CN110684738A - 一种慢病毒载体介导sv40 t抗原转染获得永生化细胞株的方法 - Google Patents

一种慢病毒载体介导sv40 t抗原转染获得永生化细胞株的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种慢病毒载体介导SV40 T抗原转染获得永生化细胞株的方法，属于细胞生物学领域。具体地，本发明通过构建一种能够高效、快速转染的SV40 T抗原慢病毒表达载体，该载体通过工程细胞包装可获得表达SV40 T抗原的慢病毒颗粒用于转染原代分离细胞，进而通过博来霉素（zeocin）抗性特点筛选获得永生化细胞株。本发明公开的构建永生化细胞株的方法具有高效、方便、快捷的特点，并且价格低廉，适于推广应用。

Description

一种慢病毒载体介导SV40 T抗原转染获得永生化细胞株的 方法
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，具体地，涉及一种慢病毒载体介导SV40 T抗原转染获得永生化细胞株的方法。
背景技术
细胞生物学研究中多数原代分离细胞作为终末分化的细胞在体外的培养和传代时间有限，传代一定次数后就会进入衰老期而不能再继续增殖。而反复分离原代细胞不仅费时费力，而且各批次细胞间存在差异，不能保持细胞生理指标的稳定性。
一些抑癌基因P53和pRB的失活以及端粒酶的激活，是人体细胞获得永生化的必要条件。哺乳动物细胞使用几种方法诱导细胞永生化(Cell immortalizing)，其中包括使用猿猴病毒40(Simian virus 40，SV40)T抗原基因、人类端粒酶逆转录酶基因、P53和pRB的shRNAs等。SV40大T抗原是由SV40病毒早期编码区编码的一种多功能磷酸蛋白，在病毒复制过程中发挥着重要作用。SV40大T抗原具有活化宿主细胞核糖体基因、诱导DNA合成、修饰蛋白质合成起始因子等作用，并且能结合、调控某些关键性的细胞调控蛋白，如视网膜母细胞瘤蛋白家族成员(如pRB)、肿瘤抑制因子p53等，并可诱导感染细胞的端粒酶活性，诱导多种细胞的永生化。通过对SV40大T抗原介导的永生化细胞系的深入研究发现：SV40大T抗原基因与宿主细胞DNA稳定整合重组后，不但能在细胞内表达SV40大T抗原，加快转化细胞的生长速率，同时也能保留原始细胞的许多分化表型，具有相对稳定的增殖特性和功能状态，而在转化细胞系中非原始基因的表达很少见。
目前，已有一些方法用于介导SV40大T抗原基因的转染，如通过脂质体介导构建有SV40大T抗原基因的真核表达质粒载体转染目标原代细胞并筛选获得永生化细胞系的方法，但其转染效率较低，筛选困难，一些较难转染的细胞难以获得稳定表达和建立细胞系。另有一些构建的腺病毒或慢病毒SV40 T表达载体在转染后缺少简便的筛选方法，如需要特殊温度控制的培养箱培养筛选。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种构建永生化细胞株的方法，为了达到这个目的，本发明构建一种能够高效、快速转染的SV40 T抗原慢病毒表达载体，该载体通过工程细胞包装可获得表达SV40 T抗原的慢病毒颗粒(假病毒)用于转染原代分离细胞，进而通过博来霉素(zeocin)抗性特点筛选获得永生化细胞株。
本发明所采用的技术方案如下：
1.构建SV-40 T抗原慢病毒表达载体：
(1)以含SV40 T抗原cDNA序列的SV40 tsA58质粒为模板，根据NCBI的SV 40完整基因组(NC_001669.1)设计特定的质粒构建引物，高保真PCR获取SV40 T抗原全长cDNA，对扩增得到PCR产物进行纯化。
在本发明的一些实施方案中，所述构建引物包括具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID No.2所示核苷酸序列的下游引物。
在本发明的一些实施方案中，高保真PCR的体系为：引物混合液1.5μL，10×PfuDNA聚合酶反应混合物(含dNTPs)5μL，Pfu DNA聚合酶0.5μL，模板DNA质粒1μL，用灭菌去离子水补齐到50μL。
在本发明的一些实施方案中，高保真PCR的反应程序为：95℃2min；95℃15s，58℃30s，68℃4min，36个循环；68℃5min。
(2)将PCR产物TOPO克隆进入pENTRTM TOPO载体，获得pENTR-SV40 T Entrez质粒。
在本发明的一些实施方案中，进一步包括对所述pENTR-SV40 T Entrez质粒进行鉴定的步骤，具体地，利用以M13正向和逆向引物对pENTR-SV40 T质粒进行PCR扩增，并通过对PCR产物进行测序对所述pENTR-SV40 T质粒进行鉴定。
(3)LR重组反应将pENTR-SV40 T质粒中的SV40 T抗原cDNA克隆到目标慢病毒载体，构建SV40 T抗原慢病毒表达载体pLenti4/V5-GW/SV40 T，并通过测序等方法鉴定。
在本发明的一些实施方案中，所述LR重组反应具体包括：1.5mL离心管中加入7μL所述pENTR-SV40 T质粒、1μL目标慢病毒载体pLenti4/V5-DEST、8μL TE缓冲液、2μL LRClonaseTMII enzyme mix，混匀，25℃孵育1h，加入1μL蛋白酶K溶液终止反应，反应液混匀后37℃孵育10min。
进一步地，转化1μL所述反应液于50μL Stbl3TM感受态细胞，冰上孵育30min，42℃热休克30秒，加入250μL S.O.C.培养液，37℃振摇培养1h，分别将20μL和100μL转化液铺于氨苄青霉素LB琼脂板。
更进一步地，以CMV正向和逆向引物进行PCR测序，鉴定克隆的SV40 T抗原cDNA序列以CMV正向和逆向引物进行PCR测序，鉴定克隆的SV40 T抗原cDNA序列，构建SV40 T抗原慢病毒表达载体pLenti4/V5-GW/SV40 T。
2.慢病毒包装：
采用脂质体LipofectamineTM2000介导pLenti4/V5-SV40 T和包装质粒pCMV-VSV-G及psPAX2转染工程细胞293FT，进行假病毒包装。
3.慢病毒介导SV40 T抗原转染原代分离细胞获得永生化细胞株：
分离和原代培养待永生化细胞，用含SV40 T抗原的轮替病毒培养上清液转染原代培养细胞，以博来霉素(zeocin)抗性特点筛选转染和稳定表达SV40 T抗原的原代细胞，获得永生化细胞株。
在本发明的一些具体实施方案中，所述待永生化细胞为肝星状细胞。
在本发明中，进一步包括对获得的永生化细胞株进行鉴定的步骤。鉴定的方法包括但不限于来源原代细胞的生物学特征的鉴定、细胞株可传代性鉴定、细胞株SV40 T抗原表达检测。
在本发明的一些具体实施方案中，所述细胞株可传代性鉴定中，如果所述细胞株至少能稳定传十代，表示可传代性好。
在本发明的一些具体实施方案中，细胞株SV40 T抗原表达检测的方法包括但不限于免疫荧光染色和Western Blot检测法。如果检测结果为阳性，表明所述细胞株为永生化细胞株。
本发明的有益效果
相对于现有技术，本发明的具有以下有益效果：
利用本发明，能够快速有效地在构建能够在体外无限培养的永生化细胞株，可使技术人员免于反复分离原代细胞，同时又可为研究、医学应用提供稳定、充足的细胞材料，因此具有重要的实用价值和运用潜能。
本发明的方法高效、方便、快捷，价格低廉，适于推广应用。
附图说明
图1示出了高保真PCR获取的SV40 T抗原全长cDNA琼脂糖凝胶电泳图，SV40 T抗原全长cDNA片段大小2477bp。
图2示出了M13正向引物对pENTR-SV40 T Entrez质粒进行PCR测序结果，验证CACC克隆位点(122-125)、ATG转录起始位点(126-128)及SV40 T抗原cDNA序列。
图3示出了CMV正向引物对pLenti4/V5-GW/SV40 T慢病毒表达质粒进行PCR测序结果，验证ATG转录起始位点(151-153)及SV40 T抗原cDNA序列。
图4示出了肝星状细胞分离和原代培养鉴定：A)油红O染色：见分离和原代培养5天肝星状细胞胞浆内充满脂滴；B)α-SMA免疫荧光染色：见分离和原代培养10天肝星状细胞胞浆内α-SMA表达和分布。
图5示出了免疫荧光染色永生化肝星状细胞株的SV40 T抗原表达：A)免疫荧光染色SV40 T抗原；B)DAPI细胞核染色；C)SV40 T抗原(红色)在转染细胞核(DAPI染色，紫色)表达和定位。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例
1.构建SV-40 T抗原慢病毒表达载体
(1)以含SV40 T抗原cDNA序列的SV40 tsA58质粒(由英国伦敦路德维希癌症研究所Jat P.S.教授惠赠)为模板，根据NCBI的SV40完整基因组(NC_001669.1)设计特定的质粒构建引物：
SV40 T-CF1：5‘-CACCATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAG-3’(SEQ ID NO.1)
SV40 T-CR1：5‘-TTATGTTTCAGGTTCAGGGGGA-3’(SEQ ID NO.2)
(2)高保真PCR获取SV40 T抗原全长cDNA：50μL PCR反应体系：引物混合液1.5μL，10×Pfu DNA聚合酶反应混合物(含dNTP)5μL，Pfu DNA聚合酶0.5μL，模板DNA质粒1μL，用灭菌去离子水补齐到50μL。PCR反应条件：95℃2min；95℃15s，58℃30s，68℃4min，36个循环；68℃5min。4℃保存备用。
(3)PCR产物纯化：PCR产物进行1％低熔点琼脂糖凝胶电泳(如图1所示)，切割回收SV40 T抗原全长cDNA PCR条带，
Figure BDA0002260020950000051
QuickGel提取纯化PCR产物，测定并调整纯化PCR产物为10ng/ul浓度。
(4)将PCR产物TOPO克隆进入pENTRTM 载体(pENTRTMDirectional
Figure BDA0002260020950000053
Cloning Kits.Invitrogen，MAN0000245)：上述纯化SV40 T抗原PCR产物4μL，盐溶液1μL，pENTRTM
Figure BDA0002260020950000054
载体1μL，总体积6μL室温轻柔混匀，室温放置30min，置于冰上。
(5)转化和Entrez克隆筛选：
Figure BDA0002260020950000055
克隆反应产物2μL转化感受态大肠杆菌(One
Figure BDA0002260020950000056
chemically competent E.coli cells)，接种于卡那霉素LB琼脂板，37℃培养过夜，挑选生长菌落5个扩增和提取质粒，以M13正向和逆向引物进行PCR测序，鉴定克隆的SV40 T抗原cDNA序列，以M13正向和逆向引物进行PCR测序(正向测序结果见图2)，鉴定克隆的SV40 T抗原cDNA序列，获得pENTR-SV40 T质粒。
(6)LR重组反应将pENTR-SV40 T质粒中的SV40 T抗原cDNA克隆到目标慢病毒载体：1.5mL离心管中加入7μL(15ng)上述Entrez克隆表达质粒pENTR-SV40 T、1μL目标慢病毒载体pLenti4/V5-DEST、8μL TE缓冲液、2μL LR ClonaseTMII enzyme mix，混匀，25℃孵育1h，加入1μL蛋白酶K溶液终止反应，反应液混匀后37℃孵育10min。
(7)转化1μL LR反应液于50μL Stbl3TM感受态细胞，冰上孵育30min，42℃热休克30秒，加入250μL S.O.C.培养液，37℃振摇培养1h，分别将20μL和100μL转化液铺于氨苄青霉素LB(LBA)琼脂板。37℃培养过夜，挑选生长菌落5个扩增和提取质粒。以CMV正向和逆向引物进行PCR测序，鉴定克隆的SV40 T抗原cDNA序列以CMV正向和逆向引物进行PCR测序(正向测序结果见图3)，鉴定克隆的SV40 T抗原cDNA序列，构建SV40 T抗原慢病毒表达载体pLenti4/V5-GW/SV40 T。
2.慢病毒包装
采用脂质体LipofectamineTM3000介导pLenti4/V5-GW/SV40 T和包装质粒pCMV-VSV-G及psPAX2(2:1.5:1)转染工程细胞293FT，进行假病毒包装，收集含包装病毒的培养上清液冻存备用(ViraPowerTMLentiviral Expression Systems，Invitrogen，MAN0000273)。
3.慢病毒介导SV40 T抗原转染原代分离细胞，筛选获得永生化细胞株
采用肝星状细胞作为待永生化细胞。
(1)肝星状细胞原代分离和培养：获得人肝脏小块新鲜手术标本，采用用酶液灌注消化及密度梯度离心两步法分离肝星状细胞并进行原代培养扩增，采用α-SMA(HSC的重要标志)(图4A)、Desmin免疫荧光染色及油红O染脂滴(图4B)，结合观察细胞内维生素A自发荧光的方法进行鉴定(王满，郭津生*，涂传涛，王吉耀，Friedman SL。人肝脏星状细胞的改良分离法。复旦学报，2008,35(4):617-620.，以参考方式全文并入此处)。
(2)慢病毒介导SV-40 T抗原转染原代培养细胞并筛选转染细胞：以含SV40 T抗原的轮替病毒培养上清液转染原代培养细胞24～48h，以博来霉素(Zeocin)抗性特点筛选转染和稳定表达SV40 T抗原的原代细胞，每3天更换含50μg/mL博来霉素的10％牛血清的DMEM培养液，2～4周后可筛选出存活细胞克隆，扩增成株。
(3)细胞株的鉴定：包括来源原代细胞的生物学特征的鉴定，细胞株可传代性(至少能稳定传十代)、细胞株SV40 T抗原表达的检测，如免疫荧光染色(图5)或Western Blot检测SV40 T抗原，可作为转染永生化细胞标志。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种构建永生化细胞株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)构建SV-40T抗原慢病毒表达载体：
以含SV40 T抗原cDNA序列的SV40 tsA58质粒为模板，根据NCBI的SV40完整基因组(NC_001669.1)设计特定的质粒构建引物，高保真PCR获取SV40T抗原全长cDNA，对扩增得到PCR产物进行纯化；
将PCR产物TOPO克隆进入pENTRTMTOPO载体，获得pENTR-SV40 T质粒；
LR重组反应将pENTR-SV40 T质粒中的SV40 T抗原cDNA克隆到目标慢病毒载体，构建SV40 T抗原慢病毒表达载体pLenti4/V5-GW/SV40 T，
2)慢病毒包装：
采用脂质体LipofectamineTM2000介导pLenti4/V5-SV40 T和包装质粒pCMV-VSV-G及psPAX2转染工程细胞293FT，进行假病毒包装，
3)慢病毒介导SV40 T抗原转染原代分离细胞获得永生化细胞株：
分离和原代培养待永生化细胞，用含SV40 T抗原的轮替病毒培养上清液转染原代培养细胞，以博来霉素抗性特点筛选转染和稳定表达SV40 T抗原的原代培养细胞，获得永生化细胞株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述构建引物包括具有SEQ IDNo.1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQID No.2所示核苷酸序列的下游引物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中高保真PCR的体系为：引物混合液1.5μL，10×Pfu DNA聚合酶反应混合物(含dNTPs)5μL，Pfu DNA聚合酶0.5μL，模板DNA质粒1μL，用灭菌去离子水补齐到50μL；反应程序为：95℃2min；95℃15s，58℃30s，68℃4min，36个循环；68℃5min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，利用以M13正向和逆向引物对pENTR-SV40 T质粒进行PCR扩增，并通过对PCR产物进行测序对所述pENTR-SV40 T质粒进行鉴定。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述LR重组反应具体包括：1.5mL离心管中加入7μL所述pENTR-SV40 T质粒、1μL目标慢病毒载体pLenti4/V5-DEST、8μLTE缓冲液、2μL LR ClonaseTMII enzyme mix，混匀，25℃孵育1h，加入1μL蛋白酶K溶液终止反应，反应液混匀后37℃孵育10min。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，进一步包括以下步骤：转化1μL所述反应液于50μL Stbl3TM感受态细胞，冰上孵育30min，42℃热休克30秒，加入250μL S.O.C.培养液，37℃振摇培养1h，分别将20μL和100μL转化液铺于氨苄青霉素LB琼脂板。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述待永生化细胞为肝星状细胞。
8.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，进一步包括对获得的永生化细胞株进行鉴定的步骤。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述鉴定包括生物学特征鉴定、细胞株的可传代性鉴定、细胞株SV40 T抗原表达检测。
10.一种永生化细胞株，其特征在于，所述永生化细胞株是利用权利1-6任一所述的方法得到的。
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