CN112280735B - 脐带来源的间充质干细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种脐带来源的间充质干细胞及其制备方法和应用，该制备方法包括以下步骤：将去除了静脉血管和动脉血管后的所有脐带组织剪碎，得到多块组织块；及将同一块组织块在含有完全培养基的不同培养容器中培养，制备间充质干细胞。上述脐带来源的间充质干细胞的制备方法可以提高带来源的间充质干细胞的产量，便于现有的手工操作转化为自动化设备。

Description

脐带来源的间充质干细胞及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及干细胞技术领域，特别是涉及一种脐带来源的间充质干细胞及其制备方法和应用。

背景技术

间充质干细胞(MSCs)是具有自我更新和分化能力的一类细胞，近年越来越多的研究证实其在多种疾病中具有治疗潜能。间充质干细胞有多种来源，例如脐带、骨髓、皮肤、外周血等组织，其中，围产期组织由于处于发育阶段早期，细胞活力更强，是理想的间充质干细胞来源。围产期组织的来源包括脐带和胎盘，人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)细胞纯度高，增殖和分泌活性强，免疫风险低，无需配型，是未来临床应用的理想种子细胞。

脐带的结构主要包括外层的羊膜、中间的三根血管(一根静脉血管和两根动脉血管)及其间的华通胶(Wharton's jelly)。脐带来源的间充质干细胞根据其分离部位的来源不同可细分为来源于华通胶的脐带间充质干细胞和来源于羊膜的羊膜间充质干细胞，这两种间充质干细胞都符合间充质干细胞的国际鉴定标准，即2006年国际细胞治疗协会颁布的贴壁生长、表达特异的细胞表面标记分子和成骨、成脂和成软骨的三向分化能力。

在基础研究逐步确认间充质干细胞具有治疗功效的研究背景下，如何高效制备间充质干细胞产品，并且符合临床相关的标准，尽可能的方便规模化、标准化是间充质干细胞临床应用和产业化的关键。然而，按照传统方法制备的脐带来源的间充质干细胞的量比较少。

发明内容

基于此，有必要提供一种脐带来源的间充质干细胞的制备方法，以提高脐带来源的间充质干细胞的产量。

一种脐带来源的间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：

将去除了静脉血管和动脉血管后的所有脐带组织剪碎，得到多块组织块；及

将同一块组织块在含有完全培养基的不同培养容器中培养，制备间充质干细胞。

上述脐带来源的间充质干细胞的制备方法以除静脉血管和动脉血管外的其他脐带组织为原料，采用组织块贴壁法制备间充质干细胞，并通过将同一组织块在含有完全培养基的不同培养容器中培养，还实现同一组织块的多次重复利用，大大提高了脐带的利用率，进而提高了脐带来源的间充质干细胞的产量。并且，经过验证，按照上述脐带来源的间充质干细胞的制备方法制得的间充质干细胞符合MSCs的国际鉴定标准。

在其中一个实施例中，所述将同一块组织块在含有完全培养基的不同培养容器中培养的步骤包括：待组织块边缘有细胞爬出后，将所述组织块移入新的完全培养基中培养；进一步地，所述待组织块边缘有细胞爬出后将所述组织块移入新的完全培养基中培养的操作重复四次。

在其中一个实施例中，在将所述组织块移入新的完全培养基后，还包括以下步骤：

将移除了组织块的培养容器中的培养上清去除，然后向去除了培养上清的培养容器中加入完全培养基；当培养容器中的细胞的细胞融合度达到80％～90％时，进行传代培养。

在其中一个实施例中，所述传代培养的步骤包括：

将培养容器中的培养上清去除后，清洗所述培养容器中的细胞；

用胰酶的质量体积百分含量为0.05％～0.25％的胰酶溶液消化清洗后的细胞1分钟～3分钟，然后加入消化所用胰酶溶液的体积的2倍～5倍的完全培养基终止消化；及

收集消化后的细胞，并将所述消化后的细胞接种于新的完全培养基中培养。

在其中一个实施例中，在将同一块组织块在含有完全培养基的不同培养容器中培养的步骤之前，还包括去除所述组织块的表面上的液体的步骤。

在其中一个实施例中，所述去除所述组织块的表面上的液体的步骤包括以下操作：

将所述组织块置于培养箱中静置0.5小时～1小时。

在其中一个实施例中，所述完全培养基中含有血清，所述完全培养基中血清的体积百分含量为10％～15％；

及/或，所述完全培养基中还含有抗生素，所述抗生素选自青霉素、链霉素、两性霉素、制霉菌素、庆大霉素、四环素及红霉素中的至少一种；

及/或，所述组织块为2立方毫米～5立方毫米的组织块。

一种间充质干细胞，由上述的脐带来源的间充质干细胞的制备方法制得。

上述的间充质干细胞在制备用于治疗关节炎或自身免疫性疾病的药物中的应用。

一种药物，包括活性成分及药学上可以接受的辅料，所述活性成分包括上述的间充质干细胞。

附图说明

图1为实施例1中去除静脉血管和动脉血管后的脐带；

图2为实施例1中组织块培养7天后从组织块中爬出的细胞；

图3～图4为实施例1中由第一培养皿中的细胞传代而得到第三代间充质干细胞的流式结果；

图5～图6为实施例1中由第四培养皿中的细胞传代而得到第三代间充质干细胞的流式结果；

图7为实施例1中由间充质干细胞诱导分化的成骨细胞；

图8为实施例1中由间充质干细胞诱导分化的脂肪细胞；

图9为实施例1中由间充质干细胞诱导分化的软骨细胞；

图10为对比例1的间充质干细胞的流式结果；

图11为对比例2的间充质干细胞的流式结果。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。此外，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

本发明一实施方式提供了一种脐带来源的间充质干细胞的制备方法，该制备方法包括步骤a～步骤d，具体地：

步骤a：清洗脐带。

具体地，用生理盐水或磷酸缓冲液(PBS)清洗脐带，以冲洗掉残留在脐带上的血液及/或其他组织。当然，在一些实施例中，也可以先挤出脐血或用无菌纱布擦拭脐带，然后用生理盐水或磷酸缓冲液清洗脐带。

步骤b：去除脐带中的静脉血管和动脉血管。

具体地，脐带中静脉血管为一根，动脉血管为两根。去除脐带中的静脉血管和动脉血管的操作包括：运用止血钳和眼科剪去除脐带中的静脉血管和动脉血管。当然，在其他一些实施例中，去除脐带中的动脉血管和静脉血管的方式不限于上述，还可以是其他方式，例如，运用机械手将脐带中的静脉血管和动脉血管去除。

步骤c：将去除了静脉血管和动脉血管的所有脐带组织剪碎，得到多块组织块。

具体地，将去除了静脉血管和动脉血管的所有脐带组织剪成2立方毫米～5立方毫米的组织块。采用2立方毫米～5立方毫米的组织块利于细胞爬出。在一个可选地具体示例中，组织块为2立方毫米、2.5立方毫米、3立方毫米、4立方毫米或5立方毫米。进一步地，组织块为2立方毫米～4立方毫米的组织块。

步骤c的操作简单，且避免了分离羊膜或华通胶的操作，减少操作的同时也使得脐带的利用率提高，进而提高间充质干细胞的产量。

步骤d：在完全培养基中培养组织块，制备间充质干细胞。

具体地，完全培养基含有血清或血清替代物。血清和血清替代物促进细胞贴壁生长，利于细胞从组织块中爬出并贴壁生长。在一个可选的具体示例中，血清为胎牛血清。在另一个可选地具体示例中，血清替代物为市售的血清替代物。血清替代物的成分明确，利于大规模生产及临床应用，安全性高。

进一步地，完全培养基中血清的体积百分含量为10％～15％。在一个可选地具体示例中，完全培养基中血清的体积百分含量为10％、11％、12％、12.5％、13％、13.5％、14％或15％。当然，完全培养基包括用于满足细胞生长所需的基本营养物质的基础培养基。在其中一个实施例中，基础培养基选自DMEM/F12培养基、α-MEM和低糖DMEM中的一种。

在其中一个实施例中，完全培养基中还含有抗生素。具体地，抗生素选自青霉素、链霉素、两性霉素、制霉菌素、庆大霉素、四环素及红霉素中的至少一种。

具体地，在完全培养基中培养组织块的步骤包括：去除组织块的表面上的液体；然后将去除了表面上的液体的组织块置于完全培养基中培养。其中，去除组织块的表面上的液体的步骤是为了促进组织贴壁。

更具体地，将组织块的表面上的液体去除的步骤包括以下操作：将组织块置于培养箱中静置0.5小时～1小时。在一个可选地具体示例中，将组织块的表面上的液体去除的步骤包括以下操作：将组织块置于干燥的培养容器中，然后将装有组织块的培养容器置于培养箱中静置0.5小时～1小时，使得组织块表面的液体挥发。当然，在一些实施例中，还可以采用擦拭组织块表面的操作，以去除组织块表面的液体。

具体地，将去除了表面上的液体的同一组织块置于含有完全培养基的不同培养容器中培养。更具体地，将去除了表面上的液体的同一组织块置于含有完全培养基的不同培养容器中培养的步骤包括：将去除了表面上的液体的组织块置于含有完全培养基的不同培养容器中培养，和培养移除了该组织块的培养容器中的细胞。具体地，培养移除了组织块的培养容器中的细胞的操作包括：更换培养基及传代培养。

在一个可选地具体示例中，将去除了表面上的液体的同一组织块置于含有完全培养基的不同培养容器中培养的步骤包括：将去除了表面上的液体的组织块置于含有完全培养基的培养容器中培养，其中，组织块浸没在完全培养基中；当培养容器中的组织块的边缘有细胞爬出后，将组织块从培养容器中移入到含有完全培养基的新的培养容器中培养；同时，更换移除了组织块的培养容器中的培养基，然后继续培养移出了组织块的培养容器中的细胞，其中，更换培养基的操作包括：将移除了组织块的培养容器中的培养上清去除，然后向培养上清已经去除的培养容器中加入完全培养基；当培养容器中细胞的细胞融合度达到80％～90％时，进行传代培养。当然，在继续培养的过程中也包括更换培养基的操作。进一步地，继续培养过程中的更换培养基的操作的频率为3天/次～4天/次。当然，从上述组织块中爬出的细胞就为脐带来源的间充质干细胞。

进一步地，传代培养的步骤包括：将培养容器中的培养上清去除后，清洗培养容器中的细胞；用胰酶含量为0.5g/L～2.5g/L的胰酶溶液(也即是胰酶的质量体积浓度为0.05％～0.25％的胰酶溶液)消化培养容器中的细胞；及收集消化后的细胞，并将消化后的细胞接种于新的完全培养基中培养。在一个可选地具体示例中，采用磷酸缓冲液清洗培养容器中的细胞。当然，在其他一些实施例中，清洗培养容器中的细胞的溶液不限于上述，还可以是其他溶液。

具体地，在传代培养过程中，首次以1:2的比例进行传代，后续每3天按照1:3或1:4的比例进行传代。

具体地，用胰酶溶液消化培养容器中的细胞的操作包括：将胰酶溶液加入到清洗后的培养容器中消化1分钟～3分钟，然后加入消化所用胰酶溶液的体积的2倍～5倍的完全培养基终止消化。当然，在消化过程中，还可以振动或敲击培养容器的底部，使得贴壁的细胞更容易从培养容器的底部脱落。可以理解的是，在一些实施例中，还可以吸取培养容器中的胰酶溶液反复轻轻吹打培养容器的底部，以使得贴壁的细胞脱落。上述操作利用较低浓度的胰酶对间充质干细胞进行传代，降低了细胞损伤程度，有利于高效制备间充质干细胞。

在其中一个实施例中，消化培养容器中的细胞所用的胰酶溶液中胰酶的浓度为0.5g/L～2.5g/L，消化培养容器中的细胞的时间为1分钟～3分钟。在一个可选地具体示例中，消化用的胰酶溶液中胰酶的浓度为0.0005g/mL(0.05％，w/v)，消化的时间为1分钟。当然，在其他实施例中，消化的时间不限于上述，还可以根据胰酶的浓度和被消化的细胞的状态调整消化的时间。

更具体地，将去除了表面上的液体的同一块组织块在含有完全培养基的不同培养容器中培养的步骤包括：在第一培养容器中的组织块的边缘有细胞爬出后，将第一培养容器中的组织块转移到含有完全培养基的第二培养容器中继续培养。该操作将经过培养的组织块移入另一个培养容器中继续培养，提高了同一组织块的利用率，使得同一组织产出更多的原代细胞，利于收获大量的低代数的细胞，满足临床应用所需。此外，多批原代细胞同时生长，培养进程上有重合，有利于未来产业化生产中降低成本，缩短培养时间，提高生产效率，利于大规模生产。进一步地，在第一培养容器中的组织块的边缘有密集的细胞爬出，且整个第一培养容器中的细胞的融合度达到75％～85％后，将第一培养容器中的组织块转移到含有完全培养基的第二培养容器中继续培养。在一个可选地具体实施例中，在第一培养容器中的组织块的边缘有密集的细胞爬出，且整个第一培养容器中的细胞的融合度达到75％、80％、82％、83％或85％后，将第一培养容器中的组织块转移到含有完全培养基的第二培养容器中继续培养。

可以理解的是，在培养容器中的组织块的边缘有细胞爬出后，将组织块转移到含有完全培养基的其他培养容器中继续培养的操作可以重复多次。在其中一个实施例中，在组织块的边缘有细胞爬出后，将组织块转移到含有完全培养基的其他培养容器中继续培养的操作重复2次～4次。在一个可选地具体示例中，上述操作重复4次。也即是，在第一培养容器中的组织块的边缘有细胞爬出后，将第一培养容器中的组织块转移到含有完全培养基的第二培养容器中继续培养；在第二培养容器中的组织块的边缘有细胞爬出后，将第二培养容器中的组织块转移到含有完全培养基的第三培养容器中继续培养；在第三培养容器中的组织块的边缘有细胞爬出后，将第三培养容器中的组织块转移到含有完全培养基的第四培养容器中继续培养；在第四培养容器中的组织块的边缘有细胞爬出后，将第四培养容器中的组织块转移到含有完全培养基的第五培养容器中继续培养。当然，同时也培养各个组织块移除后的培养容器中的细胞。

需要说明的是，本文中的第一培养容器、第二培养容器、第三培养容器、第四培养容器和第五培养容器的材质没有特别限制，只要能够用于培养间充质干细胞即可。例如，可以是培养皿(例如10cm～15cm的培养皿)或培养板，也可以培养瓶。

当然，在将从组织块中爬出的细胞进行传代培养后，还包括鉴定所培养的细胞是否符合间充质干细胞的国际标准的步骤。具体地，对所培养的细胞的贴壁能力、细胞表面标记物和分化功能进行鉴定，以判断该细胞是否符合间充质干细胞的国际标准。

上述脐带来源的间充质干细胞的制备方法，以除静脉血管和动脉血管外的其他脐带组织为原料，采用组织块贴壁法制备间充质干细胞，简化分离步骤，便于现有手工操作转化为自动化设备，且大大提高了脐带的利用率，使得有限样本高效利用，进而也大大提高了间充质干细胞的产量。重要的是，本研究意外发现，在组织块的大小相同的情况下，由去除静脉血管和动脉血管后的所有脐带组织培养得到的细胞量，高于只采用华通胶或只采用羊膜培养得到的细胞量。并且，经过验证，按照上述脐带来源的间充质干细胞的制备方法制得的间充质干细胞符合间充质干细胞的国际鉴定标准。此外，上述脐带来源的间充质干细胞的制备方法中，还将同一组织块进行多次培养，使得组织块的利用率提高，收获的细胞量成倍增加，多批次的原代细胞同时生长，培养进程上有重合，利于规模化生产。

再者，在传统的酶消化法中，虽然原代细胞从组织块爬出的时间较短，但化学消化对细胞有一定的损伤，特别是消化时间过长时消化酶对细胞损伤大，容易导致大量原代细胞死亡，而消化时间过短，无法得到足够数量的原代细胞，也即是说，传统酶消化法中消化时间不容易控制。另外消化酶，例如胰酶通常是异种来源，在临床应用的安全性方面存在引入异种病毒的风险。而上述脐带来源的间充质干细胞的制备方法采用的是组织块贴壁法制备间充质干细胞，操作简捷且减少了胰酶带来的安全性风险。

本发明一实施方式还提供了一种脐带来源的间充质干细胞，该间充质干细胞由上述的脐带来源的间充质干细胞的制备方法制得。

本发明一实施方式还提供了上述间充质干细胞在制备用于治疗关节炎或自身免疫性疾病的药物中的应用。

本发明一实施方式还提供了一种药物，该药物包括活性成分及药学上可以接受的辅料，活性成分包括上述间充质干细胞。

具体实施例

以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用药物和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。

实施例1

1.脐带收集：收集足月健康剖宫产胎儿脐带，浸没于含1％(m/v)的青霉素和1％(m/v)链霉素的PBS中，置于冰上。

2.组织分离：在超净台中将脐带剪裁为长约3cm的小段，分别纵向剖开，用无菌PBS反复冲洗至液体无血污，用止血钳和眼科去除一根静脉血管和两根动脉血管(共三根)，得到去除动脉血管和静脉血管的脐带，去除动脉血管和静脉血管的脐带如图1所示。

3.贴壁组织块制备：将步骤2得到去除动脉血管和静脉血管的脐带剪切成小于2mm³小块，以PBS冲洗后沥干，并在培养箱中放置30分钟，然后加入含15％(v/v)胎牛血清的DMEM/F12培养基；接着在37℃5％CO₂培养箱中培养。

4.倒置相差显微镜下观察步骤3中的组织块周围细胞爬出情况，7天后的爬出情况如图2所示。将组织块培养7天后首次换液(即将第一培养皿中的培养上清去除后，加入含15％(v/v)胎牛血清的DMEM/F12培养基)，以后每隔3～4天换一次培养液，当细胞扩增面积占培养皿底面积的80％～90％时，用0.05％(m/v)的胰酶-EDTA消化传代，其中首次以1:2的比例进行传代，后续每3天按照1:3或1:4的比例进行传代。在首次换液的同时还将原培养皿(即第一培养皿)的组织块转移至含有完全培养基的新的培养皿(即第二培养皿)中培养，当组织块在第二培养皿中爬出细胞后，参照之前的操作将其转移至含有完全培养基的第三培养皿中培养，同时继续培养第二培养皿中的细胞，以此类推重复利用组织块。经统计，在将组织块培养17天后计数发现，每3cm长的脐带组织所产生的细胞总量能够达到3.12×10⁷个。

本文中，将从组织块中爬出且未进行传代的细胞记为零代间充质干细胞(P0)，将零代间充质干细胞传代培养而得到的间充质干细胞记为第一代间充质干细胞(P1)，将第一代间充质干细胞传代培养而得到的间充质干细胞记为第二代间充质干细胞(P2)，其他以此类推。

5.表型鉴定：

(1)用由第一培养皿中的细胞进行传代而得到第三代间充质干细胞进行表型鉴定。具体地，取1×10⁶个细胞，加100μL的细胞染色缓冲液。然后根据抗体说明书加入相应体积的抗体[小鼠抗人PE、APC或FITC标志的单抗CD105、CD44、CD90、CD29、CD34、CD45和人类白细胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)-DR]，室温孵育30min，1000r/min离心5min，弃上清，加入500μL PBS上流式细胞仪进行检测。结果如表1和图3～图4所示。图3为CD73、CD90和CD105的结果，图4为CD34、CD45、CD14和HLA-DR的结果。

表1

由表1和图3～图4可知，由第一培养皿中的细胞进行传代而得到第三代间充质干细胞的表面表达CD105、CD73、CD90的阳性率依次分别为99.98％、99.98％、99.94％(均大于95％)，第三代间充质干细胞的表面均不表达CD45、CD34、CD14和HLA-DR。经与对比国际标准对比(国际标准中规定，间充质干细胞的细胞表面表达CD105、CD73和CD90(≥95％)，不表达CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α或CD19、HLA-DR(≤2％))，上述实验结果高于国际标准。

(2)用由第四培养皿中的细胞进行传代而得到第三代间充质干细胞进行表型鉴定，具体操作参照表型鉴定部分的步骤(1)。结果如表2和图5～图6所示。

表2

序号	表面蛋白	阳性率
			1	CD73	100％
2	CD90	100％
			3	CD105	100％
4	CD34	0.10％
			5	CD45	0.16％
6	CD14	0.38％
			7	HLA-DR	0.03％

由表2和图5～图6可知，同一组织块经过3次转移培养之后得到的间充质干细胞仍然符合间充质干细胞的国际标准。

6.诱导分化

(1)成骨分化：采用成骨培养液(10％FBS的DMEM/F12与β-甘油磷酸钠、维生素C和地塞米松混合而成，成骨培养液含有10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、0.05mmol/L维生素C和100mmol/L地塞米松)将第四代的间充质干细胞培养21天后，茜素红染色观察，结果如图7所示。

(2)成脂分化：用成脂培养液(由10％FBS的DMEM/F12与地塞米松、异丁基-甲基黄嘌呤、吲哚美辛和胰岛素混合而成，成脂培养液中含1×10^-3mol/L地塞米松、100mg/L异丁基-甲基黄嘌呤、100mg/L吲哚美辛和10mg/L胰岛素)将第四代的间充质干细胞培养21天后，用4％多聚甲醛固定细胞，进行油红O染色，结果如图8所示。

(3)软骨向分化：用成软骨培养液(由DMEM/F12与地塞米松、转移生长因子β1、抗坏血酸、LITS、丙酮酸钠、亚油酸和牛血清白蛋白混合而成，成软骨培养液含1×10^-8mol/L地塞米松、20μg/L转移生长因子β1、10mmol/L抗坏血酸、50mg/mL ITS、1mM丙酮酸钠、5.35μg/mg亚油酸和1.25ng/mL牛血清白蛋白)将第四代的间充质干细胞培养21天后，用10％甲醛固定细胞1h，进行1％甲苯胺蓝染色3h，加入95％乙醇，烘干后中性树胶封片，结果如图9所示。

由图7～图9可知，实施例1制得的间充质干细胞具有良好的分化潜能。

对比例1

对比例1制备间充质干细胞的步骤大致与实施例1相同，其不同在于，对比例1的组织分离步骤中，对比例1将脐带的动脉血管和静脉血管的去除的同时，还去除其他非华通胶的部分，仅保留华通胶。

在将对比例1的组织块培养17天后计数发现，每3cm长的脐带组织产生的细胞总量为1.01×10⁷个，少于实施例1的细胞总量。

对比例1的由第一培养皿中的细胞进行传代而得到第三代间充质干细胞进行流式细胞仪鉴定，结果如图10所示。

对比例2

对比例2制备间充质干细胞的步骤大致与实施例1相同，其不同在于，对比例2的组织分离步骤中，对比例2将脐带的动脉血管和静脉血管的去除的同时，还去除其他非羊膜的部分，仅保留羊膜。

在将对比例1的组织块培养17天后计数发现，每3cm长的脐带组织产生的细胞总量为0.68×10⁷个，少于实施例1的细胞总量。

对比例2的由第一培养皿中的细胞进行传代而得到第三代间充质干细胞进行流式细胞仪鉴定，结果如图11所示。

由实施例1、对比例1和对比例2可知，单位长度的去除静脉血管和动脉血管后的所有脐带组织培养得到的细胞量，高于单位长度的华通胶或单位长度的羊膜培养得到的细胞量。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种脐带来源的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将去除了静脉血管和动脉血管后的所有脐带组织剪碎，得到多块组织块；及

将同一块组织块在含有完全培养基的不同培养容器中培养，制备间充质干细胞，所述完全培养基中的基础培养基为DMEM/F12培养基。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述将同一块组织块在含有完全培养基的不同培养容器中培养的步骤包括：待组织块边缘有细胞爬出后，将所述组织块移入新的完全培养基中培养；进一步地，所述待组织块边缘有细胞爬出后将所述组织块移入新的完全培养基中培养的操作重复四次。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在将所述组织块移入新的完全培养基后，还包括以下步骤：

将移除了组织块的培养容器中的培养上清去除，然后向去除了培养上清的培养容器中加入完全培养基；当培养容器中的细胞的细胞融合度达到80％～90％时，进行传代培养。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述传代培养的步骤包括：

将培养容器中的培养上清去除后，清洗所述培养容器中的细胞；

用胰酶的质量体积百分含量为0.05％～0.25％的胰酶溶液消化清洗后的细胞1分钟～3分钟，然后加入消化所用胰酶溶液的体积的2倍～5倍的完全培养基终止消化；及

收集消化后的细胞，并将所述消化后的细胞接种于新的完全培养基中培养。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在将同一块组织块在含有完全培养基的不同培养容器中培养的步骤之前，还包括去除所述组织块的表面上的液体的步骤。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述去除所述组织块的表面上的液体的步骤包括以下操作：

将所述组织块置于培养箱中静置0.5小时～1小时。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述完全培养基中含有血清，所述完全培养基中血清的体积百分含量为10％～15％；

及/或，所述完全培养基中还含有抗生素，所述抗生素选自青霉素、链霉素、两性霉素、制霉菌素、庆大霉素、四环素及红霉素中的至少一种；

及/或，所述组织块为2立方毫米～5立方毫米的组织块。

8.一种间充质干细胞，其特征在于，由权利要求1～7任一项所述的脐带来源的间充质干细胞的制备方法制得。

9.权利要求8所述的间充质干细胞在制备用于治疗关节炎或自身免疫性疾病的药物中的应用。

10.一种药物，其特征在于，包括活性成分及药学上可以接受的辅料，所述活性成分包括权利要求8所述的间充质干细胞。

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