CN109042625A - 一种冻存液及其在脐带间充质干细胞冻存中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种冻存液，所述冻存液包含以下含量的组分：二甲基亚砜体积百分含量为1～5％、海藻糖20～80mmol/L、过氧化氢酶5～15μg/mL、Z‑缬氨酸‑丙氨酸消旋‑ASP(甲酯)‑氟甲基酮10～40μg/mL、胰岛素0.1～3μg/mL和硒0.01～10mg/L。本发明所述冻存液中无血清，避免了病原菌的污染，二甲基亚砜(DMSO)的含量较少，减小了细胞毒性；本发明的细胞冻存液由纯化学物质组成，成分稳定，批次间稳定性好；采用本发明所述冻存液冻存的细胞复苏后细胞活力显著增强。本发明还公开了冻存液在间充质干细胞冻存中的应用。本发明还公开了一种间充质干细胞的冻存方法。

Description

一种冻存液及其在脐带间充质干细胞冻存中的应用

技术领域

本发明涉及一种冻存液及其应用，具体涉及一种冻存液及其在脐带间充质干细胞冻存中的应用。

背景技术

间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，其在体内或体外特定诱导条件下。可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，为临床治疗各种疾病，如神经系统疾病、肾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤等提供了新的途径。间充质干细胞主要包括骨髓间充组织干细胞、脂肪间充质干细胞和脐带间充质干细胞，目前研究最为广泛是骨髓间充质干细胞，但随着供体年龄的增长及身体健康状况的差异，骨髓间充质干细胞在数量、扩增及分化能力上出现明显下降趋势，且骨髓提取操作及过程中存在病毒、细胞感染的可能，使其研究和应用受到一定限制。与骨髓间充质干细胞相比，采用医疗废弃物新生儿脐带的脐带间充质干细胞，具有来源丰富、成本低、对捐赠者无损伤及不涉及伦理问题等优势，因而成为未来干细胞在医疗应用上更具有潜力的理想选择。

在临床应用中，脐带间充质干细胞的足够数量是保证干细胞治疗的必要因素。目前，对于脐带间充干细胞的保存多为含血清的冻存方法，病毒感染的几率大大增加，因此，研发出一种不含血清且高效冻存脐带间充质干细胞的冻存液是很有必要的。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种冻存液及其在脐带间充质干细胞冻存中的应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种冻存液，包含以下含量的组分：

所述Z-缬氨酸-丙氨酸消旋-ASP(甲酯)-氟甲基酮(zVAD-fmk)为一种caspase抑制剂。

本发明所述冻存液中无血清，避免了病原菌的污染，二甲基亚砜(DMSO)的含量较少，减小了细胞毒性；本发明的细胞冻存液由纯化学物质组成，成分稳定，批次间稳定性好；采用本发明所述冻存液冻存的细胞复苏后细胞活力显著增强。本发明所述冻存液适用于间充质干细胞的冻存，尤其适用于脐带间充质干细胞的冻存。

作为本发明所述冻存液的优选实施方式，所述冻存液包含以下含量的组分：

采用上述组分配比的冻存液冻存的细胞复苏后细胞活力更高。

作为本发明所述冻存液的优选实施方式，所述冻存液包含以下含量的组分：

采用上述组分配比的冻存液冻存的细胞复苏后细胞活力最高。

本发明的目的还在于提供所述冻存液在间充质干细胞冻存中的应用。

本发明的目的还在于提供所述冻存液在脐带间充质干细胞冻存中的应用。

本发明的目的还在于提供一种间充质干细胞的冻存方法，所述间充质干细胞的冻存方法为采用所述冻存液冻存间充质干细胞。

作为本发明所述间充质干细胞的冻存方法的优选实施方式，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。

作为本发明所述间充质干细胞的冻存方法的优选实施方式，将脐带间充质干细胞悬浮于上述的冻存液中，在-70～-200℃下冻存。

作为本发明所述间充质干细胞的冻存方法的优选实施方式，将脐带间充质干细胞用胰酶消化后离心并弃上清，加入所述的冻存液，每毫升冻存液含有3×10⁶～8×10⁶个脐带间充质干细胞，在4℃放置30min，然后再在-20℃下放置2h，再在-80℃下放置8h，转入液氮长期冻存。

作为本发明所述间充质干细胞的冻存方法的优选实施方式，包括以下步骤：

(1)将脐带间充质干细胞用0.25％胰蛋白酶液消化30s，用DMEM完全培养基终止消化，轻轻吹打细胞，收集到容器中，离心，弃上清，得细胞沉淀；

(2)、在细胞沉淀中加入PBS洗细胞两次，加入所述冻存液；

(3)、将细胞在4℃放置30min，然后再在-20℃下放置2h，再在-80℃下放置8h，转入液氮长期冻存。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种冻存液及其在脐带间充质干细胞冻存中的应用。本发明所述冻存液中无血清，避免了病原菌的污染，二甲基亚砜(DMSO)的含量较少，减小了细胞毒性；本发明的细胞冻存液由纯化学物质组成，成分稳定，批次间稳定性好；采用本发明所述冻存液冻存的细胞复苏后细胞活力显著增强。本发明所述冻存液适用于间充质干细胞的冻存，尤其适用于脐带间充质干细胞的冻存。

附图说明

图1为实施例1～3和对比例所述冻存液冻存脐带间充质干细胞的表面标记物的流式检测图；其中，A为脐带间充质干细胞流式检测表面标记物阳性表达情况测试结果；B为脐带间充质干细胞流式检测表面标记物阴性表达情况测试结果；

图2为脐带间充质干细胞诱导分化为成骨细胞茜素红染色结果；

图3为脐带间充质干细胞诱导分化为成脂细胞苏木素染色结果。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

本发明所述冻存液的一种实施例，本实施例所述冻存液包含以下含量的组分：

实施例2

本发明所述冻存液的一种实施例，本实施例所述冻存液包含以下含量的组分：

实施例3

本发明所述冻存液的一种实施例，本实施例所述冻存液包含以下含量的组分：

实施例4

本发明所述冻存液的一种实施例，本实施例所述冻存液包含以下含量的组分：

实施例5

本发明所述冻存液的一种实施例，本实施例所述冻存液包含以下含量的组分：

对比例

本发明所述冻存液的一种对比例，本对比例所述冻存液包含以下体积百分含量的组分：二甲基亚砜10％和胎牛血清90％。

实施例6

将实施例1～5和对比例所述冻存液应用于脐带间充质干细胞的冻存，并将实施例1～5和对比例所述冻存液，分别按照以下方法进行细胞冻存、复苏实验及MTT检测。

一、配制实施例1～5所述冻存液

二、脐带间充质干细胞的分离

(1)在超净台中取出运输液中的脐带，放于60cm²的培养皿中，用清洗液洗涤数遍已去除脐带表面的血液；

(2)将清洗后的脐带，剪成2-3cm长的小段于60cm²的培养皿，用清洗液逐个洗涤数遍，已去除残留在里面的血液；

(3)每一段再经无抗0.9％的无菌生理盐水清洗数遍，将羊膜动静脉管剥离，只保留华通氏胶体；

(4)将所有的华通氏胶体移至50mL离心管中，加入1-2倍的生理盐水，用剪刀将其剪碎，800g，离心5min；

(5)弃去上清，将组织沉淀平均分于60cm²的培养皿中，待其贴壁加入8mL脐带间充质干细胞培养基，放于37℃，5％二氧化碳培养箱培养。

三、脐带间充质干细胞的培养

(1)当培养上述脐带块2d，对其进行半换液处理即加入4mL新鲜培养基；

(2)培养4d,组织块周边会有间充质干细胞克隆出现，可记为P₀代，进行全换液处理；

(3)培养5-6d，间充质干细胞融合度达到90％，弃去脐带组织块和原有培养液，2mL生理盐水洗涤一次，弃去；

(4)加入2mL 0.25％胰酶，放于培养箱中消化30s，加入2mL盐水进行稀释消化液，轻轻吹到细胞使其脱落；

(5)上述(4)所制得的细胞悬液经100μm滤网过滤以去除残余的组织碎片，300g，离心5min，弃去上清，加3mL新鲜培养基重悬细胞沉淀，并以1:3的比例进行传代，可标记为P₁代。

四、细胞冻存

(1)细胞冻存过程：

1)待脐带间充质干细胞融合度达到90％，弃去还有培养基，加入pH为7.0的PBS洗细胞表面一次，弃去；

2)加入0.25％胰蛋白酶液消化30s，弃去，加入2mLDMEM培养液，用移液枪轻轻吹打使细胞脱落，将细胞悬液移至15mL离心管中，离心1000rpm，离心3min，弃上清，加入PBS洗细胞两次，细胞沉淀加入实施例1～5和对比例所制备的冻存液5mL，每毫升冻存液含有3×10⁶～8×10⁶个脐带间充质干细胞，混匀，分装至冻存管内，每管1.5mL。

(2)细胞冷冻

将冻存管移至程序降温盒中放于4℃，30min；然后放入-20℃，2h；再放入-80℃，8h；最后移入液氮中保存；分别冻存4个月。每组3个重复。

(3)细胞复苏

取出冻存管快速置于37℃水浴，直至细胞悬液完全融化，移至15mL离心管中，然后3倍DMEM培养液稀释，1000rpm，离心5min，离心去除上清液，再重复3次。

五、MTT细胞活性检测

按照MTT法检测实施例1～5，对比例1所述冻存液按实验例6中的方法制得的脐带间充质干细胞的增殖情况。结果如表1所示：

表1 MTT细胞活性检测结果

组别	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	实施例5	对比例1
							活力(％)	97.77	92.58	90.38	93.23	94.15	85.38

从表1的检测结果可以看出，各实施例与对比例相比差异明显(P<0.05)，其中实施例1制得的细胞的活力高于实施例2～5(P<0.05)，说明本发明研究的冻存液比含血清的冻存液能更好地保护细胞活性，且实施例1的效果最佳。

六、流式表型检测

实验步骤：

1)上述实施例1～5和对比例所制得的各脐带间充质干细胞进行扩增培养；

2)当细胞融合度达到90％时，0.25％胰酶消化并收集细胞，分装于1.5mLEP管中，每份细胞数为2×10⁵个；

2)细胞胞重悬于1mL PBS中洗涤2次，200g，离心5min；

3)离心弃去上清液，加入200μL鼠源CD29、CD44、CD105、CD34、CD45、HLA-DR一抗抗体(稀释度为1:100)常温下孵育30min；

4)1mLPBS洗涤，分别与FITC标记二抗IgG(稀释度为1:2000)常温避光孵育1h；

5)PBS洗两次后，弃去PBS，根据细胞量加入适量的PBS重悬细胞，利用流式细胞仪检测。

其中，对实施例1～5制得脐带间充质干细胞的检测结果如图1。通过流式细胞仪分析显示，实施例1～5中的阳性蛋白CD29、CD44、CD105和阴性CD34、CD45、HLA-DR蛋白要比对比例中的表达量高；说明各实施例所制备的脐带间充质干细胞特异性好，且实施例1最佳。

七、成骨诱导及检测

实验步骤：

1)1mL0.1％明胶包被6孔板，至于二氧化碳培养包被30min；

2)将实施例1冻存液中冻存4个月复苏制得的间充质干细胞传至3代，当细胞融合度达到80％-90％时，用0.25％的胰酶消化；

3)离心，弃去上清，脐带间充质干细胞重悬细胞，细胞计数板计数，以每孔2×10⁴接种于已制备好的六孔板中，补加脐带间充质干细胞培养液到2mL；

4)当细胞融合度达到60-70％时，弃去脐带间充质干细胞培养液，向六孔板中加入2mL成骨细胞诱导培养基。

5)每隔3d，更换新的成骨细胞诱导培养基。

6)诱导2周，可进行半数换液；

7)将诱导好的成骨细胞，弃去细胞培养液，每孔加入2mLPBS洗2次，加入2mL4％多聚甲醛室温固定30min；

8)弃去固定液，每孔加入2mLPBS洗2次，加入1mL茜素红染色5min；

9)弃去茜素红染液，每孔加入2mLPBS洗2次，弃去，镜下观察，拍照如附图2所示。

图2原图为彩色图片，从图2可以看出，实施例1所制得的脐带间充质干细胞具有诱导成骨细胞的能力且效率较高。

八、成脂诱导及检测

实验步骤：

1)将实施例1冻存液中冻存4个月复苏制得的间充质干细胞传至3代，当细胞融合度达到80％-90％时，用0.25％的胰酶消化；

2)进行传代，接种至含有细胞爬片的6孔板中，待其融合度达到100％时，去掉原培养基，PBS洗细胞1次，加入成脂细胞诱导培养基进行培养，3-4d换液一次；

3)显微镜下观察到保质中有脂滴形成时，吸去培养基，PBS洗细胞2次，用4％的多聚甲醛固定细胞15min，以0.375％油红O染色20min，苏木素复染2-5min，显微镜下观察、拍照，如附图3所示。

图3原图为彩色图片，从图3可以看出，实施例1所制得的脐带间充质干细胞具有诱导成脂细胞的能力且效率较高。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种冻存液，其特征在于，包含以下含量的组分：

2.如权利要求1所述冻存液，其特征在于，所述冻存液包含以下含量的组分：

3.如权利要求1所述冻存液，其特征在于，所述冻存液包含以下含量的组分：

4.如权利要求1～3中任一项所述冻存液在间充质干细胞冻存中的应用。

5.如权利要求1～3中任一项所述冻存液在脐带间充质干细胞冻存中的应用。

6.一种间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，采用权利要求1～3中任一项所述冻存液冻存间充质干细胞。

7.如权利要求6所述间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。

8.如权利要求7所述间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，将脐带间充质干细胞悬浮于权利要求1～3中任一项所述的冻存液中，在-70～-200℃下冻存。

9.如权利要求7所述间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，将脐带间充质干细胞用胰酶消化后离心并弃上清，加入权利要求1～3中任一项所述的冻存液，每毫升冻存液含有3×10⁶～8×10⁶个脐带间充质干细胞，在4℃放置30min，然后再在-20℃下放置2h，再在-80℃下放置8h，转入液氮长期冻存。

10.如权利要求7所述间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将脐带间充质干细胞用0.25％胰蛋白酶液消化30s，用DMEM完全培养基终止消化，轻轻吹打细胞，收集到容器中，离心，弃上清，得细胞沉淀；

(2)、在细胞沉淀中加入PBS洗细胞两次，加入权利要求1～3中任一项所述冻存液；

(3)、将细胞在4℃放置30min，然后再在-20℃下放置2h，再在-80℃下放置8h，转入液氮长期冻存。