置于培养箱中培养；
每隔24h抽取3孔细胞，胰酶消化成细胞悬液后计数，每孔计三次，取平均值；
连续计数7天，以细胞密度为纵坐标，时间为横坐标，绘制如图2所示细胞生长曲线图。
由图2结果显示，各不同组织来源的成纤维细胞均呈S型生长，符合细胞基本生物学特征，且永生化后细胞增长速度更快。
实施例9
土狗成纤维细胞活力检测
从实施例1中取F2代、实施例6中F20代土狗心肌成纤维细胞、肺成纤维细胞、成肌纤维细胞，待密度汇合至80％左右时，用1×PBS清洗2次，0.25％胰酶消化3min，终止消化，1000rpm离心3min，1ml培养液重悬细胞；
从细胞悬液中取100μl，与100μl 0.4％台盼蓝溶液混合，计数板计数；
以每孔5×103细胞布板96孔培养板，每孔100μl，置于培养箱中培养48h；
设置6个重复孔，每孔加入10μl CCK-8溶液(购于Dojindo公司)，继续培养4h；
酶标仪检测450nm处的吸光度值，绘制如图3所示细胞活力图。
由图3结果显示，永生化后细胞活力明显高于原代细胞，说明永生化后细胞活力明显提升。
常规原代细胞分离培养，基本上需要7天左右细胞汇合度才能达到80％～90％，且原代细胞传代次数有限。常规原代细胞分离培养，组织常从新生动物或胚胎获取才能得到活力较强的原代细胞，且原代培养FBS所用比例会在15％～20％，来增强细胞增殖能力。而本方法得到的土狗原代成纤维细胞仅需3～4天细胞汇合度便可达到80％～90％，前5代细胞以1：3比例传代，仅需2～3天细胞汇合度便可达到80％～90％；本方法组织均从成年土狗获取，且FBS仅用10％的比例。综上，采用本发明所述土狗多个组织来源的成纤维细胞分离培养方法获取的成纤维细胞，操作简便，活力较强，纯度较高。此外，本发明还具有多向适用性和实用性，可根据需求适当改善实施例条件，来进行同一物种或不同物种不同组织来源成纤维细胞的获取。
实施例10
免疫荧光法鉴定土狗成纤维细胞
1.材料来源
4％多聚甲醛、细胞免疫荧光通透液、细胞免疫荧光封闭液、DAPI购于碧云天公司；Vimentin购于CST公司；Alexa Fluor488购于Invitrogen公司。
2.实验方法
从实施例1中取F2代、实施例6中F20代土狗心肌成纤维细胞、肺成纤维细胞、成肌纤维细胞，接种于12孔板培养板中培养48h直至细胞密度汇合至70％～80％。
弃培养液，1×PBS清洗3次，4％多聚甲醛室温固定30min；
弃固定液，1×PBS清洗3次，细胞免疫荧光通透液(0.1％100×Triton)室温孵育20min；
弃通透液，1×PBS清洗3次，加细胞免疫荧光封闭液，37℃封闭孵育1h；
弃封闭液，1×PBS清洗3次，分别加Vimentin一抗(稀释比例1：100)，4℃避光孵育过夜；
回收一抗，1×PBS清洗3次，分别加Alexa Fluor488二抗(稀释比例1：500)，室温避光孵育1h；
回收二抗，1×PBS清洗3次，加入DAPI溶液复染，37℃避光孵育30min；
回收DAPI，1×PBS清洗3次，加入抗荧光淬灭剂，于荧光倒置显微镜观察染色结果并拍照得到如图4所示的免疫荧光鉴定结果图。
由图4结果显示，永生化前后细胞均阳性表达Vimentin，说明分离得到的及永生化后的细胞是成纤维细胞。
实施例7
土狗成纤维细胞的物种鉴定
1.材料与试剂来源说明
DNA提取试剂盒购于全式金公司；2×Vazyme LAmp Master Mix购于Vazyme公司；琼脂糖购于BIOWEST公司；DNAmaker、TS-GelRed核酸凝胶染料购于擎科公司；引物合成于擎科公司。
2.实验方法
从实施例1中取F2代、实施例6中F20代细胞土狗心肌成纤维细胞、肺成纤维细胞、成肌纤维细胞，以MDCK细胞为阳性对照组，接种于6孔板培养板中培养直至细胞密度汇合至90％左右，用0.25％胰酶消化3～5min，终止消化，1000rpm离心3min，弃上清；
1×PBS清洗1次，全式金DNA提取试剂盒提取DNA；
2％琼脂糖凝胶进行核酸电泳，90V跑30min，凝胶成像系统拍照得到如图5A～图8A所示的DNA样本电泳图；
将样本DNA分别与7个常见物种的特异性引物进行扩增，扩增完成后用2％琼脂糖凝胶进行电泳检测并拍照得到如图5B～图8B所示样本PCR扩增后电泳图；
将PCR扩增产物进行测序，得到如图9所示序列结果比对图；
引物信息如表2所示，引用于现有技术(2018，鸡永生化前脂肪细胞系的建立及分析，王伟)。
表2各引物对序列信息
反应体系见表3。
表3反应体系
PCR程序：95℃，5min；95℃，30s；55℃，30s；72℃，1min(30个循环)；72℃，5min。
结果显示，从MDCK、F2、F20代土狗心肌成纤维细胞、肺成纤维细胞、成肌纤维细胞中提取的DNA有明显主带，没有拖尾和RNA污染；DNA进行PCR扩增，电泳图谱清晰，仅在狗特异性引物扩增时有单一条带，没有物种间交叉污染；经序列比对分析，PCR特异性扩增产物与NCBI上已发表的狗线粒体DNA序列U_96639的5465-5620bp一致，与物种狗的PCR结果相一致。
实施例8
土狗心肌成纤维细胞的同工酶检测
1.试剂配制及材料来源说明
细胞裂解液：称取0.33g Tris，0.0186g EDTA，2％Tritonx-10050μl，定量于50mlddH2O中，4℃保存，备用；
1M乳酸钠：取9.25ml 60％乳酸钠，定量于50ml ddH2O中，4℃保存，备用；
0.1M NaCl：称取0.584g Nacl，定量于100ml ddH2O中，4℃保存，备用；
1M DL-苹果酸钠盐：称取8.9g DL-苹果酸钠盐，定量于50ml ddH2O中，4℃保存，备用；
乳酸脱氢酶染液配制：称取50mg NAD，30mg NBT，4mg PMS，量取10ml 1M乳酸钠，5ml 0.1M NaCl，15ml 0.5M Tris-HCl(pH值8.0)，定量于100ml ddH2O中，4℃避光保存，备用；
苹果酸酶染液配制：称取50mg NAD，30mg NBT，2mg PMS，量取10ml1M DL-苹果酸钠盐，5ml 0.1M NaCl，20ml 0.5M Tris-HCl(pH值8.0)，定量于100ml ddH2O中，4℃避光保存，备用。
PAGE凝胶配制试剂盒、5×非变性PAGE蛋白上样缓冲、Tritonx-100液购于碧云天公司，Tris、EDTA、NaCl、60％乳酸钠、NAD、NBT、PMS购于生工公司，Tris-HCl(pH值8.0)购于索莱宝公司，DL-苹果酸钠盐购于麦克林公司。
2.实验方法
(1)从实施例1中取F2代、实施例6中F20代土狗心肌成纤维细胞、肺成纤维细胞、成肌纤维细胞，以人Hela细胞、小鼠3T3-L1细胞为标准参照，以狗MDCK细胞为阳性对照；
(2)接种于6孔板培养板中培养直至细胞密度汇合至90％左右，0.25％胰酶消化，1000r/min离心3min，弃上清；
(3)1×PBS清洗1次，1000r/min离心3min，弃上清，根据沉淀体积加2倍体积的细胞裂解液，充分吹打，4℃裂解30min；
(4)4℃，12000r/min离心10min，收集上清分装，于-20℃暂存；
(5)配制6％非变性PAGE蛋白胶，体系见表4。
表4 6％非变性PAGE蛋白胶的体系
| 试剂 | 体积(ml) |
| 30％Acr-Bis(29:1) | 3.13 |
| 1MTris-HCl，pH8.8 | 5.7 |
| 10％APS | 0.15 |
| TEMED | 0.016 |
| ddH<sub>2</sub>O | 6 |
| 总计 | 15 |
(6)样品与5×非变性PAGE蛋白上样缓冲液4：1混匀，10μl上样，从左到右加样顺序依次为Hela、3T3-L1、土狗心肌成纤维细胞F2代、F20代、MDCK细胞；
(7)乳酸脱氢酶100V冰浴电泳4h，苹果酸酶100V冰浴电泳2h；
(8)电泳结束后轻轻剥离胶，于相应酶染液中避光染色30min左右，直至显示出条带；
(9)弃染液，ddH2O清洗3～5次，拍照得到如图10～图12所示的同工酶谱图。
结果显示，F2、F20代土狗心肌成纤维细胞、肺成纤维细胞、成肌纤维细胞，LDH同工酶带型与MDCK细胞一致，为三条带，MD同工酶带型与MDCK细胞一致，为一条带，迁移距离相同，说明构建的土狗成纤维细胞为狗源细胞；与人Hela细胞、小鼠3T3-L1细胞带型、迁移距离存在明显差异，说明构建的土狗成纤维与人、小鼠细胞未产生交叉污染。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国科学院昆明动物研究所
<120> 一种原代分离培养土狗多个组织来源的成纤维细胞及其永生化的构建方法
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caagacaggt ttaaggagac ca 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcagaatcca gatgctcaag g 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
attacagccg tactgctcct at 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cccaaagaat cagaacagat gc 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cggccaccca gaagtgtaca tc 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggctcgggtg tctacatcta gg 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
actgccagca gcctaaatgt at 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tccctaactt gccagtctta gc 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gaactaggtc agcccggtac tt 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cggagcacca attattaacg gc 22
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcactggctt acaactaggg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tggagatgag tttgactaag 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cctctttcct gctgctaatg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tttgatactg ggatatggcg 20
Claims (10)
1.一种原代分离培养土狗多个组织来源的成纤维细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将土狗的心脏组织、肺尖部或腿部肌肉组织剪碎，得到的组织糜；
2)将所述组织糜经过酶液消化后灭酶，静置，过筛，收集筛下物；所述酶液为含胶原酶II和/或胰酶的溶液；
3)将所述筛下物固液分离，清洗，得土狗心肌成纤维细胞、肺成纤维细胞或成肌纤维细胞。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2)中心脏组织来源的组织糜进行酶液消化时，酶液为含胶原酶II和胰酶的溶液；
胶原酶II溶液和胰酶溶液的体积比为(1～3):1；所述胶原酶II的质量浓度为0.1％～0.25％；所述胰酶的质量浓度为0.05％～0.25％。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2)中肺尖部来源的组织糜进行酶液消化时，酶液为含胰酶的溶液；所述胰酶的溶液的质量浓度为0.05％～0.25％。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2)中腿部肌肉组织来源的组织糜进行酶液消化时，酶液为含胶原酶II的溶液；所述胶原酶II的溶液的质量浓度为0.1％～0.25％。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2)中组织糜进行酶液消化时，所述酶液的反应条件为36～38℃消化20～60min；步骤2)中所述组织糜和酶液的体积比为1:(3～5)。
6.根据权利要求1～5任意一项所述方法，其特征在于，步骤2)中灭酶的方法为含体积浓度10％～20％FBS、质量浓度1％～2％双抗的DMEM细胞完全培养液；所述双抗为青霉素和链霉素。
7.权利要求1～6任意一项所述方法制备的土狗多个组织来源的成纤维细胞的永生化构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.将转染质粒溶液和转染试剂混合，得到的混合液转染293T细胞，收集上清液，除杂，得到病毒液；
B.将所述病毒液转染土狗心肌成纤维细胞、肺成纤维细胞或成肌纤维细胞，培养，得到转染后的土狗心肌成纤维细胞、肺成纤维细胞或成肌纤维细胞；
C.将所述转染后的土狗心肌成纤维细胞、肺成纤维细胞或成肌纤维细胞用含嘌呤霉素的培养基进行筛选培养，再用嘌呤霉素浓度减半的培养基继续筛选培养，得到细胞群；
D.将所述细胞群经消化传代，得到永生化的不同组织来源的成纤维细胞。
8.根据权利要求7所述永生化构建方法，其特征在于，步骤C中心肌成纤维细胞以嘌呤霉素浓度为1.5μg/ml进行筛选，肺成纤维细胞以嘌呤霉素的浓度为1μg/ml进行筛选，成肌纤维细胞以嘌呤霉素的浓度为2μg/ml进行筛选。
9.根据权利要求8所述永生化构建方法，其特征在于，步骤A中所述转染质粒溶液为每500μl OPTI-MEM中含6μg pCL-Eco、6μg pCL-Ampho、6μg SV40 T和2μg pLP-Vsvg；
所述转染试剂为每500μl OPTI-MEM中含80μl LipofectamineTM2000转染试剂。
10.根据权利要求7～9任意一项所述永生化构建方法，其特征在于，步骤A中所述293T细胞的细胞汇合度为50％～60％。
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