CN105850980B - 一种角膜缘干细胞的冻存液及冻存方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及干细胞领域，公开了角膜缘干细胞的冻存液及冻存方法。本发明所述角膜缘干细胞的冻存液包括CHIR99021。与常规角膜缘干细胞的冻存液相比，采用本发明所述角膜缘干细胞的冻存液冻存后复苏，不仅在细胞活性上明显高于其他常规冻存液，细胞增殖能力也优于常规细胞冻存液，可以用于角膜缘干细胞的长期保存及应用。本发明所述角膜缘干细胞的冻存方法将角膜缘干细胞消化、离心后，去除上清，加入本发明所述角膜缘干细胞的冻存液分装于冻存管中冻存。与常规的冻存方法相比，本发明角膜缘干细胞的冻存方法冻存的细胞复苏后不仅在细胞活性上明显高于其他常规方法，细胞增殖能力也优于常规的冻存方法。

Description

一种角膜缘干细胞的冻存液及冻存方法

技术领域

本发明涉及干细胞领域，具体涉及一种角膜缘干细胞的冻存液及冻存方法。

背景技术

角膜缘为角膜和结膜、巩膜交界部分，与角膜鉴别的标志是Bowman氏膜的终止处；与结膜的鉴别标志是不含杯状细胞，宽约1mm，此处仅有上皮层和基质层，其上皮细胞层超过10层，排列不规则，细胞呈小的圆柱状，核深染，其深部基底细胞为一层小圆柱状或立方形细胞，细胞核为卵圆形，与表面平行.在基底部乳头形成，形成特殊的“栅栏”样上皮结构，其中含有色素和丰富的血管网，并与基底膜联系紧密。

角膜缘干细胞是角膜缘细胞的一个亚群，具有独特的生物学特性:生存期长，分化度低，细胞周期长，DNA合成期短，具有高度的分化和增殖潜能等。干细胞分裂产生两个子细胞，一个保持母细胞表型，继续成为干细胞，另一个演化为具有细胞功能的上皮细胞。在自身更新的组织内干细胞被认为是细胞谱系的起源，同时也是细胞增殖和分化的源泉。

角膜缘干细胞的分化阶段大体上分为：角膜缘干细胞(Limbal Stem Cells，LSCs，在角膜缘基底部的最基层)→短暂扩充细胞(Transcient Amplifying Cell，TAC，在角膜缘的基底部)→有丝分裂后细胞(Post Mitotic Cells，PMS，位于角膜上皮大多数非表面的区域)→终末分化细胞(Terminally Differentiated Cell，TDC，上皮细胞主要位于角膜的浅表)。现在普遍认为，角膜上皮细胞的更新是通过垂直向前的运动和水平向心的运动的方式共同作用实现的，而角膜缘干细胞LSCs则成为其再生的最终源泉。

目前临床多采用新鲜自体或同种异体角膜缘干细胞移植术进行眼表重建，取得满意的治疗效果，但研究证明角膜缘干细胞移植膜片中必须达到一定的干细胞比例(﹥3％)，移植成功率才有保证(﹥70％)。因而不管是角膜移植还是体外培养的角膜缘干细胞膜片移植，移植后角膜缘干细胞的质量均是手术成功与否的关键。因此角膜缘干细胞的保存体系的时间延长，能极大改善角膜缘干细胞移植的成功率。

对于角膜缘干细胞的冻存，目前传统的冻存体系：DMEM培养基+胎牛血清+DMSO的冻存液配方，在-80℃中保存。因其简便，适用性广的特点被广泛采用。但有研究表明，现有的低温冷冻方案，极大损害了角膜缘干细胞的生物学特性，并随着时间增长，损害越明显。

发明内容

有鉴于此，本发明目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种角膜缘干细胞的冻存液及冻存方法。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种角膜缘干细胞的冻存液，包括CHIR99021。

CHIR99021是GSK3抑制剂中的一种。本发明所述角膜缘干细胞的冻存液中含有CHIR99021，能更好的维持角膜缘干细胞的生物学特性，增加细胞复苏后的增殖性和活率，促进胚胎干细胞的增殖和维持多功能潜能。

作为优选，本发明所述角膜缘干细胞的冻存液中所述CHIR99021的含量为5mmol/L-30mmol/L。

进一步的，本发明所述冻存液还包括DMEM基础培养基、胎牛血清和DMSO。

在一些实施方案中，所述冻存液中所述DMEM基础培养基的含量为70v/v％-90v/v％。

在一些实施方案中，所述冻存液中胎牛血清的含量为5v/v％-20v/v％。

在一些实施方案中，所述冻存液中DMSO的含量为5v/v％-10v/v％。

本发明还提供了一种角膜缘干细胞的冻存方法，将角膜缘干细胞消化、离心后，去除上清，加入本发明所述角膜缘干细胞的冻存液分装于冻存管中冻存。

其中，所述消化优选为向角膜缘干细胞中加入0.25％的胰蛋白酶消化5min-10min，每1mL消化液加入含10％FBS的PBS中止消化。所述离心优选为1000rpm离心5min。

本领域技术人员可以理解，本发明所述角膜缘干细胞可以采用本领域公知的冻存方法进行冻存。

在一些实施方案中，本发明所述冻存方法中所述冻存的具体方法为程序降温仪逐渐降温至-196℃后转移至液氮中进行长期保存。

在一些优选实施方案中，本发明所述冻存方法中所述程序降温仪降温程序为：

常温至4℃，每分钟下降5℃；

4℃至-10℃，每分钟下降1℃；

-10℃至-80℃，每分钟下降3℃；

-80℃至-196℃，每分钟下降5℃。

在一个具体实施例中，本发明分别采用不同的冻存保护液冻存角膜缘干细胞，比较不同的冻存液冻存复苏后细胞活性以及细胞增殖情况，对比本发明所述角膜缘干细胞的冻存液与传统冻存方案的冻存液的冻存效果，结果显示本发明的细胞活率高于传统冻存方案10％以上。而增殖情况结果显示本发明所述角膜缘干细胞的冻存液冻存的细胞相对传统冻存方案的冻存液冻存的细胞，本发明细胞的增殖速度明显高于传统冻存方案。

由此可见，采用本发明所述角膜缘干细胞的冻存液，结合本发明所述的冻存方法进行角膜缘干细胞的冻存，将起到更好的冻存效果。复苏后的细胞不仅在细胞活性上明显高于其他常规冻存液，细胞增殖能力也优于常规冻存液。

本发明还提供了一种角膜缘干细胞的冻存试剂盒，包含本发明所述角膜缘干细胞的冻存液。

本发明所述角膜缘干细胞的冻存液包括CHIR99021。与常规角膜缘干细胞的冻存液相比，采用本发明所述角膜缘干细胞的冻存液冻存后复苏，不仅在细胞活性上明显高于其他常规冻存液，细胞增殖能力也优于常规细胞冻存液，可以用于角膜缘干细胞的长期保存及应用。本发明所述角膜缘干细胞的冻存方法将角膜缘干细胞消化、离心后，去除上清，加入本发明所述角膜缘干细胞的冻存液分装于冻存管中冻存。与常规的冻存方法相比，本发明角膜缘干细胞的冻存方法冻存的细胞复苏后不仅在细胞活性上明显高于其他常规方法，细胞增殖能力也优于常规的冻存方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例5复苏后各组细胞增殖情况图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。

实施例1、角膜缘干细胞的冻存液

具体成分如下：

实施例2、兔子角膜缘干细胞的分离与培养

1、在无菌环境中取兔子的新鲜眼球。

2、在超净台中，剪去结膜组织，生理盐水冲洗，含双抗的生理盐水中浸泡30min，沿角膜缘外剪下角膜，置于含双抗(青霉素和链霉素)中，解剖显微镜下去除虹膜组织，8.5环钻钻取中央角膜，将角膜环及中央角膜用组织剪碎。

3、根据组织块的体积，每1cm²组织块加入1mL1％胶原酶+0.5％中性蛋白酶，37℃消化40-60min，每1mL消化液加入含10％FBS的PBS中止消化，用100μm网筛过滤，1000rpm离心5min，弃除上清，加入(DMEM+10％FBS)培养基，以1×10⁵/mL的密度接种至培养皿中，置于37℃，含5％CO₂培养箱中培养。

实施例3、角膜缘干细胞的冻存方案

1、当每个细胞培养皿底层汇合度至80％，去除培养皿上的上清培养液，加入0.25％胰蛋白酶，消化5-10min，每1mL消化液加入含10％FBS的PBS中止消化，1000rpm离心5min，去除上清，加入冻存液。

2、放入程序降温仪中降温，设计如下降温程序：常温至4℃，每分钟下降5℃；4℃至-10℃，每分钟下降1℃；-10℃至-80℃，每分钟下降3℃，-80℃至-196℃，每分钟下降5℃。

3、待程序降温至-196℃后，放进液氮中保存。

实施例4、冻存细胞活性检测

取实施例2分离培养的角膜缘干细胞，分为对照组和实验组，实验组分5组，加入下述不同的冻存液，按照实施例3所述方法冻存1个月、6个月、12个月。取冻存后复苏的细胞悬液与台盼蓝染液混匀后，取使用细胞计数仪检测细胞活性，结果见表1。

各冻存液：

传统冻存方案(不含CHIR99021的实施例1所述的冻存液)；

实验组1：CHIR99021浓度为3mmol/L的实施例1所述的冻存液；

实验组2：CHIR99021浓度为5mmol/L的实施例1所述的冻存液；

实验组3：CHIR99021浓度为15mmol/L的实施例1所述的冻存液；

实验组4：CHIR99021浓度为30mmol/L的实施例1所述的冻存液；

实验组5：CHIR99021浓度为40mmol/L的实施例1所述的冻存液。

表1细胞活性检测

结果显示实验组2-4的细胞活率均高于其他实验组和对照组，且其活率稳定在84％-85％之间，高于其他组10％以上，证明本发明的冻存方案的细胞活率有明显提升。

实施例5、冻存细胞的增殖检测

采用CCK-8法检测冻存6个月角膜缘干细胞增殖活力。

按照实施例4所述方法，采用不同冻存液冻存后复苏的角膜缘干细胞，接种细胞于96孔板中，2000个/孔，每孔重复三个样品孔。在37℃，5％CO₂培养箱中连续培养7d。分别在1d、3d、5d、7d对细胞进行检测。在待检测孔中加入10μL染色剂，37℃，5％CO₂培养2h。用酶标仪测450nm处的吸光值。统计各组细胞增殖情况，结果见图1和表2。

表2细胞增殖情况

结果显示，纵向对比，各时间段内实验组2-4的OD值均高于其他组，证明本发明冻存方案的细胞增殖速度明显高于传统冻存方案。

实施例6、冻存细胞的标记物流式检测对比

按照实施例4所述方法，采用不同冻存液冻存角膜缘干细胞，复苏后进行细胞的标记物流式检测。

流式检测具体步骤：

1、复苏上述各组不同冻存液冻存的细胞，三个样品的平行试验，进行、消化，终止、重悬，取1×10⁶cells，平均分至2个EP管中，一管作为对照，1500rpm/min离心5min，弃上清。

2、加入1mL染色缓冲液(含10％FBS的PBS)重悬细胞，1500rpm/min离心5min，弃上清。重复以上步骤1次。

3、弃上清后，每管加入200μL染色缓冲液重悬，样本组分别加入2μL特异性识别的碱性角蛋白抗体(AE5)、缝隙连接蛋白抗体(CX43抗体)、DNA聚合酶δ的辅助蛋白抗体(PCNA)和BrdU抗体。避光孵育20min。

4、加入500μL染色缓冲液重悬，1500rpm/min离心5min洗掉剩余抗体。

5、弃上清，加入500μL上样缓冲液(10％FBS+1640培养基)，过200目筛，上机检测，结果见表3。

表3细胞的标记物

	AE5	CX43	PCNA	BrdU
					对照组	10.7％	20.5％	13.4％	45.5％
实验组1	3.5％	15.3％	21.8％	50.3％
					实验组2	1.2％	3.4％	34.8％	70.1％
实验组3	0.9％	4.3％	39.4％	73.5％
					实验组4	0.8％	4.6％	38.3％	74.8％
实验组5	1.3％	8.9％	26.2％	61.0％

抗体AE5为角膜缘成纤维细胞的表面标志性抗体；CX43为角膜缘干细胞阴性表达；PCNA抗体阳性证明该细胞具有很强的增殖能力，间接表明角膜缘干细胞的极强的增殖力；BrdU抗体阳性表明细胞具有长生长周期，符合角膜缘干细胞低分化长周期的特点。

从表3结果可知，实验组中的角膜缘干细胞纯度优于对照组，尤其实验组2-4中的角膜缘干细胞的表达更好，增殖能力更好，有更长的生长周期。证明实验组2-4的冻存液更优。

Claims (9)

1.一种角膜缘干细胞的冻存液，其特征在于，由CHIR99021和DMEM基础培养基、胎牛血清和DMSO组成。

2.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述CHIR99021的含量为5mmol/L-30mmol/L。

3.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述冻存液中所述DMEM基础培养基的含量为70v/v％-90v/v％。

4.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述冻存液中胎牛血清的含量为5v/v％-20v/v％。

5.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述冻存液中DMSO的含量为5v/v％-10v/v％。

6.一种角膜缘干细胞的冻存方法，其特征在于，将角膜缘干细胞消化、离心后，去除上清，加入权利要求1所述角膜缘干细胞的冻存液分装于冻存管中冻存。

7.根据权利要求6所述的冻存方法，其特征在于，所述冻存的具体方法为程序降温仪逐渐降温至-196℃后转移至液氮中进行长期保存。

8.根据权利要求7所述的冻存方法，其特征在于，所述程序降温仪降温程序为：

常温至4℃，每分钟下降5℃；

4℃至-10℃，每分钟下降1℃；

-10℃至-80℃，每分钟下降3℃；

-80℃至-196℃，每分钟下降5℃。

9.一种角膜缘干细胞的冻存试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-5任意一项所述角膜缘干细胞的冻存液。