CN107296041A - 一种新鲜羊膜保存液及新鲜羊膜保存方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种新鲜羊膜保存液，以1000ml保存液计，由如下组分组成：DMEM培养基30～50g，硫酸软骨素20～30g，低分子右旋糖酐10～20g，丙酮酸钠5～10ml，非必须氨基酸10～20ml，赤霉素5～10ml，HEPES 10～20ml，季戊四醇10～20g，氯化铵2～3g，DMPU 3～5ml，纳米二氧化硅15～20g，胡萝卜素8～10ml，吲哚乙酸12～15ml，氰氨化钙5～6g，氢化可的松3～5g，余量为注射用水。使用本发明保存液可以在常温下保存新鲜羊膜，保存时间可达1～2周，4℃下可以保存1年以上，方便使用；羊膜的形态未改变，羊膜中含有的细胞活性因子保存率较高。

Description

一种新鲜羊膜保存液及新鲜羊膜保存方法与应用

技术领域

本发明涉及一种新鲜羊膜保存液，尤其是涉及一种新鲜羊膜保存液及新鲜羊膜保存方法与应用。

背景技术

羊膜(厚约0.02～0.05mm)来源于胚胎，是一种透明、无神经、血管和淋巴管、低抗原性且具有韧性的组织，由上皮细胞层、基底膜、基质层、纤维母细胞层、海绵层组成。羊膜在促进上皮修复、愈合及分化，抑制炎症，抗新血管生成，抑制纤维化及瘢痕化，防止睑球粘连等眼科多个领域发挥着重要的作用。随着羊膜用量的不断增加，羊膜的保存，尤其是羊膜活性成分的保存，成了当前眼科界研究的一个热点。

现在使用较为普遍的羊膜保存液为DMEM和甘油混合液(体积比为DMEM∶甘油＝1∶1)，将羊膜片放入装有DMEM和甘油混合液的容器中，密封置-70℃冰箱保存备用，该保存液会使羊膜上皮细胞形态有所改变，代谢酶活性和生长因子的表达有所降低，但过快的降温会造成细胞水肿，发生老化及功能减退，影响羊膜的品质。

申请号为200710150436.9、公开号为CN101444202A的中国专利公开了“一种新鲜羊膜保存液及新鲜羊膜保存方法与应用”，该新鲜羊膜保存液的组成及含量为：DMEM培养基9.0-12.0克，硫酸软骨素10.0-25.0克，透明质酸钠0.5-1.0克，HEPES4.0-5.0克，右旋糖苷10.0-15.0克，庆大霉素1.0-3.0毫升，地塞米松24.0-30.0毫克，非必需氨基酸10.0-15.0毫升，还原型谷胱甘肽0.50-0.95克，胎牛血清20.00-50.0毫升，注射用水加至1000毫升。该新鲜羊膜保存液具有在4℃冰箱中保存，将新鲜羊膜保存期延长20-30天的特点。但具有如下不足之处：该保存液中加入了血清成分，增加了病毒在羊膜与保存液之间传播的机会；只是稍稍延长羊膜保存时间；需要在4℃下保存，不能常温保存；羊膜中含有的活性因子丢失率高。

发明内容

为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供一种可以常温保存，且保存时间长、羊膜中含有的活性因子丢失率低、成本低的羊膜长期保存液。

本发明采用如下技术方案实现：一种新鲜羊膜保存液，以1000ml保存液计，由如下组分组成：DMEM培养基30g～50g，硫酸软骨素20g～30g，低分子右旋糖酐10g～20g，丙酮酸钠5ml～10ml，非必须氨基酸10ml～20ml，赤霉素5ml～10ml，HEPES 10ml～20ml，季戊四醇10g～20g，氯化铵2g～3g，DMPU 3ml～5ml，纳米二氧化硅15g～20g，胡萝卜素8ml～10ml，吲哚乙酸12ml～15ml，氰氨化钙5g～6g，氢化可的松3g～5g，余量为注射用水。

优选地，所述的新鲜羊膜保存液，以1000ml保存液计，由如下组分组成：DMEM培养基42g，硫酸软骨素24g，低分子右旋糖酐16g，丙酮酸钠8ml，非必须氨基酸15ml，赤霉素8ml，HEPES 16ml，季戊四醇13g，氯化铵2g，DMPU 4ml，纳米二氧化硅18g，胡萝卜素9ml，吲哚乙酸13ml，氰氨化钙6g，氢化可的松4g，余量为注射用水。

优选地，所述非必需氨基酸为除8种必需氨基酸外的多种氨基酸，包括甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、半胱氨酸、精氨酸和组氨酸中的至少一种。

本发明还提供一种新鲜羊膜的保存方法，具体为，使用上述的新鲜羊膜保存液进行保存。

优选地，所述的新鲜羊膜的保存方法，包括如下步骤：

1)取健康剖宫产胎膜，胎膜在无菌环境中经无菌组织缓冲液或生理盐水冲洗干净；

2)用钝器将胎膜的羊膜与绒毛膜剥离，去除绒毛膜；

3)保留羊膜，再去除结缔组织与海绵层；

4)将新鲜羊膜再经无菌组织缓冲液及抗生素平衡液处理；

5)将新鲜羊膜裁剪成适度大小、分装、装入有所述新鲜羊膜保存液的容器中；

6)放置阴凉处保存，随用随取；

7)使用前将羊膜从所述新鲜羊膜保存液中取出，用无菌磷酸缓冲液或生理盐水冲洗干净，即可应用于临床医学的羊膜修补术上。

本发明所述的新鲜羊膜保存液保存的新鲜羊膜在生物制药、医疗领域的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：使用本发明保存液可以在常温下保存新鲜羊膜，保存时间可达1～2周(细胞活性因子保存率50％以上)，4℃下可以保存1年以上(细胞活性因子保存率50％以上)，方便使用；羊膜的形态未改变，羊膜中含有的细胞活性因子保存率较高，常温下保存1周后羊膜中含有的细胞活性因子保存率可达80％以上，常温下保存2周后羊膜中含有的细胞活性因子保存率可达50％以上，4℃下保存半年后羊膜中含有的细胞活性因子保存率可达60％以上，4℃下保存1年后羊膜中含有的细胞活性因子保存率可达50％以上。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明一种可降解生物羊膜复合的新型泪道修复支架作进一步的详细说明。

实施例1

一种新鲜羊膜保存液，以1000ml保存液计，由如下组分组成：DMEM培养基42g，硫酸软骨素24g，低分子右旋糖酐16g，丙酮酸钠8ml，非必须氨基酸15ml，赤霉素8ml，HEPES16ml，季戊四醇13g，氯化铵2g，DMPU 4ml，纳米二氧化硅18g，胡萝卜素9ml，吲哚乙酸13ml，氰氨化钙6g，氢化可的松4g，余量为注射用水；pH值为7.2～7.4，渗透压为350～380mOsm/L。

制备方法：将42g DMEM培养基、24g硫酸软骨素、16g低分子右旋糖酐、8ml丙酮酸钠、15ml非必须氨基酸、8ml赤霉素、16ml HEPES、13g季戊四醇、2g氯化铵、4ml DMPU、18g纳米二氧化硅、9ml胡萝卜素、13ml吲哚乙酸、6g氰氨化钙、4g氢化可的松加入到500ml注射用水中混合均匀，然后继续加入注射用水至1000ml混合均匀，调pH值为7.2～7.4，渗透压为350～380mOsm/L，经0.2μm膜过滤除菌100ml分装后即得本保存液。

新鲜羊膜的保存方法：1)取健康剖宫产胎膜，胎膜在无菌环境中经无菌组织缓冲液或生理盐水冲洗干净；2)用钝器将胎膜的羊膜与绒毛膜剥离，去除绒毛膜；3)保留羊膜，再去除结缔组织与海绵层；4)将新鲜羊膜再经无菌组织缓冲液及抗生素平衡液处理；5)将新鲜羊膜裁剪成适度大小、分装、装入有所述新鲜羊膜保存液的容器中；6)放置阴凉处保存，随用随取；7)使用前将羊膜从所述新鲜羊膜保存液中取出，用无菌磷酸缓冲液或生理盐水冲洗干净，即可应用于临床医学的羊膜修补术上。

实施例2

一种新鲜羊膜保存液，以1000ml保存液计，由如下组分组成：DMEM培养基30g，硫酸软骨素20g，低分子右旋糖酐10g，丙酮酸钠5ml，非必须氨基酸10ml，赤霉素5ml，HEPES10ml，季戊四醇10g，氯化铵2g，DMPU 3ml，纳米二氧化硅15g，胡萝卜素8ml，吲哚乙酸12ml，氰氨化钙5g，氢化可的松3g，余量为注射用水；pH值为7.2～7.4，渗透压为350～380mOsm/L。

制备方法：将30g DMEM培养基、20g硫酸软骨素、10g低分子右旋糖酐、5ml丙酮酸钠、10ml非必须氨基酸、5ml赤霉素、10ml HEPES、10g季戊四醇、2g氯化铵、3ml DMPU、15g纳米二氧化硅、8ml胡萝卜素、12ml吲哚乙酸、5g氰氨化钙、3g氢化可的松加入到500ml注射用水中混合均匀，然后继续加入注射用水至1000ml混合均匀，调pH值为7.2～7.4，渗透压为350～380mOsm/L，经0.2μm膜过滤除菌100ml分装后即得本保存液。

新鲜羊膜的保存方法：1)取健康剖宫产胎膜，胎膜在无菌环境中经无菌组织缓冲液或生理盐水冲洗干净；2)用钝器将胎膜的羊膜与绒毛膜剥离，去除绒毛膜；3)保留羊膜，再去除结缔组织与海绵层；4)将新鲜羊膜再经无菌组织缓冲液及抗生素平衡液处理；5)将新鲜羊膜裁剪成适度大小、分装、装入有所述新鲜羊膜保存液的容器中；6)放置阴凉处保存，随用随取；7)使用前将羊膜从所述新鲜羊膜保存液中取出，用无菌磷酸缓冲液或生理盐水冲洗干净，即可应用于临床医学的羊膜修补术上。

实施例3

一种新鲜羊膜保存液，以1000ml保存液计，由如下组分组成：DMEM培养基50g，硫酸软骨素30g，低分子右旋糖酐20g，丙酮酸钠10ml，非必须氨基酸20ml，赤霉素10ml，HEPES20ml，季戊四醇20g，氯化铵3g，DMPU 5ml，纳米二氧化硅20g，胡萝卜素10ml，吲哚乙酸15ml，氰氨化钙6g，氢化可的松5g，余量为注射用水；pH值为7.2～7.4，渗透压为350～380mOsm/L。

制备方法：将50g DMEM培养基、30g硫酸软骨素、20g低分子右旋糖酐、10ml丙酮酸钠、20ml非必须氨基酸、10ml赤霉素、20ml HEPES、20g季戊四醇、3g氯化铵、5ml DMPU、20g纳米二氧化硅、10ml胡萝卜素、15ml吲哚乙酸、6g氰氨化钙、5g氢化可的松加入到500ml注射用水中混合均匀，然后继续加入注射用水至1000ml混合均匀，调pH值为7.2～7.4，渗透压为350～380mOsm/L，经0.2μm膜过滤除菌100ml分装后即得本保存液。

新鲜羊膜的保存方法：1)取健康剖宫产胎膜，胎膜在无菌环境中经无菌组织缓冲液或生理盐水冲洗干净；2)用钝器将胎膜的羊膜与绒毛膜剥离，去除绒毛膜；3)保留羊膜，再去除结缔组织与海绵层；4)将新鲜羊膜再经无菌组织缓冲液及抗生素平衡液处理；5)将新鲜羊膜裁剪成适度大小、分装、装入有所述新鲜羊膜保存液的容器中；6)放置阴凉处保存，随用随取；7)使用前将羊膜从所述新鲜羊膜保存液中取出，用无菌磷酸缓冲液或生理盐水冲洗干净，即可应用于临床医学的羊膜修补术上。

实施例4

一种新鲜羊膜保存液，以1000ml保存液计，由如下组分组成：DMEM培养基35g，硫酸软骨素25g，低分子右旋糖酐12g，丙酮酸钠7ml，非必须氨基酸12ml，赤霉素7ml，HEPES12ml，季戊四醇15g，氯化铵2.8g，DMPU 4ml，纳米二氧化硅19g，胡萝卜素6ml，吲哚乙酸14ml，氰氨化钙5.6g，氢化可的松3.6g，余量为注射用水；pH值为7.2～7.4，渗透压为350～380mOsm/L。

制备方法：将35g DMEM培养基、25g硫酸软骨素、12g低分子右旋糖酐、7ml丙酮酸钠、12ml非必须氨基酸、7ml赤霉素、12ml HEPES、15g季戊四醇、2.8g氯化铵、4ml DMPU、19g纳米二氧化硅、6ml胡萝卜素、14ml吲哚乙酸、5.6g氰氨化钙、3.6g氢化可的松加入到500ml注射用水中混合均匀，然后继续加入注射用水至1000ml混合均匀，调pH值为7.2～7.4，渗透压为350～380mOsm/L，经0.2μm膜过滤除菌100ml分装后即得本保存液。

新鲜羊膜的保存方法：1)取健康剖宫产胎膜，胎膜在无菌环境中经无菌组织缓冲液或生理盐水冲洗干净；2)用钝器将胎膜的羊膜与绒毛膜剥离，去除绒毛膜；3)保留羊膜，再去除结缔组织与海绵层；4)将新鲜羊膜再经无菌组织缓冲液及抗生素平衡液处理；5)将新鲜羊膜裁剪成适度大小、分装、装入有所述新鲜羊膜保存液的容器中；6)放置阴凉处保存，随用随取；7)使用前将羊膜从所述新鲜羊膜保存液中取出，用无菌磷酸缓冲液或生理盐水冲洗干净，即可应用于临床医学的羊膜修补术上。

利用实施例1-4所述的新鲜羊膜保存液保存新鲜羊膜，与现有技术方法保存新鲜羊膜进行对比，得到下表数据：

表中代号含义：

EGF：表皮生长因子(epidermal growth factor)；FGF：成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor)；HGF：肝细胞生长因子(hepatocyte growthfactor)；TGF-β：转化生长因子β(transforming growth factor-β)；IGF：胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor)；PDGF：血小板衍生性生长因子((platelet—derivedgrowth factor)；VEGF：血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor)；NGF：神经生长因子(nerve growth factor)；BDNF：脑源性神经营养因子(brain-derivednellrotrophic factor)；CNTF：睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor)。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (6)

1.一种新鲜羊膜保存液，其特征在于，以1000ml保存液计，由如下组分组成：

2.根据权利要求1所述的新鲜羊膜保存液，其特征在于，以1000ml保存液计，由如下组分组成：

3.根据权利要求1所述的新鲜羊膜保存液，其特征在于，所述非必需氨基酸为除8种必需氨基酸外的多种氨基酸，包括甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、半胱氨酸、精氨酸和组氨酸中的至少一种。

4.一种新鲜羊膜的保存方法，其特征在于，使用如权利要求1或2所述的新鲜羊膜保存液。

5.根据权利要求4所述的新鲜羊膜的保存方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)取健康剖宫产胎膜，胎膜在无菌环境中经无菌组织缓冲液或生理盐水冲洗干净；

2)用钝器将胎膜的羊膜与绒毛膜剥离，去除绒毛膜；

3)保留羊膜，再去除结缔组织与海绵层；

4)将新鲜羊膜再经无菌组织缓冲液及抗生素平衡液处理；

5)将新鲜羊膜裁剪成适度大小、分装、装入有所述新鲜羊膜保存液的容器中；

6)放置阴凉处保存，随用随取。

7)使用前将羊膜从所述新鲜羊膜保存液中取出，用无菌磷酸缓冲液或生理盐水冲洗干净，即可应用于临床医学的羊膜修补术上。

6.根据权利要求1或2或3所述的新鲜羊膜保存液保存的新鲜羊膜在生物制药、医疗领域的应用。