CN108812641B - 人胎盘绒毛组织的制备冻存方法和应用 - Google Patents

人胎盘绒毛组织的制备冻存方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人胎盘绒毛组织的制备冻存方法，包括：(1)将胎盘洗净；沿胎盘边缘剪下已脱落的蜕膜，除去羊膜；(2)将上述已去除羊膜的胎盘胎儿面绒毛膜及大血管一起分离，剩余的胎盘组织即为胎盘绒毛组织，将胎盘绒毛组织剪成小块，再切成薄片；将薄片放入冻存袋或冻存管中，以三步法导入玻璃化冻存液，转入程序降温仪，降温至‑80℃～‑90℃，转移至液氮冷冻保存。本发明的冷冻保存方法有利于提高冻存组织和细胞的活性，复苏后形态、功能、结构与新鲜组织一致，组织内细胞总体存活率达90％以上，所保存的组织不但可以用于分离干细胞，上皮细胞等领域，还可以用于组织工程移植等领域。

Description

人胎盘绒毛组织的制备冻存方法和应用
技术领域
本发明涉及一种人胎盘绒毛组织的制备冻存方法和应用，尤其涉及人胎盘绒毛组织的冷冻保存方法及复苏方法。
背景技术
胎盘是胎儿与母体之间物质交换的重要器官，是人类妊娠期间由胚胎胚膜和母体子宫内膜联合长成的母子间组织结合器官。近年来随着科学研究的深入，人们可以从胎盘中分类出包括造血干细胞、间充质干细胞、上皮细胞等多种类型的细胞，从而改变了胎盘长期以来作为医疗废弃物的状况。
现代科学研究提示，胎盘羊膜即可以用于扩增羊膜来源的间充质干细胞，也可以用在眼科手术中。胎盘绒毛膜即可以分离出间充质干细胞，也可以分离出造血干细胞。胎盘中的绒毛结构其实是毛细血管组织，从中可以分类出内皮干细胞、上皮干细胞等。胎盘蜕膜是胎盘附着于母体的结构，研究也获得了类似间充质干细胞的蜕膜干细胞。而在羊膜和绒毛膜、绒毛膜与蜕膜之间有富含间充质干细胞的间质组织。目前对胎盘的利用是粗放的，往往只取胎盘很小一部分组织来分离出胎盘的一种或者几种干细胞进行储存，其余部分的胎盘仍然作为医疗废物处理，形成了浪费。并且，随着科学研究的深入，胎盘具有造血器官等功能，可以合成大量的激素及因子，除造血干细胞外尚含有其它的滋养支持细胞。
值得注意的是，现有技术中从胎盘组织中提取干细胞保存的方法，是仅限于现有技术手段和细胞质量标准的条件下进行的，未必符合未来技术进步后的技术和细胞质量标准要求。因此，研发一种方法，将胎盘各组成部分的组织冷冻保存，几十年甚至长期保存其活性，待未来需要时，按照未来的技术条件和细胞质量标准复苏组织，再次分离等得到更加符合未来要求的细胞或干细胞，以满足临床研究和应用，显得十分重要。
中国发明专利CN201210288706(授权公告号CN 102763642 B)，公开了一种冷冻保护液以及冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的方法。该方法保存的羊膜与绒毛膜大小仅为1cm2左右，不能将羊膜呈完整组织的大面积冷冻保存，并且冻存的方式较简单单一，冻存的组织细胞存活率较低，仅能用于扩增后制备干细胞，保存的膜组织本身活细胞较少，且胎盘中丰富的血管组织未得到保存。而研究表明，冻存组织的形式能更好的保存细胞的活性在于冻存保护剂中有害的成分不能进入富含细胞的膜结构的间隙。因此，如果冻存的组织体积太小，会使得细胞较多的暴露在冻存保护剂的毒性成分中，细胞活性将受到影响，失去了冻存组织保护细胞的作用。另外，研究表明，不同的组织、甚至不同的细胞应适用特有的冰冻方式才能有好的冻存效果，胎盘的各类组织应分别、独立采用不同的冰冻方式，才能得到较好的冻存。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种人胎盘绒毛组织的制备冻存方法和应用，具体涉及人胎盘绒毛组织的冷冻保存方法及复苏方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种人胎盘绒毛组织的制备冻存方法，包括以下步骤：
(1)将胎盘洗净(以去除污物和微生物污染)；沿胎盘边缘剪下已脱落的蜕膜，除去羊膜。
所述胎盘，通过以下方式采集得到：选取无传染病、无产科并发症的健康胎盘，经产妇同意并签署知情同意书；正常采集或者采用专利申请号为CN 2017106869531(公开号107320332A)的专利申请中所描述的胎盘采集方法，将采集到的胎盘48小时内运送至实验室，并进行各种必要的检测，如病毒等传染病检测，细菌污染检测等。
(2)将上述已去除羊膜的胎盘胎儿面绒毛膜及大血管一起分离，剩余的胎盘组织即为胎盘绒毛组织，将胎盘绒毛组织剪成5cm3的小块(剪之前尽可能去除与母体相连的部分)，用手术刀将小块切成薄片，厚度0.5cm～2cm，面积3cm2～10cm2；
将上述薄片放入冻存袋或冻存管中，以三步法导入玻璃化冻存液，转入程序降温仪，按照设定的降温程序降温至-80℃～-90℃，转移至液氮冷冻保存；所述降温程序为：在4℃保持2～5min；再以1℃/min速率降低至0℃，保持5～10min；之后在5～10min内降温至-10℃；40～60min内降温至-40℃，之后再以40℃～60℃/min的速率迅速降温至-80℃～-90℃，降低至目的温度后迅速转移至液氮中。
所述玻璃化冻存液，由质量浓度为20％的人血白蛋白溶液、二甲基亚砜、丙二醇、羟乙基脲和海藻糖组成，其中，各组分所占比例为：二甲基亚砜15～22wt％，丙二醇10～18wt％，羟乙基脲10～16wt％，海藻糖8～15wt％，余量为人血白蛋白溶液。
所述三步法导入玻璃化冻存液的具体方式为：
第一步，导入海藻糖、50％的二甲基亚砜及部分人血白蛋白溶液，于4℃平衡10min；
第二步，导入羟乙基脲、剩余的50％的二甲基亚砜及部分人血白蛋白溶液，于4℃平衡5min,
第三步，导入丙二醇及部分人血白蛋白溶液，立即放入程序降温仪；
三次导入的液体的体积比为3:1:1，用20％的人血白蛋白溶液调整至合适浓度，全部导入后，玻璃化冻存液中各组分的浓度达到上述终浓度要求。
上述羊膜、蜕膜、绒毛膜下大血管、绒毛膜以及绒毛组织按照先后顺序依次从胎盘中剥离、处理成合适大小，再装入冻存管或冻存袋等特定容器中，保存容器上编有组织名称特异的编号，样本冰冻至特定温度后再放入液氮容器特定位置长期储存，容器上的特异性编号用于复苏时查找样本。
进行上述冷冻保存后，可在有需要时进行复苏，包括以下步骤：
将冷冻保存的胎盘绒毛组织从液氮中取出，放置气相10min平衡后迅速将冻存袋或冻存管置于37℃～42℃水浴锅中，或者采用专利申请号为2017107960072(公开号107365700A)的专利申请中公开的装置进行复苏；溶解后迅速将冻存袋或冻存管转移至安全柜或超净台中，打开冻存袋或冻存管，用镊子轻轻取出胎盘绒毛组织，放入4℃的三倍基准浓度复苏液(事先预冷至4℃)中，平衡1分钟，取出，再放入4℃的二倍基准浓度复苏液(事先预冷至4℃)中，平衡1～3分钟，取出，再放入4℃的一倍基准浓度复苏液(事先预冷至4℃)中，平衡3分钟；用4℃的生理盐水或PBS溶液(事先预冷至4℃)冲洗2～5遍，放入4℃的生理盐水或PBS溶液(事先预冷至4℃)中，静置，备用；
所述复苏液，由海藻糖、右旋糖酐40、丙氨酸、甘氨酸及羟乙基淀粉氯化钠注射液组成，使用时由羟乙基淀粉氯化钠注射液或MEM培养基作为溶剂调整浓度；
一倍基准浓度复苏液中各组分的浓度为：海藻糖占5wt％，右旋糖酐40占6wt％，丙氨酸占3wt％，甘氨酸占3wt％，余量为羟乙基淀粉氯化钠注射液或MEM培养基；
二倍基准浓度复苏液中各组分的浓度为：海藻糖占10wt％，右旋糖酐40占12wt％，丙氨酸占6wt％，甘氨酸占6wt％，余量为羟乙基淀粉氯化钠注射液或MEM培养基；
三倍基准浓度复苏液中各组分的浓度为：海藻糖占15wt％，右旋糖酐40占18wt％，丙氨酸占9wt％，甘氨酸占9wt％，余量为羟乙基淀粉氯化钠注射液或MEM培养基。
复苏后的胎盘绒毛可分离获得间充质干细胞，复苏后的组织质地均匀可见间充质干细胞形态，复苏组织分离获得干细胞细胞与新鲜组织分离细胞生长特性无差异。
本发明的冷冻保存方法，可以用于组建胎盘来源的组织或细胞资源样本库。本发明为完善胎盘来源的人类遗传资源库奠定了坚实的基础和依据。
本发明的人胎盘绒毛组织的制备冻存方法和复苏方法，具有以下有益效果：
1)将胎盘羊膜、蜕膜、绒毛膜下血管、绒毛膜及绒毛等组织均分别进行了分离、保存，为胎盘来源的干细胞研究提供了重要的生物资源。
2)将胎盘膜装组织进行完整、大面积保存，所保存的组织不但可以用于分离干细胞，上皮细胞等领域，还可以用于组织工程移植等领域；现有技术中将各种组织剪碎成1～3cm3小块的统一冻存方法，仅能保证在细胞水平上有细胞存活，仅可用于分离出细胞进行扩增，不能用于组织工程大块膜移植等领域。
3)本发明的冰冻方式，有利于提高冻存组织和细胞的活性。现有技术中将各种组织剪碎成1～3cm3小块的统一冻存方法，不符合每种组织、细胞对特定冰冻方式的适应性要求，冻存后组织活性差，组织结构变形，细胞获得效率差。
4)保存的胎盘膜装组织，复苏后形态、功能、结构与新鲜组织一致，组织内细胞总体存活率达90％以上；而现有技术中的冻存组织的方法，一般为分离扩增出细胞活性达到某某值，实际上复苏组织中存活细胞极少，其分离出的细胞为冻存组织复苏后少数存活细胞经增殖后得到。
附图说明
图1：新鲜胎盘绒毛组织HE染色图。
图2：冻存后胎盘绒毛组织复苏HE染色图。
图3：从冻存过的胎盘绒毛组织获得的间充质干细胞图(左上侧)、可诱导成脂肪细胞图(左下侧)和流式表型(右侧)图。
图4：从冻存过的胎盘绒毛组织获得的胎盘源造血干细胞集落图(下侧)和CD34细胞流式图(上侧)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1人胎盘绒毛组织的冷冻保存方法
胎盘采集：选取无传染病、无产科并发症的健康胎盘，经产妇同意并签署知情同意书；正常采集，将采集到的胎盘48小时内运送至实验室，并进行各种必要的检测，如病毒等传染病检测，细菌污染检测等。
冷冻保存的方法，步骤如下：
(1)将胎盘洗净(以去除污物和微生物污染)；沿胎盘边缘剪下已脱落的蜕膜，除去羊膜。
(2)将上述已去除羊膜的胎盘胎儿面绒毛膜及大血管一起分离，剩余的胎盘组织即为胎盘绒毛组织，将胎盘绒毛组织剪成5cm3的小块(剪之前尽可能去除与母体相连的部分)，用手术刀将小块切成薄片，厚度0.5cm～2cm，面积3cm2～10cm2；
将上述薄片放入冻存袋中，以三步法导入玻璃化冻存液，转入程序降温仪，按照设定的降温程序降温至-90℃，转移至液氮冷冻保存；所述降温程序为：在4℃保持2min；再以1℃/min速率降低至0℃，保持10min；之后在5min内降温至-10℃；45min内降温至-40℃，之后再以50℃/min的速率迅速降温至-90℃，降低至目的温度后迅速转移至液氮中。
所述玻璃化冻存液，由质量浓度为20％的人血白蛋白溶液、二甲基亚砜、丙二醇、羟乙基脲和海藻糖组成，其中，各组分所占比例为：二甲基亚砜15～22wt％，丙二醇10～18wt％，羟乙基脲10～16wt％，海藻糖8～15wt％，余量为人血白蛋白溶液。
所述三步法导入玻璃化冻存液的具体方式为：
第一步，导入海藻糖、50％的二甲基亚砜及部分人血白蛋白溶液，于4℃平衡10min；
第二步，导入羟乙基脲、剩余的50％的二甲基亚砜及部分人血白蛋白溶液，于4℃平衡5min,
第三步，导入丙二醇及部分人血白蛋白溶液，立即放入程序降温仪；
三次导入的液体的体积比为3:1:1，用20％的人血白蛋白溶液调整至合适浓度，全部导入后，玻璃化冻存液中各组分的浓度达到上述终浓度要求。
上述羊膜、蜕膜、绒毛膜下大血管、绒毛膜以及绒毛组织按照先后顺序依次从胎盘中剥离、处理成合适大小，再装入冻存管或冻存袋等特定容器中，保存容器上编有组织名称特异的编号，样本冰冻至特定温度后再放入液氮容器特定位置长期储存，容器上的特异性编号用于复苏时查找样本。
实施例2冷冻保存后的复苏
按照实施例1的方法冷冻保存6个月后，进行复苏，并诱导分离间充质干细胞，步骤如下：
(2)冷冻保存的胎盘绒毛组织的复苏：将冷冻保存的胎盘绒毛组织从液氮中取出，放置气相10min平衡后迅速将冻存袋置于37℃～42℃水浴锅中；溶解后迅速将冻存袋转移至安全柜中，打开冻存袋，用镊子轻轻取出胎盘绒毛组织，放入4℃的三倍基准浓度复苏液(事先预冷至4℃)中，平衡1分钟，取出，再放入4℃的二倍基准浓度复苏液(事先预冷至4℃)中，平衡1～3分钟，取出，再放入4℃的一倍基准浓度复苏液(事先预冷至4℃)中，平衡3分钟；用4℃的生理盐水(事先预冷至4℃)冲洗2～5遍，放入4℃的生理盐水(事先预冷至4℃)中，静置，备用；
所述复苏液，由海藻糖、右旋糖酐40、丙氨酸、甘氨酸及羟乙基淀粉氯化钠注射液组成，使用时由羟乙基淀粉氯化钠注射液作为溶剂调整浓度；
一倍基准浓度复苏液中各组分的浓度为：海藻糖占5wt％，右旋糖酐40占6wt％，丙氨酸占3wt％，甘氨酸占3wt％，余量为羟乙基淀粉氯化钠注射液；
二倍基准浓度复苏液中各组分的浓度为：海藻糖占10wt％，右旋糖酐40占12wt％，丙氨酸占6wt％，甘氨酸占6wt％，余量为羟乙基淀粉氯化钠注射液；
三倍基准浓度复苏液中各组分的浓度为：海藻糖占15wt％，右旋糖酐40占18wt％，丙氨酸占9wt％，甘氨酸占9wt％，余量为羟乙基淀粉氯化钠注射液。
HE染色：新鲜的胎盘绒毛组织在冻存前取样进行HE染色；复苏后的胎盘绒毛组织，取样，进行HE染色；结果如图1、图2所示，可看出：复苏后的胎盘绒毛组织结构仍然得以维持，说明冻存复苏后的胎盘绒毛组织保持了组织结构完整。对比新鲜胎盘绒毛膜组织HE染色结果，冻存后胎盘绒毛组织复苏HE染色与新鲜组织相近，无明显重大的区别，说明冻存胎盘绒毛组织复苏后组织结构与新鲜组织相当。
复苏后的胎盘绒毛膜分离得到了绒毛膜间充质干细胞，细胞符合间充质干细胞生物学特征：呈短棒梭形，阳性表达CD44和CD105、不表达CD34和CD45，体外诱导可分化为脂肪和骨组织，如图3所示，由图可见，使用本发明的方法冻存的胎盘绒毛膜组织复苏后可成功地分离得到间充质干细胞。
复苏后的胎盘绒毛组织中可分离得到造血干细胞(方法为现有技术)，造血干细胞集落情况良好，CD34细胞含量符合现有认知，如图4所示，由图可见，使用本发明的方法冻存的胎盘绒毛膜组织复苏后可成功地分离得到造血干细胞。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。本说明书引述的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，如同这些出版物、专利和专利申请各自特别地和个别地表明通过引用并入本文。

Claims (6)

1.一种人胎盘绒毛组织的制备冻存方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）将胎盘洗净；沿胎盘边缘剪下已脱落的蜕膜，除去羊膜；
（2）将上述已去除羊膜的胎盘胎儿面绒毛膜及大血管一起分离，剩余的胎盘组织即为胎盘绒毛组织，将胎盘绒毛组织剪成小块，再切成薄片；
将上述薄片放入冻存袋或冻存管中，以三步法导入玻璃化冻存液，转入程序降温仪，按照设定的降温程序降温至-80℃～-90℃，转移至液氮冷冻保存；所述降温程序为：
在4℃保持2min；再以1℃/min速率降低至0℃，保持10min；之后在5min内降温至-10℃；45min内降温至-40℃，之后再以50℃/min的速率迅速降温至-90℃，降低至目的温度后迅速转移至液氮中；
所述玻璃化冻存液，由质量浓度为20%的人血白蛋白溶液、二甲基亚砜、丙二醇、羟乙基脲和海藻糖组成，其中，各组分所占比例为：二甲基亚砜18wt%，丙二醇12wt%，羟乙基脲12wt%，海藻糖12wt%，余量为20%的人血白蛋白溶液；
所述三步法导入玻璃化冻存液的具体方式为：
第一步，导入海藻糖、50%的二甲基亚砜及部分人血白蛋白溶液，于4℃平衡10min；
第二步，导入羟乙基脲、剩余的50%的二甲基亚砜及部分人血白蛋白溶液，于4℃平衡5min；
第三步，导入丙二醇及部分人血白蛋白溶液，立即放入程序降温仪；
三次导入的液体的体积比为3:1:1，用20%的人血白蛋白溶液调整至合适浓度。
2.根据权利要求1所述的人胎盘绒毛组织的制备冻存方法，其特征在于：所述步骤（2）中，将胎盘绒毛组织剪成5cm3的小块，用手术刀将小块切成薄片，厚度0.5cm～2cm，面积3cm2～10cm2。
3.根据权利要求1所述的人胎盘绒毛组织的制备冻存方法，其特征在于：所述步骤（2）中，将胎盘绒毛组织剪成小块前去除胎盘绒毛组织与母体相连的部分。
4.一种人胎盘绒毛组织的复苏方法，其特征在于：包括以下步骤：
将利用权利要求1～3中任一项所述的人胎盘绒毛组织的制备冻存方法冷冻保存的胎盘绒毛组织从液氮中取出，放置气相10min平衡后迅速将冻存袋或冻存管置于37℃～42℃水浴锅中；溶解后迅速将冻存袋或冻存管转移至安全柜或超净台中，打开冻存袋或冻存管，用镊子轻轻取出胎盘绒毛组织，放入4℃的三倍基准浓度复苏液中，平衡1分钟，取出，再放入4℃的二倍基准浓度复苏液中，平衡1～3分钟，取出，再放入4℃的一倍基准浓度复苏液中，平衡3分钟；冲洗；
所述复苏液，由海藻糖、右旋糖酐40、丙氨酸、甘氨酸及羟乙基淀粉氯化钠注射液组成；
一倍基准浓度复苏液中各组分的浓度为：海藻糖占5wt%，右旋糖酐40占6wt%，丙氨酸占3wt%，甘氨酸占3wt%，余量为羟乙基淀粉氯化钠注射液或MEM缓存溶液；
二倍基准浓度复苏液中各组分的浓度为：海藻糖占10wt%，右旋糖酐40占12wt%，丙氨酸占6wt%，甘氨酸占6wt%，余量为羟乙基淀粉氯化钠注射液或MEM缓存溶液；
三倍基准浓度复苏液中各组分的浓度为：海藻糖占15wt%，右旋糖酐40占18wt%，丙氨酸占9wt%，甘氨酸占9wt%，余量为羟乙基淀粉氯化钠注射液或MEM缓存溶液。
5.根据权利要求4所述的人胎盘绒毛组织的复苏方法，其特征在于：“平衡3分钟”后，用4℃的生理盐水或PBS溶液冲洗2～5遍，放入4℃的生理盐水或PBS溶液中，静置。
6.胎盘来源的组织或细胞资源样本库的建立方法，其特征在于：利用权利要求1～3中任一项所述的人胎盘绒毛组织的制备冻存方法处理人胎盘并储存。
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