CN112544611B - 细胞冻存剂及细胞的冻存方法 - Google Patents

细胞冻存剂及细胞的冻存方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种细胞冻存剂及细胞的冻存方法。该细胞冻存剂不含血清，包括稳定剂、二甲基亚砜、小分子化合物和基础培养基，稳定剂的质量、二甲基亚砜的体积、小分子化合物的体积和基础培养基的体积之比为(0.5mg～21mg)：100μL：(1μg～10μg)：(700μL～890μL)，稳定剂选自甲基纤维素、羟甲基纤维素和羧甲基纤维素中的至少一种，小分子化合物选自毛喉素、槲皮素、奥替普拉和二甲双胍中的至少一种。上述细胞冻存剂的安全性高且使用上述细胞冻存剂的细胞的存活率高、复苏率高。

Description

细胞冻存剂及细胞的冻存方法
技术领域
本发明涉及细胞冻存技术领域，特别是涉及一种细胞冻存剂及细胞的冻存方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，它能够发育成硬骨、软骨、脂肪等不同类型的细胞，已为细胞治疗的重要候选种子细胞。在临床上细胞移植的供体和受体往往存在不同时性，很难保证即离即用。因此，间充质干细胞的冻存尤为重要。
一般地，间充质干细胞冻存主要是采用冻存剂对间充质干细胞进行保护，以减少冷冻过程中间充质干细胞的损伤。目前，间充质干细胞的冻存剂主要是包含二甲基亚砜的完全培养基，但由于完全培养基中的血清一般为动物来源的胎牛血清，临床应用时的安全风险较高。近期虽然出现了用人来源的血制品替代胎牛血清的冻存剂，但该冻存剂仍要面临供体病毒污染和免疫原性等问题，安全性还有待进一步提高。
发明内容
基于此，有必要提供一种能够提高冻存细胞的安全性的细胞冻存剂。
此外，还有必要提供一种细胞的冻存方法，经该方法冻存的细胞在临床使用时安全性高。
一种细胞冻存剂，所述细胞冻存剂不含血清，所述细胞冻存剂包括稳定剂、二甲基亚砜、小分子化合物和基础培养基，所述稳定剂的质量与所述二甲基亚砜的体积和所述小分子化合物的质量以及所述基础培养基的体积之比为(0.5mg～21mg)：100μL：(1μg～10μg)：(700μL～890μL)，所述稳定剂选自甲基纤维素、羟甲基纤维素和羧甲基纤维素中的至少一种，所述小分子化合物选自毛喉素、槲皮素、奥替普拉和二甲双胍中的至少一种。
上述细胞冻存剂不含血清，可以避免由动物血清带来的临床风险，安全性高，并且上述细胞冻存剂中的稳定剂和二甲基亚砜相互配合，可减少细胞冻存和复苏过程中细胞内冰晶形成，降低冷冻损伤，使复苏后的细胞保持正常的细胞形态和较高的细胞活力，此外，毛喉素、槲皮素、奥替普拉和二甲双胍等小分子化合物的引入会使得上述细胞冻存剂的冻存效果有显著提升。
在其中一个实施例中，所述稳定剂的质量与所述二甲基亚砜的体积和所述小分子化合物的质量以及所述基础培养基的体积之比为(0.5mg～21mg)：100μL：(1μg～10μg)：(800μL～890μL)。
在其中一个实施例中，在所述小分子化合物中，毛喉素、槲皮素、奥替普拉和二甲双胍的质量之比为(1～20)：(0.1～2)：(0.1～4)：(0.1～10)。
在其中一个实施例中，所述细胞冻存剂中包括小分子化合物，所述稳定剂与所述小分子化合物的质量之比为1：(0.0001～0.01)。
在其中一个实施例中，所述细胞冻存剂还包括聚乙烯吡咯烷酮、糖、多元醇和氨基酸中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述细胞冻存剂包括聚乙烯吡咯烷酮，所述稳定剂与所述聚乙烯吡咯烷酮的质量之比为1：(4～6)。
在其中一个实施例中，所述细胞冻存剂还包括糖，所述稳定剂与所述糖的质量之比为1：(5～15)；
在其中一个实施例中，所述糖选自葡萄糖、麦芽糖、木糖、海藻糖及蔗糖中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述细胞冻存剂中还包括多元醇，所述稳定剂的质量与所述多元醇的体积之比为1mg：(200μL～500μL)；
可选地，所述多元醇选自丙二醇及丙三醇中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述细胞冻存剂中还包括氨基酸，所述稳定剂与所述氨基酸的质量之比为1：(5～15)；
在其中一个实施例中，所述氨基酸选自脯氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸及色氨酸中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述细胞冻存剂中还包括大豆低聚肽，所述大豆低聚肽的平均分子量小于500Da；
在其中一个实施例中，所述稳定剂与所述大豆低聚肽的质量之比为1：(0.0005～0.01)。
在其中一个实施例中，所述基础培养基选自DMEM/F12培养基、MEM培养基及RPIM1640培养基中的一种。
一种细胞的冻存方法，包括以下步骤：
将细胞与上述的细胞冻存剂混合后，程序降温。
在其中一个实施例中，所述细胞为间充质干细胞。
附图说明
图1为实施例1中冷冻一周的脐带间充质干细胞复苏后的生长情况图；
图2为实施例2中冷冻一周的脐带间充质干细胞复苏后的生长情况图；
图3为对比例1中冷冻一周的脐带间充质干细胞复苏后的生长情况图；
图4为实施例1、2和对比例1、2冻存的脐带间充质干细胞复苏后的生长曲线图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本发明一实施方式提供了一种细胞冻存剂，该细胞冻存剂不含血清，细胞冻存剂包括稳定剂、二甲基亚砜(DMSO)、小分子化合物和基础培养基，稳定剂的质量与二甲基亚砜的体积和基础培养基的体积之比为(0.5mg～21mg)：100μL：(1μg～10μg)：(700μL～890μL)，稳定剂选自甲基纤维素、羟甲基纤维素和羧甲基纤维素中的至少一种。
具体地，DMSO作为渗透性细胞膜内保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，改变细胞膜的通透性。在本实施方式中，DMSO为临床级二甲基亚砜。临床级二甲基亚砜作为临床应用所认可的二甲基亚砜，安全性高。
具体地，稳定剂用于减少细胞冻存和附属过程中渗透压变化引起的损伤。在一个可选地具体示例中，稳定剂为甲基纤维素。甲基纤维素广泛应用于各种口服和局部用制剂中，允许药用注射，也被广泛应用于化妆品和食品中。通常被认为无毒、无致敏、无刺激性。甲基纤维素的水溶液非常稳定，利于长期储存，使用方便。在上述细胞冻存剂中，甲基纤维素与DMSO搭配，可减少细胞冻存和复苏过程中细胞内冰晶形成，对细胞膜具有保护作用，降低冷冻损伤和渗透压变化带来的损伤，使复苏后的细胞保持正常的细胞形态和较高的细胞活力。在另一个可选地具体示例中，稳定剂为甲基纤维素和羟甲基纤维素的混合物、甲基纤维素和羧甲基纤维素的混合物或羟甲基纤维素和羧甲基纤维素的混合物。
具体地，小分子化合物是具有抗衰作用的小分子制剂。这些抗衰小分子可以延缓细胞的衰老进程。在冻存过程中，小分子化合物可以降低细胞机能的损伤，减少细胞在冻存时的死亡和形态变化。小分子化合物选自毛喉素(Forskolin)、槲皮素(Quercetin)、奥替普拉(Oltipraz)及二甲双胍(Meformin)中的至少一种。进一步地，小分子化合物与稳定剂的质量之比为(0.0001～0.01)：1。
可选地，小分子化合物为毛喉素和槲皮素的混合物；或，小分子化合物为毛喉素和奥替普拉的混合物；或，小分子化合物为毛喉素和二甲双胍的混合物；或，小分子化合物为槲皮素和奥替普拉的混合物；或，小分子化合物为槲皮素和二甲双胍的混合物；或，小分子化合物为奥替普拉和二甲双胍的混合物；小分子化合物为毛喉素、槲皮素和奥替普拉的混合物；或，小分子化合物为槲皮素、奥替普拉和二甲双胍的混合物；或，小分子化合物为毛喉素、槲皮素、奥替普拉和二甲双胍的混合物。在一个可选地具体示例中，小分子化合物为毛喉素、槲皮素、奥替普拉和二甲双胍的混合物，在小分子化合物中，毛喉素、槲皮素、奥替普拉和二甲双胍的质量之比为(1～20)：(0.1～2)：(0.1～4)：(0.1～10)。进一步地，毛喉素、槲皮素、奥替普拉和二甲双胍的质量之比为(1～10)：(0.1～1)：(0.1～1)：(0.1～1)。
具体地，基础培养基是含有细胞生长所需的基本营养物质的培养基。进一步地，基础培养基为无血清培养基。在无血清培养基中含有促进细胞贴壁和生长的因子。在一个可选地具体示例中，无血清培养基中包括促贴壁物质(例如纤连蛋白或层粘连蛋白)、促生长因子及激素(例如不同的生长因子，胰岛素)、酶抑制剂(例如大豆胰酶)、结合蛋白和转运蛋白(例如转铁蛋白，牛血清白蛋白)、和微量元素(例如硒)。可选地，基础培养基选自DMEM/F12培养基、MEM培养基及RPIM1640培养基中的一种。进一步地，无血清培养基中不含血清白蛋白。
可选地，稳定剂的质量与二甲基亚砜的体积和小分子化合物的质量以及基础培养基的体积之比为(1mg、3mg、5mg、8mg、10mg、12mg、15mg、18mg或20mg)：100μL：(1μg、2μg、8μg、10μg)：(700μL、750μL、800μL、850μL或890μL)。进一步地，稳定剂的质量与二甲基亚砜的体积和小分子化合物的质量以及基础培养基的体积之比为(1mg～15mg)：100μL：(1μg～10μg)：(750μL～890μL)。进一步地，稳定剂的质量与二甲基亚砜的体积和小分子化合物的质量以及基础培养基的体积之比为(1mg～10mg)：100μL：(1μg～10μg)：(800μL～890μL)。
在一个可选地具体示例中，上述细胞冻存剂不含血清，由稳定剂、二甲基亚砜、小分子化合物、基础培养基和溶剂组成，稳定剂的质量与二甲基亚砜的体积和基础培养基的体积之比为(0.5mg～21mg)：100μL：(1μg～10μg)：(700μL～890μL)，稳定剂选自甲基纤维素、羟甲基纤维素和羧甲基纤维素中的至少一种，溶剂选自水、PBS及DPBS中的一种。溶剂用于溶解稳定剂。
在一个可选地具体示例中，上述细胞冻存剂不含血清，由稳定剂、二甲基亚砜、小分子化合物、无血清基础培养基和溶剂组成，稳定剂的质量与二甲基亚砜的体积和小分子化合物的质量以及基础培养基的体积之比为(1mg～10mg)：100μL：(1μg～10μg)：(800μL～890μL)，稳定剂选自甲基纤维素、羟甲基纤维素和羧甲基纤维素中的至少一种，溶剂选自水、PBS及DPBS中的一种。进一步地，上述细胞冻存剂不含血清和氨基酸，由稳定剂、二甲基亚砜、无血清基础培养基和溶剂组成。由于氨基酸在溶液中的稳定性较差，必须冻存，因此不含氨基酸利于上述细胞冻存剂长期储存。
在一些实施例中，细胞冻存剂中还包括聚乙烯吡咯烷酮、糖、多元醇和氨基酸中的至少一种。聚乙烯吡咯烷酮用于降低溶液中自由水的含量，减少冰晶的形成；糖用于稳定蛋白质和细胞膜；多元醇用于抑制冰晶的生长；氨基酸用于降低细胞内外未结冰溶液中的电解质浓度。可选地，糖选自葡萄糖、麦芽糖、木糖、海藻糖及蔗糖中的至少一种；多元醇选自丙二醇及丙三醇中的至少一种，氨基酸选自脯氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸及色氨酸中的至少一种。当然，在其他实施例中，糖、多元醇及氨基酸均不限于上述，还可以是其他能用于细胞培养的糖、多元醇或氨基酸。
可选地，稳定剂与聚乙烯吡咯烷酮的质量之比为1：(4～6)。进一步地，稳定剂与聚乙烯吡咯烷酮的质量之比为1：(4～5)。可选地，稳定剂与糖的质量之比为1：(1.5～15)；进一步地，稳定剂与糖的质量之比为1：(10～15)。可选地，稳定剂的质量与多元醇的体积之比为1mg：(200μL～500μL)。进一步地，稳定剂的质量与多元醇的体积之比为1mg：(200μL～400μL)。可选地，稳定剂与氨基酸的质量之比为1：(1.5～15)。进一步地，稳定剂与氨基酸的质量之比为1：(10～15)。
在其中一个实施例中，上述细胞冻存剂不含血清，包括稳定剂、二甲基亚砜、基础培养基、聚乙烯吡咯烷酮、糖、多元醇和氨基酸。
在一些实施例中，上述细胞冻存剂还包括大豆低聚肽，大豆低聚肽用于促进细胞代谢，提高细胞内酶的活性。具体地，大豆低聚肽的平均分子量小于500Da。可选地，大豆低聚肽的平均分子量为20Da～500Da。进一步地，稳定剂与大豆低聚肽的质量之比为1：(0.0005～0.01)。更进一步地，稳定剂与大豆低聚肽的质量之比为1：(0.001～0.01)。
在其中一个实施例中，上述细胞冻存剂不含血清，包括稳定剂、二甲基亚砜、基础培养基、聚乙烯吡咯烷酮、糖、多元醇、氨基酸和大豆低聚肽。
上述细胞冻存剂至少具有如下优点：一方面，上述细胞冻存剂不含血清，可以避免由血清所带来的临床风险。在一些实施例中，上述细胞冻存剂还不含血清白蛋白，能进一步地降低细胞冻存剂的临床风险，安全性高。另一方面，上述细胞冻存剂中的稳定剂和二甲基亚砜相互配合，可减少细胞冻存和复苏过程中细胞内冰晶形成，降低冷冻损伤，使复苏后的细胞保持正常的细胞形态和较高的细胞活力。此外，毛喉素、槲皮素、奥替普拉和二甲双胍等小分子化合物的引入会使得上述细胞冻存剂的冻存效果有显著提升。
本发明一实施方式还提供了一种细胞的冻存方法，该细胞的冻存方法包括以下步骤：将细胞与上述任一实施例的细胞冻存剂混合后，程序降温。
具体地，将细胞与上述任一实施例的细胞冻存剂混合，制备细胞悬浮液；然后，将细胞悬浮液以程序降温的方式进行冻存。可选地，在细胞悬浮液中，细胞的密度为5×105个/mL～10×105个/mL。可选地，细胞为间充质干细胞。在一个可选地具体示例中，间充质干细胞为羊膜间充质干细胞(AMSC)及华通氏胶间充质干细胞(UMSC)中的至少一种。更具体地，在间充质干细胞的细胞融合度达到80％～90％时，用胰蛋白酶消化并洗涤后，将细胞沉淀与上述任一实施例的细胞冻存液混合，制得细胞悬浮液。细胞融合度是指细胞在贴壁并完全舒展以后所占的面积与培养皿的底面积的百分比。例如，细胞融合度为80％是细胞在贴壁并且完全舒展以后所占的面积是培养皿底面积的80％。
在其中一个实施例中，间充质干细胞的制备方法包括以下步骤：将脐带剪裁为长约3cm的小段，纵向剖开，用PBS反复冲洗去除血液。然后去除一根静脉血管和两根动脉血管，得到去除动脉血管和静脉血管后的所有脐带组织；然后分离羊膜，剩余部分为华通氏胶。接着分别将分离得到的羊膜和华通氏胶用剪成2mm3的组织块，并置于培养皿中，加入含10％(v/v)胎牛血清的DMEM/F12培养基，在37℃5％CO2培养箱中培养。接着，培养5天～7天后有细胞爬出，首次换液，然后每隔4天换一次，制备脐带间充质干细胞。
上述细胞的冻存方法简便，且由于使用了上述细胞冻存剂，采用上述细胞的冻存方法冻存和复苏的细胞的存活率高、复苏率高、回收率高，且复苏后的细胞在临床应用时安全性高。
具体实施例
以下结合具体实施例进行详细说明。实施例中采用药物和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。需要说明的是，实施例1～6及对比例4～7中的小分子混合物均是指毛喉素、槲皮素、奥替普拉和二甲双胍的混合物，且毛喉素、槲皮素、奥替普拉和二甲双胍的质量之比为5：1：1：1。
以下实施例所用的脐带间充质干细胞的制备方法如下：
(1)原代获得：收集足月健康剖宫产胎儿脐带(直径为1.6厘米)，采用含有1％(m/v)的青霉素和1％(m/v)链霉素的PBS冲洗数次。在PBS中将脐带剪裁为长约3cm的小段，纵向剖开，PBS冲洗去除血迹。用止血钳和眼科去除一根静脉血管和两根动脉血管，然后分离出华通氏胶。将华通氏胶用剪刀剪成2mm3的组织块，并置于15cm培养皿中，加入5mL含10％(v/v)胎牛血清的DMEM/F12培养基，在37℃5％CO2培养箱中培养。培养5～7天后有细胞爬出，首次换液，以后每隔4天换一次，培养14天左右。
(2)消化：当培养的细胞扩增到占培养皿底面积80％时，加入2mL 0.25％(m/v)胰蛋白酶，在37℃5％CO2培养箱中培养2min，加入含10％(v/v)胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，转移至15mL离心管中，250g离心4min，弃去上清，加入1mL含10％(v/v)胎牛血清的DMEM/F12培养基制备细胞悬液，并吸取10μL细胞悬液与10μL台盼蓝混匀，稀释2倍计数。
(3)传代：以1：3比例进行传代，此后每隔3天～4天传代一次，获得足量的脐带间充质干细胞。
实施例1
(1)实施例1的细胞冻存剂由0.1％(m/v)的甲基纤维素、10％(v/v)的临床级二甲基亚砜、0.0008％(m/v)的小分子混合物和89％(v/v)的DMEM/F12培养基和PBS组成；即每1mL的实施例1的细胞冻存剂中含有10μL的10％(m/v)的甲基纤维素溶液、100μL临床级二甲基亚砜、8μg的小分子混合物和890μL的DMEM/F12培养基；甲基纤维素的质量与临床级二甲基亚砜的体积和小分子混合物的质量以及DMEM/F12培养基的体积之比为1mg：100μL：8μg：890μL。
实施例1的细胞冻存剂的制备方法包括以下步骤：
1)制备10％(m/v)的甲基纤维素溶液：将1/3体积的PBS加热至80℃，将甲基纤维素加入加热的溶液中充分搅拌，至颗粒分散均匀。然后，将剩余PBS加入到搅拌好的溶液中，4℃冷藏40min，继续搅拌30min后，0.22μm过滤器过滤，制得10％(m/v)的甲基纤维素溶液。在10％(m/v)的甲基纤维素溶液中，甲基纤维素的浓度为0.1g/mL。
2)将5μg毛喉素、1μg槲皮素、1μg奥替普拉、1μg二甲双胍、10μL的10％(m/v)的甲基纤维素溶液、890μL的DMEM/F12培养基和100μL的临床级二甲基亚砜混合均匀后，0.45μm的过滤器过滤，制备实施例1的细胞冻存剂。
(2)冻存：将脐带间充质干细胞制成细胞浓度为1×106个/mL的细胞悬浮液，250g离心4min，弃上清后加入1mL步骤(1)制得的细胞冻存液混匀。然后转移至冻存管中，放置于程序降温仪中程序降温，-80℃过夜，转移至液氮中保存。
(3)复苏：冷冻一周之后，将步骤(2)冻存的装有脐带间充质干细胞的冻存管置于37℃的水浴锅中解冻。在15mL离心管中加入9mL含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM/F12培养基，并将解冻的细胞液转移至上述离心管中，轻轻混匀，然后250g离心4min，弃上清后加入1mL含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬，混匀后吸取10μL细胞悬液与10μL台盼蓝混匀，稀释2倍计数，计算活细胞、死细胞数以及复苏的总细胞数(复苏的活细胞与死细胞的总和)，并且培养观察细胞的形态，计算细胞活率、复苏率和细胞回收率。其中，细胞活率＝台盼蓝染色的活细胞数/复苏的总细胞数×100％；复苏率＝台盼蓝染色的活细胞数/冻存的细胞数×100％；细胞回收率＝复苏的总细胞数/冻存的细胞数×100％。
采用实施例1的细胞冻存剂进行细胞冻存的细胞活率、复苏率和细胞回收率如表1所示；经实施例1的细胞冻存剂冷冻一周后的脐带间充质干细胞在复苏后的生长情况如图1所示，复苏后的脐带间充质干细胞的生长曲线如图4所示。在图4中“0.1％MC”代表采用实施例1的细胞冻存剂冻存后复苏的生长曲线，由图4可知，复苏后细胞能够正常生长。
实施例2
实施例2的细胞冻存剂由1％(m/v)的甲基纤维素、10％(v/v)的临床级二甲基亚砜、0.0008％(m/v)的小分子混合物和80％(v/v)的DMEM/F12培养基(不含血清)和PBS组成。即每1mL的实施例2的细胞冻存剂中含有100μL的10％(m/v)的甲基纤维素溶液、100μL的临床级二甲基亚砜、8μg小分子混合物和800μL的DMEM/F12培养基；甲基纤维素的质量与临床级二甲基亚砜的体积和小分子混合物的质量以及DMEM/F12培养基的体积之比为10mg：100μL：8μg：800μL。
实施例2的细胞冻存剂的制备方法与实施例1的细胞冻存剂的制备方法大致相同，其不同在于，实施例2的细胞冻存剂所使用的10％(m/v)的甲基纤维素溶液的体积为100μL，实施例2的细胞冻存剂所使用的DMEM/F12培养基的体积为800μL。
采用实施例2的细胞冻存剂进行细胞冻存的细胞活率、复苏率和细胞回收率如表1所示；经实施例2的细胞冻存剂冷冻一周后的脐带间充质干细胞在复苏后的生长情况如图2所示，复苏后的脐带间充质干细胞的生长曲线如图4所示。在图4中“1％MC”代表采用实施例2的细胞冻存剂冻存后复苏的生长曲线，由图4可知，复苏后细胞能够正常生长。
实施例3
实施例3的细胞冻存剂由0.1％(m/v)甲基纤维素、10％(v/v)临床级二甲基亚砜、0.0008％(m/v)的小分子混合物、89％(v/v)DMEM/F12培养基(不含血清)、1％(m/v)脯氨酸、0.5％(m/v)L-谷氨酰胺、1.5％(m/v)葡萄糖、0.001％(m/v)大豆低聚肽(分子量为200Da～500Da)和PBS组成。即每1mL的实施例3的细胞冻存剂中含有10μL的10％(m/v)的甲基纤维素溶液、100μL临床级二甲基亚砜、8μg小分子混合物、0.01g的脯氨酸、0.005g的L-谷氨酰胺、0.015g的葡萄糖、0.00001g大豆低聚肽和890μL的DMEM/F12培养基；甲基纤维素的质量与二甲基亚砜的体积和小分子混合物的质量以及DMEM/F12培养基的体积之比为1mg：100μL：8μg：890μL。
实施例3的细胞冻存剂的制备方法与实施例1的细胞冻存剂的制备方法包括以下步骤：
用PBS和甲基纤维素制备10％(m/v)的甲基纤维素溶液；和将5μg毛喉素、1μg槲皮素、1μg奥替普拉、1μg二甲双胍、10μL的10％(m/v)的甲基纤维素溶液、100μL临床级二甲基亚砜、0.01g的脯氨酸、0.005g的L-谷氨酰胺、0.015g的葡萄糖、0.00001g大豆低聚肽和890μL DMEM/F12培养基混合均匀，0.45μm的过滤器过滤，制备实施例3的细胞冻存剂。
采用实施例3的细胞冻存剂进行细胞冻存的细胞活率、复苏率和细胞回收率如表1所示。
实施例4
实施例4的细胞冻存剂由0.5％(m/v)的甲基纤维素、10％(v/v)的临床级二甲基亚砜、0.0008％(m/v)的小分子混合物和85％(v/v)的DMEM/F12培养基(不含血清)和PBS组成。即每1mL实施例4的细胞冻存剂中含有50μL的10％(m/v)的甲基纤维素溶液、100μL的临床级二甲基亚砜、8μg的小分子混合物和850μL的DMEM/F12培养基；甲基纤维素的质量与二甲基亚砜的体积和小分子混合物的质量以及DMEM/F12培养基的体积之比为5mg：100μL：8μg：850μL。
实施例4的细胞冻存剂的制备方法与实施例1的细胞冻存剂的制备方法大致相同，其不同在于，实施例4的细胞冻存剂所使用的10％(m/v)的甲基纤维素溶液的体积为50μL，实施例4的细胞冻存剂所使用的DMEM/F12培养基的体积为850μL。
采用实施例4的细胞冻存剂进行细胞冻存的细胞活率、复苏率和细胞回收率如表1所示。
实施例5
实施例5的细胞冻存剂的组成与实施例1大致相同，其不同在于，实施例5将0.1％(m/v)的甲基纤维素替换为0.1％(m/v)的羧甲基纤维素。即实施例5的细胞冻存剂由0.1％(m/v)的羧甲基纤维素、10％(v/v)的临床级二甲基亚砜、0.0008％(m/v)的小分子混合物和89％(v/v)的DMEM/F12培养基和PBS组成。
采用实施例5的细胞冻存剂进行细胞冻存的细胞活率、复苏率和细胞回收率如表1所示。
实施例6
实施例6的细胞冻存剂的组成与实施例1大致相同，其不同在于，实施例6将0.1％(m/v)的甲基纤维素替换为0.1％(m/v)的羟甲基纤维素。即实施例6的细胞冻存剂由0.1％(m/v)的羟甲基纤维素、10％(v/v)的临床级二甲基亚砜、0.0008％(m/v)的小分子混合物和89％(v/v)的DMEM/F12培养基和PBS组成。
采用实施例6的细胞冻存剂进行细胞冻存的细胞活率、复苏率和细胞回收率如表1所示。
实施例7
实施例7的细胞冻存剂的组成与实施例1大致相同，其不同在于，实施例7的用毛喉素替代小分子混合物，且毛喉素的浓度也为0.0008％(m/v)。即实施例7的细胞冻存剂由0.1％(m/v)的甲基纤维素、10％(v/v)的临床级二甲基亚砜、0.0008％(m/v)的毛喉素和89％(v/v)的DMEM/F12培养基和PBS组成。
采用实施例7的细胞冻存剂进行细胞冻存的细胞活率、复苏率和细胞回收率如表1所示。
实施例8
实施例8的细胞冻存剂的组成与实施例1大致相同，其不同在于，实施例8的用槲皮素替代小分子混合物，且槲皮素的浓度也为0.0008％(m/v)。即实施例8的细胞冻存剂由0.1％(m/v)的甲基纤维素、10％(v/v)的临床级二甲基亚砜、0.0008％(m/v)的槲皮素和89％(v/v)的DMEM/F12培养基和PBS组成。
采用实施例8的细胞冻存剂进行细胞冻存的细胞活率、复苏率和细胞回收率如表1所示。
实施例9
实施例9的细胞冻存剂的组成与实施例1大致相同，其不同在于，实施例9的用奥替普拉替代小分子混合物，且奥替普拉的浓度也为0.0008％(m/v)。即实施例9的细胞冻存剂由0.1％(m/v)的甲基纤维素、10％(v/v)的临床级二甲基亚砜、0.0008％(m/v)的奥替普拉和89％(v/v)的DMEM/F12培养基和PBS组成。
采用实施例9的细胞冻存剂进行细胞冻存的细胞活率、复苏率和细胞回收率如表1所示。
实施例10
实施例10的细胞冻存剂的组成与实施例1大致相同，其不同在于，实施例10的用二甲双胍替代小分子混合物，且二甲双胍的浓度也为0.0008％(m/v)。即实施例10的细胞冻存剂由0.1％(m/v)的甲基纤维素、10％(v/v)的临床级二甲基亚砜、0.0008％(m/v)的二甲双胍和89％(v/v)的DMEM/F12培养基和PBS组成。
采用实施例10的细胞冻存剂进行细胞冻存的细胞活率、复苏率和细胞回收率如表1所示。
实施例11
实施例11的细胞冻存剂由0.05％(m/v)的甲基纤维素、10％(v/v)的临床级二甲基亚砜、0.0008％(m/v)的小分子混合物和89.5％(v/v)的DMEM/F12培养基(不含血清)和PBS组成。即每1mL实施例12的细胞冻存剂中含有5μL的10％(m/v)的甲基纤维素溶液、8μg小分子混合物、100μL的临床级二甲基亚砜和895μL的DMEM/F12培养基；甲基纤维素的质量与二甲基亚砜的体积和小分子混合物的质量以及DMEM/F12培养基的体积之比为0.5mg：100μL：8μg：895μL。
实施例11的细胞冻存剂的制备方法与实施例1的细胞冻存剂的制备方法大致相同，其不同在于，实施例11的细胞冻存剂所使用的10％(m/v)的甲基纤维素溶液的体积为5μL，实施例11的细胞冻存剂所使用的DMEM/F12培养基的体积为895μL。
采用实施例11的细胞冻存剂进行细胞冻存的细胞活率、复苏率和细胞回收率如表1所示。
实施例12
实施例12的细胞冻存剂由2.1％(m/v)的甲基纤维素、10％(v/v)的临床级二甲基亚砜、0.0008％(m/v)的小分子混合物和69％(v/v)的DMEM/F12培养基(不含血清)和PBS组成。即每1mL实施例12的细胞冻存剂中含有210μL的10％(m/v)的甲基纤维素溶液、8μg小分子混合物、100μL的临床级二甲基亚砜和690μL的DMEM/F12培养基；甲基纤维素的质量与二甲基亚砜的体积和小分子混合物的质量以及DMEM/F12培养基的体积之比为21mg：100μL：8μg：690μL。
实施例12的细胞冻存剂的制备方法与实施例1的细胞冻存剂的制备方法大致相同，其不同在于，实施例12的细胞冻存剂所使用的10％(m/v)的甲基纤维素溶液的体积为210μL，实施例12的细胞冻存剂所使用的DMEM/F12培养基的体积为690μL。
采用实施例12的细胞冻存剂进行细胞冻存的细胞活率、复苏率和细胞回收率如表1所示。
对比例1
对比例1的细胞冻存剂10％(v/v)的临床级二甲基亚砜和90％(v/v)的DMEM/F12培养基(不含血清)。
采用对比例1的细胞冻存剂进行细胞冻存的细胞活率、复苏率和细胞回收率如表1所示；经对比例1的细胞冻存剂冷冻一周后的脐带间充质干细胞在复苏后的生长情况如图3所示，复苏后的脐带间充质干细胞的生长曲线如图4所示。在图4中“0％MC”代表采用对比例1的细胞冻存剂冻存后复苏的生长曲线，由图4可知，复苏后细胞能够正常生长。
对比例2
对比例2的细胞冻存剂由10％(v/v)的临床级二甲基亚砜、70％(v/v)的DMEM/F12培养基和20％(v/v)的胎牛血清(FBS)。
采用对比例2的细胞冻存剂进行细胞冻存的细胞活率、复苏率和细胞回收率如表1所示，复苏后的脐带间充质干细胞的生长曲线如图4所示。在图4中“20％FBS”代表采用对比例2的细胞冻存剂冻存后复苏的生长曲线，由图4可知，复苏后细胞能够正常生长。
对比例3
对比例3的细胞冻存剂由0.1％(m/v)甲基纤维素、10％(v/v)临床级二甲基亚砜、1％(m/v)脯氨酸、0.5％(m/v)L-谷氨酰胺、1.5％(m/v)葡萄糖和磷酸盐缓冲液(PBS)组成。即每1mL对比例3的细胞冻存液中含有10μL的10％(m/v)的甲基纤维素溶液(由PBS和甲基纤维素混合而成)、100μL临床级二甲基亚砜、0.01g的脯氨酸、0.005g的L-谷氨酰胺、0.015g的葡萄糖和890μL的DPBS；甲基纤维素的质量与临床级二甲基亚砜的体积之比为1mg：100μL。
对比例3的细胞冻存剂的制备方法包括以下步骤：
用PBS和甲基纤维素混合制备10％(m/v)的甲基纤维素溶液；和将10μL的10％(m/v)的甲基纤维素溶液、100μL临床级二甲基亚砜、0.01g的脯氨酸、0.005g的L-谷氨酰胺、0.015g的葡萄糖和890μL的DPBS混合，制备对比例3的细胞冻存剂。
采用对比例3的细胞冻存剂进行细胞冻存的细胞活率、复苏率和细胞回收率如表1所示。
对比例4
对比例4的细胞冻存剂的组成与实施例1大致相同，其不同在于，对比例4将0.1％(m/v)的甲基纤维素替换为0.1％(m/v)的蔗糖。即对比例4的细胞冻存剂由0.1％(m/v)的蔗糖、0.0008％(m/v)的小分子混合物、10％(v/v)的临床级二甲基亚砜和89％(v/v)的DMEM/F12培养基和PBS组成。
采用对比例4的细胞冻存剂进行细胞冻存的细胞活率、复苏率和细胞回收率如表1所示。
对比例5
对比例5的细胞冻存剂的组成与实施例1大致相同，其不同在于，对比例5将0.1％(m/v)的甲基纤维素替换为0.1％(m/v)的可溶性淀粉。即对比例5的细胞冻存剂由0.1％(m/v)的可溶性淀粉、0.0008％(m/v)的小分子混合物、10％(v/v)的临床级二甲基亚砜和89％(v/v)的DMEM/F12培养基和PBS组成。
采用对比例5的细胞冻存剂进行细胞冻存的细胞活率、复苏率和细胞回收率如表1所示。
表1
组别 细胞活率 复苏率 回收率
实施例1 88.62％ 81.75％ 92.25％
实施例2 85.28％ 76.75％ 90％
实施例3 88.95％ 82.1％ 92.3％
实施例4 86.8％ 78.21％ 91.2％
实施例5 85.48％ 74.5％ 87.15％
实施例6 85.04％ 76.11％ 89.5％
实施例7 77.7％ 70.32％ 90.5％
实施例8 76.6％ 67.8％ 88.51％
实施例9 79％ 70％ 88.6％
实施例10 76.2％ 67.5％ 88.58％
实施例11 71.79％ 58.3％ 80.75％
实施例12 72.81％ 54.9％ 75.4％
对比例1 64.58％ 38.75％ 60％
对比例2 86.9％ 80.1％ 92.17％
对比例3 70％ 60.5％ 86.43％
对比例4 54.68％ 38％ 65％
对比例5 50.14％ 44％ 87.75％
由表1可知，采用实施例1～实施例10的细胞冻存剂进行人脐带充间质干细胞冷冻保存时，细胞活率和细胞回收率均可达85％以上，表明该细胞冻存剂可以有效的冷冻人脐带间充质干细胞。
由实施例1、实施例2和实施例4可知，在细胞冻存剂中，甲基纤维素的质量体积百分含量在0.1％～1％时，甲基纤维素的含量越少，细胞活率、复苏率及回收率越高。
由实施例1和实施例3可知，在细胞冻存剂中添加氨基酸、糖及大豆低聚肽有利于提高细胞活率、复苏率和回收率，由实施例1、实施例3和对比例3可知，在无小分子化合物时，添加氨基酸、糖及大豆低聚肽的提升效果有限。
由实施例1及实施例7～实施例10可知，为提高细胞活率、复苏率及回收率，在细胞冻存剂中添加毛喉素、槲皮素、奥替普拉和二甲双胍混合物比单独采用小分子化合物毛喉素、槲皮素、奥替普拉或二甲双胍时的效果好。
由实施例1、对比例4和对比例5可知，在细胞冻存剂中，稳定剂的含量对细胞活率、复苏率和回收率有比较明显的影响。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (13)

1.一种细胞冻存剂，用于冻存间充质干细胞，其特征在于，所述细胞冻存剂不含血清，所述细胞冻存剂包括稳定剂、二甲基亚砜、小分子化合物和基础培养基，所述稳定剂的质量与所述二甲基亚砜的体积和所述小分子化合物的质量以及所述基础培养基的体积之比为(0.5mg～21mg)：100μL：(1μg～10μg)：(700μL～890μL)，所述稳定剂选自甲基纤维素、羟甲基纤维素和羧甲基纤维素中的至少一种，所述小分子化合物为毛喉素、槲皮素、奥替普拉和二甲双胍的混合物，在所述小分子化合物中，毛喉素、槲皮素、奥替普拉和二甲双胍的质量之比为(1～20)：(0.1～2)：(0.1～4)：(0.1～10)。
2.根据权利要求1所述的细胞冻存剂，其特征在于，所述稳定剂的质量与所述二甲基亚砜的体积和所述基础培养基的体积之比为(0.5mg～21mg)：100μL：(800μL～890μL)。
3.根据权利要求1所述的细胞冻存剂，其特征在于，在所述小分子化合物中，毛喉素、槲皮素、奥替普拉和二甲双胍的质量之比为(1～10)：(0.1～1)：(0.1～1)：(0.1～1)。
4.根据权利要求1所述的细胞冻存剂，其特征在于，所述稳定剂与所述小分子化合物的质量之比为1：(0.0001～0.01)。
5.根据权利要求1所述的细胞冻存剂，其特征在于，所述细胞冻存剂还包括聚乙烯吡咯烷酮、糖、多元醇和氨基酸中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的细胞冻存剂，其特征在于，所述稳定剂与所述聚乙烯吡咯烷酮的质量之比为1：(4～6)。
7.根据权利要求5所述的细胞冻存剂，其特征在于，所述糖选自葡萄糖、麦芽糖、木糖、海藻糖及蔗糖中的至少一种，所述稳定剂与所述糖的质量之比为1：(1.5～15)。
8.根据权利要求5所述的细胞冻存剂，其特征在于，所述多元醇选自丙二醇及丙三醇中的至少一种；所述稳定剂的质量与所述多元醇的体积之比为1mg：(200μL～500μL)。
9.根据权利要求5所述的细胞冻存剂，其特征在于，所述氨基酸选自脯氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸及色氨酸中的至少一种，所述稳定剂与所述氨基酸的质量之比为1：(1.5～15)。
10.根据权利要求1～9任一项所述的细胞冻存剂，其特征在于，所述细胞冻存剂中还包括大豆低聚肽，所述大豆低聚肽的平均分子量小于500Da。
11.根据权利要求10所述的细胞冻存剂，其特征在于，所述稳定剂与所述大豆低聚肽的质量之比为1：(0.0005～0.01)。
12.根据权利要求1～9及11任一项所述的细胞冻存剂，其特征在于，所述基础培养基选自DMEM/F12培养基、MEM培养基及RPIM1640培养基中的一种。
13.一种间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：
将间充质干细胞与权利要求1～11任一项所述的细胞冻存剂混合后，程序降温。
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