CN111454990A - 人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株，其保藏号为：CGMCC NO.19664，细胞株分类命名为人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株。本发明的细胞株是第一例来源于人的颈静脉球副神经节瘤细胞株。存在SDHB基因的突变，能够模拟实际中人SDHB基因突变背景的颈静脉球副神经节瘤表型。该细胞株以进行永生化处理，能大量培养传代，培养要求相对较为简单，能够短时间内获得大量的实验用细胞，总体实验周期较短。获得的细胞的基因型背景一致，无杂质细胞混杂，较原代细胞更适合基础实验，且适合推广。

Description

人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株及其应用

技术领域

本发明属于生物和医疗技术领域，具体涉及人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株及其应用。

背景技术

目前对颈静脉球瘤的研究主要局限于临床研究，由于缺乏合适的细胞株使得肿瘤发生与发展的基础研究受限极大。以往的研究主要是使用非副神经瘤来源的细胞对琥珀酸脱氢酶B(SDHB)进行沉默或者是使用原代肿瘤细胞。这些方法存在以下缺点：(1)非副神经瘤来源的细胞缺乏特异性，不能实际模拟颈静脉球副神经节瘤的真实表型；(2)肿瘤原代细胞生长缓慢，不能传代，受病人及临床诊断影响较大，影响实际研究的应用范围；(3) 原代细胞的提取与培养较为复杂，细胞产量较低，实验周期较长，细胞的基因型背景不一致，且混杂大量的非肿瘤细胞。

因此需要获得人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株及其应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供了人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株，其保藏号为：CGMCC NO.19664，细胞株分类命名为人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株。

本发明的第二方面，提供前述人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株的用途，选自以下任一项或多项：

a.制备肿瘤细胞模型或制备肿瘤动物模型；

b.筛选和/或评价/制备肿瘤治疗药物；

c.开发肿瘤药物靶点；

d.制备肿瘤诊断产品；

e.筛选肿瘤生物治疗药物/试剂；

f.开发检测肿瘤相关生物工程产品。

本发明的第三方面，提供一种人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株的筛选方法，包括以下步骤：

(1)人颈静脉球瘤细胞的筛选；

(2)提取颈静脉球副神经节瘤原代细胞，并培养传代；

(3)细胞的免疫荧光鉴定；

(4)病毒质粒的载体构建、病毒包装，采用SV40过表达慢病毒进行载体构建；

(5)质粒转染永生化肿瘤原代细胞；

(6)转染原代细胞的筛选；

(7)永生化细胞株的扩增鉴定。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的细胞株是第一例来源于人的颈静脉球副神经节瘤细胞株。存在SDHB基因的突变，能够模拟实际中人SDHB基因突变背景的颈静脉球副神经节瘤表型。该细胞株以进行永生化处理，能大量培养传代，培养要求相对较为简单，能够短时间内获得大量的实验用细胞，总体实验周期较短。获得的细胞的基因型背景一致，无杂质细胞混杂，较原代细胞更适合基础实验，且适合推广。

本发明细胞株保藏信息如下：

细胞株分类命名：为人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株。

保藏号为：CGMCC NO.19664；

保藏日期：2020年04月09日；

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏单位简称：CGMCC；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

图1为人颈静脉球瘤患者颅内MRI检查结果；

图2为肿瘤组织基因测序初步判断病理突变点的示意图，EO7外显子c.649C>T；

图3为原代细胞基因测序明确SDHB的病理点突变判断示意图；

图4为人颈静脉球瘤细胞的分离培养放大不同倍数后的观察结果(左为100X，右为200X)；

图5为分离培养的人颈静脉球瘤细胞的免疫荧光检测结果；

图6为SV40过表达慢病毒载体结构图；

图7为分离培养的人颈静脉球瘤细胞转染观察结果(左为100X，右为200X)；

图8为分离培养的永生化人颈静脉球瘤细胞扩增观察结果(左为100X，右为200X)。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

本发明一实施例的人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株，其保藏号为：CGMCC NO.19664，细胞株分类命名为人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株。

本发明的细胞株用于非治疗目的。

进一步的，所述细胞株存在SDHB基因的突变。

进一步的，SDHB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示(NM_003000.2)。

具体为：

ATGGCGGCGGTGGTCGCCCTCTCCTTGAGGCGCCGGTTGCCGGCCACAACCCTTG GCGGAGCCTGCCTGCAGGCCTCCCGAGGAGCCCAGACAGCTGCAGCCACAGCTCCCC GTATCAAGAAATTTGCCATCTATCGATGGGACCCAGACAAGGCTGGAGACAAACCTCA TATGCAGACTTATGAAGTTGACCTTAATAAATGTGGCCCCATGGTATTGGATGCTTTAAT CAAGATTAAGAATGAAGTTGACTCTACTTTGACCTTCCGAAGATCATGCAGAGAAGGC ATCTGTGGCTCTTGTGCAATGAACATCAATGGAGGCAACACTCTAGCTTGCACCCGAA GGATTGACACCAACCTCAATAAGGTCTCAAAAATCTACCCTCTTCCACACATGTATGTG ATAAAGGATCTTGTTCCCGATTTGAGCAACTTCTATGCACAGTACAAATCCATTGAGCC TTATTTGAAGAAGAAGGATGAATCTCAGGAAGGCAAGCAGCAGTATCTGCAGTCCATA GAAGAGCGTGAGAAACTGGACGGGCTCTACGAGTGCATTCTCTGTGCCTGCTGTAGC ACCAGCTGCCCCAGCTACTGGTGGAACGGAGACAAATATCTGGGGCCTGCAGTTCTTA TGCAGGCCTATCGCTGGATGATTGACTCCAGAGATGACTTCACAGAGGAGCGCCTGGC CAAGCTGCAGGACCCATTCTCTCTATACCGCTGCCACACCATCATGAACTGCACAAGG ACCTGTCCTAAGGGTCTGAATCCAGGGAAAGCTATTGCAGAGATCAAGAAAATGATGG CAACCTATAAGGAGAAGAAAGCTTCAGTTTAA

优选的，所述细胞株中，SDHB基因存在病理意义的突变。

在一种实施方式中，所述细胞株中，SDHB基因存在的突变为点突变，具体为EO7外显子c.649C>T，错义突变。

前述人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株可以用于以下任一种或多种的用途：

a.制备肿瘤细胞模型或制备肿瘤动物模型；

b.筛选和/或评价/制备肿瘤治疗药物；

c.开发肿瘤药物靶点；

d.制备肿瘤诊断产品；

e.筛选肿瘤生物治疗药物/试剂；

f.开发检测肿瘤相关生物工程产品。

本发明一实施例的人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株的筛选方法，包括以下步骤：

(1)人颈静脉球瘤细胞的筛选；

(2)提取颈静脉球副神经节瘤原代细胞，并培养传代；

(3)细胞的免疫荧光鉴定；

(4)病毒质粒的载体构建、病毒包装，采用SV40过表达慢病毒进行载体构建；

(5)质粒转染永生化肿瘤原代细胞；

(6)转染原代细胞的筛选；

(7)永生化细胞株的扩增鉴定。

在一种实施方式中，步骤(2)人颈静脉球瘤细胞的分离培养包括以下操作步骤：

(1)将手术中取出的组织置于无菌PBS缓冲液中低温运输；

(2)在超净工作台内取出组织，用60～80％酒精浸泡1-5min，置于含有P/S的PBS中；

(3)将组织块剪成边长为0.1～0.3cm的正方形，反复清洗后弃上清，置于含有完全培养基的培养皿中，37℃孵育30～60min；

(4)用镊子夹入培养瓶中，倒置于5％CO₂培养箱中孵育2h；

(5)分别加入2ml肿瘤细胞完全培养基，浸润组织块，置于3～5％CO2细胞培养箱中；

(6)每隔3天换液，待组织块周围生长的细胞融合成片，即可去除组织块，用胰蛋白酶消化细胞，重新铺瓶。

所述完全培养基至少包括：至少包括：细胞培养添加剂、血清、抗生素和基础培养基，所述细胞培养添加剂包括：

人源血管内皮生长因子(human vascular endothelial growth factor，hVEGF)、

人表皮生长因子(human Epidermal Growth Factor，hEGF)、

人源碱性成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor,Basic,Human，hFGFbasic)、

人胰岛素生长因子(Human Insulin-like Growth Factor，hIGF-1)

氢化可的松琥珀酸酯(Hydrocortisone hemisucinate)

和维生素C(Ascorbic acid)。

可选的，所述人源血管内皮生长因子为重组人源血管内皮生长因子(rhVEGF)。

可选的，人表皮生长因子为基因重组人表皮生长因子(rhEGF)。

可选的，所述人源碱性成纤维细胞生长因子为人源重组碱性成纤维细胞生长因子(rhFGF basic)。

可选的，所述人胰岛素生长因子为重组人胰岛素生长因子(rhIGF-1)。

进一步的，以所述培养基总量为基准计，所述培养基各组分的含量为：

细胞培养添加剂 质量分数为1％-3％；

血清 质量分数为5％-10％；

抗生素 1％；

余量为基础培养基。

可选的，细胞培养添加剂的质量分数为1％-1.5％，1.5％-2％，2％-2.5％，2.5％-3％。

可选的，血清的质量分数为5％-6％，6％-7％，7％-8％，8％-9％，9％-10％。

进一步的，以细胞培养添加剂的总量为基准计，所述细胞添加剂各组分含量为：

在一种实施方式中，所述血清选自胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)。

在一种实施方式中，所述抗生素选自青霉素-链霉素双抗(penicillin/streptomycin)。

在一种实施方式中，所述基础培养基选自DMEM/F-12培养基。

优选的，所述培养基的pH值为7.55-7.70。

所述培养基可以为液体培养基。

所述培养基的颜色为淡红色。

所述培养基的渗透压(Osmolality)为：317mOsm/kg。

在一种实施方式中，步骤(3)细胞的免疫荧光鉴定包括以下步骤：

(1)细胞爬片：取玻璃片于24孔板中，每孔加入培养基1mL、细胞，置培养箱2h或过夜；

(2)固定：细胞爬片后，吸出培养基，用PBS洗，加入4％PFA于4℃固定20～40min；用PBS洗3×5min/次；也可最后一次不吸出PBS，放4℃过夜。

(3)破膜封闭：将玻片除去水分，置于培养皿支撑物上，取50μL破膜封闭液滴于防水膜上，将玻片上有细胞的一面盖上2h。

(4)一抗孵育：一抗配制：抗体与PBS 1:100(200)稀释；破膜封闭后，取50μL一抗于防水膜上(湿盒中)，将玻片(有细胞的一面)盖上置于4℃保存；

(5)二抗孵育：室温避光孵育二抗(二抗:PBS＝1:500)2h后，PBS洗3×5min/次，染DAPI(DAPI:PBS＝1:1000)5min，PBS洗3×5min/次。

(6)包埋：玻片上各滴1滴Fluoromount-G，将有细胞的一面盖上。

在一种实施方式中，所述玻璃片封闭液配置：0.5％Trition X-100与PBS 1:1混合，再加10％血清。

在一种实施方式中，所述载体为EF1α-SV40-IRES-puromycin，携带Puromycin抗性基因标记。

在一种实施方式中，步骤(6)转染原代细胞的筛选包括杀灭曲线的确定和嘌呤霉素筛选转染细胞。

实施例1

试验所需仪器设备及试剂，见下表1和表2。

表1.仪器

表2.试剂耗材

技术方案包括以下步骤：

1.筛选、诊断人颈静脉球瘤细胞

1.1术前筛选诊断颈静脉球瘤明确的患者，术中及术后病理诊断颈静脉球副神经节瘤。

患者筛选通过颅内MRI检查确认，见图1，颅脑MRI增强显示左侧颈静脉孔明显强化，伴混杂低信号，颈静脉球瘤表现。

肿瘤组织基因测序明确SDHB基因存在病理意义的点突变(EO7外显子c.649C>T，missense mutation)，见图2，为患者肿瘤组织测序结果。

患者筛选的其他指标见表3。

表3.

2.人颈静脉球瘤细胞的分离，培养、传代

包括以下操作步骤：

(1)将手术中取出的组织置于无菌PBS缓冲液中低温运输；

(2)在超净工作台内取出组织，用75％酒精浸泡2min左右，置于含有P/S的PBS中；

(3)将组织块剪成边长约为0.1cm的正方形，反复清洗后弃上清，置于含有完全培养基的培养皿中，37℃孵育30～60min；所述完全培养基中，由以下质量百分比的原料组成：胎牛血清5％、细胞培养添加剂1％、青链霉素双抗混合液1％、采用 DMEM/F-12(#1132033,Gibco ThermoFisher)作为肿瘤基础培养基，pH保持为7.70。

所述的细胞培养添加剂包括以下浓度的添加剂：5ng/ml重组人源血管内皮生长因子、 5ng/ml基因重组人表皮生长因子、5ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子、15ng/m重组人胰岛素生长因子、1ug/ml氢化可的松琥珀酸单酯、50ug/ml维生素C。

(4)用镊子夹入培养瓶中，倒置于5％CO₂培养箱中孵育2h；

(5)分别加入2ml肿瘤细胞完全培养基，浸润组织块，但不能使组织块漂浮，置于5％ CO₂细胞培养箱中；

(6)每隔3天换液，待组织块周围生长的细胞融合成片，即可去除组织块，用胰蛋白酶消化细胞，重新铺瓶。

细胞培养观察结果，见图4：镜下细胞形态清晰、完整，呈梭形状态，有突起。

3.免疫荧光鉴定

3.1实验步骤

(1)细胞爬片

取3片玻璃片于24孔板中，每孔加入培养基1mL，加入细胞0.02million个/孔，置培养箱2h或过夜。

(2)固定

细胞爬片后，吸出培养基，用PBS洗1遍，加入4％PFA于4℃固定30min。用PBS洗 3×5min/次。也可最后一次不吸出PBS，放4℃过夜。

(3)破膜封闭

将玻片除去水分，置于培养皿支撑物上，玻璃片封闭液配置：0.5％Trition X-100与PBS 1:1混合，再加10％血清，取50μL破膜封闭液滴于防水膜上，将玻片上有细胞的一面盖上2h。

(4)一抗孵育

一抗配制：抗体与PBS 1:100(200)稀释，破膜封闭后，取50μL一抗于防水膜上(湿盒中)，将玻片(有细胞的一面)盖上置于4℃(最多可放置一周)

(5)二抗孵育

室温避光孵育二抗(二抗:PBS＝1:500)2h后，PBS洗3×5min/次，染DAPI (DAPI:PBS＝1:1000)5min，PBS洗3×5min/次。

(6)包埋

玻片上各滴1滴Fluoromount-G，将有细胞的一面盖上。

鉴定细胞为原代细胞。

3.2免疫荧光鉴定结果

见图5。结果显示镜下细胞进行肿瘤特异性蛋白S100染色(绿色)明显阳性。如图3所示，细胞DNA基因测序再次明确SDHB存在病理意义的点突变(EO7外显子c.649C>T，missense mutation)。

4.病毒质粒的载体构建、病毒包装

采用SV40过表达慢病毒进行载体构建。SV40过表达慢病毒基本信息如下：

SV40过表达慢病毒，载体为EF1α-SV40-IRES-puromycin，携带Puromycin抗性基因标记，载体的图谱参看图6，其序列信息如SEQ ID NO.2所示。具体为：

gttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaggatctatttccggtgaattcatggataaagttttaaacagagaggaatctttgcagct aatggaccttctaggtcttgaaaggagtgcctgggggaatattcctctgatgagaaaggcatatttaaaaaaatgcaaggagtttcatcctgata aaggaggagatgaagaaaaaatgaagaaaatgaatactctgtacaagaaaatggaagatggagtaaaatatgctcatcaacctgactttgga ggcttctgggatgcaactgagattccaacctatggaactgatgaatgggagcagtggtggaatgcctttaatgaggaaaacctgttttgctcag aagaaatgccatctagtgatgatgaggctactgctgactctcaacattctactcctccaaaaaagaagagaaaggtagaagaccccaaggact ttccttcagaattgctaagttttttgagtcatgctgtgtttagtaatagaactcttgcttgctttgctatttacaccacaaaggaaaaagctgcactgct atacaagaaaattatggaaaaatattctgtaacctttataagtaggcataacagttataatcataacatactgttttttcttactccacacaggcatag agtgtctgctattaataactatgctcaaaaattgtgtacctttagctttttaatttgtaaaggggttaataaggaatatttgatgtatagtgccttgacta gagatccattttctgttattgaggaaagtttgccaggtgggttaaaggagcatgattttaatccagaagaagcagaggaaactaaacaagtgtcc tggaagcttgtaacagagtatgcaatggaaacaaaatgtgatgatgtgttgttattgcttgggatgtacttggaatttcagtacagttttgaaatgtg tttaaaatgtattaaaaaagaacagcccagccactataagtaccatgaaaagcattatgcaaatgctgctatatttgctgacagcaaaaaccaaa aaaccatatgccaacaggctgttgatactgttttagctaaaaagcgggttgatagcctacaattaactagagaacaaatgttaacaaacagattta atgatcttttggataggatggatataatgtttggttctacaggctctgctgacatagaagaatggatggctggagttgcttggctacactgtttgttg cccaaaatggattcagtggtgtatgactttttaaaatgcatggtgtacaacattcctaaaaaaagatactggctgtttaaaggaccaattgatagtggtaaaactacattagcagctgctttgcttgaattatgtggggggaaagctttaaatgttaatttgcccttggacaggctgaactttgagctaggagt agctattgaccagtttttagtagtttttgaggatgtaaagggcactggaggggagtccagagatttgccttcaggtcagggaattaataacctgg acaatttaagggattatttggatggcagtgttaaggtaaacttagaaaagaaacacctaaataaaagaactcaaatatttccccctggaatagtca ccatgaatgagtacagtgtgcctaaaacactgcaggccagatttgtaaaacaaatagattttaggcccaaagattatttaaagcattgcctggaa cgcagtgagtttttgttagaaaagagaataattcaaagtggcattgctttgcttcttatgttaatttggtacagacctgtggctgagtttgctcaaagt attcagagcagaattgtggagtggaaagagagattggacaaagagtttagtttgtcagtgtatcaaaaaatgaagtttaatgtggctatgggaat tggagttttagattggctaagaaacagtgatgatgatgatgaagacagccaggaaaatgctgataaaaatgaagatggtggggagaagaaca tggaagactcagggcatgaaacaggcattgattcacagtcccaaggctcatttcaggcccctcagtcctcacagtctgttcatgatcataatca gccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacagagcaaaagctcatttctgaagagg acttgtaatctagacacagtgcagcactctcaacgttcaaggacactacgcgtctggaacaatcaacc。

5.转染

(1)将细胞接种6孔板，每孔细胞数约为1×10⁵个；

(2)第二天，待细胞贴壁后，换液；

(3)加入1mL完全培养基，再加20SV40过表达慢病毒；

(4)混匀后继续培养；

(5)12h后观察细胞状态，并更换为新鲜培养基；

(6)当细胞长满板底后，传代至T25培养瓶中。

细胞转染之后在显微镜下观察，结果见图7：进行慢病毒转染后的镜下图像，细胞形态清晰完好。

6.筛选

6.1杀灭曲线的确定

(1)将未转染的细胞按每孔0.05million铺入24孔板，孵育过夜；

(2)第二天，除去24孔板中旧的培养基；

(3)将含不同浓度嘌呤霉素(1μg/mL，2μg/mL，3μg/mL，4μg/mL，5μg/mL，6μg/mL， 7μg/mL)的新鲜培养基加入已铺有细胞的24孔板；

(4)每2天更换新鲜的筛选培养基；

(5)每天观察细胞的存活比例；

(6)最小的嘌呤霉素使用浓度就是从嘌呤霉素筛选开始1-4d内杀死所有细胞的最低筛选浓度。

结果：嘌呤霉素的使用浓度为1μg/mL，作用时间2d。

6.2嘌呤霉素筛选转染细胞

(1)第一天，将转染的细胞按每孔0.05million铺入24孔板，孵育过夜；

(2)第二天，除去24孔板中旧的培养基；

(3)加入含嘌呤霉素(1μg/mL)的筛选培养基，孵育；

(4)每2天更换新鲜的筛选培养基；

(5)每天观察细胞的存活比例；

(6)在同一时间点(2d)存活的细胞，即为转染成功的细胞；

(7)对筛选后的细胞进行培养。

7.细胞扩增

利用完全培养基，将筛选后的细胞进行培养，筛选后的细胞为P1代(永生化后的第一代)，培养扩增至少到12代，以进行纯化，去除杂细胞。将P1代细胞株进行保藏，其保藏号为：CGMCC NO.19664，细胞株名称为PGL-626。

每100uL完全培养基培养人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞，将纯化后的细胞株(第 12代)和完全培养基混匀后种板(96孔板)，在37度，5％CO₂的恒温培养箱内培养24-48H，加入10ul CCK8(#CK04 Dojindo)处理1-2H后在酶标仪450nm下测定吸光度值，再按照CCK8 试剂盒方法计算细胞增殖活性率。结果如下：

由上表可知，所述永生化细胞增殖活性高，第12代永生化的细胞图片见图8，永生化后传代培养的细胞形态，形态基本无明显变化。100倍放大观察和200倍放大观察结果均表明，细胞扩增后永生化的细胞具有很高的纯度。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110> 上海交通大学医学院附属第九人民医院

<120> 人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株及其应用

<150> 2019111662802

<151> 2019-11-25

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 843

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcggcgg tggtcgccct ctccttgagg cgccggttgc cggccacaac ccttggcgga 60

gcctgcctgc aggcctcccg aggagcccag acagctgcag ccacagctcc ccgtatcaag 120

aaatttgcca tctatcgatg ggacccagac aaggctggag acaaacctca tatgcagact 180

tatgaagttg accttaataa atgtggcccc atggtattgg atgctttaat caagattaag 240

aatgaagttg actctacttt gaccttccga agatcatgca gagaaggcat ctgtggctct 300

tgtgcaatga acatcaatgg aggcaacact ctagcttgca cccgaaggat tgacaccaac 360

ctcaataagg tctcaaaaat ctaccctctt ccacacatgt atgtgataaa ggatcttgtt 420

cccgatttga gcaacttcta tgcacagtac aaatccattg agccttattt gaagaagaag 480

gatgaatctc aggaaggcaa gcagcagtat ctgcagtcca tagaagagcg tgagaaactg 540

gacgggctct acgagtgcat tctctgtgcc tgctgtagca ccagctgccc cagctactgg 600

tggaacggag acaaatatct ggggcctgca gttcttatgc aggcctatcg ctggatgatt 660

gactccagag atgacttcac agaggagcgc ctggccaagc tgcaggaccc attctctcta 720

taccgctgcc acaccatcat gaactgcaca aggacctgtc ctaagggtct gaatccaggg 780

aaagctattg cagagatcaa gaaaatgatg gcaacctata aggagaagaa agcttcagtt 840

taa 843

<210> 2

<211> 2274

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gttcaaagtt tttttcttcc atttcaggtg tcgtgaggat ctatttccgg tgaattcatg 60

gataaagttt taaacagaga ggaatctttg cagctaatgg accttctagg tcttgaaagg 120

agtgcctggg ggaatattcc tctgatgaga aaggcatatt taaaaaaatg caaggagttt 180

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cattctactc ctccaaaaaa gaagagaaag gtagaagacc ccaaggactt tccttcagaa 480

ttgctaagtt ttttgagtca tgctgtgttt agtaatagaa ctcttgcttg ctttgctatt 540

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atttgtaaag gggttaataa ggaatatttg atgtatagtg ccttgactag agatccattt 780

tctgttattg aggaaagttt gccaggtggg ttaaaggagc atgattttaa tccagaagaa 840

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tgtttaaaat gtattaaaaa agaacagccc agccactata agtaccatga aaagcattat 1020

gcaaatgctg ctatatttgc tgacagcaaa aaccaaaaaa ccatatgcca acaggctgtt 1080

gatactgttt tagctaaaaa gcgggttgat agcctacaat taactagaga acaaatgtta 1140

acaaacagat ttaatgatct tttggatagg atggatataa tgtttggttc tacaggctct 1200

gctgacatag aagaatggat ggctggagtt gcttggctac actgtttgtt gcccaaaatg 1260

gattcagtgg tgtatgactt tttaaaatgc atggtgtaca acattcctaa aaaaagatac 1320

tggctgttta aaggaccaat tgatagtggt aaaactacat tagcagctgc tttgcttgaa 1380

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tacagacctg tggctgagtt tgctcaaagt attcagagca gaattgtgga gtggaaagag 1860

agattggaca aagagtttag tttgtcagtg tatcaaaaaa tgaagtttaa tgtggctatg 1920

ggaattggag ttttagattg gctaagaaac agtgatgatg atgatgaaga cagccaggaa 1980

aatgctgata aaaatgaaga tggtggggag aagaacatgg aagactcagg gcatgaaaca 2040

ggcattgatt cacagtccca aggctcattt caggcccctc agtcctcaca gtctgttcat 2100

gatcataatc agccatacca catttgtaga ggttttactt gctttaaaaa acctcccaca 2160

cctccccctg aacctgaaac agagcaaaag ctcatttctg aagaggactt gtaatctaga 2220

cacagtgcag cactctcaac gttcaaggac actacgcgtc tggaacaatc aacc 2274

Claims (10)

1.一种人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株，其保藏号为：CGMCC NO.19664，细胞株分类命名为人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株。

2.如权利要求1所述的人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株，其特征在于，所述细胞株存在SDHB基因的突变。

3.如权利要求2所述的人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株，其特征在于，还包括以下任一项或多项：

a.SDHB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

b.所述细胞株中，SDHB基因存在病理意义的突变；

c.所述细胞株中，SDHB基因存在的突变为点突变，具体为EO7外显子c.649C>T，错义突变。

4.如权利要求1-3任一所述的人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株的用途，选自以下任一项或多项：

a.制备肿瘤细胞模型或制备肿瘤动物模型；

b.筛选和/或评价/制备肿瘤治疗药物；

c.开发肿瘤药物靶点；

d.制备肿瘤诊断产品；

e.筛选肿瘤生物治疗药物/试剂；

f.开发检测肿瘤相关生物工程产品。

5.一种人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)人颈静脉球瘤细胞的筛选；

(2)提取颈静脉球副神经节瘤原代细胞，并培养传代；

(3)细胞的免疫荧光鉴定；

(4)病毒质粒的载体构建、病毒包装，采用SV40过表达慢病毒进行载体构建；

(5)质粒转染永生化肿瘤原代细胞；

(6)转染原代细胞的筛选；

(7)永生化细胞株的扩增鉴定。

6.如权利要求5所述的人颈静脉球瘤永生化细胞株的筛选方法，其特征在于：步骤(2)人颈静脉球瘤细胞的分离培养包括以下操作步骤：

(1)将手术中取出的组织置于无菌PBS缓冲液中低温运输；

(2)在超净工作台内取出组织，用60～80％酒精浸泡1-5min，置于含有P/S的PBS中；

(3)将组织块剪成边长为0.1～0.3cm的正方形，反复清洗后弃上清，置于含有完全培养基的培养皿中，37℃孵育30～60min；

(4)用镊子夹入培养瓶中，倒置于5％CO₂培养箱中孵育2h；

(5)分别加入2ml肿瘤细胞完全培养基，浸润组织块，置于3～5％CO₂细胞培养箱中；

(6)每隔3天换液，待组织块周围生长的细胞融合成片，即可去除组织块，用胰蛋白酶消化细胞，重新铺瓶。

7.如权利要求5所述的人颈静脉球瘤永生化细胞株的筛选方法，其特征在于：步骤(3)细胞的免疫荧光鉴定包括以下步骤：

(1)细胞爬片：取玻璃片于24孔板中，每孔加入培养基1mL、细胞，置培养箱2h或过夜；

(2)固定：细胞爬片后，吸出培养基，用PBS洗，加入4％PFA于4℃固定20～40min；用PBS洗3×5min/次；也可最后一次不吸出PBS，放4℃过夜。

(3)破膜封闭：将玻片除去水分，置于培养皿支撑物上，取50μL破膜封闭液滴于防水膜上，将玻片上有细胞的一面盖上2h。

(4)一抗孵育：一抗配制：抗体与PBS 1:100(200)稀释；破膜封闭后，取50μL一抗于防水膜上(湿盒中)，将玻片(有细胞的一面)盖上置于4℃保存；

(5)二抗孵育：室温避光孵育二抗(二抗:PBS＝1:500)2h后，PBS洗3×5min/次，染DAPI(DAPI:PBS＝1:1000)5min，PBS洗3×5min/次。

(6)包埋：玻片上各滴1滴Fluoromount-G，将有细胞的一面盖上。

8.如权利要求7所述的人颈静脉球瘤永生化细胞株的筛选方法，其特征在于：所述玻璃片封闭液配置：0.5％Trition X-100与PBS 1:1混合，再加10％血清。

9.如权利要求5所述的人颈静脉球瘤永生化细胞株的筛选方法，其特征在于：所述载体为EF1α-SV40-IRES-puromycin，携带Puromycin抗性基因标记。

10.如权利要求5或9所述的人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株的筛选方法，其特征在于：步骤(6)转染原代细胞的筛选包括杀灭曲线的确定和嘌呤霉素筛选转染细胞。

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