ES2217700T3 - Solucion medica definida exenta de suero para oftalmologia. - Google Patents

Solucion medica definida exenta de suero para oftalmologia.

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ES2217700T3 ES99308702T ES99308702T ES2217700T3 ES 2217700 T3 ES2217700 T3 ES 2217700T3 ES 99308702 T ES99308702 T ES 99308702T ES 99308702 T ES99308702 T ES 99308702T ES 2217700 T3 ES2217700 T3 ES 2217700T3
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Abstract

Una solución médica definida libre de suero para aplicaciones en Oftalmología, que contiene uno o más suplementos de nutrientes celulares, y uno o más factores de crecimiento que mantienen y mejoran la preservación de tejidos oculares, incluyendo tejidos humanos de la córnea, la retina y el epitelio de la córnea, a bajas temperaturas fisiológicas (2ºC a 38ºC). Esta solución se compone de una solución acuosa definida de nutrientes y electrolitos, con un suplemento de glicosaminoglicano(s), uno o más agentes antiturgentes, una o más fuentes de energía, uno o más sistemas de amortiguación, uno o más antioxidantes, agentes estabilizadores de membranas, uno o más antibióticos y/o agentes antimicóticos, ATP o precursores energéticos, suplementos de nutrientes celulares, suplementos de coenzimas y enzimas, precursores nucleótidos, suplementos hormonales, aminoácidos no esenciales, minerales de traza, elementos de traza y uno o más factores de crecimiento.

Description

Solución médica definida exenta de suero para oftalmología.
Fundamentos de la invención 1. Campo de la invención
La presente invención se refiere a la conservación de tejido de ojos en una solución médica definida exenta de suero, y más particularmente, se refiere a la conservación y aumento de la conservación del tejido córneo humano, especificados como el tiempo entre la retirada del donante y el trasplante.
2. Descripción de la técnica anterior
La queratoplastia, o el trasplante de la córnea, ha sido eficaz en proporcionar rehabilitación visual a mucha gente que sufre trastornos córneos. Este procedimiento ha estado seriamente obstaculizado por la disponibilidad universalmente no constante de tejido de donantes. El uso de medio de almacenamiento de córneas a 4ºC, que contiene sulfato del condroitina, ha afectado positivamente a la disponibilidad de tejido donante de calidad. En Estados Unidos el 95% de todas las córneas trasplantadas se almacenan en un medio que contiene sulfato de condroitina a 4ºC hasta siete días. Después de 96 horas de conservación la córnea se ve sometida a descomposición del epitelio y pérdida de transparencia corneal, como se demuestra por la creciente hinchazón del estroma córneal. El edema estromal se atribuye tanto a la disminución del mantenimiento de la función de la bomba de la barrera del endotelio como de la función de barrera del epitelio corneal.
Un alternativa al almacenamiento de la córnea a 4ºC es el uso del cultivo del órgano. En este método de conservación de las córneas, la córnea se mantiene a temperaturas más altas (31ºC-37ºC) que permiten la mayor actividad metabólica de la córnea. El uso de córneas cultivadas de órganos se practica principalmente en Europa. El sistema de cultivo del órgano utiliza suero de bóvido fetal como principal componente del medio. Debido a la creciente preocupación por las encefalopatías espongiformes transmisibles (abreviadamente TSE, por sus iniciales en inglés Transmissible Spongiform Encephalopaties) que provenían de brotes de encefalopatía espongiforme de los bóvidos (abreviadamente BGE por sus iniciales en inglés Bovine Spongiform Encephalopaty, se ha puesto mucho énfasis en productos derivados de animales y een su uso en la conservación de la córnea. El reemplazo de los componentes del suero en la conservación de la córnea es un desafío formidable, basado en más de 350 componentes químicos conocidos encontrados en el suero.
La temperatura elevada (31ºC-37ºC) de la técnica de cultivo del órgano aumenta el índice metabólico de la córnea en comparación con las córneas almacenadas a 4ºC. El medio de conservación de la córnea debe proporcionar un ambiente similar a la situación in vivo. Un medio de conservación de la córnea exento de suero debe estar completamente definido en cuanto a suplementar los componentes encontrados normalmente en el suero. Se debe realizar una evaluación crítica de parámetros fisiológicos tales como composición iónica y de aminoácidos, equilibrio del bicarbonato, fuentes de energía disponibles, niveles de oxígeno disuelto, suplementos nutrientes de la célula, coenzimas y suplementos de enzimas, precursores del nucleótidos, suplementos hormonales, minerales trazas, elementos trazas, factores de crecimiento, osmolalidad y pH con respecto a cada medio de conservación. Los parámetros para la conservación del cultivo del órgano exento de suero se deben definir en cuanto a la reversibilidad del daño producido a las células durante el almacenamiento.
El endotelio corneal del adulto tiene una capacidad regeneradora limitada y raramente se han observado in vivo las figuras de la mitosis; el endotelio corneal humano in vivo responde normalmente al trauma deslizándose dentro de la zona herida por migración de las células. Sin embargo, la mitosis de células endoteliales in vivo se ha demostrado en endotelio de conejos, bóvidos y seres humanos. Estudios de absorción auto-radiográfica de timidina después de herida por criogenización o herida mecánica de córneas in vitro han demostrado la existencia de figuras de mitosis en la monocapa endotelial. Estos estudios fueron todos realizados en presencia de suero. El trauma quirúrgico y la enfermedad pueden acelerar la pérdida de células endoteliales y además comprometen a la córnea. Así, la conservación y el aumento de la conservación a largo plazo del endotelio corneal es un aspecto muy importante del almacenamiento de tejidos del ojo en bancos de ojos.
Una descripción general de los aspectos que intervienen en el almacenamiento y la manipulación del tejido córneo se encuentra en la obra Corneal Surgery, capítulos 1-4, páginas 1-128 editado por Federick S. Brightbill, M.D., publicado por C.V. Mosby Company, St. Louis, MO, 1986. Se han propuesto una variedad de medios de almacenamiento y técnicas, y la investigación actual continúa estando dirigidas a mantener y aumentar realmente la calidad de los tejidos de donantes, y aumentar la duración del almacenamiento de tejidos corneales, que se define como el tiempo entre la extirpación de un donante y el trasplante. Actualmente, no hay medios exentos suero definidos usados en técnicas de cultivo del órgano a 31ºC-38ºC.
La publicación de la patente europea 051797A1 describe una solución médica exenta de suero definida para aplicaciones en oftalmología, que contiene uno o más suplementos nutrientes de la célula que mantiene y aumenta la conservación de los tejidos del ojo, incluyendo tejidos corneales humanos a bajas temperaturas (2ºC a 15ºC). Esta solución se compone de una solución acuosa definida de nutrientes y electrólitos, suplementados con glicosaminoglicano(s), agente(s) desturgescentes, fuente(s) de energía, sistema(s) tampón(es), antioxidante(s), componentes estabilizadores de membranas, antibiótico(s), precursores de ATP y suplementos nutrientes de la célula.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a materiales y métodos de mejorar los tejidos oculares, especialmente tejidos corneales, durante su almacenamiento antes del trasplante. Un aspecto de la invención proporciona el aumento de la viabilidad del tejido córneo proporcionando un medio exento de suero totalmente definido que mantiene el metabolismo fisiológico normal, y mantiene el tejido córneo igual que el medio que contiene suero.
Sumario de la invención
El almacenamiento de la córnea en cultivo del órgano a 31ºC-37ºC debe proporcionar la conservación del tejido que es capaz de mantener el estado funcional del endotelio. El trabajo experimental ha demostrado que la solución médica exenta de suero definida es capaz de mantener las córneas iguales a las de las soluciones que contienen suero. Se evitan los aspectos indeseables del almacenamiento en soluciones que contienen suero. La presente invención ha definido los componentes que son necesarios para mantener tejidos córneos durante el cultivo del órgano. La presente invención define además una solución nutritiva que proporciona a las córneas glicosaminoglicano(s), agente(s) desturgescente(s), fuente(s) de energía, sistema(s) tampón(es), antioxidante(s), agentes estabilizadores de membranas, agente(s) antibiotico(s) y/o agente(s) antimicótico(s), precursores de ATP o energía, suplementos nutrientes de la célula, coenzimas y suplementos de enzimas, precursores de nucleótidos, suplementos hormonales, aminoácidos no esenciales, minerales trazas, elementos trazas y factore(s) de crecimiento que aumentan el metabolismo de la célula, el curado de las heridas y la viabilidad de las células. La proliferación celular es regulada por los acontecimientos que conducen a la síntesis del DNA; tanto si una célula está activa, como si no lo está, en la síntesis de la DNA o está detenida en las primeras etapas del ciclo celular célula es dependiente de condiciones extracelulares. El metabolismo celular puede ser aumentado por la adición de componentes nutritivos esenciales aumentando el transporte de hexosas, la síntesis de proteínas, y el transporte de aminoácidos e iones.
Las nuevas soluciones que contienen nutrientes definidas están exentas de suero. Estas soluciones pueden ser utilizadas como soluciones conservantes de córneas humanas, que mantienen las córneas humanas iguales que las soluciones que contienen suero. Aunque las soluciones suplementadas con suero pueden estimular la mitosis en células de córneas humanas en cultivo de tejido, la presencia del suero en los productos para el uso con tejidos para trasplante humano presenta muchas desventajas. El suero puede ser un agente para la transmisión de muchas enfermedades, tales como enfermedades virales, lo más notablemente posible las TSE antes citadas. Los sueros de origen no humano contienes muchas sustancias capaces de provocar una respuesta inmune, y todos los sueros contienen algunas sustancias tales como endotoxinas, y factores de crecimiento que retardan realmente la mitosis de las células. Las soluciones de conservación de córneas son bien conocidas. Los medios de almacenamiento de córneas exentos de suero comercialmente disponibles para la conservación a 4ºC consisten en Optisol y Optisol-GS, y están disponibles de Bausch & Lomb, Surgical (Irvine, CA). Estos medios fueron desarrollados por D.L. Skelnik, B.S., y R.L. Lindstrom, M.D. El medio que contiene suero comercialmente disponible para el cultivo del órgano está disponible en Opsia (Francia). No hay medios exentos de suero para el cultivo del órgano disponibles o en uso actualmente.
Las soluciones de nutrientes y electrólitos están bien definidas en la técnica de cultivo de tejidos. Tales soluciones contienen los nutrientes y los electrólitos esenciales en las concentraciones mínimas necesarias para el mantenimiento de la célula y el crecimiento de la célula. Las composiciones reales de las soluciones pueden variar grandemente. En general, contienen sales inorgánicas, tales como sales carbonatos, nitratos, fosfatos, cloruros, y similares de magnesio, de calcio, de hierro, de sodio y de potasio, aminoácidos esenciales y no esenciales y otros nutrientes esenciales. Los medios nutrientes básicos químicamente definidos están disponibles, por ejemplo, en Gibco BRL (Grand Island, NY) y Sigma (St. Louis, MO) con los nombres Medio Esencial Mínimo (MEM) y medio TC199. Las soluciones de almacenamiento de córneas se han adaptado a partir de estos medios nutrientes. La base de solución médica exenta de suero definida de la presente invención se compone de los componentes encontrados en el MEM y el medio TC199 suplementados con glicosaminoglicano(s), agente(s) desturgescentes, fuente(s) de energía, sistema(s) tampón(es), antioxidante(s), agentes estabilizadores de membranas, agente(s) antibiótico(s) y/o del antimicótico(s), precursores de ATP o de energía, suplementos nutrientes de la célula, coenzimas y suplementos de enzima, precursores de nucleótidos, suplementos hormonales, aminoácidos no esenciales, minerales trazas, elementos trazas y factore(s) de crecimiento.
Breve descripción de los dibujos
Otros objetos de la presente invención y de muchas de las ventajas acompañantes de la presente invención serán apreciados fácilmente dado que los mismos se entienden mejor con referencia a la descripción detallada siguiente cuando está considerada junto con los dibujos que se acompañan, en los cuales los números de referencia designan partes iguales a través de sus figuras y en donde:
Figura 1 - Los efectos de medios con suero y medios exentos de suero en las células endoteliales de córneas humanas.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
Figura 1 - Las soluciones médicas exenta de suero definidas preferidas para uso en la composición y los métodos de esta invención contienen una solución acuosa de nutrientes y electrólitos (por ejemplo, el Medio Esencial Mínimo y/o el medio TC199; un glicosaminoglicano (por ejemplo, sulfato de condroitina, sulfato de dermatina, sulfato de heparina, sulfato de heparano, sulfato queratano y/o ácido hialúronico) en el intervalo del 0,001 mg/ml a 1,0 gramo/ml; un agente desturgescente (por ejemplo, dextrano, sulfato de dextrano, hidroxipropilmetil-celulosa, carboximetilcelulosa, goma celular, alginato del sodio, albúmina, hidroxietil-almidón, hidroxetil-celulosa, dextrosa, glucosa y/o ciclodextrina) en el intervalo de 0,001 mg/ml a 1,0 gramo/ml; una fuente de energía (glucosa, piruvato, sacarosa, fructosa y/o dextrosa) en un intervalo de 0,01 mM a 10 mM; un sistema tampón (por ejemplo, bicarbonato de sodio, acetato de sodio, citrato de sodio, fosfato de sodio y/o tampón HEPES) en un intervalo de 0,01 mM a 10 mM; un antioxidante (por ejemplo, ácido L-ascórbico, 2-mercaptoetanol, glutation, alfa-tocoferol, acetato de alfa-tocoferol, fosfato del alfa-tocoferol, y/o selenio) en un intervalo de 0,001 \muM a 10 mM; un componente estabilizador de membranas (por ejemplo, vitamina A, vitamina B, ácido retinoico, ácido trans-retinoico, acetato de retinol, etanolamina, fosfoetanolamina, transferrina, lecitina, \beta-sitosterol y/o L-\alpha-fosfatidil-colina) en un intervalo de 0,001 pg/ml a 500 mg/mI; un antimicótico y/o un antibiótico (por ejemplo, gentamicina, kanamicina, neomicina, vancomicina, tobramicina, clindamicina, estreptomicina, levofloxacina, penicilina, ciclosporina, amfotericina B y/o nistatina) en el intervalo del 0,001 \mug/ml a 100 mg/ml; precursores de ATP o de energía (por ejemplo, adenosina, inosina, adenina, dinucleótido de flavina-adenina, uridin-5'-trifosfato Na, 5'-metilcitosina, \beta-NAD y/o \beta-NADP Na) en el intervalo de 0,001 mM a 10 mM; suplementos nutrientes de la célula (por ejemplo, alanil-glutamina, glicil-glutamina, ácido L-amino-n-butírico, L-arginina, D-biotina, betaina HCl, D-carnitina, calciferol, caroteno, colesterol, L-cistina, L-cisteína, ácido L-glutámico, D-glucosamina, glucuronato, D-glucuronolactona, L-hidroxiprolina, hipoxantina, L-inositol, glicina, L-ornitina, L-prolina, L-serina, mio-inositol, menadiona, niacina, ácido nicotínico, ácido p-amino-benzoico, ácido D-pantoténico, piridoxal-5-fosfato, piridoxina HCl, taurina, timidina, xantina y/o vitamina B12) en un intervalo del 0,001 \muM a 10 mM; coenzimas y suplementos de enzimas (por ejemplo, acetil-coenzima A, cocarboxilasa, coenzima A, coenzima Q10 y/o coenzima K) en un intervalo de 0,001 \muM a 10 mM; precursores de nucleótidos (por ejemplo, 2'-desoxiadenosina, 2'-desoxicitidina HCl, 2'-desoxi-guanosina, 2-desoxi-D-ribosa y/o D-ribosa) en un intervalo de 0,001 \muM a 10 mM; suplementos hormonales (por ejemplo, \beta-estradiol, progesterona, testosterona, cortisol, corticosterona, tiroxina, hormona estimuladora del tiroides y/o calcitonina) en un intervalo de 0,001 pg/ml a 0,100 mg/ml; aminoácidos no esenciales (por ejemplo, L-alanina, L-asparagina, ácido L-aspártico, ácido L-glutámico, glicina, L-prolina y/o L-serina) en el intervalo de 0,001 \mug/ml a 100 mg/ml; minerales trazas y elementos trazas (por ejemplo, CuSO_{4} 5H_{2}O, ZnSO_{4} 7H_{2}O, selenito Na, citrato férrico, MnSO_{4}.H_{2}O, NaSiO_{3}.9H_{2}O, ácido molíbdico, NH_{4} VO_{3}, NiSO_{4}.6H_{2}O, SnCl_{2}, AgNO_{3}, Ba(C_{2}H_{3}O_{2})_{2}, KBr, CdCl_{2}, CoCl_{2}, CrCl_{3}, NaF, GeO_{2}, KI, RbCI, ZrOCl_{2}.8H_{2}O) en el intervalo de 0,001 pg/ml a 0,100 mg/ml; factores de crecimiento (animal, animal recombinante, recombinante humano o natural); PDGF-BB, PDGF-AA, factor de crecimiento nervioso, factor de células madres, factor \alpha de crecimiento transformante, factor \beta de crecimiento transformante cimiento, factor \beta de crecimiento endotelial, factor de crecimiento endotelial vascular, factor \beta endotelial de crecimiento celular, factor de crecimiento epidérmico, péptido activador de neutrofilos epiteliales, factor del crecimiento similar a EGF fijador de heparina, factor de crecimiento fibroblástico ácido, factor de crecimiento fibroblástico básico, IGF-I, IGF-II, factor del crecimiento de queratinocitos, factor de crecimiento endotelial derivado de plaquetas, insulina) en el intervalo de 0,001 pg/ml a 0,100
mg/ml.
La solución médica exenta de suero de esta invención se compone de una solución acuosa definida de nutrientes y electrólitos, suplementada con glicosaminoglicano(s), agente(s) desturgescente(s), fuente(s) de energía, sistema(s) tampón(es), antioxidante(s), agentes estabilizadores de membranas, agente(s) antibiótico(s) y/o antimicóticos, precursores de ATP o de energía, suplementos nutrientes de la célula, coenzimas y suplementos de enzima, precursores de nucleótidos, suplementos hormonales, aminoácidos no esenciales, minerales trazas, elementos trazas y factore(s) de crecimiento en cantidades suficientes aumentar el metabolismo de la célula, la viabilidad de la célula y la curación de heridas después de almacenamiento del cultivo del órgano. Las córneas extirpadas asépticamente se transfieren a envases de la solución de almacenamiento de córneas, que luego se sellan. Para el almacenamiento estas córneas se almacenan a (2ºC a 38ºC) óptimamente a 31ºC-37ºC. Estas córneas se almacenan hasta 28 días, cambiando el medio el día 14. En el momento del trasplante las córneas se adelgazan con la solución que contiene un agente desturgescente. En el momento del trasplante, la desturgescencia córneal normal se mantiene intraoperatoriamente y post-operatoriamente. Se mantiene la función y el metabolismo endotelial, permitiendo la hidratación permanente de la córnea, y manteniendo por tanto constante el espesor y la transparencia después de la operación. Además de proporcionar una córnea viable para el trasplante, se potencia la curación de la herida. En la presente invención se pueden hacer varias modificaciones sin salirse de su alcance evidente. Por ejemplo, la solución médica exenta de suero se puede utilizar en cualquier aplicación médica, y no se limita estrictamente a la oftalmología. La invención se ilustra más a fondo por los ejemplos siguientes, que no se pretende que sean limitativos
Modo de operación
La conservación del cultivo del órgano debe proporcionar la conservación del tejido capaz de prologar el estado funcional del endotelio córneal. Cada uno de los componentes enumerados en el Apéndice I anexo se ensayó en modelos del cultivo de células con endotelio corneal humano, queratocitos estromales corneales humanos y células epiteliales de córneas humanas para determinar las concentraciones óptimas. Los ejemplos siguientes se basan en la formulación final para ilustrar el efecto que la formulación tenía en estos tipos de células. Una vez que se obtuvieron las concentraciones óptimas en modelos de cultivos celulares las formulaciones de ensayo se probaron luego en córneas humanas.
Ejemplo uno Efectos de una solución médica exenta de suero definida y de medio que contiene suero en células endoteliales de córneas humanas
El medio de cultivo estándar del órgano utiliza MEM suplementado con suero de vacuno fetal al 2,0%. Un medio exento de suero que ha de ser utilizado para el cultivo del órgano debe soportar el crecimiento celular endotelial de córneas humanas de la célula igual que el MEM suplementado con 2,0% de FBS. Este estudio se realizó para evaluar la solución médica exenta de suero definida (Apéndice I) para el crecimiento celular endotelial de córneas humanas frente a MEM exento de suero, conteniendo el MEM 2,5% de FBS, 5,0% de FBS, 10% de FBS y Optisol-GS comercial. Las soluciones de ensayo se evaluaron en un bioensayo fluorogénico de calceína AM con células endoteliales de córneas humanas (abreviadamente HCE por la expresión inglesa human corneal endothelial). Las técnicas del aislamiento desarrolladas en nuestro laboratorio han permitido el establecimiento de subcultivos primarios y subsiguientes de células endoteliales de córneas humanas. Las condiciones in vitro mantienen estas células endoteliales de córneas humanas en un estado proliferativo, experimentando activamente la mitosis. El cultivo celular ofrece un sistema modelo en el que pueden ser estudiadas estas células. Se ha desarrollado un bioensayo cuantitativo para determinar los efectos de las diversas soluciones de ensayo en la estímulación o la inhibición de la división de células endoteliales según se mide por la cuantificación de calceína-esterasa. Se usó un bioensayo fluorogénico de calceína AM para medir la actividad total de la enzima esterasa que es directamente proporcional al número de células. Se usó un ensayo de Wilcoxen Signed-Rank para evaluar la significación estadística (p<0,05) entre los grupos de ensayo y los grupos de control. Este estudio se realizó en Insight Biomed, Inc., Minneapolis, MN.
Bioensayo cuantitativo fluorescente de calceína AM
Las células vivas se distinguen por la presencia de la actividad intracelular ubicua de esterasa, determinada por conversión enzimática de la calceína AM permeante celular virtualmente no fluorescente en calceína intensamente fluorescente. La calceína polianiónica se conserva bien dentro de las células vivas, produciendo una fluorescencia verde (530 nm) uniforme e intensa en células vivas.
Calceína AM (no fluorescente) + esterasas = calceína (producto fluorescente)
La calceína, que es el producto de la acción de esterasa sobre la calceína AM, es un derivado polar de fluoresceína que se conserva mejor en las células viables y es 2,5 veces más brillante que BCECF. Los máximos de excitación y de emisión son 485 nm y 530 nm respectivamente.
Cultivos de células endoteliales de córneas humanas
Placas de cultivo de tejidos de noventa y seis pocillos se sembraron con 1 x 10^{3} células/pocillo en un volumen final 200 \mul del medio designado. Células de HCE de tercer pase se mantuvieron en una incubadora humectada a 35,5ºC en una atmósfera de 95% de aire y 5% de CO_{2}. Después de 1 día de incubación en CSM suplementado con suero vacuno fetal al 10%, se retiró el medio. A continuación las células se lavaron una vez y se incubaron con las soluciones apropiadas del ensayo o de control. Las células de HCE se incubaron durante 72 horas. Al final de cada intervalo de tiempo, cada pocillo se lavó dos veces con 200 \mul de solución salina tamponada con fosfato modificada de Dulbecco. Luego las células de HCE se incubaron con 100 \mul/pocillo de solución de calceína AM 2 \muM (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) y se leyeron inmediatamente en un sistema de medida de la fluorescencia CytoFluor^{TM} 2300 de Millipore. Para medir el producto fluorescente se usó una longitud de onda de excitación de 485/20 nm y el filtro de la longitud de onda de la emisión de 530/25 nm ajustado (a sensibilidad 5). Se empleó un ensayo Wilcoxen Signed-Rank para evaluar la significación estadística (p<0,05) entre los grupos de ensayo y de control.
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1
Discusión
Este estudio se realizó para evaluar la solución médica exenta de suero definida (Apéndice I) para el crecimiento de células endoteliales de córnea humanas frente a MEM exento de suero, conteniendo el MEM 2,5% de FBS, 5,0% de FBS, 10% de FBS y Optisol-GS comercial. Las soluciones de ensayo se evaluaron en un bioensayo fluorogénico de calceína AM con células endoteliales de córneas humanas (HCE). Se ha desarrollado un bioensayo cuantitativo para determinar los efectos de las diversas soluciones de ensayo en la estimulación o la inhibición de la división celular de células endoteliales según se mide por cuantificación de la calceína-esterasa. Se utilizó un bioensayo fluorogénico de calceína para medir la actividad enzimática total de la esterasa que es directamente proporcional al número de células. Se usó un ensayo Wilcoxen Signed-Rank para evaluar la significación estadística (p<0,05) entre los grupos de ensayo y los grupos de control.
Las células endoteliales de córneas humanas incubadas con las soluciones MEM y Optisol GS exhibieron una disminución estadística significativa de la fluorescencia total de la calceína con respecto al medio de control de MEM con 2,5% de FBS. Las células endoteliales de córneas humanas incubadas con las soluciones médicas exenta de suero definidas (Apéndice I) exhibieron un aumento estadístico significativo de fluorescencia total del calceína con respecto al medio del control de MEM con 2,5% de FBS. Las células endoteliales de córneas humanas incubadas con MEM con 5,0% de FBS y MEM con 10,0% de FBS exhibieron un aumento estadístico significativo de fluorescencia total de calceína con respecto al medio del control de MEM con 2,5% de FBS. La conclusión que se puede sacar de estos datos es que la solución médica exenta de suero definida (Apéndice I) era capaz de mantener la fluorescencia total de calceína (número total de las células de HCE) estadísticamente mayor que medio del control de MEM con 2,5% de FBS. Por lo tanto, esta solución es aceptable para el uso en cultivo del órgano como solución de conservación de la córnea para el trasplante de córneas humanas según lo definido por los parámetros de este bioensayo.
Ejemplo dos Un estudio comparativo de solución médica exenta de suero y de un medio estándar de MEM con 2% de FBS con córneas humanas
Córneas de donantes humanos se sumergieron en yodo-povidona al 1% en solución salina normal durante tres minutos, seguido por una inmersión de un minuto en solución salina normal. Los globos se lavaron luego con 12 cc de solución salina normal con una jeringuilla provista de una aguja de calibre 18. Veinte córneas apareadas de donantes inadecuados para trasplante debido a edad o causa de muerte fueron retiradas a un banco de ojos certificado una media de 12,0 horas después de la muerte y colocadas en Optisol-GS comercial (Bausch and Lomb, Surgical) a 4ºC. Los globos de los donantes se transportaron al laboratorio de investigación. Uno de cada par se colocó en 100 ml (Apéndice I) de medio exento de suero. Las córneas apareadas se colocaron en 50 ml de MEM que contenía L-glutamina, HEPES, penicilina, estreptomicina, amfotericina B y 2% de FBS. Las córneas se suspendieron en una sutura de seda 4.0. Cada uno de los frascos que contenían las córneas se cerró y guardó a 35ºC durante 14 días. Al finalizar dicho tiempo, se retiraron 10 pares de córneas y se pusieron en medio fresco apropiado y se almacenaron durante otros 14 días. En los días 14 y 28, las córneas almacenadas en medio exento de suero (Apéndice I) se colocaron luego en Optisol-GS comercial a 35ºC durante 24 horas. Las córneas apareadas almacenadas en MEM con 2% de FBS se colocaron en MEM que contenía 6% de dextrano T500 a 35ºC durante 24 horas. Debido a la hidratación creciente de la córnea a las temperaturas elevadas, las córneas necesitaron ser adelgazadas por este procedimiento. Las córneas se evaluaron después de ser adelgazadas por los métodos siguientes. El espesor de las córneas se midió por evaluación microscópica con un micrómetro. El endotelio córneo se evaluó tiñéndolo con azul tripán al 0,1% y rojo de alizarina S después de que se tomaran las medidas del espesor corneal final. El espesor de la córnea en el período de la incubación de 14 días era 0,386 \pm 0,049 mm y 0,479 \pm 0,078 mm, respectivamente, para el medio exento de suero (del Apéndice I) y MEM con 2% de FBS. Las córneas almacenadas en el medio exento de suero (Apéndice I) demostraron una disminución estadística significativa (p<0,05) del espesor corneal en comparación con las córneas almacenadas en el medio de MEM con 2% de FBS. Las córneas almacenadas en el medio exento de suero (Apéndice I) tenían recuentos de células endoteliales de 2716 \pm 712 células/mm^{2} en comparación con 2573 \pm 753 célula/mm^{2} para las córneas almacenadas en MEM con 2% de FBS. No había diferencia estadísticas entre estos dos grupos en relación a recuentos de células endoteliales. Todos las monocapas de células endoteliales estaban intactas, con la morfología endotelial normal de la célula para el medio exento de suero (Apéndice I) y los grupos almacenados en MEM con 2% de FBS. El epitelio córneo estaba intacto en ambos grupos. El espesor de la córneas en el período de incubación de 28 días era 0,343 \pm 0,015 mm y 0,379 \pm 0,015 mm, respectivamente, para el medio exento de suero (Apéndice I) y el MEM con 2% de FBS. Las córneas almacenadas en el medio exenta de suero (Apéndice I) demostraron una disminución estadística significativa (p<0,05) del espesor de las córneas respecto a las córneas almacenadas en el medio MEm con 2% de FBS. Las córneas almacenadas en el medio exento de suero (Apéndice I) tenían recuentos de células endoteliales de 2451 \pm 617 células/mm^{2} en comparación con 2422 \pm 570 célula/mm^{2} para las córneas almacenadas en MEM con 2% de FBS. No había diferencia estadística entre estos dos grupos con relación a recuentos de células endoteliales. Todos las monocapas de células endoteliales estaban intactas, con la morfología endotelial normal de las células para el medio exento de suero (Apéndice I) y los grupos almacenados en MEM con 2% de FBS. El epitelio córneal estaba intacto en ambos
grupos.
En conclusión, de los resultados de este estudio comparativo, se aprecia que las córneas almacenadas durante 14 y 28 días en medio exento de suero (Apéndice I) podían mantener el endotelio córneo viable igual en rendimiento que las córneas almacenadas en MEM con 2% de FBS. Este medio exento de suero (Apéndice I) era eficaz en mantener normales la función y el metabolismo córneos de las células. Por lo tanto, este medio exento de suero (Apéndice I) es aceptable para el uso como medio de conservación del cultivo del órgano.
Las soluciones médicas exentas de suero de la invención tienen las características útiles siguientes:
mantienen y aumentan la conservación de los tejidos del ojo de mamíferos después de estar en contacto con dicha solución;
mantienen y aumentan la conservación de los tejidos del ojo de mamíferos después de estar en contacto con dicha solución antes o después de uso quirúrgico de un láser;
mantienen y aumentan la conservación de los tejidos del ojo de mamíferos después de estar en contacto con dicha solución antes o después de estados degenerativos del ojo;
mantienen y aumentan la conservación de los tejidos del ojo de mamíferos después de estar en contacto con dicha solución antes o después de cirugía;
mantienen y aumentan la conservación de tejidos de mamíferos después de estar en contacto con dicha solución;
En la presente invención se pueden efectuar diversas modificaciones sin salirse de su alcance evidente.
Se adjunta el Apéndice I. Solución médica exenta de suero definida.
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2
3
4

Claims (302)

1. Una solución médica exenta de suero definida, que consiste esencialmente en cantidades eficaces de:
a.
una solución acuosa de nutrientes y electrólitos;
b.
un glicosaminoglicano;
c.
un agente desturgescente;
d.
una fuente de energía;
e.
un sistema tampón;
f.
un antioxidante;
g.
agentes estabilizadores de membrana;
h.
un agente antibiótico o antimicótico;
i.
precursores de ATP o de energía;
j.
suplementos nutrientes de la célula;
k.
coenzimas y suplementos de enzimas;
l.
precursores de nucleótidos;
m.
suplementos hormonales;
n.
aminoácidos no esenciales; y
o.
minerales trazas y elementos trazas.
2. Un solución médica exenta de suero definida según la reivindicación 1, que consiste esencialmente en cantidades eficaces de:
a.
Una solución acuosa de nutrientes y electrólitos seleccionada del grupo de:
1.
medio esencial del mínimo (MEM);
2.
Medio TC199 y
3.
una combinación de medio esencial mínimo (MEM) y de medio TC199;
b.
Un glicosaminoglicano en el intervalo de 0,001 mg/ml a 1,0 gramo/ml seleccionado del grupo de:
1.
sulfato del condroitina;
2.
sulfato del dermatina;
3.
sulfato del heparina;
4.
sulfato del heparano;
5.
sulfato queratano y
6.
ácido hialurónico;
c.
Un agente desturgescente en el intervalo de 0,001 mg/ml a 1,0 gramo/ml seleccionado del grupo de:
1.
dextrano;
2.
sulfato de dextrano;
3.
hidroxipropilmetil-celulosa;
4.
carboxilmetilcelulosa;
5.
goma celular;
6.
alginato de sodio;
7.
albúmina;
8.
hidroxietil-almidón;
9.
hidroxietil-celulosa;
10.
dextrosa
11.
glucosa y
12.
ciclodextrina;
d.
Una fuente de energía en un intervalo de 0,01 mM a 10 mM seleccionada del grupo de:
1.
glucosa;
2.
piruvato;
3.
sacarosa;
4.
fructosa y
5.
dextrosa;
e.
Un sistema tampón en un intervalo de 0,01 mM a 10 mM seleccionado del grupo de:
1.
bicarbonato de sodio;
2.
acetato de sodio;
3.
citrato de sodio;
4.
fosfato de sodio y
5.
tampón HEPES;
f.
Un antioxidante en un intervalo de 0,001 \muM a 10 mM seleccionado del grupo de:
1.
ácido L-ascórbico;
2.
2-mercaptoetanol;
3.
glutation;
4.
alfa-tocoferol;
5.
acetato del alfa-tocoferol;
6.
fosfato del alfa-tocoferol y
7.
selenio;
g.
Un componente estabilizador de membranas en un intervalo de 0,001 pg/ml a 500 mg/ml seleccionado del grupo de:
1.
vitamina A;
2.
vitamina B;
3.
ácido retinoico;
4.
ácido trans-retinoico;
5.
acetato de retinol;
6.
etanolamina;
7.
fosfoetanolamina;
8.
transferrina;
9.
lecitina;
10.
\beta-sitosterol y
11.
L-\alpha-fosfatidil-colina;
h.
Un antibiótico y/o un antimicótico en el intervalo de 0,001 \mug/ml a 100 mg/ml seleccionado del grupo de:
1.
gentamicina;
2.
kanamicina;
3.
neomicina;
4.
vancomicina;
5.
obramicina;
6.
clindamicina;
7.
estreptomicina;
8.
levofloxacina;
9.
penicilina;
10.
ciclosporina;
11.
amfotericina B y
12.
nistatina;
i.
Precursores de ATP o de energía en el intervalo de 0,001 mM a 10 mM seleccionados del grupo de:
1.
adenosina;
2.
inosina;
3.
adenina;
4.
dinucleotide de la adenina del flavin;
5.
uridina-5-'trifosfato Na;
6.
5'-metilcitosina;
7.
\beta-NAD y
8.
\beta-NADP Na;
j.
Suplementos nutrientes de células en un intervalo de 0,001 \muM a 10 mM seleccionados del grupo de:
1.
alanil-glutamina;
2.
glicil-glutamina;
3.
ácido L-amino-n-amino-n-butírico;
4.
L-arginina;
5.
D-biotina;
6.
betaína HCl;
7.
D-carnitina;
8.
calciferol;
9.
caroteno;
10.
colesterol;
11.
L-cistina;
12.
L-cisteina;
13.
ácido L-glutámico;
14.
D-glucosamina;
15.
glucoronato;
16.
D-glucuronolactona;
17.
L-hidroxiprolina;
18.
hipoxantina;
19.
L-inositol;
20.
glicina;
21.
L-ornitina;
22.
L-prolina;
23.
L-serina;
24.
mio-inositol;
25.
menadiona;
26.
niacina;
27.
ácido nicotínico;
28.
ácido p-amino-benzoico;
29.
ácido D-pantoténico;
30.
piridoxal-5-fosfato;
31.
piridoxina HCl;
32.
taurina;
33.
timidina;
34.
xantina y
35.
vitamina B12;
k.
Coenzimas y suplementos de enzimas en un intervalo de 0,001 \muM a 10 mM seleccionados del grupo de:
1.
acetil-coenzima A
2.
cocarboxilasa;
3.
coenzima A
4.
coenzima Q10 y
5.
coenzima K;
l.
Precursores de nucleótidos en un intervalo de 0,001 \muM a 10 mM seleccionados del grupo de:
1.
2'-desoxiadenosina;
2.
2'-desoxicitidina HCl;
3.
2'-desoxiguanosina;
4.
2-desoxi-D-ribosa y
5.
D-ribosa;
m.
Suplementos hormonales en un intervalo de 0,001 pg/ml a 0,100 mg/ml seleccionados del grupo de:
1.
\beta-estradiol;
2.
progesterona;
3.
testosterona;
4.
cortisol;
5.
Corticosterona;
6.
tiroxina;
7.
hormona estimuladdora del tiroides y
8.
calcitonina;
n.
Aminoácidos no esenciales en el intervalo de 0,001 \mug/ml a 100 mg/ml seleccionados del grupo de:
1.
L-alanina;
2.
L-asparagina;
3.
ácido L-aspártico;
4.
ácido L-glutámico;
5.
glicina;
6.
L-prolina y
7.
L-serina;
o.
Minerales trazas y elementos trazas en el intervalo de 0,001 pg/ml a 0,100 mg/mI seleccionados del grupo de:
1.
CuSO_{4} 5H_{2}O;
2.
ZnSO_{4} 7H_{2}O;
3.
selenito Na;
4.
citrato férrico;
5.
MnSO_{4} H_{2}O;
6.
NaSiO_{3}9H_{2}O;
7.
ácido molíbdico;
8.
NH_{4}VO_{3}:
9.
NiSO_{4} 6H_{2}O;
10.
SnCl_{2};
11.
AgNO_{3};
12.
Ba(C_{2}H_{3}O_{2})_{2};
13.
KBr;
14.
CdCl_{2};
15.
CoCl_{2};
16.
CrCl_{3};
17.
NaF;
18.
GeO_{2};
19.
KL;
20.
RbCl y
21.
ZrOCl_{2}.8H_{2}O.
3. Una solución médica exenta de suero definida según la reivindicación 1, que también incluye cantidades eficaces de factores de crecimiento (animal, recombinante animal, recombinante humano, o natural).
4. Una solución médica exenta de suero definida según la reivindicación 3, que consiste esencialmente en cantidades eficaces de:
a.
una solución acuosa de nutrientes y electrólitos seleccionada del grupo de:
1.
Medio esencial Mínimo (MEM);
2.
medio TC199 y
3.
Una combinación de Medio Esencial Mínimo (MEM) y de medio TC199;
b.
Un glicosaminoglicano en el intervalo de 0,001 mg/ml a 1,0 gramo/ml seleccionado del grupo de:
1.
sulfato de condroitina;
2.
sulfato de dermatina;
3.
sulfato de heparina;
4.
sulfato de heparano;
5.
sulfato de keratano y
6.
ácido hialurónico;
c.
Un agente desturgescente en el intervalo de 0,001 mg/ml a 1,0 gramo/ml seleccionado del grupo de:
1.
dextrano;
2.
sulfato de dextrano;
3.
hidroxipropilmetil-celulosa;
4.
carboximetilcelulosa;
5.
goma celular;
6.
alginato de sodio;
7.
albúmina;
8.
hidroxietil-almidón;
9.
hidroxietil-celulosa;
10.
dextrosa
11.
glucosa y
12.
ciclodextrina;
d.
Una fuente de energía en un intervalo de 0,01 mM a 10 mM seleccionada del grupo de:
1.
glucosa;
2.
piruvato;
3.
sacarosa;
4.
fructosa y
5.
dextrosa;
e.
Un sistema tampón en un intervalo de 0,01 mM a 10 mM seleccionado del grupo de:
1.
bicarbonato de sodio;
2.
acetato del sodio;
3.
citrato de sodio;
4.
fosfato del sodio y
5.
Tampón HEPES;
f.
Un antioxidante en un intervalo de 0,001 \muM a 10 mM seleccionado del grupo de:
1.
ácido L-ascórbico;
2.
2-mercaptoetanol;
3.
glutation;
4.
alfa-tocoferol;
5.
acetato del alfa-tocoferol;
6.
fosfato del alfa-tocoferol y
7.
selenio;
g.
Un componente estabilizador de membranas en un intervalo de 0,001 pg/ml a 500 mg/ml seleccionado de un grupo de:
1.
vitamina A;
2.
vitamina B;
3.
ácido retinoico;
4.
ácido trans-retinoico;
5.
acetato de retinol;
6.
etanolamina;
7.
fosfoetanolamina;
8.
transferrina;
9.
lecitina;
10.
\beta-sitosterol y
11.
L-\alpha-fosfatidil-colina;
h.
Un antibiótico y/o un antimicótico en el intervalo de 0,001 \mug/ml a 100 mg/ml seleccionados del grupo de:
1.
gentamicina;
2.
kanamicina;
3.
neomicina;
4.
vancomicina;
5.
obramicina;
6.
clindamicina;
7.
estreptomicina;
8.
levofloxacina;
9.
penicilina;
10.
ciclosporina;
11.
amfotericina B y
12.
nistatina;
i.
Precursores de ATP o de energía en el intervalo de 0,001 mM a 10 mM seleccionados del grupo de:
1.
adenosina;
2.
inosina;
3.
adenina;
4.
dinucleótido de flavina-adenina;
5.
uridina-5'-trifosfato Na;
6.
5'-metilcitosina;
7.
\beta-NAD y
8.
\beta-NADP Na;
j.
Suplementos nutrientes de la célula en un intervalo de 0,001 \muM a 10 mM seleccionados del grupo de:
1.
alanil-glutamina;
2.
glicil-glutamina;
3.
ácido L-amino-n-butírico;
4.
L-I-arginina;
5.
D-d-biotina;
6.
betaína HCl;
7.
D-carnitina;
8.
calciferol;
9.
caroteno;
10.
colesterol;
11.
L-cistina;
12.
L-cisteina;
13.
ácido L-glutámico;
14.
D-glucosamina;
15.
glucoronato;
16.
D-glucuronolactona;
17.
L-hidroxiprolina;
18.
hipoxantina;
19.
L-inositol;
20.
glicina;
21.
L-ornitina;
22.
L-prolina;
23.
L-serina;
24.
mio-inositol;
25.
menadiona;
26.
niacina;
27.
ácido nicotínico;
28.
ácido p-amino-benzoico;
29.
ácido D-pantoténico;
30.
piridoxal-5-fosfato;
31.
piridoxina HCl;
32.
taurina;
33.
timidina;
34.
xantina y
35.
vitamina B12;
k.
Coenzimas y suplementos de enzimas en un intervalo de 0,001 \muM a 10 mM seleccionados del grupo de:
1.
acetil-coenzima A;
2.
cocarboxilase;
3.
coenzima A
4.
coenzima Q10 y
5.
coenzima K;
l.
Precursores de nucleótidos en un intervalo de 0,001 \muM a 10 mM seleccionados del grupo de:
1.
2'-desoxiadenosina;
2.
2'-desoxicitidina HCl;
3.
2'-desoxiguanosina;
4.
2-desoxi-D-ribosa y
5.
D-ribosa;
m.
Suplementos hormonales en un intervalo de 0,001 pg/ml a 0,100 mg/ml seleccionados del grupo de:
1.
\beta-estradiol;
2.
progesterona;
3.
testosterona;
4.
cortisol;
5.
corticosterona;
6.
tiroxina;
7.
hormona estimuladora del tiroides y
8.
calcitonina;
n.
Aminoácidos no esenciales en el intervalo de 0,001 \mug/ml a 100 mg/ml seleccionados del grupo de:
1.
L-alanina;
2.
L-asparagina;
3.
ácido L-aspártico;
4.
ácido L-I-glutámico;
5.
glicina;
6.
L-prolina y
7.
L-serina;
o.
Minerales trazas y elementos trazas en el intervalo del 0,001 pg/ml a 0,100 mg/ml seleccionados del grupo de:
1.
CuSO_{4} 5H_{2}O;
2.
ZnSO_{4} 7H_{2}O;
3.
selenito Na;
4.
citrato férrico;
5.
MnSO_{4} H_{2}O;
6.
NaSlO_{3} 9H_{2}O;
7.
ácido molíbdico;
8.
NH_{4}VO_{3}:
9.
NiSO_{4} 6H_{2}O;
10.
SnCl_{2};
11.
AgNO_{3};
12.
Ba(C_{2}H_{3}O_{2})_{2};
13.
KBr;
14.
CdCl_{2};
15.
CoCl_{2};
16.
CrCl_{3};
17.
NaF;
18.
GeO_{2};
19.
Kl;
20.
RbCl y
21.
ZrOCl_{2}.8H_{2}O;
p.
Factores de crecimiento (animal, recombinante animal, recombinante humano, o natural) en el intervalo de 0,001 pg/ml a 0,100 mg/ml seleccionados del grupo de:
1.
PDGF-BB;
2.
PDGF-AA;
3.
factor de crecimiento nervioso;
4.
factor \beta de crecimiento nervioso;
5.
factor de células madres;
6.
factor \alpha de crecimiento transformante:
7.
factor \alpha de crecimiento transformante \beta;
8.
factor de crecimiento endotelial vascular;
9.
factor \beta de crecimiento celular endotelial;
10.
factor de crecimiento epidérmico;
11.
péptido activador de neutrófilos epiteliales;
12.
factor de crecimiento similar a EGF fijador de heparina;
13.
factor de crecimiento fibroblástico ácido;
14.
factor de crecimiento fibroblástico básico;
15.
IGF-I;
16.
IGF-II;
17.
factor del crecimiento de queratinocitos;
18.
factor de crecimiento celular endotelial derivado de plaquetas;
19.
insulina y
20.
factor del crecimiento de hepatocitos.
\newpage
5. Una solución médica exenta de suero definida según la reivindicación 3 ó 4, que mantiene y aumenta la conservación de los tejidos del ojo a 2ºC-38ºC, con un pH fisiológico.
6. Una solución médica exenta de suero definida según la reivindicación 3 ó 4, mantiene y aumenta la conservación de los tejidos del ojo a 16ºC- 38ºC, con un pH fisiológico.
7. Un método de tratar un tejido del ojo para uso en cirugía del ojo, caracterizado porque comprende mantener el tejido en contacto con una solución exenta de suero definida según cualesquiera de las reivindicaciones precedentes en el período que transcurre entre retirar el tejido de un donante e implantarlo en un receptor.
8. Una solución médica exenta de suero definida según la reivindicación 1, 2, 3 ó 4, en donde dicha solución mantiene y aumenta la conservación de los tejidos del ojo de mamíferos después de estar en contacto con dicha solución.
9. Una solución médica exenta de suero definida según la reivindicación 1, 2, 3 ó 4, en donde dicha solución mantiene y aumenta la conservación de los tejidos f del ojo de mamíferos después de estar en contacto con dicha solución antes o después de uso quirúrgico de un láser.
10. Una solución médica exenta de suero definida según la reivindicación 1, 2, 3 ó 4, en donde dicha solución mantiene y aumenta la conservación de los tejidos del ojo de mamíferos después de estar en contacto con dicha solución antes o después de estados degenerativos del ojo.
11. Una solución médica exenta de suero definida según la reivindicación 1, 2, 3 ó 4, en donde dicha solución mantiene y aumenta la conservación de los tejidos del ojo de mamíferos después de estar en contacto con dicha solución antes o después de cirugía
12. Una solución médica exenta de suero definida según la reivindicación 1, 2, 3 ó 4, en donde dicha solución mantiene y aumenta la conservación de tejidos del ojo de mamíferos después de estar en contacto con dicha solución.
13. Una solución médica exenta de suero definida según la reivindicación 1 ó 2, en donde dicha solución mantiene y aumenta la conservación de los tejidos del ojo de mamíferos a 2ºC-38ºC con un pH fisiológico.
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