CN105233303B

CN105233303B - 一种通过基因改造血管内皮细胞促进创面愈合的方法及其应用

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Publication number: CN105233303B
Application number: CN201510627006.6A
Authority: CN
Inventors: 王星童; 李恒宇; 郑勇军; 吴海斌; 田松; 仵敏娟; 罗鹏飞; 王亮; 肖仕初; 朱世辉; 夏照帆
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2015-09-28
Filing date: 2015-09-28
Publication date: 2018-12-21
Anticipated expiration: 2035-09-28
Also published as: CN105233303A

Abstract

本发明涉基因工程技术及器官修复重建领域，具体涉及一种通过基因改造血管内皮细胞促进创面愈合的方法及其应用。本发明构建了Nogo‑B低表达的脐静脉血管内皮细胞，实验发现，Nogo‑B下调后脐静脉血管内皮细胞本身增殖减慢，但可以明显促进创面愈合。本发明可提高创面愈合的速度，为创面愈合或创面覆盖物的改进提供一定的基础。

Description

一种通过基因改造血管内皮细胞促进创面愈合的方法及其应用

技术领域

本发明涉基因工程技术及器官修复重建领域，具体涉及一种通过基因改造血管内皮细胞促进创面愈合的新方法，及其将该方法应用于制备皮肤移植物促进创面愈合。

背景技术

创面愈合是一种涉及多种细胞及分子的复杂过程，主要包括炎症期、增生期和重塑期三个阶段。伤口愈合的第一个时期是炎症期,伤口形成后伤口或组织裂隙内为血凝块所充填,其周围组织发生急性炎症,各种炎症介质的释放和炎症细胞浸润使伤口表现为红、肿、热、痛，在这一过程中，纤维细胞、肌成纤维细胞于伤后6h在伤口边缘出现，24～48h有血管内皮细胞增生，逐渐形成新生毛细血管。增生期成纤维细胞、内皮细胞和新生毛细血管共同构成肉芽组织充填裂隙，同时肉芽组织内胶原纤维逐渐增多，使得其硬度与张力强度随之增加，逐渐变为纤维组织架接于断裂的组织之间，即瘢痕修复；同时上皮细胞、成骨细胞和成软骨细胞等增生，使伤口边缘皮肤新生上皮，直到伤口初步愈合。在塑形期，随着机体状态的好转和活动恢复，通过各种酶的作用和运动应力作用，调整瘢痕组织内的胶原纤维含量和排列，使其软化而不影响张力强度，从而适应生理功能，至此伤口修复过程遂告完成。在这相互交错的3个过程中，炎症反应、血管通透性、伤口血管化以及肉芽组织生长和上皮细胞增殖都是影响到伤口愈合的重要因素。

关于创面移植干细胞促进创面愈合的研究有很多，其治疗作用主要是通过发挥旁分泌和免疫调节功能，调控组织周同相关细胞以及改善微环境等作用参与修复和重建。

近年来的研究表明慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因修饰与治疗的效果。在美国已经开展了慢病毒介导的基因治疗的临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景(Dong A,Rivella S,Breda L.Gene therapy for hemoglobinopathies:progress andchallenge.Transl Res.2013 Jan 18.pii:S1931-5244(12)00447-1.)。

Nogo基因是近些年来发现的新基因，目前发现Nogo基因编码的三种蛋白：Nogo A、Nogo B和Nogo C，均是中枢神经系统髓鞘中具有抑制神经生长活性的跨膜蛋白。目前研究发现，Nogo—B与肿瘤抑制、凋亡、神经系统再生抑制、血管内膜损伤修复等多种病理生理过程有不同程度的关系。其在血管内皮细胞和平滑肌细胞中高表达，有促进内皮细胞迁移和抑制平滑肌细胞的功能，在损伤再生和血管修复重塑方面发挥重要作用。(参见文献：LiliGao,TeruoUtsumi,KeitaroTashiro,etc.Reticulon 4B(Nogo-B)Facilitates HepatocyteProliferation and Liver Regeneration in Mice.Hepatology.2013Mar；57(5):1992-2003.；Annarita Di Lorenzo,Thomas D.Manes,AlbertoDavalos,etc.Endothelialreticulon-4B(Nogo-B)regulatesICAM-1–mediated leukocyte transmigration andacute inflammation.Blood.2011,117(7):2284–95；Jun Yu,CarlosFernandez-Hernando,YajairaSuarez,etc.Reticulon 4B(Nogo-B)isnecessary for macrophage infiltrationand tissue repair.PNAS,2009,106(41):17511-17516)。

基因修饰可调节细胞增殖，并调节细胞分泌生长因子参与创面愈合。目前较为安全的基因修饰方法是慢病毒感染。慢病毒基因载体是由Ⅰ型人免疫缺陷病毒改造的新型病毒载体，作为一种高效的基因转染载体应用越来越广泛，经多次修饰改造其转导效率和安全性都得到了保证。

目前尚无文献报道有关Nogo-B基因修饰人脐静脉血管内皮细胞，以促进人创面愈合的研究及应用。

发明内容

本发明的目的在于提供跨膜蛋白Nogo-B的新用途；本发明的另一目的在于提供一种促进创面愈合的方法；以及该方法在制备皮肤移植物中的应用。

本发明的构思如下：

申请人基于Nogo-B可调节内皮细胞迁移，抑制平滑肌细胞等实验依据，构建含目的基因Nogo-B特定干扰序列的慢病毒干扰载体，将其转染人脐静脉血管内皮细胞，获得Nogo-B低表达的脐静脉血管内皮细胞，称之为 HUVEC-siNogoB，将其注射至裸鼠全层创面周围，观察其创面愈合情况。并通过冰冻切片证明细胞在创面存活情况，体外实验检测其自身血管成环情况以及对成纤维细胞增殖迁移的影响。

本发明的主要技术方案如下：首先是根据Nogo-B的基因结构，设计RNA干扰序列，构建Nogo-BRNAi慢病毒载体。通过查阅文献确定Nogo-B基因特定的干扰序列为：CAGAATCTATGGACTGAAT(Jun Yu,CarlosFernandez-Hernando,YajairaSuarez,etc.Reticulon 4B(Nogo-B)isnecessary for macrophage infiltration and tissuerepair.PNAS,2009,106(41):17511-17516)。构建Nogo-BRNA干扰的慢病毒载体为：GV248-Nogo-B RNAi-GFP，将Nogo-B的干扰慢病毒感染人脐静脉血管内皮细胞。

最后，本发明将GV248-Nogo-B RNAi-GFP颗粒感染脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)，实验发现，Nogo-B下调后脐静脉血管内皮细胞本身增殖减慢，但可以明显促进创面愈合。

本发明的第一方面，提供了跨膜蛋白Nogo-B在制备(皮肤)创面愈合(修复)药物或试剂中的应用。

所述的药物或试剂为降低跨膜蛋白Nogo-B的表达量的药物或试剂。

所述的药物或试剂包含以下任一：

A)含有跨膜蛋白Nogo-B干扰序列的重组载体；

B)含有跨膜蛋白Nogo-B干扰序列的重组病毒；

C)跨膜蛋白Nogo-B低表达的血管内皮细胞；

Nogo-B的GENBANK号：NG_029037.1

所述的干扰序列为Nogo-B的siRNA、shRNA等。

优选的，所述的跨膜蛋白Nogo-B干扰序列，如下：

CAGAATCTATGGACTGAAT(SEQ ID NO:1)

其中B)，优选为，含有跨膜蛋白Nogo-B干扰序列的慢病毒；

慢病毒载体的构建方法可以选用本领域常规方法，例如参见：耿运琪主编，慢病毒与泡沫病毒分子生物学文选，南开大学出版社。

在本发明的一个优选实施例中，所用的慢病毒载体为GV248，构建获得的Nogo-BRNA干扰的慢病毒载体为：GV248-Nogo-B RNAi–GFP。

所述的药物或试剂包含重组慢病毒GV248-Nogo-B RNAi–GFP。

其中C)，优选为，跨膜蛋白Nogo-B低表达的脐静脉血管内皮细胞；

Nogo-B低表达的脐静脉血管内皮细胞的构建方法可以选用本领域常规方法，例如参见：Elbashir SM,Harborth J,Lendeckel W,Yalcin A,Weber K,Tuschl T.Duplexes of21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammaliancells.Nature.2001 May 24；411(6836):494-8.。

在本发明的一个优选实施例中，是将GV248-Nogo-B RNAi-GFP颗粒感染脐静脉血管内皮细胞。

所述的药物或试剂包含感染慢病毒GV248-Nogo-B RNAi–GFP的脐静脉血管内皮细胞。

本发明的第二方面，是提供了一种促进创面愈合的新方法，是利用干扰Nogo-B的人脐静脉血管内皮细胞来实现。

一种促进创面愈合的新方法，也即一种促进皮肤创面修复的方法，该方法是采用降低跨膜蛋白Nogo-B的表达量的药物或试剂来修饰创面。

所述的修饰是用皮下注射的方式将提降低跨膜蛋白Nogo-B的表达量的药物或试剂注入创面皮肤组织。

优选的，所述的修饰是用皮下注射的方式将感染慢病毒GV248-Nogo-BRNAi–GFP的脐静脉血管内皮细胞移植到创面皮肤组织。

该方法包括：

A、构建含有Nogo-B干扰序列的慢病毒；

B、将步骤A获得的慢病毒去感染脐静脉血管内皮细胞，获得Nogo-B低表达的脐静脉血管内皮细胞；

C、将步骤B中的细胞注射到裸鼠创面周围，促进创面愈合。

具体的，该方法包括以下步骤：

A、构建Nogo-B RNA干扰的慢病毒：

Nogo-B基因干扰慢病毒质粒构建中合成DNA片段如下：

GIDL29193-RNAi(9525-1)-a:CCGGCACAGAATCTATGGACTGAATCTCGAGATTCAGTCCATAGATTCTGTGTTTTTG(SEQ ID NO:2)

GIDL29193-RNAi(9525-1)-b:AATTCAAAAACACAGAATCTATGGACTGAATCTCGAGATTCAGTCCATAGATTCTGTG(SEQ ID NO:3)

退火成双链DNA并连接到酶切后的病毒载体GV248上，构建Nogo-BRNA干扰的慢病毒即GV248-Nogo-B RNAi-GFP；

B、将GV248-Nogo-B RNAi-GFP慢病毒颗粒感染人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)，获得Nogo-B低表达的脐静脉血管内皮细胞，即HUVEC-siNogoB。

上述方法中，步骤A具体为：

首先合成含干扰序列的单链DNA oligo，然后退火配对产生双链DNA oligo，再通过其两端所含酶切位点直接连入酶切后的RNA干扰慢病毒载体上；

将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞，对长出的单克隆菌落先进行PCR鉴定，PCR鉴定阳性菌落进行测序鉴定，比对正确的克隆即为构建成功的目的基因RNA干扰慢病毒载体。

(1)确定目的基因siRNA序列：CAGAATCTATGGACTGAAT(SEQ ID NO:1)

(2)确定病毒载体：GV248

(3)病毒载体构建框架

(4)合成片段信息

引物退火形成带双链DNA。

(5)通过T4 DNA连接酶将双酶切线性化的载体和DNA oligo在适当的buffer中进行连接反应，连接后的产物进行转化实验，挑选阳性克隆，测序。

上述方法中，步骤B具体为：

(1)先将10μL三个不同梯度的病毒加到各组的相应孔中。加入的病毒量分别为5×10⁵TU，1×10⁵TU，1×10⁴TU，而细胞经过生长，此时细胞的数目大约为1×10⁴个，所以三个孔的MOI分别为50、10、1；

(2)每孔中加入10μL的Polybrene稀释液；

(3)在水平方向轻轻拍打培养板，使培养基和病毒等试剂充分混匀，然后把细胞板放回培养箱孵育；

(4)培养8～12h以后观察细胞状态，弃去细胞上清，更换为新鲜培养基；

(5)感染3～4天后，观察荧光表达情况。对于生长缓慢代谢慢的细胞，可以适当延长观察时间，中途可以换液，保持细胞的活性；

(6)通过细胞感染效果，确认MOI值为50可获得最佳感染效果。

本发明的第三方面，提供了一种跨膜蛋白Nogo-B低表达的脐静脉血管内皮细胞。

在本发明的一个优选实施例中，具体是一种感染慢病毒GV248-Nogo-B RNAi–GFP的脐静脉血管内皮细胞。

所述的干扰序列如SEQ ID NO:1所述。

所述的感染慢病毒GV248-Nogo-B RNAi–GFP的脐静脉血管内皮细胞构建方法如上所述。

进一步的，本发明还提供了一种跨膜蛋白Nogo-B低表达的脐静脉血管内皮细胞在制备(皮肤)创面愈合(修复)药物或试剂中的应用。

本发明还提供了根据上述方法获得的Nogo-B基因低表达的脐静脉血管内皮细胞，即HUVEC-siNogoB，然后将其沿创周皮内注射到裸鼠背部全层创面周围，促进创面愈合。

通过实验观察发现，创面前三天siNogo-B组创面较对照组相比无明显差异，但自第五天开始，创面愈合加快，至第十四天创面已完全愈合，但空白对照组仍未愈合，HUVEC-NC组痂皮未完全脱落(见图5)。利用创面冰冻切片观察创面细胞存活情况(见图6)。创面HE切片发现第五天HUVEC-siNogoB新生血管增多(见图7)。血管成形实验中HUVEC-siNogoB明显加快(见图2)。转染siNogo-B和阴性对照病毒后HUVEC细胞无明显形态变化(见图1B)。western-blot结果显示Nogo-B干扰慢病毒转染成功，Nogo-B的表达发生显下调(见图1A)。

本发明的第四方面，是提供上述的促进创面愈合的方法在创面修复或制备皮肤移植物中的应用。

进一步地，本发明还提供了构建的Nogo-B基因低表达的血管内皮细胞在制备创面修复材料或皮肤移植物中的应用。

本发明可提高创面愈合的速度，为创面愈合或创面覆盖物的改进提供一定的基础。

附图说明

图1为Nogo-B干扰慢病毒及阴性对照感染后的人脐静脉血管内皮细胞，其中A为Nogo-B干扰的蛋白电泳图，B为荧光显微镜(200×)图；WB结果显示Nogo-B干扰慢病毒转染成功，镜下细胞无明显形态变化。

图2为脐静脉血管内皮细胞干扰NogoB血管成环实验结果图；血管成形实验中HUVEC-siNogoB成血管速度明显加快。

图3为成纤维细胞CCK－8增殖曲线图；加入siNogoB细胞培养上清后，成纤维细胞增殖速度加快(***P<0.001)。

图4为siNogoB脐静脉血管内皮细胞上清刺激成纤维细胞划痕实验结果图；加入siNogoB细胞培养上清后，成纤维细胞迁移速度加快。

图5为裸鼠创面愈合大体实验图；裸鼠创面愈合，和对照组相比，注射siNogoB细胞的裸鼠创面第五天愈合速度加快，至第14天完全愈合，统计分析发现，创面愈合率在第7天、10天和14天明显高于对照组(***P<0.001)，其中A为大体拍照图，B为统计结果。

图6为冰冻切片图；裸鼠创面第3天冰冻切片荧光观察发现细胞仍存活。(第一张红色区域为CM-Dil染红的血管内皮细胞膜，第二张为DAPI染成蓝色的细胞核，第三张红蓝双标即为存活的血管内皮细胞。)

图7为HE染色和免疫组化CD31图；左侧和中间是创面HE切片发现第五天和第七天HUVEC-siNogoB新生血管增多，右侧为免疫组化检测标记血管的CD31蛋白表达增多。

*所有统计分析利用SPSS18.0软件进行分析，表示为均数±标准差，统计方法使用ANOVA分析，P<0.05认为有统计学意义，P<0.01认为差异显著。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1：构建干扰Nogo-B慢病毒GV248-Nogo-BRNAi-GFP，感染人血管内皮细胞

I、构建干扰Nogo-B慢病毒GV248-Nogo-BRNAi-GFP

(1)确定干扰序列：CAGAATCTATGGACTGAAT(针对Nogo-BDNA不同位点，设计4条干扰序列，经过质粒转染加qPCR验证，确认该干扰序列的干扰效果最好。)

(2)合成单链DNA oligo：

GIDL29193-RNAi(9525-1)-a:CCGGCACAGAATCTATGGACTGAATCTCGAGATTCAGTCCATAGATTCTGTGTTTTTG

GIDL29193-RNAi(9525-1)-b:AATTCAAAAACACAGAATCTATGGACTGAATCTCGAGATTCAGTCCATAGATTCTGTG

退火形成双链DNA oligo。

(3)Hpa I和Xho I双酶切GV248载体(吉凯公司)制备线性化的载体。

(4)T4 DNA连接酶将双酶切线性化的载体和DNA oligo连接。

(5)鉴定及测序。用上述重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5α，扩增细菌并测序(委托吉凯生物公司测序)。

(6)慢病毒包装及滴度鉴定。

II、GV248-Nogo-BRNAi-GFP感染人脐静脉血管内皮细胞。

人脐静脉血管内皮细胞购自美国模式培养物集存库(ATCC)。

实验前保证细胞的良好生长状态，实验前一天接种3～5×10³个目的细胞于96孔培养板中，所加培养基体积为90μL。实验时，一般不用96孔板边上的孔。因为慢病毒表达时间较慢，所以一般在三到四天后观察荧光，故在进行感染实验时细胞接种不宜过密(细胞的融合率约为30～50％左右)。

(1)先将10μL三个不同梯度的病毒加到各组的相应孔中。加入的病毒量分别为5×10⁵TU，1×10⁵TU，1×10⁴TU，而细胞经过生长，此时细胞的数目大约为1×10⁴个，所以三个孔的为感染复数(MOI)分别为50、10、1。

(2)每孔中加入10μL的Polybrene稀释液。

(3)在水平方向轻轻拍打培养板，使培养基和病毒等试剂充分混匀，然后把细胞板放回培养箱孵育。

(4)培养8～12h以后观察细胞状态，弃去细胞上清，更换为新鲜培养基。

(5)感染3～4天后，观察荧光表达情况。对于生长缓慢代谢慢的细胞，可以适当延长观察时间，中途可以换液，保持细胞的活性。

(6)通过细胞感染效果，确认MOI值为50可获得最佳感染效果。

(7)将Nogo-B干扰及对照用病毒载体感染后的人血管内皮细胞分别称之为HUVEC-siNogoB和HUVEC-NC。

实施例2：动物实验(体内实验)

实验动物：裸鼠15只，购自二军大实验动物中心

裸鼠背部两侧各构建一个直径8mm的全层创面，设空白对照组、NC对照组以及siNogo-B组，每组3只(6个创面)，后两组创周分别皮内注射HUVEC-NC和HUVEC-siNogoB细胞，注射细胞总数为1.0×10⁶个。

在创周附以抗瘢痕收缩环，然后观察创面愈合情况。

1)创面愈合速度的变化

和对照组相比，HUVEC-siNogoB组前三天无明显差异，从第五天开始创面愈合速度加快，第十天创面面积比对照组缩小50％，至第十四天完全愈合，但空白对照组仍有创面，HUVEC-NC组痂皮未脱落。

2)检测注射细胞在创面存活的情况

将HUVEC-siNogoB用红色细胞染料CM-Dil(introvegen)37℃孵育5分钟后注射到裸鼠背部，取第三天新鲜创面，用OCT耦合剂包埋，冰冻切片机切片，荧光倒置显微镜下拍照(红色荧光即为HUVEC-siNogoB细胞)，然后用DAPI染色染细胞核，最后Merge定位确为所注射的HUVEC-siNogoB细胞(如图6)。

3)苏木精-伊红(HE)染色和免疫组织化学检测CD31

取第五天和第七天HUVEC-NC和HUVEC-siNogoB创面，10％甲醛溶液固定48h，其与步骤同常规石蜡切片苏木精-伊红(HE)染色。镜下可见较对照组相比，HUVEC-siNogoB组新生小血管增多，如图7所示。

免疫组织化学法检测血管特异性抗原CD31：

(1)石蜡切片脱蜡复水，高温高压5min抗原修复

(2)分为2组，一组为NC组，另一组为siNogo-B组

(3)4％BSA封闭非特异性结合位点1h,PBS洗3遍

(4)1：200的浓度加入一抗CD31，4℃过夜

(5)PBS洗3遍

(6)1：500的浓度加入二抗

(7)PBS洗3遍

(8)DAB显色。

(9)自来水冲洗复染，脱水透明封片。

实验结果表明，siNogo-B组高表达血管特异性抗原蛋白CD31。如图7所示。

实施例3：细胞实验(体外实验)

利用病毒转染荧光显微镜拍照、western-blot、成血管实验以及细胞培养上清刺激成纤维细胞等生物学实验方法，从细胞形态、蛋白表达以及旁分泌功能等多方面分析细胞形态变化，目的基因表达以及对成纤维细胞增殖迁移的影响。

具体方法如下：

1)细胞生长状态的比较

用倒置荧光显微镜观察慢病毒感染的HUVEC-NC和HUVEC-siNogoB。细胞形态未见明显改变，如图1所示。

2)western-blot检测Nogo-B的表达

(1)去培养液后用温的PBS冲洗2～3遍

(2)于6孔板来说每孔加100-150ul蛋白裂解液，冰上裂解20分钟。

(3)用细胞刮刮下细胞后放置在EP管。

(4)将EP管置于4℃，12000g离心15min，吸取上清，加入loading Buffer后100℃煮沸5分钟。

(5)置于冰上冷却，待样品恢复到室温后上样。

(6)电泳、转膜。

(7)浸没于5％脱脂奶粉封闭液中室温缓慢摇荡一小时。一抗4℃下轻摇孵育过夜。

(8)根据一抗来源选择合适的二抗，根据鉴定方法选择辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体，按相应比例稀释(1:1000～1:10000)，室温轻摇一小时。

(9)洗涤，使用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法。结果可见，和GFP-EC相比，Nogo-B^kd-EC组Nogo-B的表达量显著下降。如图1所示。

3)血管成形实验

在μ-Slide每个孔中加入10μL Matrigel，Matrigel一直保持放在冰上。加入胶后，将μ-Slide放入合适大小的培养皿中，培养皿中加入吸满水的吸水纸，以防止μ-Slide中水分蒸发。将整个培养皿放入培养箱中，放置30分钟使胶凝固。HUVEC细胞消化后将细胞悬液浓度调整到2×10⁵cell/mL。从培养箱中取出μ-Slide，每孔加入50μL细胞悬液。μ-Slide盖上盖子后放入培养箱培养。分别于3h和8h记录实验结果并拍照，发现HUVEC-siNogoB成环明显加快(如图4所示)。

4)绘制生长曲线检测细胞增殖

将成纤维细胞以每孔4000个细胞接种于96孔板，分别加入HUVEC-siNogoB和HUVEC-NC培养上清，设DMEM阴性对照组、50％HUVEC-siNogoB和50％HUVEC-NC以及5％胎牛血清阳性对照组，培养7天，每天相同时间点向各孔加入20ulCCK-8试剂，37℃孵育3h后取100ul上清，酶标仪检测吸光度，每个时间点每种细胞做3复孔，实验重复3次。结果发现50％HUVEC-siNogoB组上清刺激后成纤维细胞增殖能力强于50％HUVEC-NC组上清，和5％FBS作用相近。如图3所示。

5)Nogo-B干扰人脐静脉血管内皮细胞培养上清刺激成纤维细胞迁移情况

将成纤维细胞接种于6孔板，待细胞融合90％以上，用200ul枪尖垂直于六孔板均匀划一条竖线，用PBS洗涤细胞三次，分别加入DMEM、50％HUVEC-siNogoB组上清和50％HUVEC-NC组上清各2ml，于0h、6h、12h、24h拍照。结果显示50％HUVEC-siNogoB组上清刺激后细胞迁移能力明显强于50％HUVEC-NC组上清。如图4所示。

(注：50％HUVEC-siNogoB和50％HUVEC-NC上清由DMEM稀释而成)

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims

1.跨膜蛋白Nogo-B在制备创面愈合药物或试剂中的应用，其特征在于，所述的药物或试剂包含跨膜蛋白Nogo-B低表达的脐静脉血管内皮细胞；

所述的跨膜蛋白Nogo-B低表达的脐静脉血管内皮细胞构建如下：

A、构建Nogo-B RNA干扰的慢病毒：

Nogo-B基因干扰慢病毒质粒构建中合成DNA片段如下：

GIDL29193-RNAi(9525-1)-a如SEQ ID NO:2所示，

GIDL29193-RNAi(9525-1)-b如SEQ ID NO:3所示；

退火成双链DNA并连接到酶切后的病毒载体GV248上，构建Nogo-BRNA干扰的慢病毒即GV248-Nogo-B RNAi -GFP；

B、将GV248-Nogo-B RNAi -GFP慢病毒颗粒感染人脐静脉血管内皮细胞，获得Nogo-B低表达的脐静脉血管内皮细胞。