CN111876442B - 一种mc3r基因编辑的猪成纤维细胞系的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种MC3R基因编辑的猪成纤维细胞系的制备方法，属于基因编辑领域，包括构建sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的基因敲除载体和sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的基因敲除载体，建立猪成纤维细胞系，基因敲除载体转染猪成纤维细胞系，筛选和阳性克隆鉴定获得MC3R基因纯合敲除的单克隆细胞。本发明提供的一种MC3R基因编辑的猪成纤维细胞系的制备方法具有简单、快速、高效、且成本较低的优点。

Description

一种MC3R基因编辑的猪成纤维细胞系的制备方法
技术领域
本发明属于基因编辑领域，具体涉及一种MC3R基因编辑的猪成纤维细胞系的制备方法。
背景技术
我国是猪肉消费大国，是当今畜牧业重要组成，而且在世界范围内广泛饲养，对于猪肉品质的要求也会越来越高。传统的育种方式对于肉质提高的发展研究变得缓慢，这就要求我们用新的提高肉质的育种方式，例如分子育种。同时，猪与人类的亲缘性强，而且各个器官结构十分相似，它为生物学和医学领域的研究做出了巨大奉献，常被当作研究生物反应器、异种器官移植和人类疾病模型的理想模式动物。可见，猪作为农业动物和医学模型，在人类日常生活和科学探索研究中有着重要作用。而MC3R基因作为与肥胖综合症相关基因的候选基因，并且与猪的采食和能量分配有调控作用，这对于猪生长速度、胴体瘦肉率等经济性状具有重要影响。但是目前MC3R生理功能及作用机制并不明确，仅有来自MC3R基因敲除小鼠模型的少数报道。构建出MC3R基因敲除猪，不仅可以评估MC3R基因的育种价值，还可以作为研究MC3R的基因功能的材料。
现有技术如公开号CN 107893088 A的中国发明专利，公开了一种基因敲除载体、制备CD13基因敲除的猪成纤维细胞或基因编辑猪的方法、由上述方法制备而成的CD13敲除的猪成纤维细胞。该发明所述基因敲除载体包括基因编辑载体骨架以及连接到该载体骨架上的一段DNA片段，所述载体骨架选自CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas9n、CRISPR/Cpf1或CRISPR/C2c2，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-3任一项所示，优选地，如SEQ ID NO：1所示。通过该发明上述载体和方法可以快速、准确地将CD13基因敲除，获得CD13基因纯合敲除、且不带有外源标记基因的猪成纤维细胞或基因编辑猪，可以为猪流行性腹泻提供研究平台，同时具有极高的抗病育种价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单、快速、高效、且成本较低的MC3R基因编辑的猪成纤维细胞系的制备方法。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
提供一种MC3R基因敲除载体，包括基因敲除载体1和基因敲除载体2，上述基因敲除载体包括基因编辑载体骨架和连接到该载体骨架上的sgRNA，上述载体骨架为CRISPR/Cas9，上述基因敲除载体1的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述基因敲除载体2的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。利用本发明提供的基因敲除载体能够对猪MC3R基因几乎全部敲除，获得MC3R基因纯合敲除成纤维细胞，能够为猪生长速度和胴体瘦肉率的研究提供重要平台，在培育肉质改良猪的方面具有重要意义。
优选地，上述CRISPR/Cas9载体骨架选自px330、px458、px335、px552载体之一。
优选地，上述CRISPR/Cas9载体骨架为px458，上述sgRNA连接到所述px458载体上的具体过程如下：利用BbsI限制性内切酶对px458进行线性化，得到线性化的px458质粒；设计上述sgRNA的正向引物和反向引物；上述正向引物中含有能够与所述线性化的px458质粒的粘性末端互补的BbsI限制性内切酶酶切位点的粘性末端CACC，上述反向引物中含有能够与上述线性化的px458质粒的粘性末端互补的BbsI限制性内切酶酶切位点的粘性末端AAAC；将上述正向引物和反向引物退火成双链，得到sgRNA双链片段；在含有连接酶的体系中将线性化的px458质粒与sgRNA双链片段进行连接，得到连接产物；将上述连接产物转化到感受态大肠杆菌中，筛选出阳性连接产物即为基因敲除载体px458-MC3R。
优选地，上述核苷酸序列为SEQ ID NO:1的sgRNA的的正向引物和反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3-4所示，构建的基因敲除载体1为px458-MC3R-sgRNA1；
上述核苷酸序列为SEQ ID NO:2的sgRNA的的正向引物和反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5-6所示，构建的基因敲除载体2为px458-MC3R-sgRNA2。
提供一种制备MC3R基因敲除的猪成纤维细胞系的方法，具体包括以下步骤：
S1、构建基因敲除载体；
S2、建立猪成纤维细胞系；
S3、基因敲除载体转染猪成纤维细胞系；
S4、筛选和阳性克隆鉴定获得MC3R基因纯合敲除的单克隆细胞。
优选地，上述步骤S1中基因敲除载体包括sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的CRISPR/Cas9基因敲除载体和sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的CRISPR/Cas9基因敲除载体。
更为优选地，上述步骤S1中基因敲除载体包括上述px458-MC3R-sgRNA1和px458-MC3R-sgRNA2。
优选地，上述步骤S3中基因敲除载体转染猪成纤维细胞系的具体过程包括：
将经解冻和传代的成纤维细胞进行培养，培养液为含10％体积分数胎牛血清的DMEM培养液；待细胞汇合度达70-80％以上时，利用改良胰蛋白酶消化液消化细胞20-30s后，终止消化；将px458-MC3R-sgRNA1、px458-MC3R-sgRNA2、px459v2和电击转染液混合后重悬细胞，进行电击转染；
上述每升改良胰蛋白酶消化液的制备方法为：准确称取EDTA 0.5-0.9g，右旋葡萄糖0.9-1.1g，磷酸盐缓冲液干粉9-10g，Tris碱2.8-3.1g，2-乙基-3-羟基-4-吡喃酮0.18-0.5g，用880-900mL超纯水溶解，调pH值至7.2-7.6，然后加胰蛋白酶0.7-1.1g，溶解后定容至1L，用0.2μm膜过滤分装，-18至-22℃保存；上述胰蛋白酶和2-乙基-3-羟基-4-吡喃酮的质量比为20:5-9。胰蛋白酶作用时间较短时对细胞的消化不完全，在敲打过程中，细胞所受到的物理损伤较大，随着胰蛋白酶作用时间的延长，死细胞率也将逐渐提高，以胰蛋白酶和2-乙基-3-羟基-4-吡喃酮按质量比为20:5-9进行组合可以使胰蛋白酶在较低的浓度快速完全消化，降低细胞死亡率，减少细胞损伤，提高细胞转染率，提高靶序列的剪切效率，提高MC3R基因纯合敲除细胞获得率。
优选地，上述将电击转染后的猪成纤维细胞转移到含有5-乙基-5-苯基-1-甲基-2,4,6-(1H,3H,5H)-嘧啶三酮单钠盐的DMEM培养液中，在36.8-37.8℃、4.8-5.2％CO2饱和湿度的环境中培养。
优选地，上述步骤S4中阳性单克隆细胞筛选时所用的培养液也为含有5-乙基-5-苯基-1-甲基-2,4,6-(1H,3H,5H)-嘧啶三酮单钠盐的DMEM培养液。
更为优选地，上述DMEM培养液中5-乙基-5-苯基-1-甲基-2,4,6-(1H,3H,5H)-嘧啶三酮单钠盐的含量为0.047-0.088wt％；每升上述DMEM培养液的配制方法为：DMEM粉末13.2-13.4g加丙酮酸钠0.10-0.12g，NaHCO33.5-3.7g，5-乙基-5-苯基-1-甲基-2,4,6-(1H,3H,5H)-嘧啶三酮单钠盐0.48-0.89g，三蒸水溶解，定容到1000mL，调pH至7.2-7.4，0.22μm滤膜除菌过滤，2-6℃冰箱保存。细胞电击转染后在含有5-乙基-5-苯基-1-甲基-2,4,6-(1H,3H,5H)-嘧啶三酮单钠盐的DMEM培养液中培养，能够增加转染细胞中Cas9蛋白的表达量，提高对靶序列的剪切效率，提高MC3R基因纯合敲除细胞的获得率。
提供一种制备MC3R基因敲除的猪成纤维细胞系的方法在制备MC3R基因敲除猪中的用途。
本发明由于采用了sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的基因敲除载体和sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的基因敲除载体对MC3R基因进行敲除，因而具有如下有益效果：能够对猪MC3R基因几乎全部敲除，获得MC3R基因纯合敲除成纤维细胞，能够为猪生长速度和胴体瘦肉率的研究提供重要平台，在培育肉质改良猪的方面具有重要意义。
本发明由于采用了改良胰蛋白酶消化液，因而具有如下有益效果：胰蛋白酶作用时间较短时对细胞的消化不完全，在敲打过程中，细胞所受到的物理损伤较大，随着胰蛋白酶作用时间的延长，死细胞率也将逐渐提高，以胰蛋白酶和2-乙基-3-羟基-4-吡喃酮按质量比为20:5-9进行组合可以使胰蛋白酶在较低的浓度快速完全消化，降低细胞死亡率，减少细胞损伤，提高细胞转染率，提高靶序列的剪切效率，提高MC3R基因纯合敲除细胞获得率。
本发明由于采用了含有5-乙基-5-苯基-1-甲基-2,4,6-(1H,3H,5H)-嘧啶三酮单钠盐的DMEM培养液对电击转染后的细胞进行培养，因而具有如下有益效果：细胞电击转染后在含有5-乙基-5-苯基-1-甲基-2,4,6-(1H,3H,5H)-嘧啶三酮单钠盐的DMEM培养液中培养，能够增加转染细胞中Cas9蛋白的表达量，提高对靶序列的剪切效率，提高MC3R基因纯合敲除细胞的获得率。
因此，本发明是一种简单、快速、高效、且成本较低的MC3R基因编辑的猪成纤维细胞系的制备方法。
附图说明
图1为本发明实施例1中部分PCR鉴定结果；
图2为本发明实施例1中阳性片段测序结果；
图3为本发明试验例1中Cas9蛋白的免疫印迹图；
图4为本发明试验例1中细胞存活率和72小时细胞生长数目；
图5为本发明试验例1中转染细胞荧光图；
图6为本发明试验例1中细胞转染率；
图7为本发明试验例1中剪切效率和基因纯合敲除率。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：
实施例1：
1.一种MC3R基因敲除载体的构建，包括：
1.1靶标设计
以MC3R基因的猪17号染色体克隆的BAC序列(CH242-163M14)为参考，设计引物扩增大白猪细胞的MC3R基因及其部分调控区：严格依据QIAGEN 69506 DNeasy Blood&TissueKit(250)说明书提取基因组DNA，设计以下引物进行鉴定扩增：MC-F：TGCTATCGACCGGACGCCAATC；MC-R：ACTGCACTGCTCAACCTATTAC。反应体系为：10×LA Buffer 2μL，2.5mM dNTPs 1.6μL，CX-F1 1μL，CX-R2 1μL，LA DNA Polymerase 0.2μL，基因组DNA 10μL，ddH2O 4.2μL。反应程序：94℃2min，98℃10s，69℃200s，循环30次，72℃10min，4℃保存。以PCR反应结束后，产物加入4μL 6x Loding Buffer混匀后，用1％琼脂糖凝胶电泳。扩增后琼脂糖凝胶电泳检测出现2.8kb条带，以CX-F：CTGCGAAGTATGCAGTAGACTAATC为测序引物，进行测序。测序结果如SEQ ID NO:11所示，与在GeneBank数据库中检索到的猪MC3R基因组序列(登录号EU091085)比对结果一致，利用在线软件Feng Zhang lab's Target Finder(http://crispr.mit.edu/)及DNA2.0gRNA设计工具软件(https://www.dna20.com/eCommerce/cas9/input)设计sgRNA，输入上述MC3R基因序列，设置并检索获得最优的靶序列。选择两个软件均推荐的靶序列，共选择最优的2个靶序列，如下：
名称 序列号 靶序列 位置
sgRNA1 SEQ ID NO:1 CTGCCTGCTCTCTGCTCCAC 15-34
sgRNA2 SEQ ID NO:2 GGAACTGCGCAACACCTTCA 912-931
1.2合成靶标片段
上述设计优化的靶标拟克隆岛px485载体，该载体来源于美国Addgene质粒库(http://www.addgene.org/CRISPR/)，将靶标序列上加上载体Bbs1酶酶切的粘性连接末端，得到靶序列sgRNA的上下游引物。
SgRNA1的上下游引物为：
SgRNA1-F1：5’-caccCTGCCTGCTCTCTGCTCCAC-3’(SEQ ID NO:3)；
SgRNA1-R1：5’-aaacGTGGAGCAGAGAGCAGGCAG-3’(SEQ ID NO:4)。
SgRNA2的上下游引物为：
SgRNA1-F2：5’-caccGGAACTGCGCAACACCTTCA-3’(SEQ ID NO:5)；
SgRNA1-R1：5’-aaacTGAAGGTGTTGCGCAGTTCC-3’(SEQ ID NO:6)。
1.3载体酶切
从美国Addgene质粒库(http://www.addgene.org/CRISPR/)购入px458穿刺菌质粒(编号：48138)。挑取少量穿刺菌菌落于250mL LB液体培养基(LB液体培养基的组分配比为：10g蛋白胨、10g NaCl、5g酵母提取物、30mg氨苄霉素、1L水。)中37℃摇床培养过夜。通过QIAGEN
Figure BDA0002550565050000051
Plasmid Maxi Kit(QIAGEN，德国)试剂盒抽提LB菌液中的px458质粒DNA。
提取好的px458载体质粒，用BbSⅠ限制性内切酶进行酶切，酶切体系如下：px458载体质粒7μL、10×NEB Buffer 5μL、BbSⅠ5μL、ddH2O 43μL，混匀后，于55℃水浴2h，酶切产物在质量分数为1％的琼脂糖凝胶中电泳，将9kb左右的片段进行割胶，用
Figure BDA0002550565050000061
GelExtraction Kit(QIAGEN，德国)纯化。
1.4sgRNA的上下游引物退火成双链
将合成的2对靶点的上游引物、下游引物分别稀释到40μM，靶点退火体系为：10×PCR Buffer 2μL、sgRNA-F 5μL、sgRNA-R 5μL、ddH2O 8μL。退火程序为：95℃5min，20℃2min，4℃保存。分别得到sgRNA1的退火产物和sgRNA2的退火产物。
1.5退火产物和BbsI酶切后px458载体连接转化并测序
将BbsI酶切后的px458载体酶切回收产物分别与2对sgRNA的退火产物进行4℃过夜连接。连接体系为：px458载体酶切回收产物1μL、sgRNA的退火产物4μL、10×T4 DNALigase Buffer 1μL、T4 DNA Ligase 1μL、ddH2O 3μL。16℃连接12h。
将连接产物转化到DH5α感受态细胞中，涂布到Amp抗性培养基上，37℃培养箱培养过夜。每个靶点挑取10个菌斑，在新的Amp抗性的LB固体培养基上划线培养，37℃培养箱培养14h。待菌线长大后，挑取少量菌体到5mL有Amp抗性的LB液体培养基中，37℃、220rpm摇床培养12h，留存备份，将菌线进行测序，测序引物为PX-F：CGTCGCGTAATCGCTAACTG。
测序正确后，取保存的菌液200μL加入到5mL LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜后，再取100μL菌液于250mL LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜后，利用QIAGEN
Figure BDA0002550565050000062
Plasmid Maxi Kit大提试剂盒提取打靶质粒，分别得到px458-MC3R-sgRNA1和px458-MC3R-sgRNA2基因敲除载体。
2.一种制备MC3R基因敲除的猪成纤维细胞系的方法，具体包括：
2.1药品和试剂：
PBS：准确称取9.6g PBS粉末(Solarbio P1010)，用超纯水溶解后定容至1L，用0.2μm膜过滤分装，4℃保存；
DMEM培养液：DMEM粉末13.4g加丙酮酸钠0.11g，NaHCO33.7g，三蒸水溶解，定容到1000mL，调pH至7.2，0.22μm滤膜除菌过滤，4℃冰箱保存。
10％胎牛血清(FBS)的DMEM即FBS/DMEM＝1:9(体积比)。
0.1％胰蛋白酶消化液：准确称取EDTA 0.5g，右旋葡萄糖1.0g，PBS粉末9.6g，Tris碱3.0g，用900mL超纯水溶解，调pH值至7.6，然后加胰蛋白酶1g，溶解后定容至1L，用0.2μm膜过滤分装，-20℃保存；
细胞冻存液：DMOS(二甲基亚砜)/FBS＝1:9(体积比)；
电击转染液：严格按照Lonza VPI-1002 Basic Primary FibroblastsNucleofector Kit说明书配置100μL电击转染液。
2.2以上述构建的px458-MC3R-sgRNA1和px458-MC3R-sgRNA2共同作为基因敲除载体；
2.3建立猪胚胎成纤维细胞系
2.3.1猪胚胎成纤维细胞的原代培养：无菌条件下，取妊娠28天大白猪子宫，用剪刀剪开子宫壁，取出包有胎膜的胎儿，放在PBS缓冲液(含5wt％青霉素和5wt％链霉素)中冲洗3次，用剪刀撕开胎膜取出胎儿，除掉胎儿的头，尾，四肢，内脏，血液；将胚胎置于100mm表面皿中，用PBS缓冲液(含5wt％青霉素和5wt％链霉素)冲洗8次；将组织在表面皿中充分剪碎；将剪碎的组织转移到T75细胞培养瓶的底壁，将组织块均匀铺到瓶底；将有组织块的一面向上，加入10mL DMEM培养液(含10％体积含量的FBS、1wt％青霉素和1wt％链霉素)，在37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱中培养；12小时后观察细胞贴壁生长状况，在开始培养后的20h左右，更换新的DMEM培养液。
2.3.2猪胚胎成纤维细胞的冻存：移除T75培养瓶中的DMEM培养液，用PBS清洗两次，加入3mL 0.1％胰酶消化液于37.5℃下消化3min；加入10mL含10％FBS的DMEM培养液终止消化，用移液枪轻柔反复吹打数次，保证细胞全部被消化下来；将离心管的细胞培养液上清吸除，加入细胞冻存液3mL，冻存液现配现用，冻存细胞转入冻存管后放入冻存盒中，置于-80℃冰箱中过夜，之后转入液氮长期保存。
2.4基因敲除载体转染猪胚胎成纤维细胞系：
2.4.1细胞解冻和传代：将冻存管从液氮中取出，快速投入37℃水浴锅中，并在水浴锅中快速摇动冻存管，使其迅速解冻；待细胞完全解冻后，用移液枪将细胞缓慢滴加到已经加有5mL 10％FBS的DMEM培养基的15mL离心管中，过程中缓慢摇晃离心管；1000rpm离心5min后，弃掉上清，加入2mL 10％FBS的DMEM培养基，重悬细胞；将重悬后的细胞，分别转移到48孔板的24个孔中，加入1mL 10％FBS的DMEM培养基，在37.5℃，5％CO2饱和湿度的培养箱培养，第二天待细胞贴壁后换液；显微镜下观察发现细胞的汇合度达到90％左右时候，取出6孔板，用移液枪将培养基吸净丢弃后，每孔各加2mL PBS漂洗2次；加入500μL的0.1％胰蛋白酶消化液，37℃恒温培养箱内消化约3min；加入2ml 10％FBS的DMEM培养基终止消化，用移液枪轻柔反复吹打数次，保证细胞全部被消化下来，将每个孔中的细胞分别转移到15mL无菌离心管中，1000rpm离心5min；弃去上清，加入5mL 10％FBS的DMEM培养基，重悬细胞；将每孔中的细胞分到两个孔，分别分到12孔板的12个孔中后，加入2mL 10％FBS的DMEM培养基，在37.5℃，5％CO2饱和湿度的培养箱培养，第二天待细胞贴壁后换液。
2.4.2电击转染：待细胞汇合度为75％时，取出12孔板，用移液枪将培养基吸净，每孔各加2mL PBS漂洗2次；加入500μL的0.1％胰蛋白酶消化液，37℃恒温培养箱内消化约3min；加入2mL 10％FBS的DMEM培养基终止消化，用移液枪轻柔反复吹打数次，保证细胞全部被消化下来；将12孔的细胞分别转移到12个15ml无菌离心管中，1000rpm离心5min，离心结束后，弃掉上清，用移液枪将残余培养基尽量吸净；将1μL px458-MC3R-sgRNA1、1μLpx458-MC3R-sgRNA2、1μL px459v2在100μL电击转染液中混合均匀，用混合好载体的电击液重悬细胞，小心轻柔快速的混匀，尽量不产生气泡；将重悬好的细胞，全部转移到电击杯底部，将电击杯放入Nucleofector TM核转仪的电击槽中，用A-024程序进行电击；电击结束后，取出电击杯，沿电击杯内壁缓慢加入1mL 37℃预热后的含10％FBS的DMEM培养液，用试剂盒中特制的吸管将细胞全部转移到12个灭菌后的1.5mL离心管中，取对应1.5mL离心管中的细胞50μL，加到已经加入1mL含10％FBS的DMEM培养液的10cm培养皿中，每个离心管分20个10cm培养皿，在37.5℃，5％CO2饱和湿度的培养箱培养。
2.5筛选和阳性克隆鉴定获得MC3R基因纯合敲除的单克隆细胞：
2.5.1阳性单克隆细胞的筛选：第2d细胞贴壁生长后，用含10％FBS的DMEM培养液+嘌呤霉素筛选，嘌呤霉素筛选梯度为：第2d 3.5μg/mL、第3d 6.5μg/mL、第4d 8.5μg/mL、第5d换培养液不再加药，每3d更换一次培养基，等待克隆点出现，直到克隆点长大，挑取单克隆。
2.5.2阳性单克隆细胞的鉴定：严格依据QIAGEN 69506 DNeasy Blood&TissueKit(250)说明书提取基因组DNA，以以下引物进行鉴定：MC-F：TGCTATCGACCGGACGCCAATC；MC-R：ACTGCACTGCTCAACCTATTAC。反应体系为：10×LA Buffer 2μL，2.5mM dNTPs 1.6μL，MC-F 1μL，MC-R 1μL，LA DNA Polymerase 0.2μL，基因组DNA 10μL，ddH2O 4.2μL。反应程序：94℃2min，98℃10s，69℃200s，循环30次，72℃10min，4℃保存。以PCR反应结束后，产物加入4μL 6x Loding Buffer混匀后，用1％琼脂糖凝胶电泳。以电泳显示扩增片段为2800bp左右的为阴性，扩增片段为1800bp左右的为阳性。鉴定为阳性的，以CX-F：CTGCGAAGTATGCAGTAGACTAATC为测序引物，进行测序。部分PCR鉴定结果见图1，对阳性片段进行胶回收并测序，阳性片段测序结果见图2。
由图1可以看出，样本1和2只有阴性片段，为假阳性细胞克隆，样本4、5、7、8同时含有阳性和阴性片段，为基因杂合敲除的细胞克隆，样本3和6只有阳性片段，为基因纯合敲除的细胞克隆。由图2可以看出，敲除型的阳性片段的测序结果与野生型的未敲除片段相比可知，MC3R的基因几乎全部被敲除。
实施例2：
改良胰蛋白酶消化液的制备方法为：准确称取EDTA 0.5g，右旋葡萄糖1.0g，PBS粉末9.6g，Tris碱3.0g，2-乙基-3-羟基-4-吡喃酮0.3g，用900mL超纯水溶解，调pH值至7.6，然后加胰蛋白酶1g，溶解后定容至1L，用0.2μm膜过滤分装，-20℃保存。
2.4.2电击转染：待细胞汇合度为75％时，取出12孔板，用移液枪将培养基吸净，每孔各加2ml PBS漂洗2次；加入500μL的改良胰蛋白酶消化液，37℃恒温培养箱内消化约30s；加入2ml 10％FBS的DMEM培养基终止消化，用移液枪轻柔反复吹打数次，保证细胞全部被消化下来，其余部分和实施例1完全一致。
实施例3：
改良胰蛋白酶消化液的制备方法为：准确称取EDTA 0.5g，右旋葡萄糖1.0g，PBS粉末9.6g，Tris碱3.0g，2-乙基-3-羟基-4-吡喃酮0.15g，用900mL超纯水溶解，调pH值至7.6，然后加胰蛋白酶1g，溶解后定容至1L，用0.2μm膜过滤分装，-20℃保存。其余部分和实施例2完全一致。
实施例4：
改良胰蛋白酶消化液的制备方法为：准确称取EDTA 0.5g，右旋葡萄糖1.0g，PBS粉末9.6g，Tris碱3.0g，2-乙基-3-羟基-4-吡喃酮0.55g，用900mL超纯水溶解，调pH值至7.6，然后加胰蛋白酶1g，溶解后定容至1L，用0.2μm膜过滤分装，-20℃保存。其余部分和实施例2完全一致。
实施例5：
2.4.2电击转染：待细胞汇合度为75％时，取出12孔板，用移液枪将培养基吸净，每孔各加2ml PBS漂洗2次；加入500μL的0.1％胰蛋白酶消化液，37℃恒温培养箱内消化约30s；加入2ml 10％FBS的DMEM培养基终止消化，用移液枪轻柔反复吹打数次，保证细胞全部被消化下来，其余部分和实施例1完全一致。
实施例6：
电击结束后，取出电击杯，沿电击杯内壁缓慢加入1mL 37℃预热后的含10％FBS的DMEM培养液，用试剂盒中特制的吸管将细胞全部转移到12个灭菌后的1.5mL离心管中，取对应1.5mL离心管中的细胞50μL，加到已经加入1mL含10％FBS的改良DMEM培养液的10cm培养皿中，每个离心管分20个10cm培养皿，在37.5℃，5％CO2饱和湿度的培养箱培养。阳性单克隆细胞的筛选用含10％FBS的改良DMEM培养液+嘌呤霉素筛选。
改良DMEM培养液为含0.078％质量分数5-乙基-5-苯基-1-甲基-2,4,6-(1H,3H,5H)-嘧啶三酮单钠盐的DMEM培养液，配制方法为：DMEM粉末13.4g加丙酮酸钠0.11g，NaHCO33.7g，5-乙基-5-苯基-1-甲基-2,4,6-(1H,3H,5H)-嘧啶三酮单钠盐0.79g，三蒸水溶解，定容到1000mL，调pH至7.2，0.22μm滤膜除菌过滤，4℃冰箱保存。
含10％体积分数的FBS的改良DMEM培养液的配制方法即为：将FBS与含0.078％质量分数5-乙基-5-苯基-1-甲基-2,4,6-(1H,3H,5H)-嘧啶三酮单钠盐的DMEM培养液按体积比1:9混合。其余部分和实施例2完全一致。
实施例7：
电击结束后，取出电击杯，沿电击杯内壁缓慢加入1mL 37℃预热后的含10％FBS的DMEM培养液，用试剂盒中特制的吸管将细胞全部转移到12个灭菌后的1.5mL离心管中，取对应1.5mL离心管中的细胞50μL，加到已经加入1mL含10％FBS的改良DMEM培养液的10cm培养皿中，每个离心管分20个10cm培养皿，在37.5℃，5％CO2饱和湿度的培养箱培养。阳性单克隆细胞的筛选用含10％FBS的改良DMEM培养液+嘌呤霉素筛选。
改良DMEM培养液为含0.078％质量分数5-乙基-5-苯基-1-甲基-2,4,6-(1H,3H,5H)-嘧啶三酮单钠盐的DMEM培养液，配制方法为：DMEM粉末13.4g加丙酮酸钠0.11g，NaHCO33.7g，5-乙基-5-苯基-1-甲基-2,4,6-(1H,3H,5H)-嘧啶三酮单钠盐0.79g，三蒸水溶解，定容到1000mL，调pH至7.2，0.22μm滤膜除菌过滤，4℃冰箱保存。
含10％体积分数的FBS的改良DMEM培养液的配制方法即为：将FBS与含0.078％质量分数5-乙基-5-苯基-1-甲基-2,4,6-(1H,3H,5H)-嘧啶三酮单钠盐的DMEM培养液按体积比1:9混合。其余部分和实施例1完全一致。
试验例1：
1.1利用免疫印迹法检测Cas9蛋白的表达：
以β-actin蛋白为参考蛋白，以CRISPR-Cas9兔多克隆抗体(华安生物)作为一抗，采用一站式蛋白免疫印迹检测试剂盒(北京爱普拜生物技术有限公司)检测转染后培养3d的细胞中的Cas9蛋白。Cas9蛋白的免疫印迹图见图3。
1.2取转染前细胞汇合度达到75％的12孔板两板，每孔各加2ml PBS漂洗2次；分为5组，每组4孔，分别加入500μL消化液消化(A组消化液实施例1配制的0.1％胰蛋白酶消化液，37℃恒温培养箱内消化约3min；B组为实施例2配制的改良胰蛋白酶消化液，37℃恒温培养箱内消化约30s；C组为实施例2配制的改良胰蛋白酶消化液，37℃恒温培养箱内消化约30s；D组为实施例2配制的改良胰蛋白酶消化液，37℃恒温培养箱内消化约30s；E组消化液为实施例1配制的0.1％胰蛋白酶消化液，37℃恒温培养箱内消化约30s)；加入2ml 10％FBS的DMEM培养基终止消化，用移液枪轻柔反复吹打数次，保证细胞全部被消化下来，以1×105个/ml的密度传入50ml培养瓶中继续培养。
1.2.1台盼兰鉴别死活细胞：用微量加样器吸取0.5ml细胞悬液于一小试管中(无菌操作)，再加入0.5ml 0.4％台盼兰染液，用吸管轻轻打匀，染色1～2分钟。计数：取一滴染色后的细胞悬液滴入计数板，计数每毫升细胞悬液中死亡细胞数(被染色的细胞)。由于在细胞悬液中加了等量的台盼兰染液，所以计数出的细胞数要再乘以2(稀释倍数)才是正确的死细胞数。
细胞存活率计算：细胞存活率＝(细胞总数－死细胞数)/细胞总数×100％
1.2.2 72小时细胞生长情况：传代后72小时用实施例1配制的0.1％胰蛋白酶消化液消化，37℃恒温培养箱内消化约3min；加入2ml 10％FBS的DMEM培养基终止消化，用移液枪轻柔反复吹打数次，保证细胞全部被消化下来，用红细胞计数板计数。细胞存活率和72小时细胞生长数目见图4。
1.3转染率：经过电击转染的细胞培养30h后，将转染细胞放在激发波长为488nm的荧光倒置显微镜观察荧光，估测电击转染的效率。以放大40倍的显微镜视野为标准，计5个显微镜视野表达绿色荧光的细胞数，算出阳性率，以此评价转染效率。转染细胞荧光图见图5。细胞转染率见图6。
1.4基因敲除效率：分别取上述实施例筛选得到的80个单克隆进行测序，以同时具有阳性片段和阴性片段的细胞克隆为杂合子，以只有阴性片段的细胞克隆为纯合子。设定剪切效率＝(杂合子数+纯合子数)/单克隆数×100％，基因纯合敲除率＝纯合子数/单克隆数×100％。剪切效率和基因纯合敲除率见图7。
由图3可以看出，实施例7的Cas9蛋白表达量比实施例1明显较高，实施例6的Cas9蛋白表达量比实施例2明显较高，由图7可以看出，实施例7的剪切效率和基因纯合敲除率明显高于实施例1，实施例6的剪切效率和基因纯合敲除率明显高于实施例2，这说明细胞电击转染后在含有5-乙基-5-苯基-1-甲基-2,4,6-(1H,3H,5H)-嘧啶三酮单钠盐的DMEM培养液中培养，能够增加转染细胞中Cas9蛋白的表达量，提高对靶序列的剪切效率，提高MC3R基因纯合敲除细胞的获得率。
由图4可以看出，实施例2、实施例3、实施例4、实施例5的细胞存活率明显高于实施例1，实施例2的72小时细胞生长数目明显高于实施例1、实施例3、实施例4、实施例5，且实施例3和实施例4的细胞存活率和72小时细胞生长数目与实施例5无明显差异；由图5、图6可以看出，实施例2的细胞转染效果明显高于实施例1、实施例3、实施例4、实施例5，且实施例3和实施例4的细胞转染率与实施例5相比无明显差异；由图7可以看出，实施例2的剪切效率和基因纯合敲除率明显高于实施例1、实施例3、实施例4、实施例5，且实施例3和实施例4的剪切效率和基因纯合敲除率与实施例5相比无明显差异，实施例6的剪切效率和基因纯合敲除率明显高于实施例7，这说明，胰蛋白酶作用时间较短时对细胞的消化不完全，在敲打过程中，细胞所受到的物理损伤较大，随着胰蛋白酶作用时间的延长，死细胞率也将逐渐提高，以胰蛋白酶和2-乙基-3-羟基-4-吡喃酮按质量比为20:5-9进行组合可以使胰蛋白酶在较低的浓度快速完全消化，降低细胞死亡率，减少细胞损伤，提高细胞转染率，提高靶序列的剪切效率，提高MC3R基因纯合敲除细胞获得率。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
序列表
<110> 浙江青莲食品股份有限公司
<120> 一种MC3R基因编辑的猪成纤维细胞系的制备方法
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctgcctgctc tctgctccac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggaactgcgc aacaccttca 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caccctgcct gctctctgct ccac 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaacgtggag cagagagcag gcag 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caccggaact gcgcaacacc ttca 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaactgaagg tgttgcgcag ttcc 24
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgtcgcgtaa tcgctaactg 20
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgctatcgac cggacgccaa tc 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
actgcactgc tcaacctatt ac 22
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctgcgaagta tgcagtagac taatc 25
<210> 11
<211> 2765
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 11
gcttcttgcc tccgggttgg aagcatatta ttccctctgc ccagactcct cttccacccc 60
ccttcaactc cagcccctac cttacccctg ggtatcttct ctgcttgctc gaaatcaaag 120
cttaggtgcc ccttcctcat ggaacttcca ttgaccatcc aagtgagaag accccccgcc 180
gccaggctcc cccaggcccc tggccttccc cgattcaagc attcattgca ctgtaatata 240
attgcctgtt ttctcatctc ccaccccaga ctctgagttt gaggaaaaca ggatgagcct 300
atctgtcttt ctcacccctg aacttcctgc actgggcaga aacccgacac acagtaggtg 360
ctcaatgaac gttgctaccc gtcccccacc ccgtgccccc ccccaaaaga atgagtgaat 420
ggacacacaa atggatggaa ggaaggctgt gccatttcca caagaaataa aaacggctca 480
gcccagccag tgaacagagt ctggcctgca gagggcacca ggctgctttt tcatctccag 540
gtccaaggcc agggagccgg cactgctgtc actcagagag gcacccgccg ctcagtggtc 600
acttggctgc actgaagatt aagtaggagt tgtctgcctc cagcgatgta taaaaccagt 660
gttcacccct cactcccaac gactcctacc acagccctct cttgctatgc aaagagccgt 720
aactgtagca accgggggct ggtgtgttcc attcccaggt ggggaggtga ggagaggaag 780
gtaagacagg agagagctaa gagcatctag aaaactgctt gccctggaga agcaaagttc 840
tctgcatgtc tcggagctga ctctctctct ctctccctct tctctccatc tcgggcagaa 900
gagaatcaaa gtccagactg gactagcatc caaaacaagc acctgcaggg agatttttct 960
ctttcctgga agcagcagcc acagcagcct ctgcaccctg ctggagcccg ggctccgatc 1020
cccggccgtg agcaatgaat gcttcgtgct gcctgctctc tgctccaccg gcgctgccta 1080
acagctcaga gcacctcccc gccccttcct tcagcaacca gagcagcagc ggcttctgcg 1140
agcaggtcgt catccagccc gaggtcttcc tggctctggg catcctcagc ctgctggaga 1200
acgtgctggt catcctggcc gtggccagga acggcaacct gcactcgccc atgtacctct 1260
tcctctgcag cctggccgtg gccgacctgc tggtgagcgt gtccaacgcc ctggagacca 1320
tcatgatcgc cgtggtcaac agcgacgccc tgaccttcga ggaccagttc gtccagcaca 1380
tggacaacgt cttcgactcc atgatctgca tctcgctggt ggcctccatc tgcaacctct 1440
tggccatcgc cgtggacagg tacgtcacca tcttctacgc gctgcgctac cacagcatca 1500
tgaccgtgcg gaaggcgggg gccctgatcg cggccatctg ggtgtgctgc ggcgtctgcg 1560
gcgtggtctt catcgtctac tccgagagca agatggtcat cgtgtgcctt gtcgtcatct 1620
tcttcgccat gctgctcctc atgggcaccc tctacgtgca catgtttctc ttcgcccggc 1680
tgcacgtcca gcgcatcgcc gcgctgccgc ccgccgacgg ggggcccccc ccgcagcgct 1740
cgtgcctgaa gggggccgtg accatctccc tcctgctggg ggtcttcatc ttctgctggg 1800
cccccttctt tctccacctg gttctcatca tcacctgccc cacccacccc tactgcatct 1860
gctacaccgc ccacttcaac acctacctgg tcctcatcat gtgcaactcg gtcatcgacc 1920
ccctgatcta cgccttccgg agcctggaac tgcgcaacac cttcaaggag atcctgtgca 1980
gctgcaacgc ctgaacctgg ggtaggaggc agggccccgc cggagcggtc ctcagcctgg 2040
tcgcgtttca cctgccggcc agccaaggtg tttaggaagc ggggagaaac gcactcaaaa 2100
gatggaaaga tgtgttcacg gtcatgatca tacaggtcct tttgttttta agcttacaaa 2160
acgttgagaa agaagggggg ggggctttct gaaaggacgc caacttgggt aagtccccaa 2220
ctctgctttc ccaaagagtc gcgggggcaa atccgtggag acggctctgg gtgctgtctg 2280
cgttcgtttc catgcacccg ggatccgtga tgccccgcct gctccccggc ttcccaccca 2340
cgcctccgtg tttcaagttc aaacctctcc caagcaaacc tgttccagct attgaccttc 2400
agctaccagc tgctcgggtg gctttgccct cattttgtga gaccctgagt ctctattact 2460
ctctttacaa gaaaacggtt tcctaaaaac aatgacctct ttgtggaaga agtgatgcta 2520
tttgcccctc ctcttgaccc cagagctccc ctgcaaaaat agggtgggaa tgtagcccac 2580
ttctagtctg ttgttattgt tattgttgct gctgctgctg ctgctgctgc tgctgctgct 2640
gctgctgctt gttaggcttt tatgcaggca acatagggca gctttcaaaa ctcttctgaa 2700
agagaaagtg ctttggaaaa tcagaacata cccatctaca aagtatttgg agaccttgct 2760
acttt 2765

Claims (2)

1.一种制备MC3R基因敲除的猪成纤维细胞系的方法，其特征在于：
S1、构建基因敲除载体；
S2、建立猪成纤维细胞系；
S3、基因敲除载体转染猪成纤维细胞系；
S4、筛选和阳性克隆鉴定获得MC3R基因纯合敲除的单克隆细胞；
所述步骤S1中基因敲除载体包括sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的CRISPR/Cas9基因敲除载体和sgRNA的核苷酸序列如SEQID NO:2所示的CRISPR/Cas9基因敲除载体；
所述步骤S3中基因敲除载体转染猪成纤维细胞系的具体过程包括：
将经解冻和传代的成纤维细胞进行培养，培养液为含10％体积分数胎牛血清的DMEM培养液，待细胞汇合度达70-80％时，利用改良胰蛋白酶消化液消化细胞20-30s后，终止消化，将所述基因敲除载体，px459v2和电击转染液混合后重悬细胞，进行电击转染；
每升所述改良胰蛋白酶消化液的制备方法为：准确称取EDTA 0.5g，右旋葡萄糖1.0g，PBS粉末9.6g，Tris碱3.0g，2-乙基-3-羟基-4-吡喃酮0.3g，用900mL超纯水溶解，调pH值至7.6，然后加胰蛋白酶1g，溶解后定容至1L，用0.2μm膜过滤分装，-20℃保存。
2.权利要求1所述的一种制备MC3R基因敲除的猪成纤维细胞系的方法在制备MC3R基因敲除猪中的用途。
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