CN110699326A - 一种永生化人肝星状细胞株及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种永生化人肝星状细胞株及其制备方法，属于细胞生物学领域。所述永生化人肝星状细胞WM07于2019年9月19日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保存编号是CGMCC No.18522。本发明通过构建一种能够高效、快速转染的SV40 T抗原慢病毒表达载体，该载体通过工程细胞包装可获得表达SV40 T抗原的慢病毒颗粒用于转染原代分离人肝星状细胞，进而通过博来霉素（zeocin）抗性特点筛选获得永生化人肝星状细胞株。本发明的永生化人肝星状细胞株WM07可稳定传代，并可用于肝纤维化研究，具有重要的应用价值。

Description

一种永生化人肝星状细胞株及其制备方法

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体地，涉及一种永生化人肝星状细胞株及其制备方法。

背景技术

肝星状细胞(HSC)是肝脏的一种非实质细胞，在肝纤维化发生中起到关键作用，原代分离的肝星状细胞在体外的培养和传代时间有限，传代一定次数后就会进入衰老期而不能再继续增殖。而反复分离原代细胞不仅费时费力，而且各批次细胞间存在差异，不能保持细胞生理指标的稳定性。建立和改良人肝星状细胞的原代分离培养方法及获得永生化人肝星状细胞株对于肝纤维化发生机制、诊断及治疗研究具有重要意义。

一些抑癌基因P53和pRB的失活以及端粒酶的激活，是人体细胞获得永生化的必要条件。哺乳动物细胞使用几种方法诱导细胞永生化(Cell immortalizing)，其中包括使用猿猴病毒40(Simian virus 40，SV40)T抗原基因、人类端粒酶逆转录酶基因、P53和pRB的shRNAs等。SV40大T抗原是由SV40病毒早期编码区编码的一种多功能磷酸蛋白，在病毒复制过程中发挥着重要作用。SV40大T抗原具有活化宿主细胞核糖体基因、诱导DNA合成、修饰蛋白质合成起始因子等作用，并且能结合、调控某些关键性的细胞调控蛋白，如视网膜母细胞瘤蛋白家族成员(如 pRB)、肿瘤抑制因子p53等，并可诱导感染细胞的端粒酶活性，诱导多种细胞的永生化。通过对SV40大T抗原介导的永生化细胞系的深入研究发现：SV40大T 抗原基因与宿主细胞DNA稳定整合重组后，不但能在细胞内表达SV40大T抗原，加快转化细胞的生长速率，同时也能保留原始细胞的许多分化表型，具有相对稳定的增殖特性和功能状态，而在转化细胞系中非原始基因的表达很少见。

已有通过脂质体介导构建有SV40大T抗原基因的真核表达质粒载体转染目标原代细胞并筛选获得永生化人肝星状细胞(LX2)，但其转染效率较低，筛选困难，一些较难转染的细胞难以获得稳定表达和建立细胞系。

发明内容

为了解决上述技术问题，发明人通过建立改良人肝星状细胞分离和原代培养的方法，并基于慢病毒载体介导SV40T抗原转染和筛选，成功获得一种永生化人肝星状细胞株WM07，为肝纤维化相关研究提供稳定、充足的细胞材料，从而完成本发明。

因此，本发明的目的是提供一种永生化人肝星状细胞株及其制备方法，为达到上述目的，

本发明的第一方面提供一种人永生化人肝星状细胞WM07，该永生化人肝星状细胞WM07于2019年9月19日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保存编号是CGMCC No.18522。保藏地址中国北京。

本发明的第二方面提供一种人永生化肝星状细胞株的制备方法，包括步骤如下：

1.构建SV-40T抗原慢病毒表达载体：

(1)以含SV40T抗原cDNA序列的SV40tsA58质粒为模板，根据NCBI的 SV 40完整基因组(NC_001669.1)设计特定的质粒构建引物，高保真PCR获取 SV40T抗原全长cDNA，对扩增得到PCR产物进行纯化。

在本发明的一些实施方案中，所述构建引物包括具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID No.2所示核苷酸序列的下游引物。

在本发明的一些实施方案中，高保真PCR的体系为：引物混合液1.5μL， 10×PfuDNA聚合酶反应混合物(含dNTPs)5μL，Pfu DNA聚合酶0.5μL，模板DNA质粒1μL，用灭菌去离子水补齐到50μL。

在本发明的一些实施方案中，高保真PCR的反应程序为：95℃ 2min；95℃ 15s，58℃ 30s，68℃ 4min，36个循环；68℃ 5min。

(2)将PCR产物TOPO克隆进入pENTR^TMTOPO载体，获得pENTR-SV40T Entrez质粒。

在本发明的一些实施方案中，进一步包括对所述pENTR-SV40T Entrez质粒进行鉴定的步骤，具体地，利用以M13正向和逆向引物对pENTR-SV40T质粒进行PCR扩增，并通过对PCR产物进行测序对所述pENTR-SV40T质粒进行鉴定。

(3)LR重组反应将pENTR-SV40T质粒中的SV40T抗原cDNA克隆到目标慢病毒载体，构建SV40T抗原慢病毒表达载体pLenti4/V5-GW/SV40T，并通过测序等方法鉴定。

在本发明的一些实施方案中，所述LR重组反应具体包括：1.5mL离心管中加入7μL所述pENTR-SV40T质粒、1μL目标慢病毒载体pLenti4/V5-DEST、8μL TE缓冲液、2μL LRClonase^TMII enzyme mix，混匀，25℃孵育1h，加入1μL 蛋白酶K溶液终止反应，反应液混匀后37℃孵育10min。

进一步地，转化1μL所述反应液于50μL Stbl3^TM感受态细胞，冰上孵育30 min，42℃热休克30秒，加入250μL S.O.C.培养液，37℃振摇培养1h，分别将 20μL和100μL转化液铺于氨苄青霉素LB琼脂板。

更进一步地，以CMV正向和逆向引物进行PCR测序，鉴定克隆的SV40T 抗原cDNA序列以CMV正向和逆向引物进行PCR测序，鉴定克隆的SV40T抗原 cDNA序列，构建SV40T抗原慢病毒表达载体pLenti4/V5-GW/SV40T。

2.慢病毒包装：

采用脂质体Lipofectamine^TM2000介导pLenti4/V5-SV40T和包装质粒 pCMV-VSV-G及psPAX2转染工程细胞293FT，进行假病毒包装。

3.慢病毒介导SV40T抗原转染原代分离细胞获得永生化细胞株：

分离和原代培养人肝星状细胞，用含SV40T抗原的轮替病毒培养上清液转染原代培养人肝星状细胞，以博来霉素(zeocin)抗性特点筛选转染和稳定表达SV40T抗原的原代细胞，获得永生化人肝星状细胞株。

在本发明的一些实施方案中，所述分离和原代培养人肝星状细胞包括：

(1)获取新鲜人肝脏标本；

(2)采改良酶液灌注消化及Nycodenz密度梯度离心两步法分离人肝星状细胞；

(3)对分离的人肝星状细胞进行原代培养。

在本发明的一些优选实施方案中，进一步包括对人肝星状细胞进行鉴定，包括但不限于细胞活力鉴定和细胞纯度鉴定。其中，所述细胞活力鉴定利用常规台盼蓝拒染法；所述细胞纯度鉴定可采用的方法包括但不限于自发蓝绿色荧光、油红O脂滴染色、α-SMA、Desmin免疫荧光染色法。

在本发明中，进一步包括对获得的永生化细胞株进行鉴定的步骤。鉴定的方法包括但不限于来源原代细胞的生物学特征的鉴定、细胞株可传代性鉴定、细胞株SV40T抗原表达检测。

在本发明的一些具体实施方案中，所述细胞株可传代性鉴定中，如果所述细胞株至少能稳定传十代，表示可传代性好。

在本发明的一些具体实施方案中，细胞株SV40T抗原表达检测的方法包括但不限于免疫荧光染色和Western Blot检测法。如果检测结果为阳性，表明所述细胞株为永生化细胞株。

本发明的第三方面提供一种永生化人肝星状细胞株，所述永生化人肝星状细胞株是利用本发明第二方面所述方法构建得到的。

本发明的有益效果

相对于现有技术，本发明的具有以下有益效果：

利用本发明的方法构建的能够在体外无限培养的永生化肝星状细胞，可为科学研究、医学应用提供稳定、充足的细胞材料。

本发明采改良酶液灌注消化及密度梯度离心两步法从儿童肝肿瘤手术患者肝脏标本分离肝星状细胞，并通过慢病毒转染SV40T抗原永生化获得人肝星状细胞株(命名为WM07)。所采用的分离方法较传统的三步法更为简捷，细胞得率和纯度高，获得的永生化肝星状细胞株WM07可稳定传代，并可用于肝纤维化研究，具有重要的应用价值。

附图说明

图1示出了高保真PCR获取的SV40T抗原全长cDNA琼脂糖凝胶电泳图， SV40T抗原全长cDNA片段大小2477bp。

图2示出了M13正向引物对pENTR-SV40T Entrez质粒进行PCR测序结果，验证CACC克隆位点(122-125)、ATG转录起始位点(126-128)及SV40T抗原 cDNA序列。

图3示出了CMV正向引物对pLenti4/V5-GW/SV40T慢病毒表达质粒进行PCR 测序结果，验证ATG转录起始位点(151-153)及SV40T抗原cDNA序列。

图4示出了肝星状细胞分离和原代培养鉴定：A)油红O染色：见分离和原代培养5天肝星状细胞胞浆内充满脂滴；B)α-SMA免疫荧光染色：见分离和原代培养10天肝星状细胞胞浆内α-SMA表达和分布。

图5示出了免疫荧光染色永生化肝星状细胞株的SV40T抗原表达：A)免疫荧光染色SV40T抗原；B)DAPI细胞核染色；C)SV40T抗原(红色)在转染细胞核(DAPI染色，紫色)表达和定位。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例

1.构建SV-40T抗原慢病毒表达载体

(1)以含SV40T抗原cDNA序列的SV40tsA58质粒(由英国伦敦路德维希癌症研究所Jat P.S.教授惠赠)为模板，根据NCBI的SV 40完整基因组(NC_001669.1)设计特定的质粒构建引物：

SV40T-CF1：5‘-CACCATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAG-3’(SEQ ID NO.1)

SV40T-CR1：5‘-TTATGTTTCAGGTTCAGGGGGA-3’(SEQ ID NO.2)

(2)高保真PCR获取SV40T抗原全长cDNA：50μL PCR反应体系：引物混合液1.5μL，10×Pfu DNA聚合酶反应混合物(含dNTP)5μL，Pfu DNA聚合酶0.5μL，模板DNA质粒1μL，用灭菌去离子水补齐到50μL。PCR反应条件： 95℃ 2min；95℃ 15s，58℃ 30s，68℃ 4min，36个循环；68℃ 5min。4℃保存备用。

(3)PCR产物纯化：PCR产物进行1％低熔点琼脂糖凝胶电泳(如图1所示)，切割回收SV40T抗原全长cDNA PCR条带，pureLink^RQuickGel提取纯化PCR产物，测定并调整纯化PCR产物为10ng/ul浓度。

(4)将PCR产物TOPO克隆进入pENTR^TM

载体(pENTR^TM Directional

Cloning Kits.Invitrogen，MAN0000245)：上述纯化SV40T抗原PCR产物4μL，盐溶液1μL，pENTR^TM 载体1μL，总体积6μL室温轻柔混匀，室温放置30min，置于冰上。

(5)转化和Entrez克隆筛选：

克隆反应产物2μL转化感受态大肠杆菌(One

chemically competent E.coli cells)，接种于卡那霉素LB琼脂板， 37℃培养过夜，挑选生长菌落5个扩增和提取质粒，以M13正向和逆向引物进行 PCR测序，鉴定克隆的SV40T抗原cDNA序列，以M13正向和逆向引物进行PCR 测序(图2)，鉴定克隆的SV40T抗原cDNA序列，获得pENTR-SV40T质粒。

(6)LR重组反应将pENTR-SV40T质粒中的SV40T抗原cDNA克隆到目标慢病毒载体：1.5mL离心管中加入7μL(15ng)上述Entrez克隆表达质粒 pENTR-SV40T、1μL目标慢病毒载体pLenti4/V5-DEST、8μL TE缓冲液、2μL LR Clonase^TMII enzyme mix，混匀，25℃孵育1h，加入1μL蛋白酶K溶液终止反应，反应液混匀后37℃孵育10min。

(7)转化1μL LR反应液于50μL Stbl3^TM感受态细胞，冰上孵育30min， 42℃热休克30秒，加入250μL S.O.C.培养液，37℃振摇培养1h，分别将20μL 和100μL转化液铺于氨苄青霉素LB(LBA)琼脂板。37℃培养过夜，挑选生长菌落5个扩增和提取质粒。以CMV正向和逆向引物进行PCR测序(图3)，鉴定克隆的SV40T抗原cDNA序列以CMV正向和逆向引物进行PCR测序，鉴定克隆的SV40T抗原cDNA序列，构建SV40T抗原慢病毒表达载体 pLenti4/V5-GW/SV40T。

2.慢病毒包装

采用脂质体Lipofectamine^TM3000介导pLenti4/V5-GW/SV40T和包装质粒 pCMV-VSV-G及psPAX2(2:1.5:1)转染工程细胞293FT，进行假病毒包装，收集含包装病毒的培养上清液冻存备用(ViraPower^TM Lentiviral Expression Systems，Invitrogen，MAN0000273)。

3.慢病毒介导SV40T抗原转染原代分离人肝星状细胞，筛选获得永生化人肝星状细胞株

(1)获取新鲜肝脏手术标本：复旦大学附属中山医院(原上海医科大学所属)外科手术切除人肝脏肿瘤标本，无菌操作切取病灶周围相对正常的一小块肝组织，按5ml/g用EGTA液(含肝素20U/ml)沿血管残端反复灌注冲洗残余血液，至肝组织呈灰黄色。

(2)人肝星状细胞分离：将含抗生素(硫酸链霉素100mg/L及青霉素G钠 1×10⁹U/L)的细胞洗涤液(D-Hanks平衡盐液)及酶消化液(0.1％IV型胶原酶 /DMEM基础培养液)于37℃水浴预热。取肝脏标本置于无菌碗中，用刀片修整肝块表面，暴露血管端口，选用与血管直径大小相当的平口灌注针及5ml注射器，用细胞洗涤液以50ml/min速度反复抽吸灌注5min，将肝块中含有肝素的 EGTA液洗净，继而以酶消化液(2×4mL/g肝组织)灌注约20min。待肝脏明显变软之后用镊子撕开肝包膜并剔除结缔组织，将糊状细胞悬液转移至三角烧瓶中，加入相同体积的细胞洗涤液(使酶消化液浓度由0.1％下降至0.05％)，继续在37℃水浴中缓慢振摇消化30min，最后加入等体积冰冷EGTA液终止消化。细胞悬液通过200目钢网过滤后收集于数只50mL离心管中，1600r/min离心10 min，弃上清液，再用冰冷EGTA液重悬沉淀，吹打使细胞充分分散及悬浮，540 r/min离心3min共3次，收集上清液；再次1600r/min离心10min，弃上清，合并所有沉淀用少量DMEM基础培养液重悬。向数只10mL离心管中加入Nycodenz 梯度分离液(18％Nycodenz/不含NaCl的Hanks平衡液)，将所得细胞悬液均匀分铺于其上形成明显界面，并使细胞悬液及分离液体积比为2：3，即Nycodenz 工作液浓度为10％～11％。2400r/min离心25min后将分离液与细胞悬液交界面之间的絮状细胞层吸出，转入50mL离心管中，用足量(约5倍体积)DMEM基础培养液稀释，1800r/min离心10min。最后将细胞悬浮于含20％胎牛血清的 DMEM培养液内。

(3)原代肝星状细胞的培养与鉴定

细胞活力鉴定：常规台盼蓝拒染法观察细胞活力。

细胞纯度鉴定：荧光显微镜下观察初分离的细胞具有自发蓝绿色维生素A 荧光；制作细胞爬片(盖玻片培养法)进行原代细胞(第2、5天)油红O脂滴染色(图4A)以及在原代培养第2天、第10天行α-SMA(HSC的重要标志)免疫荧光染色(图4B)，染色阳性者为肝星状细胞。调整细胞密度为1×10⁶个/mL 接种于塑料培养瓶中，置37℃、5％CO₂的培养箱中培养，24～48h后换液，改用含10％胎牛血清的DMEM液继续培养，以后每3天换液1次。

(4)永生化肝星状细胞株WM07的建立

慢病毒介导SV40T抗原转染原代培养细胞并筛选转染细胞：以含SV40T 抗原的轮替病毒培养上清液加入细胞培养液中转染原代培养细胞，48h后换用含50μg/mL博来霉素(Zeocin)的10％牛血清的DMEM培养液筛选转染和稳定表达SV40T抗原的原代细胞，每3天更换，2-4周后可筛选出存活细胞克隆，扩增成株。

WM07人肝星状细胞株的鉴定：

原代细胞的生物学特征的鉴定：表达α-SMA(HSC的重要标志)及I型胶原。

细胞株可传代性：至少稳定传十代

细胞株SV40T抗原表达的检测：一抗采用抗SV40T抗原抗体(1:200，Santa Cruz，sc-148)免疫荧光染色检测SV40T抗原(图5)，可作为转染永生化细胞标志。

永生化人肝星状细胞WM07于2019年9月19日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保存编号是CGMCC No.18522。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种永生化人肝星状细胞WM07，其特征在于，所述永生化人肝星状细胞WM07于2019年9月19日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保存编号是CGMCC No.18522。

2.一种构建永生化人肝星状细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)构建SV40 T抗原慢病毒表达载体：

以含SV40 T抗原cDNA序列的SV40 tsA58质粒为模板，根据NCBI的SV 40完整基因组(NC_001669.1)设计特定的质粒构建引物，高保真PCR获取SV40 T抗原全长cDNA，对扩增得到PCR产物进行纯化；

将PCR产物TOPO克隆进入pENTR^TM TOPO载体，获得pENTR-SV40 T质粒；

LR重组反应将pENTR-SV40 T质粒中的SV40 T抗原cDNA克隆到目标慢病毒载体，构建SV40 T抗原慢病毒表达载体pLenti4/V5-GW/SV40 T，

2)慢病毒包装：

采用脂质体Lipofectamine^TM2000介导pLenti4/V5-SV40 T和包装质粒pCMV-VSV-G及psPAX2转染工程细胞293FT，进行假病毒包装，

3)慢病毒介导SV40 T抗原转染原代分离细胞获得永生化细胞株：

分离和原代培养人肝星状细胞，用含SV40 T抗原的轮替病毒培养上清液转染原代培养人肝星状细胞，以博来霉素抗性特点筛选转染和稳定表达SV40 T抗原的原代培养人肝星状细胞，获得永生化人肝星状细胞株。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述构建引物包括具有SEQ IDNo.1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID No.2所示核苷酸序列的下游引物。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，利用以M13正向和逆向引物对pENTR-SV40 T质粒进行PCR扩增，并通过对PCR产物进行测序对所述pENTR-SV40 T质粒进行鉴定。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述LR重组反应具体包括：1.5mL离心管中加入7μL所述pENTR-SV40 T质粒、1μL目标慢病毒载体pLenti4/V5-DEST、8μLTE缓冲液、2μL LR Clonase^TMII enzyme mix，混匀，25℃孵育1h，加入1μL蛋白酶K溶液终止反应，反应液混匀后37℃孵育10min。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，进一步包括以下步骤：转化1μL所述反应液于50μL Stbl3^TM感受态细胞，冰上孵育30min，42℃热休克30秒，加入250μL S.O.C.培养液，37℃振摇培养1h，分别将20μL和100μL转化液铺于氨苄青霉素LB琼脂板。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述分离和原代培养人肝星状细胞包括：

(1)获取新鲜人肝脏标本；

(2)采改良酶液灌注消化及Nycodenz密度梯度离心两步法分离人肝星状细胞；

(3)对分离的人肝星状细胞进行原代培养。

8.根据权利要求2-7任一所述的方法，其特征在于，进一步包括对获得的永生化人肝星状细胞株进行鉴定的步骤。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述鉴定包括生物学特征鉴定、细胞株的可传代性鉴定、细胞株SV40 T抗原表达检测。

10.一种永生化人肝星状细胞，其特征在于，所述永生化人肝星状细胞是利用权利要求2-7任一所述的方法得到的。

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