CN103074297B - 家畜精原干细胞培养液 - Google Patents

Abstract

本发明公开了家畜精原干细胞培养液SSCM，制备方法为：临用前，将SSCB、细胞因子储存液、青霉素储存液、链霉素储存液、Fungizone储存液按下列比例混合均匀：1ml SSCB，分别添加三种细胞因子储存液各1μl、青霉素储存液1μl、链霉素储存液1μl、Fungizone储存液1μl，混合均匀即得；本专利公开的家畜精原干细胞培养液适合家畜精原干细胞的长期培养。同时提交的还有家畜精原干细胞长期培养方法，免疫荧光染色鉴定方法，冷冻保存方法等。

Description

家畜精原干细胞培养液

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及的是一种家畜精原干细胞培养液。 

背景技术

精原干细胞(SSCs)是最重要的成体干细胞之一。精原干细胞不仅有传宗接代的遗传功能，近来研究显示，精原干细胞很容易通过退分化产生多能干细胞。这使得精原干细胞操作技术得到生命科学、农业科学和医学各路专家的垂青【1】。自从精原干细胞移植技术【2，3】建立以来，精原干细胞的研究得到了空前的发展。近年来又建立了小鼠和大鼠精原干细胞的体外长期培养方法【4，5】。若要在体外对精原干细胞进行操作，那么首先就要对精原干细胞进行分离和纯化培养。在小鼠睾丸内的全部生殖细胞中，仅有0.03％是干细胞【6】，因此对精原干细胞进行分离和纯化是培养精原干细胞关键的一步。国内精原干细胞的研究近几年取得了较大的进展。上海交通大学吴际团队在小鼠精原干细胞的自我更生、增殖培养、冷冻储存及睾丸移植等方面的研究取得了好成果【7，8】。 

精原干细胞不仅在生殖生物学研究中具有重要价值，也是转基因动物技术研究的新的方向【9】。制作转基因动物的方法有多种。当前常用的制作转基因动物的方法有两种：DNA原核显微注射法和核移植法。这两种方法的共同点是，都进行胚胎操作；不同点是，外源基因的重组整合时间点不同。原核显微注射法外源基因的重组整合在胚胎显微操作之后，外源DNA只能随机整合，无选择余地，因而产生嵌合体的比例高，产生生殖系遗传的比例低，转基因的表达水平在不同个体中差异大。最大的弱点是成功率低。因此家畜转基因操作已经不用DNA原核显微注射法。核移植法转基因，也称转基因克隆，外源基因的重组整合发生在胚胎显微操作之前，先筛选基因重组体细胞做为供体再进行 核移植，因而保证产生的转基因动物具有生殖系遗传特性。但是，核移植法也有它的弱点，除了效率低之外，还常伴有出生体重超常和生理不正常等。核移植过程不能避免表观遗传改变的影响，也使转基因克隆动物对外源基因的表达存在不确定性。用精原干细胞移植法制作转基因动物，既可以先筛选基因重组的精原干细胞，又不会受表观遗传改变的影响。因为精原干细胞在长期培养过程中具有卓越的稳定性和增殖潜能，它们有一个独特的机制，能防止已损坏的遗传基因和表观遗传性状传播给后代。这些特性使精原干细胞成为具有吸引力的目标生殖系的遗传修饰【10】。这些研究结果说明用精原干细胞移植法制作转基因动物具有内在的优点。 

精原干细胞冷冻储存是雄性动物种质资源保存研究的新的分支。至今为止哺乳动物种质资源都是用卵母细胞冷冻保存。一旦精原干细胞长期培养方法和冷冻储存方法都建立起来了，雄性动物的种质资源就有保存方法了，而且比卵母细胞的保存简便，复苏后又可以增殖扩大培养。如小鼠精原干细胞经过2年多的培养，超过(增殖超过10(85)倍)，将其移植到先天性不孕的受体小鼠的生精小管，仍能使其恢复生育力，并产生有正常生育力的后代【11】。这些特性将使精原干细胞成为有潜力的种质资源。 

通过退分化诱导精原干细胞能够产生多能干细胞，用于组织器官康复临床医疗的研究及应用【12，13，14】。精原干细胞及其衍生的多能干细胞在再生医疗方面将有大的作为。也许在不久的将来，男士们就可以通过自己睾丸的一个小小的切片来治愈自身的疾病【15】。 

可见精原干细胞在生殖生物学研究、转基因动物技术研究、退分化诱导产生多能干细胞研究、动物种质资源保存研究及组织器官康复临床医疗研究上具有重要意义。精原干细胞培养技术的建立，对多个学科的研究和应用有促进作用。但是，家畜精原干细胞的长期培养至今仍然是世界难题。精原干细胞研究最著名的专家Brinster带领的研究组2008年曾经发表论文说过大动物精原干细胞长期培养方法的建立还需要5至10年的研究【16】。虽然鼠类的精原干细胞长期培养方法已经建立，种族差别、基因库差别、市售抗体不能通用等多种因素的存在，家畜精原干细胞的长期培养方法不能照搬鼠类的方法。鉴于家畜精原干细胞长期培养技术意义重大，不仅具有理论价值，在农牧业和医 学上还具有经济应用价值和社会价值【1】，美、欧、日、澳、韩等国均有科研组织致力于家畜精原干细胞长期培养的研究，曾有家畜精原干细胞的纯化、鉴定方面的报道，但是家畜精原干细胞的长期培养还没有成功。国内西北农林科技大学张涌团队在牛精原干细胞分离纯化方面取得了一定的成果【17】。但是，至今还没有看到完整的家畜精原干细胞长期纯化培养方法、分子水平特异鉴定及遗传修饰的报道。 

转基因家畜是现代农业发展的方向之一。转基因家畜的制作方法已列入国家十一五科技攻关的转基因专项，对未来国民经济的发展具有重大影响。目前只有转基因克隆技术可用于转基因家畜的制作。上面已经谈及这项技术存的缺陷。且不说它的成功率偏低，动物克隆过程中表观遗传的改变对后代遗传表型的影响至今还没有解决的办法。然而用精原干细胞移植技术产生供体遗传传播的过程不存在后代表观遗传改变的影响。比较而言，用精原干细胞移植技术制作转基因家畜具有天然的优势。用精原干细胞移植技术制作转基因小鼠已经取得成功【18】。但是，要建立用精原干细胞移植方法制作转基因家畜的技术，首先要实现家畜精原干细胞的长期培养。 

家畜精原干细胞液是进行精原干细胞长期培养的关键因素之一。本发明提供一种多种成分所组成的适用于家畜精原干细胞培养的培养液。这种精原干细胞培养液不含动物血清，辅以滋养层细胞，能够实现家畜精原干细胞的长期培养。本发明的培养液可用来建立家畜精原干细胞系，用于长期培养家畜精原干细胞，能维持精原干细胞的标记分子表达特性和分化为精母细胞的分化能力，移植到受体家畜睾丸，能够进入精子发生过程。本发明还涉及所述的精原干细胞培养液在长期保藏家畜精原干细胞中的用途。 

参考文献： 

【1】Kanatsu-Shinohara M，Takehashi M，Shinohara T.Brief history，pitfalls，and 

prospects of mammalian spermatogonial stem cell research.Cold Spring HarbSymp Quant Biol.2008；73：17-23. 

【2】Brinster R L，Avarbock M R.Germl ine transmission of donor haplotypefollowing spermatogonial transplantation [J].Proc Natl Acad Sci，1994， 91：11303-11307. 

【3】Brinster R L，Zimmermann J W.Spermatogenesis following male germ-celltransplantation [J].Proc Natl Acad Sci，1994，91：11298-11302. 

【4】Shinohara M K，Ogonuki N，Inoue K，et al.Long-term proliferation in cultureand germline transmission of mouse male germline stem cells.Biol Reprod，2003，69：612-616. 

【5】Hamra F K，Chapman K M，Nguyen D M，Williams-Stephens A A，Hammer R E，GarbersD L.Self renewal，expansion，and transfection of rat spermatogonial stemcells in culture.Proc Natl Acad Sci U S A.2005，102(48)：17430-17435. 

【6】Ehmcke J，Wistuba J，Schlatt S.Spermatogonial stem cells：questions，modelsand perspectives [J].Hum Reprod Update，2006，12(3)：275-282. 

【7】Wu J，Zhang Y，Tian GG，Zou K，Lee CM，Yu Q，Yuan Z.Short-type PB-cadherinpromotes self-renewal of spermatogonial stem cells via multiple signalingpathways.Cell Signal.2008，20(6)：1052-60. 

【8】Yuan Z，Hou R，Wu J.Generation of mice by transplantation of an adultspermatogonial cell line after cryopreservation.Cell Prolif.2009，42(2)：123-31. 

【9】吴应积，罗奋华，旭日干.用精原干细胞移植技术制作转基因动物的研究前景.科学通报，2005，50(19)：2061-2068. 

【10】Kanatsu-Shinohara M，Ogonuki N，Iwano T，Lee J，Kazuki Y，Inoue K，MikiH，Takehashi M，Toyokuni S，Shinkai Y，Oshimura M，Ishino F，Ogura A，Shinohara T.Genetic and epigenetic properties of mouse male germline stemcells during long-term culture.Development.2005Sep；132(18)：4155-4163. 

【11】Kanatsu-Shinohara M，Shinohara T.Culture and genetic modification of mousegermline stem cells.Ann N Y Acad Sci.2007.1120：59-71. 

【12】Mito Kanatsu-Shinohara，Kimiko Inoue，et al.Generation of Pluripotent Stem Cells from Neonatal Mouse Testis.Cell，2004，119：1001-1012. 

【13】Kaomei Guan，Karim Nayernia，et al.Pluripotency of spermatogonial stemcells from adult mouse testis.Nature，2006，440(7088)：1199-203. 

【14】Conrad S，Renninger M，et al.Generation of pluripotent stem cells fromadult human testis.Nature，2008，456(7220)：344-349. 

【15】Dym M，He Z，Jiang J，Pant D，Kokkinaki M.Spermatogonial stem cells：unlimited potential.Reprod Fertil Dev.2009；21(1)：15-21. 

【16】Hiroshi Kubota and Ralph L.Brinster.Culture of Rodent SpermatogonialStem Cells.Male Germline Stem Cells of the Postnatal Animal.METHODS INCELL BIOLOGY，2008，86：59-84. 

【17】毕聪明，张仕强，彭树英，李吉霞，张涌.牛精原干细胞的分离和纯化及体外培养的一般特性.畜牧兽医学报，2006，37(10)，977～981 

【18】Kanatsu-Shinohara M，Ikawa M，Takehashi M，Ogonuki N，Miki H，Inoue K，Kazuki Y，Lee J，Toyokuni S，Oshimura M，Ogura A，Shinohara T.Productionof knockout mice by random or targeted mutagenesis in spermatogonial stemcells.Proc Natl Acad Sci U S A.2006，103(21)：8018-23. 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种家畜精原干细胞培养液SSCM。 

本发明的技术方案如下： 

家畜精原干细胞培养液SSCM，制备方法为：临用前，将SSCB、细胞因子储存液、青霉素储存液、链霉素储存液、Fungizone储存液按下列比例混合均匀：lml SSCB，分别添加三种细胞因子储存液各1μl、青霉素储存液1μl、链霉素储存液1μl、Fungizone储存液1μl，混合均匀即得； 

其中，按照下表配方配制1升SSCB溶液： 

试剂名称	重量(mg)	体积(ml)	备注
				DMEM/F12(high glucose)粉	15600		按厂家要求添加NaHCO3
丙酮酸钠	55
				L-glutamin	511
BSA	5500
				Biotin	0.10
DL Alpha Tocopherol Acetate	1.0
				DL Alpha-Tocopherol(vit.E)	1.0
过氧化氢酶	2.5
				人重组胰岛素	4.0
人转铁蛋白	5.0
				过氧化物歧化酶，	2.5
皮质酮(皮质类固醇)	0.02
				半乳糖	15.0
乙醇胺/乙醇胺-Cl	1.0
				谷胱苷肽	1.0
L-卡尼汀	2.0
				亚油酸	1.0
亚麻酸	1.0
				孕酮	0.0063
腐胺/腐胺-2HCl	16.1
				亚硒酸钠	0.0144
三碘甲状腺原氨酸	0.002
				硒代蛋氨酸	0.04
MEM  NON-ESSENTIAL  AMINO  ACIDS		10

SOLUTION(100X)
				BME AMINO ACIDS SOLUTION(50X)		20

所述三种细胞因子储存液配制： 

GDNF储存液：20ng/μl； 

bFGF储存液：20ng/μl； 

Gfral储存液：100ng/μl； 

所述青霉素储存液配制：青霉素100kU/ml； 

所述链霉素储存液配制：100mg/ml； 

所述Fungizone储存液：2.5mg/ml。 

家畜(具体指绵羊、山羊、牛、猪等，下同)精原干细胞操作在下列几方面具有重要应用价值：1.畜牧业杂种优势遗传育种；2.转基因动物制作；3.家畜优良品种及频危动物种质资源保存及应用；4.组织器官再生临床医学研究。精原干细胞操作的核心技术之一是精原干细胞的长期纯化培养。由于家畜精原干细胞的长期培养研究面临多重挑战，至今未见研究成功的报道。发明人经过近几年的努力，在家畜精原干细胞长期纯化培养技术上取得了突破，建立了家畜精原干细胞分离纯化和长期培养方法，建立了家畜精原干细胞冷冻储存方法。用免疫荧光细胞染色法及RT-PCR法对家畜精原干细胞进行鉴定，结果显示，家畜精原干细胞培养传代最多已达40代以上，最长储存时间长达2年以上，体外培养的家畜精原干细胞保持表达Plzf、CDH1、OCT4、Thy1、PGP9.5、和Gfral等精原干细胞的标记基因不变，经体外诱导能转变为表达SCP3的精母细胞。 

这些结果证明我们已经获得了家畜精原干细胞株，为开展家畜杂交育种、种子资源的储存、以及转基因家畜的制作奠定了坚实的基础，并将对再生医学研究产生深刻的影响。精原干细胞培养液配制是精原干细胞长期培养技术的重要部分。本专利提出的家畜精原干细胞培养液适合家畜精原干细胞的长期培养。同时提交的还有家畜精原干细胞长期培养方法，免疫荧光染色鉴定方法，冷冻保存方法等。 

附图说明

图1.用PLZF抗体染色结果。绵羊SSCs被染成红色。 

图2.用CDH1抗体染色结果。绵羊SSCs被染成绿色。 

图3.用Hoechst33342染色结果。所有活细胞的核被染成蓝色。 

图4.与上述各图同一视野中，绵羊SSCs与STO滋养层细胞的照片。 

图5为图1、图2、图3、图4合并所得的照片。 

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。 

实施例1、家畜精原干细胞培养液(SSCM) 

A.SSCM的成分 

DMEM/F12(high glucose)粉，丙酮酸钠，L-glutamin，BSA，Biotin，DL AlphaTocopherol Acetate，DL Alpha-Tocopherol(vit.E)，过氧化氢酶，人重组胰岛素，人转铁蛋白，过氧物歧化酶，皮质酮(皮质类固醇)，半乳糖，乙醇胺/乙醇胺-C1，谷胱苷肽，L-卡尼汀，亚油酸，亚麻酸，孕酮，腐胺/腐胺-2HCl，亚硒酸钠，三碘甲状腺原氨酸，硒代蛋氨酸，GDNF，bFGF，Gfral，MEM NON-ESSENTIAL AMINO ACIDSSOLUTION(100X)，BME AMINO ACIDS SOLUTION(50X)，青霉素储存液，链霉素储存液，Fungizone储存液。 

B.SSCM的基础培养液SSCB的配制方法 

B1、按照下表配方配制1升SSCB溶液，严格按照细胞培养无菌操作技术要求配制。 

B2、三种细胞因子储存液配制 

GDNF储存液：20ng/μl 

bFGF储存液：20ng/μl 

Gfral储存液：100ng/μl 

B3、青霉素储存液配制：青霉素100kU/ml 

B4、链霉素储存液配制：100mg/ml 

B5、Fungizone储存液：2.5mg/ml 

B6、SSCM的配制 

临用前，将SSCB，细胞因子储存液，青霉素储存液，链霉素储存液，Fungizone储存液按下列比例混合均匀，用于家畜精原干细胞的培养。 

1ml SSCB，分别添加上述三种细胞因子储存液各1μl、青霉素储存液1μl、链霉素储存液1μl、Fungizone储存液1μl，混合均匀。 

实施例2家畜精原干细胞培养液的应用 

A.滋养层细胞的制备操作步骤 

1、STO细胞用STO细胞培养液(DMEM/F12，添加7％标准胎牛血清，青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)进行培养。每次按1∶4传代，大约2天左右细胞汇合度达到70％-80％，准备丝裂霉素处理。 

2、培养至汇合度为80％左右的STO细胞，加入丝裂霉素(按终浓度15μg/ml计算)，放入细胞培养箱，在37℃，5％ CO₂，饱和湿度的条件下培养2h。 

3、去掉含有丝裂霉素的培养液，并用10mlPBS洗三次。 

4、用1ml Trypsin/EDTA使细胞脱壁，并用4ml培养液D终止Trypsin的消化作用，收集消化后的细胞，2000rpm离心5分钟。 

5、重悬细胞，计数。以6×10⁵细胞/mL的浓度加入含10％DMSO的培养液D，液氮保存。 

6、制备滋养层时，解冻丝裂霉素处理的STO细胞，以2×10⁵细胞/mL的终浓度将细胞接种在事先由gelatin处理过的12孔板中，在37℃，5％CO₂，饱和湿度的条件下培养。滋养层细胞宜在第二天长好，立即用于接种SSCs。 

B.家畜SSC的培养，以绵羊精原干细胞为例 

1.将绵羊SSCs用SSCM重悬，以5×10⁴细胞/mL的浓度接种到铺好STO滋养层细 胞的12孔细胞培养板中，在37℃，5％CO²，饱和湿度的条件下培养。 

2.每隔2天换SSCM一次，换液操作要温和。因为SSCs在STO滋养层上粘附的不是很紧，每次操作时都要轻拿轻放。培养良好的SSCs在显微镜下很容易观察到成串的细胞簇。 

3.培养6-8天之后，一般要进行传代。传代之前一天，按上述A-6步方法用12孔板制备好滋养层细胞。将培养好的细胞按1∶3的稀释度传代。操作方法如下：缓慢吸出原培养液，每孔加入1ml新鲜SSCM，并用1mL移液管轻轻吹打，以便SSCs从滋养层细胞上脱离，但滋养层细胞又不会从培养板脱离。将细胞转移到50ml试管中。再加入2ml新鲜的SSCM，轻轻吹打3-5次，将细胞混匀，按每孔1ml转移到制备好的滋养层细胞之上。4.重复第2，第3步操作，直到进行第二次传代。培养良好的SSCs在显微镜下很容易观察到成串的细胞簇。培养好的SSC细胞根据需要用于冻存，分析鉴定，或用于SSC传代等。 

C.家畜SSCs的冷冻保存，以绵羊为例 

SSC细胞冻存液：SSCM，加10％DMSO。 

操作方法 

1.待冻存的绵羊SSCs用1mL吸液管温和地轻轻吹打，SSCs从滋养层细胞上脱离，收集SSCs至50ml塑料管，进行细胞计数。然后2000rpm离心5min，弃上清。 

2.用SSC细胞冻存液重悬细胞并根据需要调整细胞密度，分装到冻存管内，至于冰上3min，转移至4℃冰箱放置30min，-80℃放置24h，之后转入液氮中长期保存。 

D.家畜SSCs的免疫荧光双标染色鉴定 

根据已报道的SSC标记蛋白分子，选用适当的一抗和二抗对不同家畜的SSC进行免疫荧光双标记染色鉴定。以绵羊SSCs的免疫荧光双标染色鉴定为例。选用的绵羊SSC的分子标记抗体如下表： 

家畜名称

一抗

来源

稀释倍数

二抗

来源

稀释倍数

染色图

绵羊

PLZF

SantaCruz

1∶50

驴抗山羊IgG-CY3

中杉金桥

1∶400

图1

CDH1

自制

1∶100

羊抗小鼠IgG-FITC

中杉金桥

1∶300

注：染色时抗体的稀释度根据染色条件做适当调整。 

SSC的免疫荧光双标染色鉴定方法 

(1)将体外多次继代培养与12孔板的SSCs用PBS洗三次，洗涤过程中用摇床缓慢摇动，每次5min。 

(2)吸去PBS，加入500μL 4％多聚甲醛0.02％戊二醛固定液，缓慢地轻轻晃动培养板一次。 

(3)吸去固定液，加入750μL4％多聚甲醛0.02％戊二醛固定液，室温放置30min。 

(4)吸去固定液，用PBS洗涤三次，每次在摇床上平缓摇动5min。 

(5)加入一定浓度的Triton-X100，在摇床上缓慢摇动适当的时间分钟。 

(6)吸去Triton-X100，加入PBS，在摇床上缓慢摇动5分钟，共洗涤三次。 

(7)用含10％正常山羊血清的封闭液室温封闭30min。 

(8)封闭后直接加入500μL按适当比例稀释第一种一抗，4℃过夜孵育。 

(9)PBS洗涤三次，每次1ml，在摇床上缓慢摇动5min。 

(10)加入适当比例稀释的二抗，摇床上缓慢摇动室温避光孵育30min。 

(11)吸去二抗，用PBS洗涤三次，每次在摇床上平缓摇动5min。 

(12)PBS洗三次，每次5min。 

(13)加入一定浓度的Triton-X100，在摇床上缓慢摇动适当的时间分钟。 

(14)吸去Triton-X100，加入PBS，在摇床上缓慢摇动5分钟，共洗涤三次。 

(15)加入适当比例稀释的第二种一抗，封口膜封口，4℃过夜。 

(16)PBS洗三次，每次5min。 

(17)加入适当比例稀释的二抗，摇床上缓慢摇动室温避光孵育30min。 

(18)吸去二抗，用PBS洗涤三次，每次在摇床上平缓摇动5min。 

(19)加入适当比例稀释的Hoechst33342，在摇床上缓慢摇动8min对细胞核染色。 

(20)PBS洗三次，每次5min。 

(21)荧光显微镜观察照相。 

E鉴定结果 

经过免疫荧光双标记染色分析鉴定，鉴定本方法培养的绵羊SSC是精原干细胞。经过多代培养后，维持表达精原干细胞的标记分子。用本方法培养成功的大家畜SSC有绵羊SSC(40代以上)，山羊SSC(30代以上)，猪SSC(30代以上)，牛SSC(30代以上)。 

用标记分子PLZF和CDH1的抗体对绵羊SSCs进行免疫荧光双标记染色，用Hoechst33342对活细胞核进行染色，用荧光显微镜拍照，放大倍数200X，标尺为40μm。结果显示，PLZF抗体将SSCs染成红色(见1)，CDH1抗体将SSCs染成绿色(见2)，Hoechst33342将所有的细胞核都染成蓝色(见3)，4为可见光照片。将1、2、3、4四张图合并得到5(可见红色和绿色重叠叠加为黄色，指示为SSCs，其他细胞为滋养层细胞STO)，从这张合并图可以清楚地看到，两个标记分子PLZF和CDH1染色结果重叠，使绵羊精原干细胞染成黄色。看到蓝色细胞核的是滋养层细胞STO。这个鉴定结果说明，经过长期培养后，绵羊精原干细胞仍然维持表达其标记分子PLZF和CDH1不变。 

确定了家畜精原干细胞培养液SSCM的配方。在培养过程中家畜精原干细胞没有分化现象，建立了继代培养条件。建立了家畜精原干细胞培养体系，包含滋养层细胞及SSCM培养液配方，及培养中需要添加的细胞因子，使体外培养的家畜精原干细胞没有分化。建立了家畜精原干细胞冷冻储存方法，经过反复冷冻复苏传代试验，冷冻储存后复苏培养的家畜精原干细胞能保留其表达标记分子的特性，还具有分化潜能。家畜精原干细胞经过2年多的长期培养，鉴定分析，冷冻储存后再融化复苏进行培养，仍然保持标记基因表达特性和分化能力不变，说明家畜精原干细胞长期培养液用于精原干细胞培养获得成功。 

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。 

Claims (1)

1.一种家畜精原干细胞培养液SSCM，其特征在于，制备方法为：临用前，将SSCB、细胞因子储存液、青霉素储存液、链霉素储存液、Fungizone储存液按下列比例混合均匀：1ml SSCB，分别添加三种细胞因子储存液各1μl、青霉素储存液1μl、链霉素储存液1μl、Fungizone储存液1μl，混合均匀即得；

其中，按照下表配方配制1升SSCB溶液：

所述三种细胞因子储存液配制：

GDNF储存液：20ng／μl；

bFGF储存液：20ng／μl；

Gfral储存液：100ng／μl；

所述青霉素储存液配制：青霉素100kU／ml；

所述链霉素储存液配制：100mg／ml；

所述Fungizone储存液：2.5mg／ml。