CN107641612A - 三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201732，其细胞形态为典型的成纤维状细胞，染色体众数为3n＝136，染色体数目正确，可以进行冷冻保存及细胞复苏；同时该细胞系可以进行转染和用于基因功能研究，这为进行该鱼的免疫学及病毒学研究奠定了基础，还为三倍体鱼功能基因体外研究奠定了坚实的平台。本发明还提供了三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC的构建方法，本方法在原代培养时，对在进行干贴前将尾鳍组织小块用胎牛血清进行了浸泡，并对浸泡时间进行了优化，充分吸收了胎牛血清后的尾鳍组织小块，在后续干贴过程中可以更好地维持细胞的活性，大大减少了细胞迁出所需时间。

Description

三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于鱼类发育领域，尤其涉及一种三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC及其构建方法和应用。

背景技术

湖南师范大学生命科学学院鱼类发育生物学研究室以红鲫(Carassius auratasred.Var,2n＝100)为母本、湘江野鲤(Cyprinus carpio,2n＝100)为父本进行杂交，子一代(F1)中发现部分可育后代。通过F1自交获得二倍体后代F2；将F2自交得到了F3。F3为雌雄均可育、染色体数目为200条的异源四倍体。该异源四倍体鲫鲤群体雌雄可育且能稳定的产生二倍体配子，使得四倍体特征能够连续稳定遗传。以异源四倍体鲫鲤为父本，二倍体日本白鲫为母本，通过倍间交配方法制备出染色体数目为150的三倍体湘云鲫(3n＝150)。三倍体湘云鲫的性腺根据其结构特征可被分成三种：卵巢型、精巢型和脂肪型；三倍体湘云鲫的三种性腺均不能产生可育的配子，繁殖和养殖实践也证明了其完全不育性。由于三倍体湘云鲫具有生长速度快、抗病性强、抗逆性强及完全不育的优点，已经在全国得到推广养殖，产生了显著的经济效益和社会效益。

改良三倍体湘云鲫(湘云鲫2号)是改良四倍体鲫鲤和改良三倍体湘云鲫进行交配产生的一种新型三倍体鲫鱼。与传统三倍体湘云鲫相比，改良三倍体鲫鱼不但保留了三倍体鱼生长速度快、不育等特点，而且在体形方面表现出明显的改良特征。

近年来对改良三倍体湘云鲫以及改良三倍体鲫鱼的水产养殖研究表明两种鱼都具有生长速度快，肉质好，抗逆性强等方面的优势，这为其在全国范围内推广奠定了坚实的基础。改良三倍体湘云鲫较其母本(改良二倍体红鲫)和父本(四倍体鲫鲤)具有更强的抗病能力，这已经在生产实践中得到了验证，但目前缺乏与抗病性能力相关的理论依据。因此建立合适的体外研究细胞系，并利用其深入探究三倍体鱼抗病能力强的生物学学机制是十分有意义的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对目前研究三倍体鱼抗病机制缺乏合适的体外细胞系，而提供一种三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC及其构建方法和应用。

为解决上述问题，本发明一方面提供了一种三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201732。

本发明另一方面提供了一种三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC的构建方法，主要包括以下步骤：

(1)从三倍体湘云鲫尾鳍进行取材，消毒漂洗后剪成尾鳍组织小块；

(2)将步骤(1)后得到的尾鳍组织小块用胎牛血清浸泡后，在DMEM培养基中进行原代培养；

(3)待步骤(2)后得到的细胞生长至形成单层后，加入胰酶进行消化，终止消化后进行传代培养。

上述的构建方法，优选的，所述构建方法具体包括以下步骤：

(1)用体积浓度为70％～75％的酒精对要取材的三倍体湘云鲫尾鳍进行消毒后，剪取尾鳍组织，用70％～75％的酒精浸泡，再用磷酸缓冲液漂洗后剪成0.5～1mm²的尾鳍组织小块；

(2)将步骤(1)后得到的尾鳍组织小块用磷酸缓冲液清洗，进行离心，去上清，再用磷酸缓冲液重复清洗，加入尾鳍组织小块5～10倍体积的胎牛血清浸泡15～30min，进行离心，去上清后，将得到的尾鳍组织小块均匀接种于培养皿底部，25℃下倒置干贴0.5～2h，往培养皿中加入DMEM培养基，置于25℃且含体积5％CO₂的培养箱中培养；

(3)当细胞生长至形成单层后，去除培养皿中的培养基并加入磷酸缓冲液润洗细胞，去除磷酸缓冲液，加入质量浓度0.25％的胰酶消化，除去胰酶，加入DMEM培养基终止消化，用移液器轻轻吸打使细胞充分分离，以1：1.5～2的细胞数量比进行传代，然后仍置于培养箱中继续培养，待其再次长至单层后，依照上述方法再进行传代培养，将得到的三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC进行细胞冻存和细胞复苏。

本制备方法以三倍体湘云鲫尾鳍成纤维细胞为转染材料，以PEGFP-N1进行基因转染实验，可以看到明显的绿色荧光存在，证明三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC可以用于基因功能研究。本制备方法的尾鳍组织小块在进行干贴前用胎牛血清进行了浸泡，充分吸收了胎牛血清后的尾鳍组织小块，在后续干贴过程中可以更好地维持细胞的活性，大大减少了细胞迁出所需时间(约6～8天左右，便有细胞从组织块中迁出，比不用血清浸泡的对照组要快一周以上)。本制备方法中，尾鳍在酒精中的最大浸泡时间为10～40s，相比二倍体红鲫，其在酒精中最大耐受时间较长；同时研究发现，三倍体湘云鲫尾鳍在血清中浸泡15min即可较好的维持后续干贴过程中细胞的活性，这些都说明三倍体尾鳍细胞相对于二倍体具有较强的抗逆性和活性。培养箱中CO₂的作用在于稳定培养基的pH值。

优选的，所述三倍体湘云鲫为3～9月龄的改良三倍体湘云鲫(湘云鲫2号)，更优选为无病无伤、鲜活的三倍体湘云鲫。

优选的，所述步骤(2)和(3)中的DMEM培养基，其中还包括青霉素、链霉素、人碱性成纤维细胞生长因子和胎牛血清，使青霉素的浓度为100Iμ/mL，链霉素的浓度为100μg/mL，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10ng/mL，胎牛血清的体积占总体积的15％～30％。

优选的，所述胎牛血清所占的比例根据培养细胞所处的代数来调整，第一代到第十代细胞用含有体积30％胎牛血清的DMEM培养基培养，第十一代到第三十代细胞培用含有体积20％胎牛血清的DMEM培养基培养，第三十一代后的细胞用含有体积15％胎牛血清的DMEM培养基中培养。

优选的，所述步骤(1)中，浸泡时间为10～40s，漂洗遍数为2～3遍；所述步骤(2)中，离心使用的转速为800～1000rpm，离心时间为3～5min，磷酸缓冲液重复清洗1～2次，定期更换培养基的方式是每隔4～6天更换培养皿中一半的培养基；所述步骤(3)中，消化时间为1～2min。消化时间更长说明三倍体细胞贴壁更紧，更耐胰酶消化。

优选的，所述细胞冻存的具体步骤为：选取生长旺盛且细胞密度达到90％以上的一皿细胞，去除培养皿中的培养基并加入磷酸缓冲液润洗细胞，去除磷酸缓冲液，加入质量浓度0.25％的胰酶消化1～2min，除去胰酶，加入含有体积15～30％胎牛血清的新鲜DMEM终止消化，用移液器轻轻吸打使细胞充分分离，然后将细胞移入冻存管中，以转速为800～1000rpm离心3～5min，去上清，用冻存液悬浮细胞，将冻存管置于冻存盒中，4℃条件下放置1～2h，然后移至-20℃条件下放置1～2h，再将其放到-80℃条件下放置12～24h，最后移至液氮罐中保存；所述冻存液中含体积20％的胎牛血清、10％二甲基亚砜和70％DMEM。

优选的，所述细胞复苏的具体步骤为：从液氮罐中取出保存的冻存管，将其管盖朝上置于25℃水中融化，细胞完全融化后用移液器将其轻轻混匀，并转入盛有培养基的培养皿中，放置于25℃的培养箱中培养。

基于一个总的技术构思，本发明还提供一种上述三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC和由上述构建方法得到的三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC在多倍体鱼类抗病毒免疫研发领域的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、本发明提供的三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC，其细胞形态为典型的成纤维状细胞，染色体众数为3n＝136，染色体数目正确，可以进行冷冻保存及细胞复苏；该细胞系可以连续传代，目前已传代120代以上，且细胞增殖稳定，能提供大量的细胞用于鱼类免疫学及病毒学研究；同时该细胞系可以进行转染和用于基因功能研究，这为进行该鱼的免疫学及病毒学研究奠定了基础，还为三倍体鱼功能基因体外研究奠定了坚实的平台。

2、本发明还提供了三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC的构建方法，在原代培养时，在进行干贴前用胎牛血清进行了浸泡，充分吸收了胎牛血清后的尾鳍组织小块，在后续干贴过程中可以更好地维持细胞的活性，大大减少了细胞迁出所需时间(约4～6天左右，便有细胞从组织块中迁出，比不用血清浸泡的对照组要快一周以上)；同时本方法还对胎牛血清的浓度根据培养细胞所处的代数进行了调整，不仅节省了用料成本，而且可以明显缩短细胞培养的时间；此外，本方法中对尾鳍在酒精中的最大浸泡时间进行了优化，提高了三倍体尾鳍在酒精中最大耐受时间，减少了原代培养时污染发生的可能，提高了原代培养的成功率；还发现三倍体湘云鲫尾鳍在血清中浸泡15min即可较好的维持后续干贴过程中细胞的活性，简化了原代培养步骤。

一种三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏机构地址为湖北省武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C201732，保藏时间为2017年2月16日。

三倍体湘云鲫尾鳍的直接来源由湖南师范大学生命科学学院傅永明于2010年9月自行采集于中国湖南省长沙市，原始来源年代久远，无法查证原始采集者和具体获取时间。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明中相差显微镜下低细胞密度的第十代三倍体湘云鲫尾鳍成纤维细胞。

图2为本发明中相差显微镜下高细胞密度的第十代三倍体湘云鲫尾鳍成纤维细胞。

图3为本发明中三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC的染色体分布图。

图4为本发明中三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC的中期分裂相示意图。

图5为本发明中二倍体红鲫血细胞的DNA含量。

图6为本发明中三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC的DNA含量。

图7为三倍体湘云鲫MAVS基因部分cDNA序列及所推测出的氨基酸序列。

图8为本发明中三倍体湘云鲫尾鳍成纤维细胞系转染PEGFP-N1后的荧光图片。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例：

本发明的一种三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：C201732。该三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC的构建方法如下：

(1)尾鳍取材：取3～9月龄、无病无伤、鲜活的三倍体湘云鲫尾鳍，用体积浓度为75％的酒精进行消毒后，置于生物安全柜中剪取尾鳍组织，用体积浓度为75％的酒精浸泡40s，再用磷酸缓冲液漂洗3遍后剪成0.5～1mm²的尾鳍组织小块；

(2)原代培养：将步骤(1)后得到的尾鳍组织小块收集并置于1.5mL EP管中，加入1mL的磷酸缓冲液进行漂洗，以1000rpm的转速进行离心3min，去上清，再用1mL磷酸缓冲液清洗1次，加入尾鳍组织小块10倍体积的胎牛血清浸泡15min，以1000rpm的转速进行离心3min，去上清后，用无菌的解剖镊将湿润的尾鳍组织小块均匀接种于60mm培养皿底部，25℃下倒置干贴0.5h，培养皿中加入适合的培养基，置于25℃且含体积5％CO₂的培养箱中培养，一般在4～6天后会有细胞从组织块周围游离出来，每隔4～6天去除培养皿中一半的培养基并添加入新鲜培养基；所述适合的培养基，选用GIBICO公司的DMEM瓶装液体培养基，向培养基中加入青霉素、链霉素、人碱性成纤维细胞生长因子、胎牛血清，使青霉素的浓度为100Iμ/mL，链霉素的浓度为100μg/mL，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10ng/mL，胎牛血清占总体积的15％～30％(第一代到第十代细胞培养于含有30％胎牛血清的DMEM培养基中，第十一代到第三十代细胞培养于含有20％胎牛血清的DMEM培养基中，第三十一代后的细胞培养于含有15％胎牛血清的DMEM培养基中)；

(3)传代培养：当细胞生长至形成单层后，去除培养皿中的培养基并加入3mL磷酸缓冲液润洗细胞，去除磷酸缓冲液，加入500μL质量浓度0.25％的胰酶消化1min，除去胰酶，加入1mL含有胎牛血清的新鲜DMEM终止消化，用移液器轻轻吸打使细胞充分分离，以1：2的细胞数量比进行传代，然后置于培养箱中继续培养；待其再次长至单层后，依照上述方法再进行传代培养，传至第十一代时，培养基中胎牛血清含量减为总体积的20％，传至第三十一代时，培养基中胎牛血清含量减为总体积的15％；从启动原代培养至今，该细胞系已经传至120代，细胞已能稳定增殖，可以定为细胞系，命名为3nFC，该细胞系的细胞类型为成纤维细胞(见图1和图2)；

(4)细胞冻存：选取生长旺盛的且细胞密度达到90％以上的一皿细胞，去除培养皿中的培养基并加入3mL的磷酸缓冲液润洗细胞，去除磷酸缓冲液，加入500μL 0.25％的胰酶消化2min，除去胰酶，加入1mL含有体积15～30％胎牛血清的新鲜DMEM终止消化；用移液器轻轻吸打使细胞充分分离，将消化好的细胞移入冻存管中，以1000rpm的转速离心3min，去上清，用500μL冻存液(含20％胎牛血清，10％二甲基亚砜，70％的DMEM)悬浮细胞，将冻存管置于冻存盒中，4℃放置1h，然后移至-20℃冰箱中放置1h，再将其放到-80℃放置12h，最后移至液氮罐中保存，并做好记录；

(5)细胞复苏：从液氮罐中取出保存的冻存管，用一次性手套包好，管盖朝上置于25℃水中融化，细胞完全融化后用移液器将其轻轻混匀，并转入盛有培养基的培养皿中，放置于25℃培养箱培养。

尾鳍组织血清浸泡最优时间的确定：

已有的研究表明，在组织培养时，血清浸泡有利于维持后续干贴过程中细胞活性的维持，减少细胞迁出所需时间。在生产应用上，已有的研究表明三倍体湘云鲫在生长、抗逆性等方法相比母本二倍体红鲫具有显著的优势。因此我们有理由猜测三倍体湘云鲫组织细胞在生长、抗逆性等方面较二倍体红鲫会有优势，从而缩短原代培养操作时间，简化操作步骤。为确定三倍体鱼尾鳍组织血清浸泡最优时间，我们对尾鳍组织块不同的血清浸泡时间进行了比较。分别将组织块在血清中浸泡5min、10min、15min、20min、25min、30min、40min、50min和60min后，干贴30min，进行培养，然后观察细胞迁出时间。结果发现浸泡5min和10min的组织块细胞迁出时间为10～14天，15min、20min、25min和30min组为4～6天，40min、50min和60min组为7～10天。因此，我们将尾鳍组织血清浸泡时间优选为15～30min。

上述得到的三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC的鉴定包括以下两个方面：

1、染色体分析

培养细胞至对数生长期，然后在培养基中加入10μg/mL的秋水仙碱至终浓度为0.1μg/mL，继续培养3h；收集细胞，900rpm离心5min，去上清；加入5mL磷酸缓冲液洗涤细胞一次，900rpm离心5min，去上清，加入低渗KCl液讲细胞悬浮并且在室温下静置10min；以900rpm离心5min沉淀低渗后的细胞，去上清；加入4mL新鲜配制的卡诺氏固定液(冰醋酸：甲醇＝1：3)，用滴管将细胞轻轻悬浮，室温静置30min，800rpm离心5min，去上清；细胞重新悬浮于4mL新鲜配制的卡诺氏固定液中，室温静置30min；以800rpm离心5min沉淀固定好的细胞，用少量的固定液(1～2mL)重悬细胞，从高处将细胞悬液滴至-20℃预冷的干净的载玻片上，并小心在酒精灯上烤干载玻片的背面；将制备的染色体片用吉姆萨染液染60min，之后用流水洗去染液，烘干备用；在油镜下观察染色体成片，选择50个以上良好的分裂相，使用Olympμs CX401显微镜进行拍照保存，统计分析各分裂相中染色体的数目。如图3和图4，结果显示三倍体湘云鲫尾鳍成纤维细胞的染色体数目为136，染色体数目正确，可以进行冷冻保存及细胞复苏。

2、流式细胞仪分析

收集4皿已长满的细胞，4℃预冷的75％的酒精固定24h以上，实验前将固定好的细胞用磷酸缓冲液(PBS)洗一遍，1000rpm，3min，吸走PBS，并加500μL DAPI轻轻吸打悬浮细胞，置于暗处染色10min，上机前将细胞悬液过滤，以得到单个悬浮的细胞悬液。测定时，以三倍体湘云鲫血细胞作参照，测三倍体湘云鲫尾鳍细胞中DNA含量，测量结果用卡平方检测好适度。如图5和图6，结果表明三倍体湘云鲫尾鳍培养细胞的平均DNA含量为171，是红鲫血细胞DNA含量的1.71倍。

本发明的三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC可应用于鱼类抗病毒免疫研发领域，具体包括以下两个方面：

1.三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC鲤春病毒血症病毒(SVCV)感染后转录组差异分析

采用感染浓度均为MOI＝3×10^-3的SVCV病毒感染细胞后，提取细胞总RNA，采用Illumina/Solexa平台进行转录组测序，将获得的数据进行整理，分析，与未用病毒感染的细胞的转录组数据进行比较分析。三倍体对照组测序得到47992506条reads，总碱基数量为5999063250bp，三倍体实验组得到25934388条reads，总碱基数量为3241798500bp，通过注释共获得28992条Unigene。进一步对Unigene进行了分析，发现三倍体细胞在感染SVCV后，共有430条Unigene差异表达，其中上调表达的有386条，下调表达的有44条。并且三倍体细胞中众多天然免疫信号通路相关基因出现了明显上调，如RIG-I、MDA5、MAVS、LGP2、TRAF3、TANK、TBK1、IRF3、IRF7和IFNA等，表明三倍体湘云鲫细胞系在收到病毒刺激后，引发了细胞内的抗病毒反应，这也说明三倍体湘云鲫尾鳍细胞系可用于研究三倍体鱼的看病毒天然免疫反应。

2.免疫相关功能基因研究及绿色荧光蛋白基因转染分析

本发明中三倍体湘云鲫尾鳍细胞系可以应用于鱼类免疫相关功能基因克隆及分析。以MAVS基因为例：取三倍体湘云鲫尾鳍培养细胞一皿，收集细胞后，采用Trizol法提取细胞的总RNA，利用逆转录试剂盒合成第一链cDNA；然后根据在NCBI上搜索鱼类MAVS保守区序列设计了一对简并引物，来扩增三倍体湘云鲫的MAVS cDNA的中间片段；再根据三倍体鱼MAVS基因的中间片段设计5'race和3'race引物，扩增出基因3'片段和5'片段；最后组装，获得三倍体鱼与MAVS基因cDNA全序列并根据基因序列预测期氨基酸序列(如图7)，氨基酸序列如序列表所示。

本发明中三倍体湘云鲫尾鳍细胞系也可直接应用于基因转染及功能分析，以绿色荧光蛋白为例：在转染前12～24h，接种1×10⁶个细胞于盛有2mLDMEM完全培养基的6孔板中，直到细胞长到90％～95％的满度，转染前1h，将培养基换成不含双抗的培养基，以减少转染过程中对细胞的损伤；取4μg转染质粒用不含双抗也不含有血清的DMEM稀释至250μL，并用枪头吸打混匀；取10μL Lipofectamin2000用不含双抗也不含有血清的DMEM稀释至250μL，并用枪头吸打混匀，室温静置5min；将混匀的质粒与混匀的转染试剂混合在一起，并将混合液均匀的加到待转染细胞中；在培养箱中培养6～8h后即可将培养基移除，并换入新鲜的完全培养基培养，在细胞转染后48h便可在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光的表达，发现约有10％的细胞表达较强荧光(见图8)，证明三倍体湘云鲫尾鳍成纤维细胞系可以用于基因功能研究。

综上所述，本发明提供的三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC是人工制备的三倍体鱼中的首例体外细胞系，其细胞形态为典型的成纤维状细胞，染色体众数为3n＝136，染色体数目正确，可以进行冷冻保存及细胞复苏；同时该细胞系可以进行转染和用于基因功能研究，这为进行该鱼的免疫学及病毒学研究奠定了基础，还为三倍体鱼功能基因体外研究奠定了坚实的平台。本发明还提供了三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC的构建方法，以改良三倍体湘云鲫尾鳍组织为材料，将尾鳍组织剪碎后采用组织块贴壁法启动原代培养所获得，本方法在原代培养时，对在进行干贴前将尾鳍组织小块用胎牛血清进行了浸泡，并对浸泡时间进行了优化，充分吸收了胎牛血清后的尾鳍组织小块，在后续干贴过程中可以更好地维持细胞的活性，大大减少了细胞迁出所需时间(约4-6天左右，便有细胞从组织块中迁出，比不用血清浸泡的对照组要快一周以上)。

序列表

<110> 湖南师范大学

<120> 三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC及其构建方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3275

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

taagcagtgg tatcaacgca gagtacatgg gagactgacc ttcctttaaa gggtctgatt 60

tggagtccag attcagggac acaaagaaaa ggctgttgaa ttttactatt taaagcagtg 120

caaaaatgtc atttactcgt gaacaatttt ataacgaggc aataaggccg aatttggctc 180

gtttttcatc aacggtcaaa gtgagagata tcttacctca cctgccatgc ctcacactca 240

ctgataggga agaggtcgaa gccaagagag aaacttctgg aaacttcact gctatgcaga 300

cacttctgga caatctacgc agacgtgaga aatggcctga tgagttcatc actgcactcc 360

ggaactgtga acatagggaa ctggctaatg agatgagagc tacttatgac aggatcaggg 420

gcatcacaaa taatgctgct cctgttgctc ctaaacccag accagcacct gctgcaggtg 480

ctgcttctac ttcatctggt tccacaacaa ccacaaccac agtgacagtt catgcagtcc 540

cagcgaccac acctcatctg ctgattccac cctcaggggg agccccagca agttcaacgg 600

ccccttccaa cgctgcagcc ccagaaccat ctcctgctcc tgttaaacct cctactccag 660

ttccagcacc ttctcctgaa ccagtttccc aagctgaagt agcacctcct gttgtagcta 720

cttcccaagc acctcaccct cctgcagtct cagtttctga agtgtcttta cctgttccaa 780

ccgctgagaa caaaacacct gctttagata gttcagatgg cttggcttta acagaccgaa 840

ccaccatctc ctcatcaact ggtgaagctc tcctctccac ctcaagtgct caaacatcct 900

cctcagacac ttccactgct caaaaccaaa taacaaagcc ttacaccacc tcccagactt 960

ctccgaagtc aaagaacacc caggtgccaa cagcagacaa agatattgac acttctgaga 1020

gacttcctgt ccaagacact aatccctcat tgagaatgca aaggacattt caggagccgg 1080

aagagatctc tgacccaact gcaaatgggg ggattcagag gaacaacact gttgggttgc 1140

cagttttcaa taatgctcca acaaattcta ccagaacatc tcgggcaaca tcttctgcac 1200

ctgctgaggt ggttaatgca tctccttctt ccatcaacca ggaatatttc agcaagcctg 1260

gtgtccttca gcctccagaa ccccagcaga acagagcaga gattcttcct gtctttcaag 1320

aggagccttg ctcagtggtt tcagatgatt tggagatcag taacgcgaca gactcttcca 1380

cagaacttgg agagtctaat agtcttgcag accagaactc cgctcccttt gattctgcta 1440

ctcagtcctt tcaagaccct ccatacaatg ctgctccctt gacccataac cagcctgagg 1500

aggaccacta tgaatctttc tacgagaatc atactcagat aaatgtaatc cggtatgctg 1560

aagagccatc tgctgaaaat atgaatggtc agccaccaag catgctgcaa cgtagcagag 1620

tcatctctga ggaccagcgt accctgaact atgttggcac agaaagtgca gttcttcttt 1680

ctgagccatc tgggcatgac cgtaagaagt caaccaccat cagcattcga gaggaagaat 1740

ccagtgctgc taggccagag cagagaggag aggggcgccc agagttattc aggataaaca 1800

acttccacct tattgctgct gcagggattg gtctttctgc tgcattcttg gcctggaaat 1860

tcacacacaa atgaaagtag tccttatgat gtttgtgcta tataccaagt cttctataat 1920

cattcgatag cttgctgtga ggaacagact agcagttgtc caacataata tctgtcacct 1980

gtggtttatc ctaatgtatt tattttaatg agtgtgtata cagtatatag gacatagtaa 2040

tcatggtttg ccatgtgcct tacatacata tgccttgtat gctagggccg aaaatgaatt 2100

tgaatgccgt tgcacctttt tcactgctat taaatggagt gtcatggagc attaaagtaa 2160

attggagaac ccagcttgac aggctattta gtgttcaaca atttgattta ttgttgagtt 2220

gcgagaagtt gcaggaatac atcctgtgag tgacagacca tggatgagca ggagctgttg 2280

cataacctaa cctatcggac atgtctaaaa agctcatttg gaacatatta catggactgg 2340

agaattgctc caaccctctc cactagcccc ctcgcaggag tgtttcttct caaactcatc 2400

ttgtttctta taaatcctca atcactgatg ccttagtgaa aactttctcc atcactgtcc 2460

catatgttct gggcagtttg aacctgtaag agtctcaaag tgcacataca cacacacaca 2520

cacacacaag aacactgccc gcttttgata aaaatcaaat gtattctcct aatgccttct 2580

gtaagaaggt ccaatagtgg agaaactgtt aagatatgtt aagccaaatg caagcataac 2640

caagtgcccc atgtgtgaaa atgtaaagtt tatattgttt ataatgctga tatataagtg 2700

ttgtgtgcag aagtgtccaa gtacagtgca caacagtaat acttttagtt gaaaaatatc 2760

atttttgact cttttattga acactgtatt ctaggcatat attcagtatg cattctctga 2820

gattcaaact catgttcttt ggggttgata gtggaattgc cctatcgttt gagctgcaga 2880

aacaacatga aaagatttgt gctattagca taaagttgtc tgtgtaaggg taacgtcaaa 2940

cagctacaca ttgtaagtaa agattgtgaa tgactgaatg aattaggtat acacttcaaa 3000

tgtaatccat gtcattttta atcagcaact gcactttatt cacacattaa tgtaaatgat 3060

tgaacctggt tttaaatgca cttgttatgt tactcctgat cctttatttg ggcctgtatg 3120

ttttgctaga tacaattttc caggggaata tgtgtatcta cgcttaactg tttcgctttc 3180

tgtgtactag ttaaacttga tcatgcattg tcataatgat ttccagaatt gtttctgaaa 3240

taaaatatcc taccttgaaa aaaaaaaaaa aaaaa 3275

Claims (10)

1.一种三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201732。

2.一种如权利要求1所述的三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC的构建方法，主要包括以下步骤：

(1)从三倍体湘云鲫尾鳍进行取材，消毒漂洗后剪成尾鳍组织小块；

(2)将步骤(1)后得到的尾鳍组织小块用胎牛血清浸泡后，在DMEM培养基中进行原代培养；

(3)待步骤(2)后得到的细胞生长至形成单层后，加入胰酶进行消化，终止消化后进行传代培养。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法具体包括以下步骤：

(1)用体积浓度为70％～75％的酒精对要取材的三倍体湘云鲫尾鳍进行消毒后，剪取尾鳍组织，用70％～75％的酒精浸泡，再用磷酸缓冲液漂洗后剪成0.5～1mm²的尾鳍组织小块；

(2)将步骤(1)后得到的尾鳍组织小块用磷酸缓冲液清洗，进行离心，去上清，再用磷酸缓冲液重复清洗，加入尾鳍组织小块5～10倍体积的胎牛血清浸泡15～30min，进行离心，去上清后，将得到的尾鳍组织小块均匀接种于培养皿底部，25℃下倒置干贴0.5～2h，往培养皿中加入DMEM培养基，置于25℃且含体积5％CO₂的培养箱中培养；

(3)当细胞生长至形成单层后，去除培养皿中的培养基并加入磷酸缓冲液润洗细胞，去除磷酸缓冲液，加入质量浓度0.25％的胰酶消化，除去胰酶，加入DMEM培养基终止消化，用移液器轻轻吸打使细胞充分分离，以1：1.5～2的细胞数量比进行传代，然后仍置于培养箱中继续培养，待其再次长至单层后，依照上述方法再进行传代培养，将得到的三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC进行细胞冻存和细胞复苏。

4.根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于，所述三倍体湘云鲫为3～9月龄的改良三倍体湘云鲫。

5.根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)和(3)中的DMEM培养基，其中还包括青霉素、链霉素、人碱性成纤维细胞生长因子和胎牛血清，使青霉素的浓度为100Iμ/mL，链霉素的浓度为100μg/mL，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10ng/mL，胎牛血清的体积占总体积的15％～30％。

6.根据权利要求5所述所述的构建方法，其特征在于，所述胎牛血清所占的比例根据培养细胞所处的代数来调整，第一代到第十代细胞用含有体积30％胎牛血清的DMEM培养基培养，第十一代到第三十代细胞培用含有体积20％胎牛血清的DMEM培养基培养，第三十一代后的细胞用含有体积15％胎牛血清的DMEM培养基中培养。

7.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中，浸泡时间为10～40s，漂洗遍数为2～3遍；

所述步骤(2)中，离心使用的转速为800～1000rpm，离心时间为3～5min，磷酸缓冲液重复清洗1～2次，定期更换培养基的方式是每隔4～6天更换培养皿中一半的培养基；

所述步骤(3)中，消化时间为1～2min。

8.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述细胞冻存的具体步骤为：选取生长旺盛且细胞密度达到90％以上的一皿细胞，去除培养皿中的培养基并加入磷酸缓冲液润洗细胞，去除磷酸缓冲液，加入质量浓度0.25％的胰酶消化1～2min，除去胰酶，加入含有体积15～30％胎牛血清的新鲜DMEM终止消化，用移液器轻轻吸打使细胞充分分离，然后将细胞移入冻存管中，以转速为800～1000rpm离心3～5min，去上清，用冻存液悬浮细胞，将冻存管置于冻存盒中，4℃条件下放置1～2h，然后移至-20℃条件下放置1～2h，再将其放到-80℃条件下放置12～24h，最后移至液氮罐中保存；所述冻存液中含体积20％的胎牛血清、10％二甲基亚砜和70％DMEM。

9.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述细胞复苏的具体步骤为：从液氮罐中取出保存的冻存管，将其管盖朝上置于25℃水中融化，细胞完全融化后用移液器将其轻轻混匀，并转入盛有培养基的培养皿中，放置于25℃的培养箱中培养。

10.一种如权利要求1所述或由权利要求2～9中任一项所述构建方法得到的三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC在多倍体鱼类抗病毒免疫研发领域的应用。