CN113973808A - 一种改进的细胞冻存液配方 - Google Patents
一种改进的细胞冻存液配方 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113973808A CN113973808A CN202111351011.0A CN202111351011A CN113973808A CN 113973808 A CN113973808 A CN 113973808A CN 202111351011 A CN202111351011 A CN 202111351011A CN 113973808 A CN113973808 A CN 113973808A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cells
- cell
- solution
- freezing
- formula
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 239000007788 liquid Substances 0.000 title abstract description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 21
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims abstract description 13
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims abstract description 13
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 claims abstract description 11
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 abstract description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 abstract description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 abstract description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 abstract description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 53
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 3
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N Adenosine diphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 102400000888 Cholecystokinin-8 Human genes 0.000 description 1
- 101800005151 Cholecystokinin-8 Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- TTWYZDPBDWHJOR-IDIVVRGQSA-L adenosine triphosphate disodium Chemical compound [Na+].[Na+].C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O TTWYZDPBDWHJOR-IDIVVRGQSA-L 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physiology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种改进的细胞冻存液配方，该配方是在传统的细胞冻存液由基础培养基：胎牛血清：DMSO＝5:4:1组成中进行改进，在原冻存液中加入1.5％的2mM Se溶液和1.5％的20mM ATP溶液，加入之后，与细胞混匀，梯度降温冻存细胞。该配方可以显著地提高细胞存活率，以利于下一步涉及到细胞生物学实验的顺利开展。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学技术领域，特别是有关细胞冻存的技术领域。
背景技术
在细胞生物学研究的过程中，细胞培养是最基本的操作。随着生物学实验技术的发展，细胞体外培养技术被广泛应用于各个领域中。细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化，并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。
利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态，减少细胞代谢，将其细胞特性保存起来，也可防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到细胞保种的作用。
传统冻存液由基础培养基：胎牛血清：DMSO＝5:4:1组成。冻存时向培养基中加入保护剂二甲基亚砜(DMSO)，因分子量小能够较快的渗入细胞中与水分子结合，降低细胞冰点和细胞内外的电解质浓度，在缓慢冻结条件下，改变细胞膜对水的通透性，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。但DMSO在常温下对细胞有一定的毒性，极性很强能够与细胞内的多种蛋白质结合，改变其空间结构，使多种酶失活。
胎牛血清中含有丰富的细胞生长所必需的营养物质，能够为细胞提供生长、分化、繁殖和黏附的生理环境，是细胞培养中最天然的培养基，中和DMSO 毒性，对细胞有保护作用。
体外培养细胞传统冻存液冻存复苏后的存活率不高，阻碍了其生物学方面的研究进展。因此，开发高效、经济、实用的冻存液，提高细胞存活率，是顺利进行后续各项生物学实验关键所在。
ATP(三磷酸腺苷)，是生命活动能量的直接来源。水解产生ADP(二磷酸腺苷)和一个Pi(磷酸基团)，同时释放能量,产生的能量供各种生化反应所用，改善新陈代谢。
Se硒，保护细胞膜和染色体，保护核糖核酸等大分子的结构及功能，能阻止过氧化物和自由基的形成。在改进配方中，于原冻存液中加入了ATP溶液和Se溶液，极大地提高了细胞的存活率。
发明内容
本发明提供了一种改进的细胞冻存液配方，可以有效解决上述问题。
本发明提供了一种改进的细胞冻存液配方，包括以下组分：
一种改进的细胞冻存液配方，原细胞冻存液中加入1.5％的2mM Se溶液，以用于冻存细胞。
一种改进的细胞冻存液配方，原细胞冻存液中加入1.5％的20mM ATP溶液，以用于冻存细胞。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。以下为针对传统冻存液和冻存液的改进配方实例。
本发明采用的实验步骤如下：
(1)细胞培养、传代，显微镜下观察待细胞生长状态良好、铺满培养瓶瓶底80-90％，于生物安全柜内进行实验操作。用PBS清洗细胞2次，弃去洗液，加入适量胰酶消化细胞，于37℃5％CO2培养箱静置一段时间。
(2)取出培养瓶，于显微镜/肉眼观察细胞消化状态，补充等体积的含血清培养基，适当力度吹打混匀培养瓶四个角和中间，转移至15ml离心管，1000rpm离心3min。
(3)离心后，倒掉上清，加入适量培养基重悬，细胞计数。按细胞密度 5×106个/ml，比例基础培养基：胎牛血清：DMSO＝5:4:1配冻存液，混匀。
(4)在冻存前，于原冻存液中分别加入1.5％的2mM Se溶液和1.5％的20mM ATP溶液。加入之后，再与细胞混匀，
(5)转入细胞冻存管内，一般容量为1ml/管。封口膜封口，管壁做好标记(细胞名称、培养基、代数、日期、操作人)后转入程序降温冻存盒，-80℃过夜，再转入液氮保存。
以293T cell的细胞存活率作为参照，对传统冻存液和改进冻存液进行比较。
对传统冻存液和改进冻存液的细胞毒性分别进行测定，通过酶标仪记录 OD＝450nm值。
用传统冻存液和改进冻存液分别冻存细胞一段时间后，进行细胞复苏，以1:1的比例在细胞中加入0.08％台盼蓝，通过细胞计数仪计算细胞总数、活细胞数，确定细胞存活率。
使用改进的冻存液配方，确定可以极大的提高细胞的存活率，且毒性较小。
| 传统冻存液 | 改进冻存液 | |
| OD值 | 1.6428 | 1.2527 |
| 细胞总数 | 4.78×10<sup>6</sup> | 4.47×10<sup>6</sup> |
| 活细胞数 | 1.15×10<sup>6</sup> | 1.67×10<sup>6</sup> |
| 存活率％ | 24±3％ | 38±4％ |
传统冻存液和改进的冻存液配方的CCK8 OD值和细胞存活率值对比。
Claims (2)
1.一种改进的细胞冻存液配方，其特征在于：原细胞冻存液中加入1.5％的2mM Se溶液，以用于冻存细胞。
2.一种改进的细胞冻存液配方，其特征在于：原细胞冻存液中加入1.5％的20mM ATP溶液，以用于冻存细胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111351011.0A CN113973808A (zh) | 2021-11-15 | 2021-11-15 | 一种改进的细胞冻存液配方 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111351011.0A CN113973808A (zh) | 2021-11-15 | 2021-11-15 | 一种改进的细胞冻存液配方 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113973808A true CN113973808A (zh) | 2022-01-28 |
Family
ID=79748638
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111351011.0A Pending CN113973808A (zh) | 2021-11-15 | 2021-11-15 | 一种改进的细胞冻存液配方 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113973808A (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1784142A (zh) * | 2003-05-09 | 2006-06-07 | 生命血液医学公司 | 用于维持器官和细胞生存能力的组合物 |
| CN102511471A (zh) * | 2011-12-15 | 2012-06-27 | 成都清科生物科技有限公司 | 一种间充质干细胞冻存液及其制备方法 |
| CN109042625A (zh) * | 2018-08-01 | 2018-12-21 | 广州润虹医药科技股份有限公司 | 一种冻存液及其在脐带间充质干细胞冻存中的应用 |
-
2021
- 2021-11-15 CN CN202111351011.0A patent/CN113973808A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1784142A (zh) * | 2003-05-09 | 2006-06-07 | 生命血液医学公司 | 用于维持器官和细胞生存能力的组合物 |
| CN102511471A (zh) * | 2011-12-15 | 2012-06-27 | 成都清科生物科技有限公司 | 一种间充质干细胞冻存液及其制备方法 |
| CN109042625A (zh) * | 2018-08-01 | 2018-12-21 | 广州润虹医药科技股份有限公司 | 一种冻存液及其在脐带间充质干细胞冻存中的应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Smith et al. | Volutin production in Aerobacter aerogenes due to nutrient imbalance | |
| CN102154197B (zh) | 一种在低血清和无血清培养基中高密度悬浮培养的bhk-21细胞及其制备方法 | |
| Franěk | Starvation‐induced programmed death of hybridoma cells: Prevention by amino acid mixtures | |
| CN108184817A (zh) | 一种脐带血造血干细胞冻存液及冻存方法 | |
| CN103380769A (zh) | 用于分离培养干细胞的脂肪组织的长时间保存液 | |
| CN107494521B (zh) | 细胞冻存液和细胞冻存方法 | |
| CN116473051A (zh) | 一种无血清非程序细胞冻存液及其制备方法和应用 | |
| CN105454220A (zh) | 一种胎盘保存方法、胎盘保存液及其制备方法 | |
| CN112715533B (zh) | 一种间充质干细胞的冻存液及冻存方法 | |
| CN113973808A (zh) | 一种改进的细胞冻存液配方 | |
| Iyengar et al. | Expression of creatine kinase isoenzyme during oogenesis and embryogenesis in the mouse | |
| CN103074297B (zh) | 家畜精原干细胞培养液 | |
| CN108552156A (zh) | 一种无血清的诱导多功能干细胞冻存液及冻存方法 | |
| CA1054085A (en) | Urokinase production | |
| Diettrich et al. | Long-term storage in liquid nitrogen of an embryogenic cell strain of Digitalis lanata | |
| WO2015026307A1 (en) | Boron added cell cryopreservation medium | |
| Schachtschabel et al. | Serial cultivation of Ehrlich ascites tumor cells in hypertonic media | |
| CN113564101A (zh) | 一种多能干细胞来源的角质形成细胞的培养方法 | |
| CN112655700A (zh) | 冻存液在胆囊干细胞中的应用及胆囊干细胞的复苏方法 | |
| CN111226909A (zh) | 卵子及卵裂期胚胎的玻璃化解冻液及解冻方法 | |
| CN115119827B (zh) | 一种冷冻保护剂及其制备方法和应用 | |
| US20230023218A1 (en) | Use of a cell culture composition for promoting cell growth | |
| CN113462636B (zh) | 一种表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法 | |
| CN114946833B (zh) | 五味子乙素在制备离体生物样本保存液中的应用 | |
| Goh et al. | Successful in vitro growth of rat two-cell embryos to blastocysts using a simple chemically defined medium |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20220128 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |