CN116076489B - 间充质干细胞的冻存方法 - Google Patents

Abstract

一种间充质干细胞的冻存方法，取间充质干细胞，胰酶消化后离心并弃上清，加入冻存液，在‑80℃保存过夜后，转入液氮长期冻存，每毫升所述冻存液冻存所述的间充质干细胞密度为0.5～1.0×10⁷个细胞。本发明的方法所用冻存液不含有动物源血清，避免了污染和过敏原风险，临床安全性更高，适用于人胎盘源、脐带源、脐血源间充质干细胞冻存。

Description

间充质干细胞的冻存方法

本申请是依据申请日为2017年8月7日，申请号为201710668712.4，发明创造名称为“无血清冻存液及其在冻存间充质干细胞中的应用”的原申请所提出的分案申请。

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种围产期间充质干细胞的无血清冻存液及其冻存方法，通过优化冻存液组分及配方，用生长因子及营养物质替代动物血清，以不含外源性血清、能保持细胞良好活性和生物学特征的方式进行间充质干细胞的冻存。

背景技术

间充质干细胞(MesenchymalStemCells，MSCs)是一类具有自我增殖能力和多向分化潜能的干细胞类型，在特定条件下可以分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、肌细胞等。人们最早从骨髓中分离得到MSCs，后来发现肝脏、皮肤、肌肉、软骨、皮肤、外周血等多种组织中也有少量MSCs存在。最新研究表明，MSCs具有支持造血、调节免疫功能、促进损伤组织修复和防治移植物抗宿主病等作用，已成为再生医学和组织工程学领域的重要种子细胞与潜在治疗工具。作为MSCs的最早来源，骨髓中MSCs的含量非常少(约占有核细胞总数的0.001％～0.01％)，在衰老和疾病状况下其数量和分化潜能还会下降，无法保证种子细胞质量的稳定性，且骨髓采集为创伤性过程，获取代价较大。相比之下，围产间充质干细胞(PerinatalMesenchymal StemCells，P-MSCs)为MSCs的科学研究和临床应用提供了新的重要来源。

P-MSCs是指以出生相关组织为来源的间充质干细胞，主要为脐血、脐带和胎盘源间充质干细胞，它不仅具有MSCs的共有特性，如多向分化潜能、低免疫原性、旁分泌作用等，相比于脊髓和其他组织来源，还具有如下优势：首先，其细胞含量丰富，制备方法简单；其次，获取过程为非侵袭性操作，对供者无伤害，同时细菌和病毒感染风险较成体组织来源的间充质干细胞低；再者，由于脐血、脐带、胎盘原本为生物废弃物，作为间充质干细胞来源系变废为宝且不会引起道德伦理问题，尤其适用于开展产业化操作。

1999年～2017年期间，全球注册的干细胞临床研究的6000个项目中，MSCs研究项目占比为4/5。截至2016年12月，我国卫计委备案的13个干细胞临床研究项目中，7项为MSCs研究，其中又有6项为P-MSCs研究，包括其对狼疮性肾炎、小儿脑性瘫痪、脊髓损伤、急性心梗、心衰等重大疾病的防治作用研究，提示间充质干细胞已经成为继胚胎干细胞、造血干细胞后的又一大研究热点，有着巨大的临床价值和广阔的应用前景。因此，为保障中下游MSCs临床研究的有效开展，安全推进其临床应用，MSCs种子细胞的安全性与质量变得尤为重要。

细胞冻存是保存细胞的重要手段，可以使细胞在一定时期内脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，在需要的时候进行复苏用于实验研究或临床应用。因此，细胞冻存技术，尤其是冻存液，对于维持冻存细胞活性，降低细胞损伤至关重要。但现有的MSCs冻存液及方法尚有诸多缺点，例如：含有高比例的胎牛血清(FetalBovineSerum，FBS)，可能增加临床研究与应用中外源性蛋白引起排异反应的风险；另无血清冻存方法，因采用血清替代物，试剂价格昂贵，应用范围受限。如：中国发明专利申请201610936192.6公开了一种脂肪间充质干细胞冻存液，由RPMI-1640培养基、FBS(2％～5％，v/v)、环丁砜、乙醇、乙二醇、丙二醇、吐温、甘油、聚乙烯吡咯烷酮、琼脂粉、海藻糖、青霉素，以及冷冻保护剂羟乙基淀粉或葡聚糖组成。中国发明专利申请CN201510718538.0公开了一种胎盘羊膜间充质干细胞的冻存液与冻存方法，其冻存液由DMSO、基础培养基和FBS(10％～50％，v/v)组成。这些方法的间充质干细胞冻存液中均含有FBS，引入了外源性动物血清。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种冻存液，该冻存液不含动物血清，组成成分明确且易于获取，不影响冻存期间细胞的干性和活性，并能避免潜在的冻存液中动物血清造成的临床应用风险。

本发明的另一个目的在于提供一种冻存液的制备方法。

本发明的再一个目的在于提供一种冻存液在间充质干细胞冻存中的应用，如：脐带源、胎盘源和脐血源的间充质干细胞等。

本发明的再一个目的在于提供一种冻存液在围产间充质干细胞冻存中的应用。所述无血清冻存液的冻存方法。

本发明提供的一种冻存液，不含血清，包括DMSO8v/v％～15v/v％，DMEM基础培养基85v/v％～92v/v％和营养添加物。

本发明提供的冻存液，还含有：成纤维细胞生长因子(BasicFibroblastGrowthFactor，bFGF)4.5ng/mL～27ng/mL，胰岛素4.5μg/mL～18μg/mL，生长激素2.7ng/mL～3.5ng/mL，转铁蛋白(Transferrin，TF)0.045μg/mL～0.18μg/mL，骨形态发生蛋白4(BoneMorphogeneticProtein-4，BMP-4)0.09ng/mL～0.12ng/mL，谷氨酰胺150mg/L～400mg/L，丙酮酸钠45mg/L～70mg/L，β-巯基乙醇23μM～60μM，人表皮细胞生长因子(HumanEpidermalGrowthFactor，hEGF)10ng/L～20ng/mL，亚硒酸钠15μM～45μM，人血小板生长因子(PlateletGrowthFactor，PGF)4.5ng/mL～18ng/mL。这些组分单独或组合应用于本发明。

本发明提供的冻存液，还含有：维生素B120.18mg/L～0.9mg/L，维生素C0.1mg/L～0.25mg/L，维生素B610μg/L～90μg/L，维生素B20.2mg/L～0.6mg/L，谷氨酸9.6mg/L～16.8mg/L，丙氨酸9.2mg/L～21.3mg/L，甘氨酸5.06mg/L～7.2mg/L，天门冬氨酸8.6mg/L～14.7mg/L，脯氨酸6.9mg/L～13.2mg/L和丝氨酸6.0mg/L～9.8mg/L。这些组分单独或组合应用于本发明。

冻存液中，DMSO的浓度优先选择9v/v％～12v/v％，如：但不仅限于9v/v％、10v/v％、11v/v％和12v/v％。

冻存液中，优先选择低糖DMEM基础培养基(L-DMEM)，浓度为88v/v％～91v/v％，如：但不仅限于88v/v％、89v/v％、90v/v％和91v/v％。

冻存液中，优先选择pH7.0～8.5。

本发明提供的一种冻存液，包括10v/v％DMSO，90v/v％DMEM基础培养基。

本发明提供的一种冻存液适用于脐带源、胎盘源和脐血源间充质干细胞，尤其是围产间充质干细胞的长期冻存，每毫升冻存液冻存的间充质干细胞密度为0.5～1×10⁷个细胞，在-80℃保存过夜后，转入液氮长期冻存。经冻存后复苏验证，细胞的活率高。

一种本发明的冻存液用于冻存P-MSCs的方法，包括：

首先，用37℃水浴预热的0.25％胰蛋白酶消化贴壁细胞，用DMEM完全培养基终止消化，轻轻吹打细胞(如：使用3mL无菌滴管轻轻吹打细胞)，收集到容器中(如：15mL离心管)，离心(如：1,500rpm，5min)，弃上清；

接着，在细胞沉淀中加入本发明无血清冻存液(用量为0.5～1.0×10⁷个活细胞中加入1mL冻存液)，轻轻吹打混匀，转入无菌冻存管中，封存。

最后，将细胞置于-80℃中冻存过夜，之后转入液氮中长期冻存。

本发明技术方案实现的有益效果：

本发明提供的冻存液，系无血清冻存液，通过对冻存保护剂、生长激素、营养组分及其用量进行优化而获得，实现了间充质干细胞(尤其是P-MSCs)冻存过程不引入动物血清，从而避免了常规有血清冻存液的缺点，如：动物血清中含有的细胞毒性物质，如多胺氧化酶等会对冻存细胞产生毒性作用；外源血清因个体、产地、批号等不同引起冻存液品质不稳定；外源性动物蛋白增加临床过敏原风险。

本发明提供的冻存液，各个组分明确，与含动物血清或商业化血清替代物的冻存液相比，成本更低，同时能很好地保持间充质干细胞的活性和表面抗原特性，复苏后细胞活率高、贴壁效果好。

本发明提供的冻存液，适用于用于间充质干细胞(尤其是P-MSCs)的的冻存，冻存方法简单，冻存效果好。

附图说明

图1为无血清与有血清冻存液冻存细胞复苏后形态学观察比较；其中，图A1、图A2、图A3和图A4分别为无血清冻存液组细胞复苏后培养第1、2、3、4天的形态学观察结果，图B1、图B2、图B3和图B4分别为含血清冻存液组细胞复苏后培养第1、2、3、4天的形态学观察结果；

图2为流式检测本发明无血清冻存液冻存细胞复苏后的表面标记抗原；

图3为流式检测含血清冻存液冻存细胞复苏后的表面标记抗原。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

实施例1无血清间充质干细胞冻存液冻存脐带间充质干细胞

取新生儿脐带作为间充质干细胞的来源，48h内在无菌条件下完成脐带间充质干细胞制备和原代培养，之后进行传代培养。取P3代脐带MSCs，待其细胞融合度达到80-90％后，弃去培养液，加入5mLPBS缓冲液轻轻洗涤细胞后弃去洗液，用37℃预热的0.25％胰蛋白酶消化细胞，胰酶用量以刚好可以浸润培养容器底部为宜，如：显微镜下观察细胞呈透亮球状而不再贴壁时，立即加入DMEM完全培养基，其用量如：/> 接着，用无菌滴管轻轻吹落细胞，将细胞悬液转入15mL离心管中，原培养容器中加入3mL～5mLDMEM完全培养基洗涤一次，洗涤液合并加入离心管中，室温下1,500rpm离心5min，弃上清；每(0.5～1.0)×10⁷个细胞中加入1mL无血清冻存液，移液枪轻轻吹打混匀细胞，每支冻存管中加入1mL细胞，封口膜密封管口，管体标记冻存信息；将冻存管置于-80℃冰箱过夜，转入液氮罐中深低温保存。

所用P-MSCs无血清冻存液，包含如下成分：以终浓度计，

DMSO：12％(v/v)；

DMEM基础培养基：88％(v/v)；

bFGF：10ng/mL；

胰岛素：6.8μg/mL；

生长激素：2.7ng/mL；

TF：0.08μg/mL；

BMP-4：0.1ng/mL；

谷氨酰胺：180mg/L；

丙酮酸钠：55mg/L；

β-巯基乙醇：30μM；

hEGF：12ng/mL；

亚硒酸钠：20μM；

PGF：8.5ng/mL；

谷氨酸：12.8mg/L，丙氨酸：16.8mg/L，甘氨酸：6.2mg/L，天门冬氨酸：11.5mg/L，脯氨酸：9.2mg/L，丝氨酸：7.7mg/L；

维生素B12：0.36mg/L，维生素C：0.15mg/L，维生素B6：35μg/L，维生素B2：0.6mg/L。

实施例2无血清间充质干细胞冻存液冻存脐带间充质干细胞

按照实施例1所述方法冻存分离自脐带的MSCs。

所用无血清冻存液，包含如下成分：以终浓度计，

DMSO：9％(v/v)；

DMEM基础培养基：91％(v/v)；

bFGF：25ng/mL；

胰岛素：16.5μg/mL；

生长激素：3.0ng/mL；

TF：0.15μg/mL；

BMP-4：0.12ng/mL；

谷氨酰胺：350mg/L；

丙酮酸钠：65mg/L；

β-巯基乙醇：50μM；

hEGF：15ng/mL；

亚硒酸钠：42μM；

PGF：16ng/mL；

谷氨酸：15.6mg/L，丙氨酸：10.5mg/L，甘氨酸：7.0mg/L，天门冬氨酸：9.5mg/L，脯氨酸：13.0mg/L，丝氨酸：9.5mg/L；

维生素B12：0.82mg/L，维生素C：0.25mg/L，维生素B6：65μg/L，维生素B2：0.25mg/L。

实施例3无血清间充质干细胞冻存液冻存脐带间充质干细胞

按照实施例1所述方法冻存脐带MSCs。

所用无血清冻存液，包含如下成分：以终浓度计，

DMSO：10％(v/v)；

DMEM基础培养基：90％(v/v)；

bFGF：9ng/mL；

胰岛素：9μg/mL；

生长激素：2.7ng/mL；

TF：0.09μg/mL；

BMP-4：0.09ng/mL；

谷氨酰胺：270mg/L；

丙酮酸钠：50mg/L；

β-巯基乙醇：35μM；

hEGF：9ng/mL；

亚硒酸钠：15μM；

PGF：10.6ng/mL；

谷氨酸：13.2mg/L，丙氨酸：15.3mg/L，甘氨酸：6.1mg/L，天门冬氨酸：11.7mg/L，脯氨酸：10mg/L，丝氨酸：7.9mg/L；

维生素B12：0.54mg/L，维生素C：0.18mg/L，维生素B6：50μg/L，维生素B2：0.4mg/L。

实施例4无血清间充质干细胞冻存液冻存脐带间充质干细胞

取新生儿胎盘作为间充质干细胞的来源，48h内在无菌条件下完成胎盘间充质干细胞制备和原代培养，之后进行传代培养。取P3代胎盘MSCs，按照如实施例1所述步骤完成细胞冻存。

所用无血清冻存液同实施例1。

实施例5无血清间充质干细胞冻存液冻存脐带间充质干细胞

取新生儿胎盘作为间充质干细胞的来源，48h内在无菌条件下完成胎盘间充质干细胞制备和原代培养，之后进行传代培养。取P3代胎盘MSCs，按照如实施例1所述步骤完成细胞冻存。

所用无血清冻存液同实施例2。

实施例6无血清间充质干细胞冻存液冻存脐带间充质干细胞

取新生儿胎盘作为间充质干细胞的来源，48h内在无菌条件下完成胎盘间充质干细胞制备和原代培养，之后进行传代培养。取P3代胎盘MSCs，按照如实施例1所述步骤完成细胞冻存。

所用无血清冻存液同实施例3。

实施例7含血清间充质干细胞冻存液冻存脐带间充质干细胞

按照实施例1所述方法冻存脐带MSCs。

所用有血清冻存液，包含如下成分：以终浓度计，

DMSO：10％(v/v)；

DMEM基础培养基：60％(v/v)；

FBS：30％(v/v)。

实施例8含血清间充质干细胞冻存液冻存胎盘间充质干细胞

按照实施例4所述方法冻存胎盘MSCs。

所用有血清冻存液配方同实施例7。

实施例9间充质干细胞的复苏

将实施例1～实施例8的间充质干细胞冻存三个月后，从液氮中取出，于37℃恒温水浴中来回晃动，1min内完成解冻。然后，用75％酒精棉球擦拭冻存管外壁，将细胞转移到15mL离心管中，加入10mLDMEM完全培养基，混匀，1,500rpm离心5min，弃上清，在细胞沉淀中加入适量培养基(1mL～3mL)，轻轻吹匀，与台盼蓝染液1:1混匀后进行活细胞计数(参见表1)，以5×10⁴-1×10⁵/mL于皿接种，加入DMEM完全培养基，如：/> 放入CO₂培养箱中，37℃、5％CO₂条件培养。复苏操作在万级无菌室的生物安全柜内进行。

表1无血清与有血清冻存液冻存细胞的复苏细胞活率比较。

实施例10间充质干细胞复苏后进行形态学观察

将实施例4、8所述胎盘间充质干细胞冻存三个月后按实施例9所述方法进行复苏、培养，复苏第二天为细胞全量换液，之后每2天进行全量换液，细胞放入CO₂培养箱中，37℃、5％CO₂条件培养，每天用相差显微镜观察细胞的贴壁和生长情况并拍照(参见图1)。复苏与换液操作在万级无菌室的生物安全柜内进行。

实施例11流式鉴定间充质干细胞的表面标记抗原

将实施例1和实施例7脐带间充质干细胞冻存三个月后按实施例9所述方法进行复苏、培养，第二天为细胞全量换液，待细胞愈合度达到80-90％左右，0.25％胰蛋白酶消化，DMEM完全培养基终止消化，1,500rpm离心5min，弃上清，用PBS调整细胞浓度至1×10⁷/mL，取100μL细胞加入流式管，分别加入鼠抗人单克隆标记抗体CD90-PerCP、CD105-PE、CD73-APC、CD14-/CD19-/CD34-/CD45-FITC，以鼠抗人的IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-APC、IgG1-PerCP作为同型对照，室温避光孵育20min，流式细胞仪上样检测，FlowJo软件分析测定结果(参见图2、图3)。

实施例中，DMEM完全培养基的配方为：以DMEM基础培养基为基础，还含有终浓度10％(v/v)FBS、100kU/L青霉素和100mg/L链霉素。

实施例中，本领域技术人员应当知道，对照例所采用冻存液为经典的有血清细胞冻存液配方。

上述实施例主要试剂的来源如下：

0.25％胰蛋白酶：美国Gibco公司，1000mg规格，用400mLPBS配制成质量体积比为0.25％的酶溶液；

DMEM培养基、FBS：美国Gibco公司，500mL规格；

DMSO：美国Sigma公司，10mL规格。

Claims (6)

1.一种间充质干细胞的冻存方法，其特征在于取间充质干细胞，胰酶消化后离心并弃上清，加入冻存液，在-80℃保存过夜后，转入液氮长期冻存，每毫升所述冻存液冻存所述的间充质干细胞密度为0.5～1.0×10⁷个细胞；

所述的冻存液组成为：8v/v％～15v/v％DMSO、85v/v％～92v/v％DMEM，以及

4.5ng/mL～27ng/mL成纤维细胞生长因子，4.5μg/mL～18μg/mL胰岛素，2.7ng/mL～3.5ng/mL生长激素，0.045μg/mL～0.18μg/mL转铁蛋白，0.09ng/mL～0.12ng/mL骨形态发生蛋白4，150mg/L～400mg/L谷氨酰胺，45mg/L～70mg/L丙酮酸钠，23μM～60μMβ-巯基乙醇，10ng/mL～20ng/mL人表皮细胞生长因子，15μM～45μM亚硒酸钠，4.5ng/mL～18ng/mL人血小板生长因子，9.6mg/L～16.8mg/L谷氨酸，9.2mg/L～21.3mg/L丙氨酸，5.06mg/L～7.2mg/L甘氨酸，8.6mg/L～14.7mg/L天门冬氨酸，6.9mg/L～13.2mg/L脯氨酸和6.0mg/L～9.8mg/L丝氨酸，各种所述组分的浓度均为在所述的冻存液中的浓度。

2.根据权利要求1所述的间充质干细胞的冻存方法，其特征在于所述的间充质干细胞为围产间充质干细胞。

3.根据权利要求1所述的间充质干细胞的冻存方法，其特征在于所述的冻存液还包括0.18mg/L～0.9mg/L维生素B12、0.1mg/L～0.25mg/L维生素C、10μg/L～90μg/L维生素B6和0.2mg/L～0.6mg/L维生素B2之一种或几种，各种所述维生素的浓度均为在所述的冻存液中的浓度。

4.根据权利要求1所述的间充质干细胞的冻存方法，其特征在于所述的DMEM培养基为L-DMEM。

5.根据权利要求1所述的间充质干细胞的冻存方法，其特征在于所述的冻存液pH 7.0～8.5。

6.根据权利要求1所述的间充质干细胞的冻存方法，其特征在于包括：

首先，用37℃水浴预热的0.25％胰蛋白酶消化贴壁细胞，用DMEM完全培养基终止消化，轻轻吹打细胞，收集到容器中，离心，弃上清；

接着，在细胞沉淀中加入所述的冻存液，用量为0.5～1.0×10⁷个活细胞中加入1mL冻存液，轻轻吹打混匀，转入无菌冻存管中，封存；

最后，将细胞置于-80℃中冻存过夜，之后转入液氮中长期冻存。