CN105969723A - 一种高效分离小鼠精原干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效分离小鼠精原干细胞的方法，包括如下步骤：步骤一，收集小鼠睾丸，采用两步酶消化法制备睾丸细胞悬液；步骤二，将睾丸细胞悬液按照一定密度接种到孔板中，加入精原干细胞培养液进行体外培养；步骤三，去掉培养液，用胰蛋白酶消化培养不同时间的睾丸细胞，从睾丸细胞中用免疫磁珠法分选精原干细胞；步骤四，将分选的精原干细胞接种到STO滋养层上，加入精原干细胞培养液，对精原干细胞进行原代和传代培养。本发明通过分离→培养→再分离→再培养的方法，建立了小鼠精原干细胞系，该发明可以达到体外高效富集精原干细胞的目的，且经济易行。从而为珍稀动物品种的保护及男性不育的治疗提供一个方向。

Description

一种高效分离小鼠精原干细胞的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是一种高效分离小鼠精原干细胞的方法。

背景技术

精原干细胞是雄性哺乳动物睾丸内维持精子发生的根源，自从1998年Brinster实验室第一次成功的对小鼠的精原干细胞进行了体外培养，并且证明了精原干细胞脱离曲细精管后在体外可以长期培养以来，许多实验室也开始研究哺乳动物的精原干细胞，但是小鼠睾丸内精原干细胞数量较少，且分离得到的精原干细胞纯度也较低，即使目前认为分离纯度较高的THY-1抗体直接分离得到的精原干细胞纯度也仅为60%左右，因而会影响其培养扩增，我们通过优化分离培养条件，能够从不同周龄小鼠获得纯度较高且倍增时间较短的精原干细胞。

现有技术的分离小鼠精原干细胞的方法为，目前常用的分离小鼠精原干细胞方法多数是以出生后5-7天的雄性小鼠为模型，直接用免疫磁珠法或借助流式细胞仪根据抗原抗体反应分选精原干细胞，但是，现有方法存在三个弊端：第一，实验对象比较局限，只能选择未进入减数分裂期的小鼠，因为一旦进入减数分裂，在分选过程中就会带入许多体细胞及各级精母细胞，降低精原干细胞纯度；第二，分离得到的精原干细胞数量少，通常分离一只出生后5-7天的小鼠仅可获得1×10⁴-1.5×10⁴个细胞/ml，分离一只成年鼠可获得2×10⁵-3×10⁵个细胞/ml;第三，成本较高，由于分离得到的精原干细胞数量较少且增殖速度较慢，要想得到更多的精原干细胞，需要长时间培养，因此，导致培养细胞的各项成本增加。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种高效分离小鼠精原干细胞的方法，成本低，操作简单，可以从小鼠睾丸中高效分离出精原干细胞。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种高效分离小鼠精原干细胞的方法，包括以下步骤：

（1）收集小鼠睾丸，采用两步酶消化法制备睾丸细胞悬液；

（2）将睾丸细胞接种到细胞培养板上，加入精原干细胞培养液，于37℃培养箱中培养，3d更换一次培养液；

（3）去掉细胞培养液，胰蛋白酶消化后，用免疫磁珠法分离出精原干细胞；

（4）将分离出来的精原干细胞接种到STO滋养层上，加入精原干细胞培养液，对精原干细胞进行原代和传代培养。

所述步骤（4）精原干细胞原代培养方法为：每2天更换一次精原干细胞培养液，5-7d传代一次；所述传代培养为：去掉细胞培养液，加入胰蛋白酶，置于37℃细胞培养箱中消化，离心收集细胞之后加入精原干细胞培养液，接种到新的STO滋养层上培养。

所述精原干细胞培养液成分包括：MEMα基础培养基、牛血清白蛋白BSA、游离脂肪酸FFA、L-谷氨酰胺L-Glutamine、亚硒酸钠Na₂SeO₃、Human recombinant GDNF、Ratrecombinant GFRα1/Fc Chimera、Human recombinant BFGF、胰岛素Insulin、转铁蛋白Transferin、腐胺Putrescine、HEPES、2-巯基乙醇2-ME、双抗P/S。

所述牛血清白蛋白的体积含量为0.2%-0.3%，所述游离脂肪酸的含量为6-8µeq/L，所述L-谷氨酰胺的含量为2-3mM，所述亚硒酸钠的含量为2×10^-8-3×10^-8M，所述GDNF含量为20-30ng/ml，所述GFRα-1含量为200-300ng/ml，所述BFGF含量为1-2ng/ml，所述胰岛素的含量为3 -5μg/ml，所述转铁蛋白的含量为8-10μg/ml，所述腐胺的含量为55 -60μM，所述HEPES的含量为7-10mM，所述β-巯基乙醇的含量为40-50μM，双抗浓度为1倍-2倍。

具体地说，包括以下步骤：

（1）分离小鼠睾丸细胞

实验动物为出生后5天-8周等不同周龄的雄性小鼠，用颈椎脱臼方法处死后取出双侧睾丸，洗去血污，去掉白膜，用两步酶消化法获得睾丸细胞，然后用70μm孔径的细胞筛过滤细胞悬液，将获得的睾丸细胞按照一定密度接种到6孔板中，置于37℃，5%CO₂培养箱中培养，培养液为精原干细胞培养液，3d更换一次培养液；

（2）制备STO滋养层

在37℃，5% CO₂培养箱中培养STO细胞，当细胞达到一定密度时，加入终浓度为17μg/ml的丝裂霉素C，在CO₂培养箱中培养2-3小时后加入胰蛋白酶，在37℃培养箱中消化收集STO细胞，按照需要调整细胞密度加入冻存液，分装到冻存管中放置于-80℃过夜后转移至液氮中长期保存备用；

（3）接种STO滋养层

在12孔板中加入含有0.2%明胶的DPBS包被过夜，次日取出放置于超净工作台晾干2小时，37℃水浴复苏用丝裂霉素C处理后的STO细胞，逐滴加入STO培养液，用移液枪轻柔吹打混匀后离心弃上清，再加入STO培养液接种到明胶包被后的12孔板中，37℃，5% CO₂培养箱中培养12小时；

（4）分离精原干细胞

将培养不同时间的睾丸细胞，胰蛋白酶消化后，用结合有THY-1抗体的磁珠4℃孵育20min，过分选柱，分离出精原干细胞，然后加入精原干细胞培养液，接种到含有STO滋养层的12孔板上，置于37℃，5% CO₂培养箱中培养；

（5）精原干细胞原代和传代培养

培养精原干细胞，2d更换一次培养液；5-7d传代一次，传代的方法为：去掉培养液，加入胰蛋白酶，于37℃培养箱中消化，离心收集精原干细胞，调整细胞密度加入精原干细胞培养液，将精原干细胞接种到新的含有STO滋养层的12孔板中培养；

所述精原干细胞培养液包括：MEMα基础培养基、体积含量为0.2%的牛血清白蛋白BSA、7.6µeq/L的游离脂肪酸FFA、2M的L-谷氨酰胺L-Glutamine、3×10^-8M的亚硒酸钠Na₂SeO₃、20ng/ml的Human recombinant GDNF、300ng/ml的 Rat recombinant GFRα1/Fc Chimera、1ng/ml的Human recombinant BFGF、5μg/ml的胰岛素Insulin、10μg/ml的转铁蛋白Transferin、60μM的腐胺Putrescine、10mM 的HEPES、50μM 的2-巯基乙醇2-ME、1倍的双抗P/S。

本发明的有益效果是：与常用的精原干细胞分离方法相比，具有以下四个优势：首先，我们既可以从出生后5-7d的雄性乳鼠睾丸中分离精原干细胞，也可以从性成熟后的雄性小鼠睾丸内分离精原干细胞，实验对象不受限制；其次，我们通过培养小鼠睾丸细胞使得睾丸内的体细胞及各级精母细胞大量死亡，因此，可以提高精原干细胞的分离纯度；再次，在用精原干细胞培养液培养睾丸细胞期间，精原干细胞会大量增殖，分离一只出生后5-7天的小鼠可获得4×10⁴-5×10⁴个细胞/ml,而分离一只成年小鼠可获得8.6×10⁵-1.5×10⁶个细胞/ml，比常用分离方法得到的精原干细胞数量增加4-5倍；第四，由于我们可以在短时间内培养即可获得大量的精原干细胞，因此，节约细胞培养成本，经济易行。本发明分离方法简便，获得的精原干细胞数量可倍增，对于不孕不育的治疗以及濒临灭绝物种资源的保护具有重要意义。

附图说明

图1为精原干细胞细胞培养结果图（a-e)分别为第一代到第五代的精原干细胞细胞图，a，c，e)标尺：100μm；b，d)标尺：50μm）。

图2为AP染色结果图（标尺：25μm）。

图3为培养6代后的精原干细胞不同表面标记物的免疫荧光染色结果图（注：a-d）C-KIT基因；e-h）OCT4基因；i-l）PLZF基因，其中a，e，i为明视野细胞图，b，f，j为DAPI复染，c，g，k为GFP细胞，d，h，l为不同抗体染色结果，标尺：25μm）。

图4为流式分析结果图。

图5为RT-PCR电泳图（注：从左至右依次为培养7d：OCT-4 、DDX4、DAZL；培养3d：OCT-4 、DDX4、DAZL；培养0d：OCT-4、DDX4、DAZL）。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

本发明的高效分离小鼠精原干细胞的方法包括以下步骤：

（1）收集小鼠睾丸，采用两步酶消化法制备睾丸细胞悬液；

（2）将睾丸细胞接种到细胞培养板上，加入精原干细胞培养液，于37℃培养箱中培养，3d更换一次培养液；

（3）去掉细胞培养液，胰蛋白酶消化后，用免疫磁珠法分离出精原干细胞；

（4）将分离出来的精原干细胞接种到STO滋养层上，加入精原干细胞培养液，对精原干细胞进行原代和传代培养。

所述步骤（4）精原干细胞原代培养方法为：每2天更换一次精原干细胞培养液，5-7d传代一次；所述传代培养为：去掉细胞培养液，加入胰蛋白酶，置于37℃细胞培养箱中消化，离心收集细胞之后加入精原干细胞培养液，接种到新的STO滋养层上培养。

所述精原干细胞培养液成分包括：MEMα基础培养基、牛血清白蛋白BSA、游离脂肪酸FFA、L-谷氨酰胺L-Glutamine、亚硒酸钠Na₂SeO₃、Human recombinant GDNF、Ratrecombinant GFRα1/Fc Chimera、Human recombinant BFGF、胰岛素Insulin、转铁蛋白Transferin、腐胺Putrescine、HEPES、2-巯基乙醇2-ME、双抗P/S。

所述牛血清白蛋白的体积含量为0.2%-0.3%，所述游离脂肪酸的含量为6-8µeq/L，所述L-谷氨酰胺的含量为2-3mM，所述亚硒酸钠的含量为2×10^-8-3×10^-8M，所述GDNF含量为20-30ng/ml，所述GFRα-1含量为200-300ng/ml，所述BFGF含量为1-2ng/ml，所述胰岛素的含量为3-5μg/ml，所述转铁蛋白的含量为8 -10μg/ml，所述腐胺的含量为55 -60μM，所述HEPES的含量为7-10mM，所述β-巯基乙醇的含量为40-50μM，双抗浓度为1倍-2倍。

具体地说，包括以下步骤：

（1）分离小鼠睾丸细胞

实验动物为出生后5天-8周等不同周龄的雄性小鼠，用颈椎脱臼方法处死后取出双侧睾丸，洗去血污，去掉白膜，用两步酶消化法获得睾丸细胞，然后用70μm孔径的细胞筛过滤细胞悬液，将获得的睾丸细胞按照一定密度接种到6孔板中，置于37℃，5%CO₂培养箱中培养，培养液为精原干细胞培养液，3d更换一次培养液；

（2）制备STO滋养层

在37℃，5% CO₂培养箱中培养STO细胞，当细胞达到一定密度时，加入终浓度为17μg/ml的丝裂霉素C，在CO₂培养箱中培养2-3小时后加入胰蛋白酶，在37℃培养箱中消化收集STO细胞，按照需要调整细胞密度加入冻存液，分装到冻存管中于液氮中保存备用；

（3）接种STO滋养层

在12孔板中加入含有0.2%明胶的DPBS包被过夜，第二天37℃水浴解冻丝裂霉素C处理后的STO细胞，加入STO培养液，离心收集细胞，再加入STO培养液接种到明胶包被后的12孔板中。37℃，5% CO₂培养箱中培养12小时；

（4）分离精原干细胞

将培养不同时间的睾丸细胞，胰蛋白酶消化后，用结合有THY-1抗体的磁珠4℃孵育20min，过分选柱，分离出精原干细胞，然后加入精原干细胞培养液，接种到含有STO滋养层的12孔板上，置于37℃，5% CO₂培养箱中培养；

（5）精原干细胞原代和传代培养

培养精原干细胞，2d更换一次培养液；5-7d传代一次，传代的方法为：去掉培养液，加入胰蛋白酶，于37℃培养箱中消化，离心收集精原干细胞，调整细胞密度加入精原干细胞培养液，将精原干细胞接种到新的含有STO滋养层的12孔板中培养。

所述精原干细胞培养液包括：MEMα基础培养基、0.2%的牛血清白蛋白（BSA）、7.6µeq/L的游离脂肪酸(FFA)、2mM的L-谷氨酰胺(L-Glutamine)、3×10^-8M的亚硒酸钠(Na₂SeO₃)、20ng/ml的Human recombinant GDNF、300ng/ml的Rat recombinant GFRα1/FcChimera、1ng/ml的Human recombinant BFGF、5μg/ml的胰岛素(Insulin)、10μg/ml的转铁蛋白(Transferin)、60µM的腐胺(Putrescine)、10mM的HEPES、50µM的2-巯基乙醇(2-ME)、1倍的双抗(P/S) ，其中GDNF因子对于精原干细胞的培养非常重要。

实施例

小鼠精原干细胞的建系培养

步骤一，睾丸细胞的分离与培养

（1）将出生后7天或8周龄的雄性小鼠颈椎脱臼处死后浸泡到75%酒精中消毒，然后在超净工作台中取出双侧睾丸，用DPBS洗去血污，去掉组织白膜。

（2）用剪刀将组织剪碎后移至含440µlDPBS的24孔板中，孔板中加入50μl 浓度为1mg/ml的胶原酶Ⅳ和10μl 浓度为7mg/ml的DNaseⅠ，吹打混匀后在37℃培养箱内消化15min，每隔3min用移液枪吹打一次。

（3）将孔板中的液体转移到1.5ml的离心管中，加入等体积的DPBS，4℃,600g，离心7min，弃上清。再加入1ml DPBS重悬细胞，4℃,600g，离心7min离心洗一遍。

（4）加入480μl含0.25%Typsin-EDTA的DPBS和20μl 浓度为7mg/ml的DNaseⅠ，在37℃培养箱内消化5min，加入50μl的FBS终止消化，收集细胞于1.5ml离心管中，再加入等体积的DPBS，4℃,600g，离心7min，弃上清。

（5）加入1ml DPBS重悬细胞，用70μm孔径的细胞筛过滤细胞悬液，计数，4℃,600g，离心7min，弃上清。以1×10⁷个细胞/孔调整细胞密度接种于6孔板中。3天更换一次培养液。

步骤二，精原干细胞分离与培养

精原干细胞的分离

（1）小鼠睾丸细胞用精原干细胞培养液分别培养3d、7d、10d后，去掉培养液，加入400μl含0.05%Typsin-EDTA的DPBS消化5min，加入50μl的FBS终止反应，4℃,600g离心7min，弃上清。

（2）加入1ml的DPBS重悬细胞，用40μm孔径的细胞筛过滤细胞悬液，计数，4℃,600g离心7min，弃上清；

（3）30% Percoll密度梯度离心：加入5ml PBS-S重悬细胞后移入含有2ml 30% Percoll的15ml离心管中，4℃,600g，离心7min；先用移液枪小心去除细胞碎片，然后去掉所有上清，用2ml的PBS-S重悬细胞，计数，4℃,600g，离心7min，弃上清；

（4）用90μl的PBS-S重悬细胞，加入10μl结合有抗THY-1特异抗体的磁珠，4℃孵育30min，每10min弹拨混匀一次；加入1.2ml PBS-S混匀，4℃,600g离心7min，弃上清，再加入1ml PBS-S重新悬浮细胞；

（5）将MS分选柱置于磁场中，先用500µl PBS-S润洗分选柱一次，然后将细胞悬液加入分选柱，再用500µl PBS-S洗分选柱三次；洗脱：向MS分选柱中加入1ml SFM培养液，迅速将分选柱移出磁场，用配套的柱塞缓慢推出细胞液到1.5ml离心管中，4℃，600g离心7min，弃上清，再用1ml 精原干细胞培养液重复离心洗涤2次；将细胞悬浮于1ml 精原干细胞培养液中，计数，调整细胞密度以2×10⁵个细胞/孔接种于以STO为滋养层的12孔板中，置于37℃，5% CO₂培养箱中培养。

步骤三，精原干细胞培养液的配方

（1）配制精原干细胞培养液：MEMα培养基中加入0.2%牛血清白蛋白（BSA）在4℃过夜溶解，次日再加入终浓度为7.6µeq/L的游离脂肪酸(FFA)、2mM 的L-谷氨酰胺(L-Glutamine)、3×10^-8M的亚硒酸钠(Na₂SeO₃)、20ng/ml的Human recombinant GDNF、300ng/ml的 Ratrecombinant GFRα1/Fc Chimera、1ng/ml 的Human recombinant BFGF、5μg/ml的胰岛素(Insulin)、10μg/ml的转铁蛋白(Transferin)、60μM的腐胺(Putrescine)、10mM 的HEPES、50μM 的2-巯基乙醇(2-ME)、1倍的双抗(P/S) 。

（2）配制STO滋养层培养液：以DMEM为基础培养基，分别添加终浓度为7% 的FBS，100µm的2-ME，10 mM的HEPES，2 mM的谷氨酰胺，1倍的双抗；用0.2µm 的滤器过滤除菌，4℃保存。

步骤四，STO滋养层的制备

（1）将解冻后的STO细胞以1×10⁶个细胞/皿的密度均匀接种于10cm培养皿里，加入10ml的培养基，于37℃，5% CO₂培养箱中培养；

（2）培养3-4d后在显微镜下观察，在细胞密度达到视野的80%-90%时，按1:10的比例传代；

（3）传代后的细胞仍按照之前的培养方法进行培养，继续培养3-4天；

（4）向培养皿中加入终浓度为17μg/ml的丝裂霉素C，在37℃，5% CO₂培养箱中培养3h；

（5）吸掉培养液，用DPBS洗3次；

（6）向培养皿中加入3ml含0.05% Trypsin-EDTA的DPBS，37℃培养箱内消化5min，加入300μl的FBS终止消化，移液枪轻轻吹打使细胞悬浮，收集细胞，4℃，600g，离心7min，弃上清。加入1ml培养液重悬细胞，计数，4℃，600g，离心7min，弃上清；

（7）配制冻存液：将FBS和DMSO以9:1的比例混合；

（8）将丝裂霉素处理后的STO按照需要适当调整密度，加入冻存液分装于冻存管中；

（9）将冻存管放入程序冷冻盒中，然后将冷冻盒放入-80℃冰箱冻存，24h后转移到液氮中长期保存。

（10）接种密度以5×10⁴个细胞/cm²接种于12孔板中；接种后4天内可以使用，使用前更换为精原干细胞的培养液。

精原干细胞鉴定

（1）碱性磷酸酶染色

将精原干细胞传至7代后接种于24孔板中，培养4天后即可进行碱性磷酸酶染色鉴定，具体方案为：

（1）去掉培养液，DPBS洗3次，每次5min；

（2）加入300μl 4%多聚甲醛固定2min，DPBS洗3次；

（3）中杉金桥的碱性磷酸酶染色试剂盒染色，其中各配方比例为AP buffer：NBT:BCIP=100:1：1，每孔加300μl染液，染色15min，于倒置显微镜下观察，拍照。

（2）免疫荧光染色

精原干细胞传至第6代后，接种于24孔板中，接种前在24孔板中放入消毒后的盖玻片。培养4天后即可进行免疫荧光染色鉴定，具体方案为：

（1） 固定：去培养液，DPBS洗3次，每次5min；加入4%多聚甲醛固定10min，再用DPBS洗三次，每次5min；

（2）通透：加入300μl含0.1% Triton的超纯水，静置10min，DPBS洗3次，每次5min；

（3）封闭：加入300µl 含10%鸡血清的DPBS室温封闭1h；

（4）一抗孵育：用含10%鸡血清的DPBS分别稀释C-KIT、OCT-4、PLZF抗体，稀释比例为1：100；阴性对照为不加一抗的10%鸡血清；将24孔板放入湿盒内，4℃孵育过夜；

（5）取出24孔板，复温30min，去掉一抗，DBPS洗3次，每次5min；

（6.）二抗孵育：二抗为TR标记的鸡抗兔抗体，用10%鸡封闭血清稀释二抗，稀释比例为1：200；黑盒内室温孵育1h；

（7） DAPI染色：去掉二抗，用DPBS洗3次，每次5min，加入200µl DAPI 染剂，染色3min；去除染液，DPBS洗2次，每次5min；

（8）用抗荧光萃灭试剂封片，荧光倒置显微镜下观察，拍照，记录；

小鼠精原干细胞纯化效率提高鉴定

流式细胞术分析

准备分别培养0d、3d、7d、10d的小鼠睾丸细胞，加入1ml含 0.05%Typsin-EDTA的DPBS于37℃培养箱中消化5min，再加入100ul的FBS终止消化，收集细胞到1.5ml离心管中，用70μm细胞筛过滤细胞悬液，4℃,600g离心7min，弃上清。然后完成以下步骤：

（1）固定：每管加入100μl 4%多聚甲醛室温固定10min，加入1ml DPBS，4℃,600g，离心7min，弃上清。

（2）通透：每管加入100μl 0.05%TritonX-100，室温通透10min，加入1mlDPBS，4℃,600g，离心7min，弃上清。

（3）封闭过氧化物酶：每管加入100μl 10%驴血清37℃封闭10min。

(4)一抗孵育：一抗为兔抗C-KIT抗体和荧光标记的大鼠来源的SSEA-1AlexaFluor® 488抗体，分别用10%驴血清稀释，稀释比例为1:100,对照组为不加抗体的10%驴血清。37℃孵育30min。DPBS洗2次。SSEA-1抗体孵育的细胞用600μl DPBS重悬后转移至流式管中，将流式管放入冰盒内待做流式分析。

（5）二抗孵育：C-KIT孵育的细胞和对照组需要用二抗孵育，二抗为驴抗兔IgGCFL488，10%驴血清稀释，稀释比例为1:200,37℃孵育20min。DPBS洗2次。

（6）加入600μl DPBS重悬细胞，细胞转移至流式管中待做流式分析。

分析

（1）将分别培养0d、3d、7d的小鼠精原干细胞去掉培养液，每孔加入500μl含0.05%Trypsin-EDTA的DPBS在37℃培养箱中消化5min；

（2）每孔加入50μl FBS终止反应，移液枪轻柔吹打孔板，收集细胞到1.5ml离心管中，4℃,600g离心7min，弃上清；

（3）每孔加入1mlDPBS，4℃,600g离心7min洗一遍；

（4）提取RNA，按照QiAGEN RNA提取试剂盒上的说明书完成。

（5）用酶标仪在波长为260nm下测定RNA浓度，RNA浓度计算公式为：RNA浓度（ng/μl）=OD_260nm×40×稀释倍数/1000。

（6）提取的RNA跑 1%琼脂糖凝胶电泳，观察18s和28s条带。

（7）将所提取的RNA反转录为cDNA，按照Takara反转录试剂盒上的说明完成。

（8）PCR扩增：

PCR引物：

PCR反应体系为：

PCR反应条件：95℃,5min；95℃,30s；50℃,30s；72℃,25s，30个循环；72℃,7min，4℃，∞。

实验结果表明：有效分离精原干细胞的具体方法为：分离→培养→再分离→再培养，即将小鼠睾丸细胞按照传统的两步酶消化法分离出来后培养数天，再用免疫磁珠法分离精原干细胞进行培养，所得到的精原干细胞数量和纯度远远高于直接分离法所获得的精原干细胞。

精原干细胞的研究对于不孕不育的治疗以及濒临灭绝物种资源的保护具有重要意义。

以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。

Claims (5)

1.一种高效分离小鼠精原干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）收集小鼠睾丸，采用两步酶消化法制备睾丸细胞悬液；

（2）将睾丸细胞接种到细胞培养板上，加入精原干细胞培养液，于37℃5%CO₂培养箱中培养，3d更换一次培养液；

（3）去掉细胞培养液，胰蛋白酶消化后，用免疫磁珠法分离出精原干细胞；

（4）将分离出来的精原干细胞接种到STO滋养层上，加入精原干细胞培养液，对精原干细胞进行原代和传代培养。

2.根据权利要求1所述的高效分离小鼠精原干细胞的方法，其特征在于，所述步骤（4）精原干细胞原代培养方法为：每2天更换一次精原干细胞培养液，5-7d传代一次；所述传代培养为：去掉细胞培养液，加入胰蛋白酶，置于37℃5%CO₂细胞培养箱中消化，离心弃上清之后加入精原干细胞培养液，接种到新的STO滋养层上培养。

3.根据权利要求1所述的高效分离小鼠精原干细胞的方法，其特征在于，所述精原干细胞培养液成分包括：MEMα基础培养基、牛血清白蛋白BSA、游离脂肪酸FFA、L-谷氨酰胺L-Glutamine、亚硒酸钠Na₂SeO₃、Human recombinant GDNF、Rat recombinant GFRα1/FcChimera、Human recombinant BFGF、胰岛素Insulin、转铁蛋白Transferin、腐胺Putrescine、HEPES、2-巯基乙醇2-ME、双抗P/S。

4.根据权利要求3所述的高效分离小鼠精原干细胞的方法，其特征在于，所述牛血清白蛋白的体积含量为0.2%-0.3%，所述游离脂肪酸的含量为6-8µeq/L，所述L-谷氨酰胺的含量为2-3mM，所述亚硒酸钠的含量为2×10^-8-3×10^-8M，所述GDNF含量为20-30ng/ml，所述GFRα-1含量为200-300ng/ml，所述BFGF含量为1-2ng/ml，所述胰岛素的含量为3-5µg/ml，所述转铁蛋白的含量为8-10µg/ml，所述腐胺的含量为55-60µM，所述HEPES的含量为7-10mM，所述β-巯基乙醇的含量为40-50µM，双抗浓度为1倍-2倍。

5.根据权利要求1所述的高效分离小鼠精原干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）分离小鼠睾丸细胞

实验动物为出生后5天-8周等不同周龄的雄性小鼠，用颈椎脱臼方法处死后取出双侧睾丸，洗去血污，去掉白膜，用两步酶消化法获得睾丸细胞，然后用70μm孔径的细胞筛过滤细胞悬液，将获得的睾丸细胞按照一定密度接种到6孔板中，置于37℃，5%CO₂培养箱中培养，培养液为精原干细胞培养液，3d更换一次培养液；

（2）制备STO滋养层

在37℃，5% CO₂培养箱中培养STO细胞，当细胞达到一定密度时，加入终浓度为17μg/ml的丝裂霉素C，在CO₂培养箱中培养2-3小时后加入胰蛋白酶，在37℃培养箱中消化收集STO细胞，按照需要调整细胞密度加入冻存液，分装到冻存管中放置于-80℃过夜后转移至液氮中长期保存备用；

（3）接种STO滋养层

在12孔板中加入含有0.2%明胶的DPBS包被过夜，次日取出放置于超净工作台晾干2小时，37℃水浴复苏用丝裂霉素C处理后的STO细胞，逐滴加入STO培养液，用移液枪轻柔吹打混匀后离心弃上清，再加入STO培养液接种到明胶包被后的12孔板中，37℃，5% CO₂培养箱中培养12小时；

（4）分离精原干细胞

将培养不同时间的睾丸细胞，胰蛋白酶消化后，用结合有THY-1抗体的磁珠4℃孵育20min，过分选柱，分离出精原干细胞，然后加入精原干细胞培养液，接种到含有STO滋养层的12孔板上，置于37℃，5% CO₂培养箱中培养；

（5）精原干细胞原代和传代培养

培养精原干细胞，2d更换一次培养液；5-7d传代一次，传代的方法为：去掉培养液，加入胰蛋白酶，于37℃培养箱中消化，离心收集精原干细胞，调整细胞密度加入精原干细胞培养液，将精原干细胞接种到新的含有STO滋养层的12孔板中培养；

所述精原干细胞培养液包括：MEMα基础培养基、体积含量为0.2%的牛血清白蛋白BSA、7.6µeq/L的游离脂肪酸FFA、2M的L-谷氨酰胺L-Glutamine、3×10^-8M的亚硒酸钠Na₂SeO₃、20ng/ml的Human recombinant GDNF、300ng/ml的 Rat recombinant GFRα1/Fc Chimera、1ng/ml的Human recombinant BFGF、5μg/ml的胰岛素Insulin、10μg/ml的转铁蛋白Transferin、60μM的腐胺Putrescine、10mM 的HEPES、50μM 的2-巯基乙醇2-ME、1倍的双抗P/S。