CN102726370B - 一种角膜缘组织的保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种角膜缘组织的保存方法，包括对新鲜角膜缘组织进行消毒的步骤以及对消毒后的新鲜角膜缘组织进行空气暴露保存的步骤。该空气暴露保存的步骤是将新鲜角膜缘组织置于可透水的铺膜上，该铺膜下为可提供角膜缘组织营养成分的保存液或细胞培养基，角膜上皮则直接与空气接触，该空气暴露保存的培养环境温度为0-37℃，氧气浓度为0-20%。与传统浸没保存相比，本发明角膜缘组织结构保存更完整，角膜上皮不会出现明显凋亡，角膜缘干细胞能保持较高活性，并且还具有制作流程简单、可靠、易于实施和成本低等功效。
Description
技术领域
本发明涉及移植材料的保存领域，更具体的说涉及一种角膜缘组织的保存方法。
背景技术
角膜缘组织在许多在角膜缘上皮干细胞缺乏(limbal stem cell deficiency)或功能障碍（limbal stem cell dysfunction）、边缘角膜变性和角膜缘肿瘤等疾病中被广泛应用。在该治疗中重要问题之一是从供体取出角膜缘组织并予以保持使之存活。
1992年，Kaufman报告了Optisol角膜活性保存液，使眼库对角膜片的保存在2-3周内应用安全可靠，成为全世界眼库保存角膜片行穿透性角膜移植首选采用的保存液，而在国内主要是应用2-4°湿房保存法。传统的角膜移植以穿透性角膜移植术（penetrating keratoplasty，PKP）为主流术式，为考虑角膜植片满足穿透性角膜移植而侧重于提供角膜活性好内皮，即角膜保存的关键是保存角膜内皮细胞的活性，因此关于角膜保存液成分的改良研究主要是围绕着如何提高角膜内皮细胞活性而进行的。
随着手术技术的进步、医疗器械的发展，临床上角膜移植手术逐渐向成分角膜移植方向发展，即只移植患者角膜中发生病变的上皮、基质或内皮部分，如角膜缘干细胞、角膜上皮移植、板层角膜基质移植、带内皮的板层基质移植，以及单纯内皮移植等，显著拓宽了适应症，术后并发症少，光学效果更好，但也给成分角膜的保存带来了一些新的挑战。传统角膜材料在保存期间，会失去上皮，甚至损伤基底膜，一定程度上限制了角膜缘活性组织的临床应用。
角膜缘组织是角膜与结膜、巩膜之间的一个区带，角膜缘的解剖结构与角膜不同，主要由上皮细胞层、疏松纤维组织层和主质层构成，其表面不光滑，有很多放射状突起，自巩膜缘开始到角膜逐渐消失。考虑到角膜缘上皮基底层，则存在有上皮干细胞、黑色素细胞、郎罕氏细胞等。在角膜缘上皮与基质之间有胶原、整合素、N-钙黏素等。而在角膜缘基质，则含有丰富血管、淋巴管和神经，从而给予角膜缘组织提供充分的营养。因此为保存角膜缘组织最大活性，需要尽最大可能模拟角膜的生理环境并提供所需的营养物质。
发明内容
本发明的目的在于提供一种角膜缘组织的保存方法，其保存的角膜缘组织生物学特性与新鲜角膜缘接近、上皮结构完整、生物活性高、凋亡细胞上皮破坏少、易于手术操作、无异常分化、运输及保存方便，能被广大患者接受并应用于临床。
为了达成上述目的，本发明的解决方案是：
一种角膜缘组织的保存方法，其中，包括对新鲜角膜缘组织进行消毒的步骤以及对消毒后的新鲜角膜缘组织进行空气暴露保存的步骤。
进一步，该对新鲜角膜缘组织进行消毒的步骤是将新鲜角膜缘组织用含抗菌素的磷酸盐缓冲液浸泡和冲洗，浸泡时间为5-10min，冲洗至少3次，每次大于或等于5min。
进一步，该抗菌素选自5万U/L青霉素、8万U/L妥布霉素、100mg/L链霉素中的一种或两种以上的组合。
进一步，该空气暴露保存的步骤是将新鲜角膜缘组织置于可透水的铺膜上，该铺膜下为可提供角膜缘组织营养成分的保存液或细胞培养基，角膜上皮则直接与空气接触，该空气暴露保存的培养环境温度为0-37℃，氧气浓度为0-20%。
进一步，该铺膜选择硝酸纤维素膜、乙酸纤维素膜或微孔滤膜中的一种。
进一步，该铺膜中的孔径选自0.1μm～5.0μm，厚度为100-140μm。
进一步，该保存液或细胞培养基选自Optisol中期保存液、DMEM培养基、SHEM培养基、血清或多种细胞因子中的一种或多种。
采用上述结构后，本发明对角膜缘组织进行的保存是直接采用空气暴露保存的方式，其模拟了正常生理泪眼环境，其与传统浸没保存相比，角膜缘组织结构保存更完整，角膜上皮不会出现明显凋亡，角膜缘干细胞能保持较高活性，并且还具有制作流程简单、可靠、易于实施和成本低等功效。
附图说明
图1为本发明涉及一种角膜缘组织的保存方法的流程示意图；
图2为角膜缘组织采用本发明涉及保存方法与传统浸没保存方法后的状态对比示意图；
图3为角膜缘组织采用本发明涉及保存方法后的免疫荧光染色分析图；
图4为角膜缘组织采用本发明涉及保存方法后的免疫荧光染色和免疫组织化学染色分析图；
图5为角膜缘组织采用本发明涉及保存方法后的TUNEL荧光染色分析图；
图6A和图6B分别为角膜缘组织采用本发明涉及保存方法后的细胞克隆培养和技术分析图；
图7为采用本发明方法保存的角膜缘组织上皮在保存6天、8天后移植至角膜缘干细胞缺损患者后的裂隙灯和荧光素染色检查图。
图中：
角膜缘组织 1 角膜上皮 2
铺膜 3 杯体 4
保存液 41。
具体实施方式
为了进一步解释本发明的技术方案，下面通过具体实施例来对本发明进行详细阐述。
本发明涉及的一种角膜缘组织的保存方法，包括对新鲜角膜缘组织进行消毒的步骤以及对消毒后的新鲜角膜缘组织进行空气暴露保存的步骤。
其中，对新鲜角膜缘组织进行消毒的步骤是将新鲜角膜缘组织用含抗菌素的磷酸盐缓冲液浸泡和冲洗，浸泡时间为5-10min，冲洗至少3次，每次大于或等于5min；作为该抗菌素的进一步细化，该抗菌素选自5万U/L青霉素、8万U/L妥布霉素、100mg/L链霉素中的一种或两种以上的组合。
如图1所示，其为空气暴露保存的一种具体实施方式，其将新鲜角膜缘组织1（即从）置于可透水的铺膜2上，该铺膜2下为可提供角膜缘组织1营养成分的保存液41或细胞培养基，其中角膜上皮2不与铺膜3和杯体4接触，该角膜上皮2直接与空气接触，从而起到模拟正常生理泪眼环境的功效；该空气暴露保存的培养环境温度为0-37℃，氧气浓度为0-20%。
作为铺膜的材料选择，其可以为硝酸纤维素膜、乙酸纤维素膜或微孔滤膜中的一种。而该铺膜中的孔径选自0.1μm～5.0μm，厚度为100-140μm；该孔径具体可以选自0.1μm、0.22μm、0.45μm、0.65μm、1.0μm、3.0μm、5.0μm。
其中，该保存液或细胞培养基可以选自Optisol中期保存液、DMEM培养基、SHEM培养基、血清或多种细胞因子中的一种或多种。
如图2所示，从中可以看出：采用传统浸没保存的角膜缘上皮组织，在保存的第2天组织上皮开始破碎脱落，而以采用本发明方法保存的角膜缘组织上皮在保存至第8天仍较为完整。在各个时间段，角膜上皮的厚度数据如下：
第0天，浸没组上皮平均厚度46.37±3.12μm，空气暴露组上皮平均厚度 45.23±2.43μm；第2天，浸没组上皮平均厚度45.91±4.36μm，空气暴露组上皮平均厚度 49.74±4.28μm；第4天，浸没组上皮平均厚度45.82±4.47μm，空气暴露组上皮平均厚度 51.62±5.05μm；第6天，浸没组上皮平均厚度46.32±5.12μm，空气暴露组上皮平均厚度 50.39±4.54μm；第8天，浸没组上皮平均厚度29.67±4.71μm，空气暴露组上皮平均厚度 46.84±4.83μm，两组差异有统计学意义，p＜0.05。
如图 3所示，经DAPI免疫荧光染色分析，采用本发明方法保存的角膜缘组织上皮在保存0天、2天、4天、6天、8天的过程中，角膜上皮特异性的角蛋白K12表达无明显改变；而且在保存0天、2天、4天、6天、8天后均无皮肤特异性的角蛋白K10表达；K12在角膜缘阳性表达的吸光度值平均值为（3528±1532.83），而K10的吸光度值为0，组内吸光度值差异无统计学意义。
如图4所示，经免疫荧光染色和免疫组织化学染色分析，采用本发明方法保存的角膜缘组织上皮在保存0天、2天、4天、6天和8天的过程中，角膜上皮干细胞特异性标记物K14、Ki67、p63表达无明显改变。K14在角膜的阳性表达的吸光度值为(2854.35±1830.23)，而在Ki67的吸光度值为(881.67±517.96)，p63的吸光度值为(4102.39±2291.51)，组内吸光度值差异无统计学意义。
如图5所示，经TUNEL荧光染色分析，采用本发明方法保存的角膜缘组织上皮在保存0天、2天、4天、6天的过程中，未检测到明显凋亡细胞的存在，在培养至第8天可见少量上皮细胞发生凋亡。
如图6A和6B所示，经细胞克隆培养及克隆计数分析，采用本发明方法保存的角膜缘组织上皮在保存4后克隆细胞数量较0天、2天有一定程度下降，保存4天、6天、8天的角膜缘上皮组织中克隆细胞数量无明显变化。其具体数值如下表所示：
| 组别\时间 | 0d | 2d | 4d | 6d | 8d |
| 空气暴露组 | 9.6±1.2 | 9.2±0.7 | 8.9±1.0 | 8.4±0.6 | 8.5±0.9 |
如图7所示，经裂隙灯和荧光素染色检查，采用本发明方法保存的角膜缘组织上皮在保存6天、8天的角膜缘组织移植给角膜缘干细胞缺损患者可明显改进患者眼表生理状况，患者上皮缺损状况获得明显改善，具体评分如下：
| 组别\时间 | 0d | 2d | 4d | 7d | 30d |
| 空气暴露组 | 4 | 1.35 | 0.5 | 0 | 0 |
上皮缺损评分标准为：0：无上皮缺损，0.25：角膜上皮缺损范围在10%以内，0.5,：角膜上皮缺损在15%以内；0,75：角膜上皮缺损范围在20%以内；1：角膜上皮缺损范围在25%以内；2：角膜上皮缺损范围在26%-50%以内；3：角膜上皮缺损范围在50%-75%；4：角膜上皮缺损范围大于75%。
综上所述，由于本发明对角膜缘组织进行的保存是直接采用空气暴露保存的方式，其模拟了正常生理泪眼环境，其与传统浸没保存相比，角膜缘组织结构保存更完整，角膜上皮不会出现明显凋亡，角膜缘干细胞能保持较高活性，并且还具有制作流程简单、可靠、易于实施和成本低等功效。
实施例1
本发明所述的制备方法，包括以下步骤：尸源眼球经角膜移植后的剩余角膜缘组织,在无菌洁净环境内,用无菌生理盐水洗净其表面的血迹，并进行消毒处理，即将新鲜角膜缘组织用含抗菌素的磷酸盐缓冲液浸泡和冲洗，浸泡时间为5-10min，冲洗至少3次，每次大于或等于5min；术者双手戴无菌手套,应用显微器械去除结膜虹膜组织,将无菌的transwell小室置于无菌的直径为35mm细胞培养皿中，将角膜缘组织平铺在transwell小室的PVDF膜上；在transwell小室底部添加中期保存液至液面与PVDF膜充分接触；将细胞培养皿置于冰箱中保持环境温度4℃恒定，每隔2天更换新鲜的无菌中期保存液。在本实施例中，该PVDF膜即为上述铺膜中的一种具体实现方式。
实施例2
本发明所述的制备方法，包括以下步骤：尸源眼球经角膜移植后的剩余角膜缘组织,在无菌洁净环境内,用无菌生理盐水洗净其表面的血迹，并进行消毒处理，即将新鲜角膜缘组织用含抗菌素的磷酸盐缓冲液浸泡和冲洗，浸泡时间为5-10min，冲洗至少3次，每次大于或等于5min；术者双手戴无菌手套,应用显微器械去除结膜虹膜组织,将无菌的transwell小室置于无菌的直径为35mm细胞培养皿中，将角膜缘组织平铺在transwell小室的PVDF膜上；在transwell小室底部添加中期保存液至液面与PVDF膜充分接触；将细胞培养皿置于恒温箱中，保持环境温度37℃恒定，每隔2天更换新鲜的无菌中期保存液。在本实施例中，该PVDF膜即为上述铺膜中的一种具体实现方式。
实施例3
本发明所述的制备方法，包括以下步骤：尸源眼球经角膜移植后的剩余角膜缘组织,在无菌洁净环境内,用无菌生理盐水洗净其表面的血迹，并进行消毒处理，将新鲜角膜缘组织用含抗菌素的磷酸盐缓冲液浸泡和冲洗，浸泡时间为5-10min，冲洗至少3次，每次大于或等于5min；术者双手戴无菌手套,应用显微器械去除结膜虹膜组织,将无菌的transwell小室置于无菌的直径为35mm细胞培养皿中，将角膜缘组织平铺在transwell小室的PVDF膜上；在transwell小室底部添加SHEM培养基至液面与PVDF膜充分接触；将细胞培养皿置于冰箱中保持环境温度4℃恒定，每隔2天更换新鲜的无菌SHEM培养基。在本实施例中，该PVDF膜即为上述铺膜中的一种具体实现方式。
实施例4
本发明所述的制备方法，包括以下步骤：尸源眼球经角膜移植后的剩余角膜缘组织,在无菌洁净环境内,用无菌生理盐水洗净其表面的血迹，并进行消毒处理，将新鲜角膜缘组织用含抗菌素的磷酸盐缓冲液浸泡和冲洗，浸泡时间为5-10min，冲洗至少3次，每次大于或等于5min；术者双手戴无菌手套,应用显微器械去除结膜虹膜组织,将无菌的transwell小室置于无菌的直径为35mm细胞培养皿中，将角膜缘组织平铺在transwell小室的微孔滤膜上；在transwell小室底部添加SHEM培养基至液面与PVDF膜充分接触；将细胞培养皿置于冰箱中保持环境温度4℃恒定，每隔2天更换新鲜的无菌SHEM培养基。在本实施例中，该PVDF膜即为上述铺膜中的一种具体实现方式。
DMEM 细胞培养基（粉末型）成分，如下表：
| 序号 | 化合物名称 | 含量 (mg/L) | 序号 | 化合物名称 | 含量 (mg/L) |
| 1 | 无水氯化钙 | 200.00 | 17 | L-丝氨酸 | 42.00 |
| 2 | 硝酸铁.9H2O | 0.10 | 18 | L-苏氨酸 | 95.00 |
| 3 | 氯化钾 | 400.00 | 19 | L-色氨酸 | 16.00 |
| 4 | 无水硫酸镁 | 97.67 | 20 | L-酪氨酸钠盐 | 104.00 |
| 5 | 氯化钠 | 6400.00 | 21 | L-缬氨酸 | 94.00 |
| 6 | 无水磷酸二氢钠 | 125.00 | 22 | D-泛酸钙 | 4.00 |
| 7 | L-盐酸精氨酸 | 84.00 | 23 | 氯化胆碱 | 4.00 |
| 8 | L-盐酸胱氨酸 | 63.00 | 24 | 叶酸 | 4.00 |
| 9 | L-谷氨酰胺 | 584.00 | 25 | 肌醇 | 7.20 |
| 10 | 甘氨酸 | 30.00 | 26 | 烟酰胺 | 4.00 |
| 11 | L-盐酸组氨酸 | 42.00 | 27 | 核黄素 | 0.40 |
| 12 | L-异亮氨酸 | 105.00 | 28 | 盐酸硫胺 | 4.00 |
| 13 | L-亮氨酸 | 105.00 | 29 | 盐酸吡哆辛 | 4.00 |
| 14 | L-盐酸赖氨酸 | 146.00 | 30 | 葡萄糖 | 4500.00 |
| 15 | L-甲硫氨酸 | 30.00 | 31 | 丙酮酸钠 | 110.00 |
| 16 | L-苯丙氨酸 | 66.00 | 32 | 酚红 | 15.00 |
SHEM培养基：
SHEM培养基是在无血清DMEM/F12液体培养基使用前加入5 %胎牛血清、25 mM Heps（N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸）、5 μg/mL insulin（胰岛素）、 5 μg/mL transferrin（转铁蛋白）、5 ng/mL selenium（硒）、0.5 μg/mL 氢化可的松、0.5 % DMSO（二甲基亚砜）、10ng/ml mouse EGF（上皮生长因子）、1 nM Cholera toxin（霍乱菌素）、50 μg/mL Gentamicin（庆大霉素）、1.25 μg/mL Amphotericin B（两性霉素B）。
在本案中，新鲜只是能够应用于临床为限，一般是指1-2天以内。
上述实施例和图式并非限定本发明的产品形态和式样，任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰，皆应视为不脱离本发明的专利范畴。
Claims (3)
1.一种角膜缘组织的保存方法，其特征在于，包括对新鲜角膜缘组织进行消毒的步骤以及对消毒后的新鲜角膜缘组织进行空气暴露保存的步骤；该空气暴露保存的步骤是将新鲜角膜缘组织置于可透水的铺膜上，该铺膜下为可提供角膜缘组织营养成分的保存液或细胞培养基，角膜上皮则直接与空气接触，该空气暴露保存的培养环境温度为0-37℃；该空气暴露保存的培养环境氧气浓度为0-20%；该铺膜选择硝酸纤维素膜、乙酸纤维素膜或微孔滤膜中的一种；该铺膜中的孔径选自0.1μm～5.0μm，厚度为100-140μm；该保存液或细胞培养基选自Optisol中期保存液、DMEM培养基、SHEM培养基或血清中的一种或多种。
2.如权利要求1所述的一种角膜缘组织的保存方法，其特征在于，该对新鲜角膜缘组织进行消毒的步骤是将新鲜角膜缘组织用含抗菌素的磷酸盐缓冲液浸泡和冲洗，浸泡时间为5-10min，冲洗至少3次，每次大于或等于5min。
3.如权利要求2所述的一种角膜缘组织的保存方法，其特征在于，该抗菌素选自5万U/L青霉素、8万U/L妥布霉素、100mg/L链霉素中的一种或两种以上的组合。
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Effective date of registration: 20170626 Address after: Xiamen City, Fujian province 361004 Wo Road, Siming District of Xiamen No. 336 Patentee after: Xiamen ophthalmology Center Co Ltd of Xiamen University Address before: Xiamen City, Fujian province 361004 Wo Road, Siming District of Xiamen No. 336 Patentee before: Xiamen Eye Center of Xiamen University |
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| TR01 | Transfer of patent right | ||
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Address after: No. 336, Xiahe Road, Siming District, Xiamen City, Fujian Province, 361000 Patentee after: Xiamen Eye Center Co.,Ltd. Address before: 361004 No. 336 Xiahe Road, Siming District, Xiamen City, Fujian Province Patentee before: XIAMEN EYE CENTER OF XIAMEN University |
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| CP03 | Change of name, title or address |