CN114763527A - 一种高效稳定工作细胞库的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高效稳定工作细胞库的制备方法，包括人脐带采集与检测；脐带间充质干细胞原代培养；脐带间充质干细胞传代培养；脐带间充质干细胞工作细胞库收获、冻存；工作细胞库入库检测。脐带检测和工作细胞库入库检测了确保制备的工作库细胞各项指标符合质量标准，使用无血清培养基避免了血清培养基成分的不确定性及血清培养的不稳定性带来的风险，冷冻液不仅降低了DMOS含量从而降低临床使用的风险性，且能保持工作细胞库中细胞的生物活性，冷冻复苏后具有高的存活率和优选的分化能力。

Description

一种高效稳定工作细胞库的制备方法
技术领域
本发明属于细胞生物学技术领域，尤其涉及一种高效稳定工作细胞库的制备方法。
背景技术
间充质干细胞最初在骨髓中发现，目前已经从多种组织中分离提取，例如脐带，脂肪，牙髓，胎盘，羊水，肌肉，肺，肝和胰腺等组织中都能分离到间充质干细胞。脐带间充质干细胞的来源包括：最外层的羊膜，羊膜下层，华通氏胶，脐带动脉和静脉血管周围组织。血管周围为含水量丰富的华通胶有保护脐带血管的作用，也可分离提取到间充质干细胞。目前的制备方法中应用最为广泛的是华通氏胶来源的间充质干细胞。
为了更好的利用脐带间充质干细胞，可制备脐带间充质干细胞工作细胞库，工作细胞库是由有限传代水平的主细胞库制备而来的均一性细胞悬液，分装适宜体积于多个容器中，冻存备用。现有的工作细胞库制备在脐带接收时缺乏必要的病毒检测，往往只是采用医用酒精消毒，入库前缺乏必要的全检检测，增加了工作库细胞各项指标不符合质量标准的风险另外，在冻存液配制时，二甲基亚砜(DMSO)的含量较高则增大了临床使用的风险性。且冻存液对冷冻细胞复苏后的存活率和分化能力造成一定的不利影响。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种高效稳定工作细胞库的制备方法，至少包括以下步骤：
S1，人脐带采集与检测；
S2，脐带间充质干细胞原代培养；
S3，脐带间充质干细胞传代培养；
S4，脐带间充质干细胞工作细胞库收获、冻存；
S5，工作细胞库入库检测；
所述脐带间充质干细胞传代培养包括P0至P1代脐带间充质干细胞传代培养；P1至P2代人脐带间充质干细胞传代培养；P2至P3代人脐带间充质干细胞传代培养。
作为一种优选的技术方案，S1中的检测包括乙型肝炎病毒核酸定量检测、人巨细胞病毒核酸定量检测、丙型肝炎病毒核酸定量检测、EB病毒核酸定量检测、人免疫缺陷病毒抗体测定检测、梅毒快速血浆反应素试验RPR检测、梅毒螺旋体特异抗体检测、HTLV病毒检测。
作为一种优选的技术方案，S2中原代培养过程中采用组织块贴壁法培养原代细胞。
作为一种优选的技术方案，S3中传代培养过程中采用重组酶消化细胞，所述重组酶为不含动物源成分和酚红成分的重组胰蛋白酶。
作为一种优选的技术方案，S3中传代培养过程中使用的培养基为无血清培养基。
作为一种优选的技术方案，S4中冻存过程中使用的冻存液为低DMSO含量的冻存液。
作为一种优选的技术方案，所述低二甲基亚砜(DMSO)含量的冻存液，按体积百分比计，包括1～10％的DMSO，40～60％的间充质干细胞无血清基础培养基，30-60％的人血白蛋白。
作为一种优选的技术方案，S5中工作细胞库入库检测至少包括STR图谱检测、染色体核型检测、淋巴细胞增殖抑制检测、特定淋巴细胞亚群检测、淋巴细胞分泌因子检测、分化试验检测、IDO1检测检测、细胞周期检测、细胞凋亡检测、流式检测、群体倍增时间检测、CFU-F检测、无菌检测、支原体检测、细胞活率检测、细胞数检测、软琼脂克隆检测。
本发明的第二方面提供了一种人脐带间充质干细胞工作细胞库，根据上述所述的一种高效稳定工作细胞库的制备方法制备得到。
有益效果：
本发明提供了一种高效稳定工作细胞库的制备方法，脐带检测和工作细胞库入库检测了确保制备的工作库细胞各项指标符合质量标准，使用无血清培养基避免了血清培养基成分的不确定性及血清培养的不稳定性带来的风险，冷冻液降低了二甲基亚砜(DMOS)的含量，不仅降低临床使用的风险性，且能保持工作细胞库中细胞的生物活性，冷冻复苏后具有高的存活率和优选的分化能力。
附图说明
图1是实施例1制备的工作细胞库细胞冻存6个月复苏后的成骨分化图；
图2是实施例1制备的工作细胞库细胞冻存6个月复苏后的成脂分化图；
具体实施方式
结合以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可进一步地理解本发明的内容。除非另有说明，本文中使用的所有技术及科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员的通常理解相同的含义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本发明中提供的任何定义不一致，则以本发明中提供的术语定义为准。
在本文中使用的，除非上下文中明确地另有指示，否则没有限定单复数形式的特征也意在包括复数形式的特征。还应理解的是，如本文所用术语“由…制备”与“包含”同义，“包括”、“包括有”、“具有”、“包含”和/或“包含有”，当在本说明书中使用时表示所陈述的组合物、步骤、方法、制品或装置，但不排除存在或添加一个或多个其它组合物、步骤、方法、制品或装置。此外，当描述本发明的实施方式时，使用“优选的”、“优选地”、“更优选的”等是指，在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。除此之外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。
为了解决上述问题，本发明的第一方面提供了一种高效稳定工作细胞库的制备方法，至少包括以下步骤：
S1，人脐带采集与检测；
S2，脐带间充质干细胞原代培养；原代培养是指对采集的脐带组织进行的首次培养，也叫初代培养；
S3，脐带间充质干细胞传代培养；传代培养是指原代培养完成后，需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿内，再进行培养的过程。
S4，脐带间充质干细胞工作细胞库收获、冻存；
S5，工作细胞库入库检测；工作细胞库(Working Cell Bank，WCB)是由有限传代水平的主细胞库制备而来的均一性细胞悬液，分装适宜体积于多个容器中，冻存备用。本发明所述人脐带间充质干细胞工作细胞库是指P3代人脐带间充质干细胞工作细胞库。
所述脐带间充质干细胞传代培养包括P0至P1代脐带间充质干细胞传代培养；P1至P2代人脐带间充质干细胞传代培养；P2至P3代人脐带间充质干细胞传代培养。P0代脐带间充质干细胞是至原代培养结束后获得的脐带间充质干细胞，P1、P2、P3代脐带间充质干细胞分别由原代培养结束后获得的脐带间充质干细胞经过第一代培养、第二代培养、第三代培养获得的脐带间充质干细胞。
为了确保制备的工作库细胞各项指标符合质量标准，在一些优选的实施方式中，S1中的检测包括乙型肝炎病毒核酸定量检测、人巨细胞病毒核酸定量检测、丙型肝炎病毒核酸定量检测、EB病毒核酸定量检测、人免疫缺陷病毒抗体测定检测、梅毒快速血浆反应素试验RPR检测、梅毒螺旋体特异抗体检测、HTLV病毒检测。
在一些优选的实施方式中，S2中原代培养过程中采用组织块贴壁法培养原代细胞。组织块贴壁培养法是通过分离华通氏胶后剪成小块再直接贴壁培养，酶消化法主要使用一种或多种酶对华通氏胶进行消化。酶消化法培养原代细胞虽然短时间内可以获得细胞，但费用高，消化的时间不好掌握，常温消化需要的时间长，容易造成分离的间充质干细胞受到损伤导致活性不佳；而相对于酶消化法，组织块贴壁法操作简便，对实验条件要求低，易于掌握。
在一些优选的实施方式中，S3中传代培养过程中采用重组酶消化细胞，所述重组酶为不含动物源成分和酚红成分的重组胰蛋白酶。例如购自GIBCO，货号12563-029的重组胰蛋白酶。
在一些优选的实施方式中，S3中传代培养过程中使用的培养基为无血清培养基。例如购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号为CM-SC01的间充质干细胞无血清培养基。可避免含血清的培养基因批次间的质量变动，提高细胞培养和实验结果的重复性，避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染，提高产品的表达水平并使细胞产品易于纯化。
在一些优选的实施方式中，S4中冻存过程中使用的冻存液为低DMSO含量的冻存液。
在一些优选的实施方式中，所述低DMSO含量的冻存液，按体积百分比计，包括1～10％的DMSO，40～60％的间充质干细胞无血清基础培养基，30～60％的人血白蛋白。冻存液不仅DMSO含量低，且冻存的细胞可直接稀释后应用于临床，不需要离心去除冻存液的成分，冻存液可以作为辅料，直接应用于临床给药，更加方便。
在一些优选的实施方式中，人血白蛋白的百分含量为20％。
在一些优选的实施方式中，S5中工作细胞库入库检测至少包括STR图谱检测、染色体核型检测、淋巴细胞增殖抑制检测、特定淋巴细胞亚群检测、淋巴细胞分泌因子检测、分化试验检测、IDO1检测检测、细胞周期检测、细胞凋亡检测、流式检测、群体倍增时间检测、CFU-F检测、无菌检测、支原体检测、细胞活率检测、细胞数检测、软琼脂克隆检测。
本发明的第二方面提供了一种人脐带间充质干细胞工作细胞库，根据上述所述的一种高效稳定工作细胞库的制备方法制备得到。
下面通过实施例对本发明进行具体描述。有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的专业技术人员根据上述本发明的内容做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
另外，如果没有其它说明，所用原料都是市售的。
实施例
以下通过实施例对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。
实施例1
实施例1提供了一种高效稳定工作细胞库的制备方法，至少包括以下步骤：
S1，新生儿脐带通过公立医院采集并进行乙型肝炎病毒核酸定量检测、人巨细胞病毒核酸定量检测、丙型肝炎病毒核酸定量检测、EB病毒核酸定量检测、人免疫缺陷病毒抗体测定检测、梅毒快速血浆反应素试验RPR检测、梅毒螺旋体特异抗体检测、HTLV病毒检测。
S2，脐带检测合格后，剪取10cm左右脐带组织，转入氯化钠注射液的培养皿中，用止血钳将脐带中残血挤出、剪短，剥离脐带血管和外膜；然后吸取0.5ml华通氏胶组织糜浆于75cm2培养瓶中，采用组织块贴壁法进行原代培养。
S3，当原代培养有50％以上的组织块周围爬出细胞且局部融合度在80％以上，即进行传代操作；吸取培养瓶中一半的上清离心，然后吸弃多余的培养上清和组织块并用氯化钠注射液清洗；向培养瓶加入3ml重组酶(不含动物源成分和酚红成分的重组胰蛋白酶，例如购自GIBCO，货号12563-029)消化细胞，加入3ml离心的上清得到细胞悬液1；将细胞悬液1转移至离心管，并向培养瓶中加入5ml氯化钠注射液清洗得到细胞悬液2，收集清洗后的细胞悬液2加入离心管与细胞悬液1混合得到混合细胞悬液，离心弃上清，加入5ml氯化钠注射液重悬细胞沉淀，再次离心弃上清，加入3ml间充质干细胞无血清培养基(购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号为CM-SC01)重悬，混匀；将混匀的细胞重悬液接种至培养瓶，放入37.0℃，5.0％CO2培养箱中培养，获得P1传代细胞；待传代细胞的融合度达到80％以上时，按照上述方法继续P1至P2代、P2至P3代传代培养；获得P3代脐带间充质干细胞。
S4，待P3代脐带间充质干细胞融合度达到80％以上时，按照S3中制备混合细胞悬液的方法制备并收集P3代混合细胞悬液，以400g离心力离心5min，弃上清，加入冻存液重悬细胞，补加冻存液至以冻存细胞浓度为1×107个/ml；分装至4.5ml冻存管中，每管3ml，获得人脐带间充质干细胞工作细胞库。
所述冻存液，按体积百分比计，包括10％的DMSO，40％的间充质干细胞无血清基础培养基，50％的20％人血白蛋白。
S5，在S4制备P3代混合细胞悬液的同时，取P3代脐带间充质干细胞上清、细胞悬液进行STR图谱检测、染色体核型检测、淋巴细胞增殖抑制检测、特定淋巴细胞亚群检测、淋巴细胞分泌因子检测、分化试验检测、IDO1检测检测、细胞周期检测、细胞凋亡检测、流式检测、群体倍增时间检测、CFU-F检测、无菌检测、支原体检测、细胞活率检测、细胞数检测、软琼脂克隆检测；检测合格后将工作细胞库入库冻存。
实施例1还提供了一种人脐带间充质干细胞工作细胞库，根据上述所述的一种高效稳定工作细胞库的制备方法制备得到。
实施例2
实施例2提供了一种高效稳定工作细胞库的制备方法，至少包括以下步骤：
S1，新生儿脐带通过公立医院采集并进行乙型肝炎病毒核酸定量检测、人巨细胞病毒核酸定量检测、丙型肝炎病毒核酸定量检测、EB病毒核酸定量检测、人免疫缺陷病毒抗体测定检测、梅毒快速血浆反应素试验RPR检测、梅毒螺旋体特异抗体检测、HTLV病毒检测。
S2，脐带检测合格后，剪取10cm左右脐带组织，转入氯化钠注射液的培养皿中，用止血钳将脐带中残血挤出、剪短，剥离脐带血管和外膜；然后吸取0.6ml华通氏胶组织糜浆于75cm2培养瓶中，采用组织块贴壁法进行原代培养。
S3，当原代培养有50％以上的组织块周围爬出细胞且局部融合度在80％以上，即进行传代操作；吸取培养瓶中一半的上清离心，然后吸弃多余的培养上清和组织块并用氯化钠注射液清洗；向培养瓶加入4ml重组酶(不含动物源成分和酚红成分的重组胰蛋白酶，例如购自GIBCO，货号12563-029)消化细胞，加入3ml离心的上清得到细胞悬液1；将细胞悬液1转移至离心管，并向培养瓶中加入5ml氯化钠注射液清洗得到细胞悬液2，收集清洗后的细胞悬液2加入离心管与细胞悬液1混合得到混合细胞悬液，离心弃上清，加入5ml氯化钠注射液重悬细胞沉淀，再次离心弃上清，加入3ml间充质干细胞无血清培养基(购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号为CM-SC01)重悬，混匀；将混匀的细胞重悬液接种至培养瓶，放入37.0℃，5.0％CO2培养箱中培养，获得P1传代细胞；待传代细胞的融合度达到80％以上时，按照上述方法继续P1至P2代、P2至P3代传代培养；获得P3代脐带间充质干细胞。
S4，待P3代脐带间充质干细胞融合度达到80％以上时，按照S3中制备混合细胞悬液的方法制备并收集P3代混合细胞悬液，以400g离心力离心5min，弃上清，加入冻存液重悬细胞，补加冻存液至以冻存细胞浓度为1×107个/ml；分装至4.5ml冻存管中，每管3ml，获得人脐带间充质干细胞工作细胞库。
所述冻存液，按体积百分比计，包括10％的DMSO，40％的间充质干细胞无血清基础培养基，50％的20％人血白蛋白。S5，在S4制备P3代混合细胞悬液的同时，取P3代脐带间充质干细胞上清、细胞悬液进行STR图谱检测、染色体核型检测、淋巴细胞增殖抑制检测、特定淋巴细胞亚群检测、淋巴细胞分泌因子检测、分化试验检测、IDO1检测检测、细胞周期检测、细胞凋亡检测、流式检测、群体倍增时间检测、CFU-F检测、无菌检测、支原体检测、细胞活率检测、细胞数检测、软琼脂克隆检测；检测合格后将工作细胞库入库冻存。
实施例2还提供了一种人脐带间充质干细胞工作细胞库，根据上述所述的一种高效稳定工作细胞库的制备方法制备得到。
实施例3
实施例3提供了一种高效稳定工作细胞库的制备方法，至少包括以下步骤：
S1，新生儿脐带通过公立医院采集并进行乙型肝炎病毒核酸定量检测、人巨细胞病毒核酸定量检测、丙型肝炎病毒核酸定量检测、EB病毒核酸定量检测、人免疫缺陷病毒抗体测定检测、梅毒快速血浆反应素试验RPR检测、梅毒螺旋体特异抗体检测、HTLV病毒检测。
S2，脐带检测合格后，剪取10cm左右脐带组织，转入氯化钠注射液的培养皿中，用止血钳将脐带中残血挤出、剪短，剥离脐带血管和外膜；然后吸取0.5ml华通氏胶组织糜浆于75cm2培养瓶中，采用组织块贴壁法进行原代培养。
S3，当原代培养有50％以上的组织块周围爬出细胞且局部融合度在80％以上，即进行传代操作；吸取培养瓶中一半的上清离心，然后吸弃多余的培养上清和组织块并用氯化钠注射液清洗；向培养瓶加入3ml重组酶(不含动物源成分和酚红成分的重组胰蛋白酶，例如购自GIBCO，货号12563-029)消化细胞，加入3ml离心的上清得到细胞悬液1；将细胞悬液1转移至离心管，并向培养瓶中加入5ml氯化钠注射液清洗得到细胞悬液2，收集清洗后的细胞悬液2加入离心管与细胞悬液1混合得到混合细胞悬液，离心弃上清，加入5ml氯化钠注射液重悬细胞沉淀，再次离心弃上清，加入3ml间充质干细胞无血清培养基(购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号为CM-SC01)重悬，混匀；将混匀的细胞重悬液接种至培养瓶，放入37.0℃，5.0％CO2培养箱中培养，获得P1传代细胞；待传代细胞的融合度达到80％以上时，按照上述方法继续P1至P2代、P2至P3代传代培养；获得P3代脐带间充质干细胞。
S4，待P3代脐带间充质干细胞融合度达到80％以上时，按照S3中制备混合细胞悬液的方法制备并收集P3代混合细胞悬液，以400g离心力离心5min，弃上清，加入冻存液重悬细胞，补加冻存液至以冻存细胞浓度为1×107个/ml；分装至4.5ml冻存管中，每管3ml，获得人脐带间充质干细胞工作细胞库。
所述冻存液，按体积百分比计，包括10％的DMSO，30％的间充质干细胞无血清基础培养基，60％的20％人血白蛋白。S5，在S4制备P3代混合细胞悬液的同时，取P3代脐带间充质干细胞上清、细胞悬液进行STR图谱检测、染色体核型检测、淋巴细胞增殖抑制检测、特定淋巴细胞亚群检测、淋巴细胞分泌因子检测、分化试验检测、IDO1检测检测、细胞周期检测、细胞凋亡检测、流式检测、群体倍增时间检测、CFU-F检测、无菌检测、支原体检测、细胞活率检测、细胞数检测、软琼脂克隆检测；检测合格后将工作细胞库入库冻存。
实施例3还提供了一种人脐带间充质干细胞工作细胞库，根据上述所述的一种高效稳定工作细胞库的制备方法制备得到。
实施例4
实施例4提供了一种高效稳定工作细胞库的制备方法，至少包括以下步骤：
S1，新生儿脐带通过公立医院采集并进行乙型肝炎病毒核酸定量检测、人巨细胞病毒核酸定量检测、丙型肝炎病毒核酸定量检测、EB病毒核酸定量检测、人免疫缺陷病毒抗体测定检测、梅毒快速血浆反应素试验RPR检测、梅毒螺旋体特异抗体检测、HTLV病毒检测。
S2，脐带检测合格后，剪取10cm左右脐带组织，转入氯化钠注射液的培养皿中，用止血钳将脐带中残血挤出、剪短，剥离脐带血管和外膜；然后吸取0.5ml华通氏胶组织糜浆于75cm2培养瓶中，采用组织块贴壁法进行原代培养。
S3，当原代培养有50％以上的组织块周围爬出细胞且局部融合度在80％以上，即进行传代操作；吸取培养瓶中一半的上清离心，然后吸弃多余的培养上清和组织块并用氯化钠注射液清洗；向培养瓶加入3ml重组酶(不含动物源成分和酚红成分的重组胰蛋白酶，例如购自GIBCO，货号12563-029)消化细胞，加入3ml离心的上清得到细胞悬液1；将细胞悬液1转移至离心管，并向培养瓶中加入5ml氯化钠注射液清洗得到细胞悬液2，收集清洗后的细胞悬液2加入离心管与细胞悬液1混合得到混合细胞悬液，离心弃上清，加入5ml氯化钠注射液重悬细胞沉淀，再次离心弃上清，加入3ml间充质干细胞无血清培养基(购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号为CM-SC01)重悬，混匀；将混匀的细胞重悬液接种至培养瓶，放入37.0℃，5.0％CO2培养箱中培养，获得P1传代细胞；待传代细胞的融合度达到80％以上时，按照上述方法继续P1至P2代、P2至P3代传代培养；获得P3代脐带间充质干细胞。
S4，待P3代脐带间充质干细胞融合度达到80％以上时，按照S3中制备混合细胞悬液的方法制备并收集P3代混合细胞悬液，以400g离心力离心5min，弃上清，加入冻存液重悬细胞，补加冻存液至以冻存细胞浓度为1×107个/ml；分装至4.5ml冻存管中，每管3ml，获得人脐带间充质干细胞工作细胞库。
所述冻存液，按体积百分比计，包括5％的DMSO，45％的间充质干细胞无血清基础培养基，50％的20％人血白蛋白。
S5，在S4制备P3代混合细胞悬液的同时，取P3代脐带间充质干细胞上清、细胞悬液进行STR图谱检测、染色体核型检测、淋巴细胞增殖抑制检测、特定淋巴细胞亚群检测、淋巴细胞分泌因子检测、分化试验检测、IDO1检测检测、细胞周期检测、细胞凋亡检测、流式检测、群体倍增时间检测、CFU-F检测、无菌检测、支原体检测、细胞活率检测、细胞数检测、软琼脂克隆检测；检测合格后将工作细胞库入库冻存。
实施例4还提供了一种人脐带间充质干细胞工作细胞库，根据上述所述的一种高效稳定工作细胞库的制备方法制备得到。
对比例1
对比例1提供了一种高效稳定工作细胞库的制备方法，至少包括以下步骤：
S1，新生儿脐带通过公立医院采集并进行乙型肝炎病毒核酸定量检测、人巨细胞病毒核酸定量检测、丙型肝炎病毒核酸定量检测、EB病毒核酸定量检测、人免疫缺陷病毒抗体测定检测、梅毒快速血浆反应素试验RPR检测、梅毒螺旋体特异抗体检测、HTLV病毒检测。
S2，脐带检测合格后，剪取10cm左右脐带组织，转入氯化钠注射液的培养皿中，用止血钳将脐带中残血挤出、剪短，剥离脐带血管和外膜；然后吸取0.5ml华通氏胶组织糜浆于75cm2培养瓶中，采用组织块贴壁法进行原代培养。
S3，当原代培养有50％以上的组织块周围爬出细胞且局部融合度在80％以上，即进行传代操作；吸取培养瓶中一半的上清离心，然后吸弃多余的培养上清和组织块并用氯化钠注射液清洗；向培养瓶加入3ml重组酶(不含动物源成分和酚红成分的重组胰蛋白酶，例如购自GIBCO，货号12563-029)消化细胞，加入3ml离心的上清得到细胞悬液1；将细胞悬液1转移至离心管，并向培养瓶中加入5ml氯化钠注射液清洗得到细胞悬液2，收集清洗后的细胞悬液2加入离心管与细胞悬液1混合得到混合细胞悬液，离心弃上清，加入5ml氯化钠注射液重悬细胞沉淀，再次离心弃上清，加入3ml间充质干细胞无血清培养基(购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号为CM-SC01)重悬，混匀；将混匀的细胞重悬液接种至培养瓶，放入37.0℃，5.0％CO2培养箱中培养，获得P1传代细胞；待传代细胞的融合度达到80％以上时，按照上述方法继续P1至P2代、P2至P3代传代培养；获得P3代脐带间充质干细胞。
S4，待P3代脐带间充质干细胞融合度达到80％以上时，按照S3中制备混合细胞悬液的方法制备并收集P3代混合细胞悬液，以400g转速离心5min，弃上清，加入冻存液重悬细胞，补加冻存液至以冻存细胞浓度为1×107个/ml；分装至4.5ml冻存管中，每管3ml，获得人脐带间充质干细胞工作细胞库。
所述冻存液为现有技术，按体积百分比计，包括勃脉力A35％、复方氨基酸注射液25％、人血白蛋白30％、DMSO 10％。
S5，在S4制备P3代混合细胞悬液的同时，取P3代脐带间充质干细胞上清、细胞悬液进行STR图谱检测、染色体核型检测、淋巴细胞增殖抑制检测、特定淋巴细胞亚群检测、淋巴细胞分泌因子检测、分化试验检测、IDO1检测检测、细胞周期检测、细胞凋亡检测、流式检测、群体倍增时间检测、CFU-F检测、无菌检测、支原体检测、细胞活率检测、细胞数检测、软琼脂克隆检测；检测合格后将工作细胞库入库冻存。
对比例1还提供了一种人脐带间充质干细胞工作细胞库，根据上述所述的一种高效稳定工作细胞库的制备方法制备得到。
性能评价
1、细胞存活率测试
检测上述实施例和对比例工作细胞库细胞冻存6个月复苏后的细胞存活率，存活率≥90％的记为A级，存活率≥85％但＜90％的记为B级，存活率＜85％记为C级，检测结果见表1。
2、分化能力测试
检测上述实施例1-4工作细胞库细胞冻存6个月复苏后的细胞增殖能力。其中图1是实施例1制备的工作细胞库细胞冻存6个月复苏后的成骨分化图，图2是实施例1制备的工作细胞库细胞冻存6个月复苏后的成脂分化图，实施例2～41制备的工作细胞库细胞冻存6个月复苏后的成骨分化、成脂分化能力分别与图1、图2类似。
表1
Figure BDA0003067504480000111
Figure BDA0003067504480000121
通过上述实施例和对比例可以得知，本发明提供了一种高效稳定工作细胞库的制备方法，脐带检测和工作细胞库入库检测了确保制备的工作库细胞各项指标符合质量标准，使用无血清培养基避免了血清培养基成分的不确定性及血清培养的不稳定性带来的风险，冷冻液不仅降低了DMOS含量从而降低临床使用的风险性，且能保持工作细胞库中细胞的生物活性，冷冻复苏后具有高的存活率和优选的分化能力。
最后指出，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种高效稳定工作细胞库的制备方法，其特征在于：至少包括以下步骤：
S1，人脐带采集与检测；
S2，脐带间充质干细胞原代培养；
S3，脐带间充质干细胞传代培养；
S4，脐带间充质干细胞工作细胞库收获、冻存；
S5，工作细胞库入库检测；
所述脐带间充质干细胞传代培养包括P0至P1代脐带间充质干细胞传代培养；P1至P2代人脐带间充质干细胞传代培养；P2至P3代人脐带间充质干细胞传代培养。
2.根据权利要求1所述的一种高效稳定工作细胞库的制备方法，其特征在于：S1中的检测包括乙型肝炎病毒核酸定量检测、人巨细胞病毒核酸定量检测、丙型肝炎病毒核酸定量检测、EB病毒核酸定量检测、人免疫缺陷病毒抗体测定检测、梅毒快速血浆反应素试验RPR检测、梅毒螺旋体特异抗体检测、HTLV病毒检测。
3.根据权利要求1所述的一种高效稳定工作细胞库的制备方法，其特征在于：S2中原代培养过程中采用组织块贴壁法培养原代细胞。
4.根据权利要求1所述的一种高效稳定工作细胞库的制备方法，其特征在于：S3中传代培养过程中采用重组酶消化细胞，所述重组酶为不含动物源成分和酚红成分的重组胰蛋白酶。
5.根据权利要求1所述的一种高效稳定工作细胞库的制备方法，其特征在于：S3中传代培养过程中使用的培养基为无血清培养基。
6.根据权利要求1所述的一种高效稳定工作细胞库的制备方法，其特征在于：S4中冻存过程中使用的冻存液为低DMSO含量的冻存液。
7.根据权利要求1所述的一种高效稳定工作细胞库的制备方法，其特征在于：所述低DMSO含量的冻存液，按体积百分比计，包括1～10％的DMSO，40～60％的间充质干细胞无血清基础培养基，30～60％的人血白蛋白。
8.根据权利要求1所述的一种高效稳定工作细胞库的制备方法，其特征在于：S5中工作细胞库入库检测至少包括STR图谱检测、染色体核型检测、淋巴细胞增殖抑制检测、特定淋巴细胞亚群检测、淋巴细胞分泌因子检测、分化试验检测、IDO1检测检测、细胞周期检测、细胞凋亡检测、流式检测、群体倍增时间检测、CFU-F检测、无菌检测、支原体检测、细胞活率检测、细胞数检测、软琼脂克隆检测。
9.一种人脐带间充质干细胞工作细胞库，其特征在于：根据权利要求1～8任意一项所述的一种高效稳定工作细胞库的制备方法制备得到。
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