CN108077243A - 一种冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的保护液及其制备方法和使用方法 - Google Patents
一种冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的保护液及其制备方法和使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的保护液，每100ml保护液主要由以下各成分组成：甘油1‑10g、异丙醇5‑15g、葡萄糖5‑15g、二甲基亚砜1‑10g、谷胱甘肽0.2‑2g、辅酶Q10 0.5‑2g、氨基酸混合物1‑5g、ATP 0.1‑1g，余量为去离子水。本发明的冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的方法和保护液，使用和制备中不包含胎牛血清，保存后细胞的活力优于或接近含血清的保护液。
Description
技术领域
本发明属于组织冷冻保存领域，具体涉及一种冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的保护液及其制备方法和使用方法。
背景技术
胎盘(placenta)羊膜、叶状绒毛膜(丛密绒毛膜)和底蜕膜构成。其中羊膜和叶状绒毛膜构成胎盘的胎儿部分，羊膜位于两层胎膜的内层，绒毛膜位于外层。底蜕膜构成胎盘的母体部分。
人羊膜不表达人类白细胞抗原，这种免疫学特性，使得羊膜成为临床上理想的移植材料。1940年De Rotth将带有绒毛膜的新鲜人羊膜移植到眼球表面修复芥末缺损；1995年Kim等采用羊膜移植使化学性损伤后的眼表得以重建。羊膜在眼科的研究和引用不断深入。
因为人胎盘羊膜和绒毛膜的提供和研究及临床试验的分离，人胎盘羊膜和绒毛膜的保存成为比不缺少的环节，也是关键环节。专利CN201210288706.3(公开号：CN102763642A，专利名称：一种冷冻保护液以及冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的方法)公开了一种人胎盘羊膜和绒毛膜的冷冻保护液及冷冻方法，该保护液由胎牛血清、二甲基亚砜和右旋糖酐40组成，胎牛血清、二甲基亚砜和右旋糖酐40的体积比为7-9:1:1。此种冷冻保护液中需要用到胎牛血清，因为疯牛病和一些宗教的原因，一些人不愿意接受此种冷冻保护液冷冻保存的移植材料。
发明内容
针对上述问题，本发明提出了一种新的冷冻保护液及其冷冻方法，不含胎牛血清。
本发明的第一方面在于提供一种冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的保护液，每100ml保护液主要由以下各成分组成：甘油1-10g、异丙醇5-15g、葡萄糖5-15g、二甲基亚砜1-10g、谷胱甘肽0.2-2g、辅酶Q10 0.5-2g、氨基酸混合物1-5g、ATP 0.1-1g，余量为去离子水。
优选的，所述氨基酸混合物包括精氨酸、赖氨酸、组氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺。
进一步优选的，所述氨基酸混合物的精氨酸、赖氨酸、组氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺的重量比例为2:1:2:2:3。
优选的，每100ml保护液主要由以下各成分组成：甘油5g、异丙醇10g、葡萄糖10g、二甲基亚砜5g、谷胱甘肽1g、辅酶Q10 1g、氨基酸混合物3g、ATP0.5g，余量为去离子水。
本发明的第二方面在于提供一种第一方面所述的保护液的制备方法，包括以下步骤：
S11，取一半目标体积的去离子水，加入葡萄糖，溶解后，加入甘油和异丙醇，搅拌均匀，121℃湿热灭菌，得到基质A；
S12，谷胱甘肽、辅酶Q10、氨基酸混合物和ATP用十分之一目标体积的去离子水溶解，搅拌均匀，过滤灭菌，得到基质B；
S13，无菌条件下，基质B与基质A混合，用无菌的去离子水定容至目标体积，得到保护液。
本发明的第三方面在于提供一种第一方面所述的保护液的使用方法，包括以下步骤：
S21，母体无HIV、HBV的自然生产或剖腹产的人胎盘，用有齿镊轻轻的分离开羊膜和绒毛膜，洗尽血液，剔除血管，并剪成1.0～2.0mm3小块，用无菌生理盐水冲洗羊膜和绒毛膜3次；
S22，保护液预冷到-20℃；
S22，羊膜和绒毛膜转移到冷冻管中，加入预冷的保护液至液面没过羊膜和绒毛膜2-3cm，冷冻管的使用高度不超过1/2；
S23，10min后，冷冻管以5℃/min的速度快速冷冻至-100℃；
S24，转移至液氮罐中超低温保存。
优选的，还包括解冻步骤：
S241，从液氮罐中中取出冷冻管，加入预冷的保护液至冷冻管满容量，倒置冷冻管；
S242，5-60min后，摇晃1-3min，冷冻管正过来，转移至30℃恒温水浴解冻；
S243，用无菌生理盐水冲洗羊膜和绒毛膜3次。
进一步优选的，S242中30min后，摇晃1-3min，转移至30℃恒温水浴解冻。
本发明的第四方面在于提供一种第一方面所述的保护液的在制备冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的保护液中的应用。
本发明所使用的试剂、药品和器材，均购自市场的普通商品。提供洗羊膜和绒毛膜的产妇已签署知情同意书。
有益效果：
本发明的冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的方法和保护液，使用和制备中不包含胎牛血清，保存后细胞的活力优于或接近含血清的保护液。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但足本领域技术人员将会理解，下列实施例仅于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
一种冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的保护液，每100ml保护液主要由以下各成分组成：甘油1g、异丙醇5g、葡萄糖5g、二甲基亚砜1g、谷胱甘肽0.2g、辅酶Q10 0.5g、精氨酸0.2g、赖氨酸0.2g、组氨酸0.2g、甘氨酸0.2g、谷氨酰胺0.2g、ATP 0.1g，余量为去离子水。
实施例2
一种冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的保护液的制备方法，包括以下步骤：
S11，取一半目标体积的去离子水，加入葡萄糖，溶解后，加入甘油和异丙醇，搅拌均匀，121℃湿热灭菌，得到基质A；
S12，谷胱甘肽、辅酶Q10、氨基酸混合物和ATP用十分之一目标体积的去离子水溶解，搅拌均匀，过滤灭菌，得到基质B；
S13，无菌条件下，基质B与基质A混合，用无菌的去离子水定容至目标体积，得到保护液。
实施例3
一种冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的保护液，每100ml保护液主要由以下各成分组成：甘油10g、异丙醇15g、葡萄糖15g、二甲基亚砜10g、谷胱甘肽2g、辅酶Q10 2g、精氨酸1g、赖氨酸1g、组氨酸1g、甘氨酸1g、谷氨酰胺1g、ATP 1g，余量为去离子水。
实施例4
一种冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的保护液，每100ml保护液主要由以下各成分组成：甘油5g、异丙醇10g、葡萄糖10g、二甲基亚砜5g、谷胱甘肽1g、辅酶Q10 1g、精氨酸0.6g、赖氨酸0.3g、组氨酸0.6g、甘氨酸0.6g、谷氨酰胺0.9g、ATP 0.5g，余量为去离子水。
实施例5
一种冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的保护液的使用方法，包括以下步骤：
S21，母体无HIV、HBV的自然生产或剖腹产的人胎盘，用有齿镊轻轻的分离开羊膜和绒毛膜，洗尽血液，剔除血管，并剪成1.0～2.0mm3小块，用无菌生理盐水冲洗羊膜和绒毛膜3次；
S22，保护液预冷到-20℃；
S22，羊膜和绒毛膜转移到冷冻管中，加入预冷的保护液至液面没过羊膜和绒毛膜2-3cm，冷冻管的使用高度不超过1/2；
S23，10min后，冷冻管以5℃/min的速度快速冷冻至-100℃；
S24，转移至液氮罐中超低温保存。
实施例6
实施例5一种冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的保护液的使用方法的解冻步骤：
S241，从液氮罐中中取出冷冻管，加入预冷的保护液至冷冻管满容量，倒置冷冻管；
S242，5min后，摇晃1-3min，冷冻管正过来，转移至30℃恒温水浴解冻；
S243，用无菌生理盐水冲洗羊膜和绒毛膜3次。
实施例7
实施例5一种冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的保护液的使用方法的解冻步骤：
S241，从液氮罐中中取出冷冻管，加入预冷的保护液至冷冻管满容量，倒置冷冻管；
S242，60min后，摇晃1-3min，冷冻管正过来，转移至30℃恒温水浴解冻；
S243，用无菌生理盐水冲洗羊膜和绒毛膜3次。
实施例8
实施例7一种冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的保护液的使用方法的解冻步骤：
S241，从液氮罐中中取出冷冻管，加入预冷的保护液至冷冻管满容量，倒置冷冻管；
S242，30min后，摇晃1-3min，冷冻管正过来，转移至30℃恒温水浴解冻；
S243，用无菌生理盐水冲洗羊膜和绒毛膜3次。
对照例1
一种冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的保护液，每100ml保护液主要由以下各成分组成：甘油1g、二甲基亚砜1g、谷胱甘肽0.2g、辅酶Q10 0.5g、精氨酸0.2g、赖氨酸0.2g、组氨酸0.2g、甘氨酸0.2g、谷氨酰胺0.2g、ATP 0.1g，余量为去离子水。
对照例2
一种冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的保护液，每100ml保护液主要由以下各成分组成：甘油1g、异丙醇5g、葡萄糖5g、谷胱甘肽0.2g、精氨酸0.2g、赖氨酸0.2g、组氨酸0.2g、甘氨酸0.2g、谷氨酰胺0.2g、ATP 0.1g，余量为去离子水。
对照例3
一种冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的保护液，每100ml保护液主要由以下各成分组成：甘油1g、异丙醇5g、葡萄糖5g、二甲基亚砜1g、谷胱甘肽0.2g、辅酶Q10 0.5g、精氨酸0.2g、赖氨酸0.2g、组氨酸0.2g、甘氨酸0.2g，余量为去离子水。
对照例4
一种冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的保护液，每100ml保护液主要由以下各成分组成：甘油1g、异丙醇5g、葡萄糖5g、二甲基亚砜1g、谷胱甘肽0.2g、辅酶Q10 0.5g、精氨酸0.2g、赖氨酸0.2g、组氨酸0.2g、ATP 0.1g，余量为去离子水。
实验例1保护液的配方和制备方法对冷冻保存后的细胞活力的影响
以本实施例1、3、4和对照例1-4的保护液，按照实施例2的制备方法，对照例参照实施例2的方法，即没有的组分则不添加，使用实施例5的方法冷冻保存人胎盘的羊膜和绒毛膜组织块72h，使用实施例6的方法解冻，测定组织块的活力。以新鲜的组织块为对照。组织块用0.2％的Ⅱ型胶原酶，在37℃水浴消化40min，300目筛网过滤，滤液300G离心5min，洗涤2-3次后，用生理盐水重悬细胞，测定细胞活力。结果见表1。
表1冷冻保存后羊膜和绒毛膜组织块酶解后的细胞活力
结果表明，样品8与对照相比，没有显著差异(P>0.05)，表明经冷冻保存后细胞活力没有降低，保存效果良好。样品6-8与对照相比，有显著差异(P<0.05)，但是活力均在85以上。样品2-5活力在50-60之间。其中样品7和8细胞活力均在90以上，优于CN102763642A的含胎牛血清保护液的90。
实验例2解冻方法对冷冻保存后的细胞活力的影响
以本实施例1的保护液，按照实施例2的制备方法，使用实施例5的方法冷冻保存人胎盘的羊膜和绒毛膜组织块72h，使用实施例6-8的方法解冻，测定组织块的活力。以新鲜的组织块为对照。组织块用0.2％的Ⅱ型胶原酶，在37℃水浴消化40min，300目筛网过滤，滤液300G离心5min，洗涤2-3次后，用生理盐水重悬细胞，测定细胞活力。结果见表2。
表2冷冻保存后羊膜和绒毛膜组织块酶解后的细胞活力
结果表明，样品10与对照相比，没有显著差异(P>0.05)，表明经冷冻保存后细胞活力没有降低，保存效果良好。样品6和9与对照相比，有显著差异(P<0.05)，但是活力均在85以上。解冻方法显著影响冷冻保存后的细胞活力。样品10细胞活力均在90以上，优于CN102763642A的含胎牛血清保护液的90。
实验例3经本发明的保护液的冷冻保存后的细胞增殖速度
以实验例1中的样品2和样品8为实验组和对照组，样品1为空白对照，分别组织块酶后，以10％接种量接种到MSC无血清培养基(北京同立海源生物科技有限公司的AMMS-HMSC培养基)，接种到培养瓶中，于37℃、5％CO2培养。观察统计细胞贴壁时间。结果见表3。
表3样品的贴壁时间
结果表明，实验组与空白对照相比，细胞贴壁时间没有显著差异(P>0.05)，表明经过冷冻保存的人胎盘羊膜细胞和绒毛膜细胞的增殖速度没有明显改变，而对照组的增殖速度显著减低(P<0.05)。
实验例4经本发明的保护液的冷冻保存后的羊膜的可移植性
取实验例1中的样品2和样品8的羊膜，分别组织块酶后，以10％接种量接种到MSC无血清培养基(北京同立海源生物科技有限公司的AMMS-HMSC培养基)，接种到培养瓶中，于37℃、5％CO2培养，得到的成片的羊膜，分别为对照组和实验组，以新鲜的羊膜为空白对照。用采用高敏感度的双抗体夹心酶联免疫吸附分析试剂盒(R&D Systems，USA)测定碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)和肝细胞生长因子(HGF)的水平。
b-FGF和HGF可以促进损伤的修复，显著提高移植的成活率。结果表明实验组羊膜的b-FGF和HGF水平与空白对照的新鲜羊膜相比，均有略微下降，特别是HGF下降较多，但不具显著性(P>0.05)。对照组与空白对照相比，显著下降，具有统计学意义(P<0.05)。表明经冷冻保存后一代增殖的羊膜具有很好的可移植性。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (9)
1.一种冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的保护液，其特征在于，每100ml保护液主要由以下各成分组成：
甘油1-10g、异丙醇5-15g、葡萄糖5-15g、二甲基亚砜1-10g、谷胱甘肽0.2-2g、辅酶Q100.5-2g、氨基酸混合物1-5g、ATP 0.1-1g，余量为去离子水。
2.如权利要求1所述的保护液，其特征在于，所述氨基酸混合物包括精氨酸、赖氨酸、组氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺。
3.如权利要求2所述的保护液，其特征在于，所述氨基酸混合物的精氨酸、赖氨酸、组氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺的重量比例为2:1:2:2:3。
4.如权利要求1所述的保护液，其特征在于，每100ml保护液主要由以下各成分组成：
甘油5g、异丙醇10g、葡萄糖10g、二甲基亚砜5g、谷胱甘肽1g、辅酶Q10 1g、氨基酸混合物3g、ATP 0.5g，余量为去离子水。
5.如权利要求1-4任一所述的保护液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S11，取一半目标体积的去离子水，加入葡萄糖，溶解后，加入甘油和异丙醇，搅拌均匀，121℃湿热灭菌，得到基质A；
S12，谷胱甘肽、辅酶Q10、氨基酸混合物和ATP用十分之一目标体积的去离子水溶解，搅拌均匀，过滤灭菌，得到基质B；
S13，无菌条件下，基质B与基质A混合，用无菌的去离子水定容至目标体积，得到保护液。
6.如权利要求1-4任一所述的保护液的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
S21，母体无HIV、HBV的自然生产或剖腹产的人胎盘，用有齿镊轻轻的分离开羊膜和绒毛膜，洗尽血液，剔除血管，并剪成1.0～2.0mm3小块，用无菌生理盐水冲洗羊膜和绒毛膜3次；
S22，保护液预冷到-20℃；
S22，羊膜和绒毛膜转移到冷冻管中，加入预冷的保护液至液面没过羊膜和绒毛膜2-3cm，冷冻管的使用高度不超过1/2；
S23，10min后，冷冻管以5℃/min的速度快速冷冻至-100℃；
S24，转移至液氮罐中超低温保存。
7.如权利要求6所述的保护液的使用方法，其特征在于，还包括解冻步骤：
S241，从液氮罐中中取出冷冻管，加入预冷的保护液至冷冻管满容量，倒置冷冻管；
S242，5-60min后，摇晃1-3min，冷冻管正过来，转移至30℃恒温水浴解冻；
S243，用无菌生理盐水冲洗羊膜和绒毛膜3次。
8.如权利要求2所述的保护液的使用方法，其特征在于，S242中30min后，摇晃1-3min，转移至30℃恒温水浴解冻。
9.如权利要求1-4任一所述的保护液在制备冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的保护液中的应用。
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