CN109456938A - 一种小鼠精原干细胞体外向精子高效分化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种小鼠精原干细胞体外向精子高效分化的方法，本专利根据睾丸发育特点，利用性成熟前小鼠睾丸组织细胞为精原干细胞分化精子的微环境，建立了促进精原干细胞体外高效向精子分化方法。本发明建立的小鼠精原干细胞体外向精子高效分化的方法，是对比了不同阶段小鼠睾丸组织细胞状态和组成比例，通过实验方法最后优选出高效促进精原干细胞体外向精子分化的方法，该方法操作简单，重复性好，比目前建立精原干细胞体外分化精子的方法更具有优势，是精原干细胞体外分化研究技术的新突破，在后期科研和相关应用中有广泛的应用前景，同时对于其他物种精子体外分化和人类辅助生殖的研究也具有重要的参考价值。

Description

一种小鼠精原干细胞体外向精子高效分化的方法
技术领域
本发明涉及生殖干细胞领域，具体涉及一种小鼠精原干细胞体外向精子高效分化的方法。
背景技术
精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是一类存在于雄性动物体内生精小管内侧壁基底膜上能够维持自我更新和分化的细胞；通过自我更新维持生殖干细胞数量恒定；通过分化可以源源不断产生精子，保证雄性动物一生的正常的生殖能力。SSCs是雄性动物中唯一能将遗传信息传递给后代的干细胞，同时在体外是最容易转变为多能干细胞的成体干细胞，因此它是生殖医学、干细胞工程和发育生物学、动物转基因等方面的重要研究材料，具有极大的科研价值。
各类干细胞和生殖细胞体外诱导精子分化的技术，成为人类辅助生殖、濒危物种保护和转基因动物研究的一项重要亟待解决的技术。但成功建立高效体外诱导发育到功能精子的报道还很少。目前，主要依赖的方法是新生小鼠睾丸成纤维细胞以及添加多种诱导剂来实施，但仍然还存在成功率不高，可操作性不强的问题。
在成年动物睾丸中，成熟的支持细胞，生精小管的类肌细胞和生精小管之间的间质空间内存在的各级间质细胞以及其中的血管和淋巴管，是构成SSCs的微环境(“龛”：“Niche”)的重要组成部分，这个“Niche”调控着SSCs维持自我更新和源源不断的分化精子，是SSCs有序产生精子的保障。
体外获得有受精能力的生殖细胞一直都是生殖生物学和生殖医学领域的难题和热点。体外模拟睾丸组织内的“Niche”方法建立体外精子分化，是高效建立精子体外分化的突破点，日本生殖生物学家Takehiko Ogawa将摘除新出生两三天的幼鼠的睾丸，放置到一个含有专用培养基中体外组织培养，建立精子分化所需的体内“Niche”，移植进入的SSCs可以在体外分化成正常功能的精子。成为体外诱导精子分化研究的一个新方法；中国科学院动物研究所联合团队通过添加睾酮和等激素和利用睾丸细胞共培养的方法，最终成功的将小鼠ESCs诱导成精子样细胞；日本科学家Saitou通过联合联合过表达Blimp1、Prdm14和Tfap2c转录因子，获得外胚层干细胞来源的原始生殖干细胞，然后在通过移植到受体小鼠，利用受体小鼠睾丸体内微环境实现了精子分化。
精子发生过程相当复杂，呈现多步骤分化，不同物种之间也展现出了很大的差异，目前，特征性SSCs系也只有啮齿动物SSCs获得体外成功建系，成为生殖调控研究的最主要材料，而人和其他动物SSCs仍不能长期培养，一定程度上也限制了精子分化的研究，而利用其他类干细胞诱导精子，相对于SSCs，又增加了一定的难度。
因此，现有技术有待于进一步发展和改进。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供了一种小鼠SSCs体外向精子高效分化的方法，能够高效诱导SSCs体外精子分化，其技术方案如下。
本发明技术方案如下：
本发明提供一种小鼠SSCs体外向精子高效分化的方法，其中，利用性成熟前小鼠睾丸组织细胞构建SSCs诱导分化的微环境，促进SSCs向精子分化。
所述小鼠SSCs体外向精子高效分化的方法，其中，性成熟前小鼠睾丸组织细胞为2w龄雄性小鼠睾丸组织成纤维细胞，成为优选最佳构建体外微环境细胞时期。
所述小鼠SSCs体外向精子高效分化的方法，其中，将少量2w龄雄性小鼠睾丸成纤维细胞混合到小鼠胚胎成纤维细胞饲养层中，构建体外诱导SSCs分化的微环境，形成SSCs体外精子分化的培养体系。
所述小鼠SSCs体外向精子高效分化的方法，其中，其特征在于，将1-5×103数量的2w龄雄性小鼠睾丸成纤维细胞接种到含0.5-1×105数量铺板的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层中培养1-2d后开始接入SSCs。
所述小鼠SSCs体外向精子高效分化的方法，其中，其特征在于，SSCs接种到体外精子分化微环境中培养2-3d，出现分化精原细胞，培养至14-15d，分化精原细胞进入减数分裂，随后产生圆形精子。
所述小鼠SSCs体外向精子高效分化的方法，其中，2w龄雄性小鼠睾丸成纤维细胞通过如下方法分离得到：
S1、取2w龄雄性小鼠睾丸，放入盛有PBS的培养皿中，并用PBS洗涤2-3次，除去血污；
S2、去掉睾丸白膜，将剩下的睾丸组织转移到10mL离心管，加入10倍体积的PBS，用吸管轻轻吸打，然后静置，待睾丸组织沉到离心管底后，弃掉上清液，如此反复洗涤2-3次；
S3、加入10倍体积的Ⅳ型胶原酶1mg/mL和20μg/mL的DNAseⅠ联合消化，于37℃水浴锅消化6～10min，然后用吸管轻轻吹打，直到曲精细管分散开，并且保证曲精细管的完整性；
S4、加入5-10mL PBS，轻轻吹打，然后600rpm离心5min，弃上清，收集曲精细管，如此反复2次；
S5、加入5倍体积的0.25％胰酶-EDTA和20μg/mL的DNAaseⅠ混合消化，于37℃水浴锅中消化8-10min，用等量的10％FBS的DMEM/F12终止消化，用约60μm的细胞筛过滤细胞悬液，除去未消化完全的组织块。
S6、滤液于1000rpm离心6min，弃上清，用不完全培养基清洗2-3次；
S7、细胞计数，用差异贴壁培养基重悬细胞调整细胞浓度为5×105个/mL，接种到事先用0.1％明胶包被的25cm2培养瓶，在37℃、5％CO2无菌培养箱条件下培养2-3h，差速贴壁三次，去除上清中精原干细胞、精原细胞，淋巴细胞和血细胞；
S8、用PBS洗两次，然后改为用DMEM/F12+10％FBS继续培养贴壁的细胞，贴壁的细胞即为睾丸成纤维细胞。
所述小鼠SSCs体外向精子高效分化的方法，其中，SSCs体外精子分化的培养体系中所用培养基为：97％Stro-34培养基+1％ITS+55μMβ-巯基乙醇+1％L-谷氨酰胺+2％FBS+1％双抗。
所述小鼠SSCs体外向精子高效分化的方法，其中，SSCs体外增殖的培养基为：95％Stro-34培养基+1％ITS+55μMβ-巯基乙醇+1％L-谷氨酰胺+2％B27+20ng/mL GDNF+10ng/mLEGF+10ng/mL bFGF+1000IU/mL LIF+1％双抗。
有益效果：
本发明建立的小鼠SSCs体外向精子高效分化的方法充分利用睾丸Niche的思路进行体外诱导精子分化。可以有效的促进SSCs向精子分化，是对比分析小鼠不同时期睾丸组织(1w，2w，4w和8w)细胞组成和状态，结果显示2w细胞对于构建体外微环境。该方法操作简单，重复性好，对比现有的技术，是SSCs体外分化研究技术的新突破，在后期科研和相关应用中有广泛的应用前景，同时对于其他物种精子体外分化和人类辅助生殖的研究也具有重要的参考价值。
附图说明
图1为本发明小鼠SSCs体外向精子高效分化的方法技术路线图。
图2为不同时期的小鼠睾丸组织切片显微图，其中A：6d小鼠睾丸曲精细胞组织切片NANOG免疫组织化学观察；B，C和D分别为第2w，4w和8w小鼠睾丸曲精细胞组织切片NANOG免疫组织化学观察。
图3为不同时期的小鼠睾丸成纤维状态的组织切片显微图，其中A：6d小鼠睾丸成纤维培养结果；B，C和D分别为第2w，4w和8w小鼠睾丸曲睾丸成纤维分离和培养情况。
图4为睾丸间质细胞成熟与精子分化的染色图，其中A代表精子分化早期；B，C，D和E分别为精子分化前期，中期，后期和晚期；F，G和H分别为Hochest33342染核，SOX9染色，3β-HSD染色。
图5为小鼠SSCs体外分化精子过程图，其中A：小鼠SSCs接种到饲养细胞中2-3d；B：培养第4-7d，出现一定比例分化细胞；C：培养至8-10d，出现大量的分化精原细胞；D和E：分化精原细胞数量急剧增加；F和G：培养至14-15d圆形精子生成期；H：出现长尾精子。
图6为小鼠SSCs体外诱导分化圆形精子免疫荧光检测图。
图7为小鼠SSCs体外诱导分化圆形精子RT-PCR检测结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明技术路线如图1所示，本发明利用2w龄小鼠睾丸混合细胞(不包括生殖细胞)来构建体外精子分化的干细胞龛(Niche)，可以有效的促进SSCs向精子分化，并通过细胞生物学分析体外检测证明发生减数分裂，最终形成单倍体精子，此方法操作简单，重复性好，是SSCs体外分化研究技术的新突破，在后期科研和相关应用中有广泛的应用前景，同时对于其他物种精子体外分化和人类辅助生殖的研究也具有重要的参考价值。
本发明建立的体外SSCs分化的干细胞龛(Niche)，无需添加雄性激素和各类添加剂，只在SSCs培养系统中，去除生长因子和添加一定量血清的条件下，就可以实现SSCs高效向精子体外分化，体外发生减数分裂，产生单倍体精子，该方案充分利用睾丸Niche的思路进行体外诱导精子分化。2w龄雄性小鼠睾丸组织成纤维细胞最为合适，伴随睾丸间质干细胞分化，类圆形成熟间质细胞提供精子发育必要的睾酮激素和相关营养，高效的诱导SSCs体外精子分化，将少量睾丸成纤维细胞混合到小鼠胚胎成纤维细胞饲养层(Mef饲养层)中，Mef饲养层存在有利于诱导分化精原细胞贴附。
本发明SSCs体外自我更新培养方案：
95％Stro-34培养基(含添加物，Invitrogen)+1％ITS(Gibco)+55μMβ-巯基乙醇(Gibco)+1％L-谷氨酰胺+2％B27(Gibco)+20ng/mL GDNF(Peprotech)+10ng/mL EGF(Prospec)+10ng/mL bFGF(Peprotech)+1000IU/mL LIF(Millipore)+1％双抗(Gibco)。
本发明体外SSCs向精子分化的培养方案：
97％Stro-34培养基(含添加物，Invitrogen)+1％ITS(Gibco)+55μMβ-巯基乙醇(Gibco)+1％L-谷氨酰胺+2％FBS(Gibco)+1％双抗(Gibco)。
实施例1
小鼠睾丸组织发育规律
NANOG蛋白在生精小管内侧只表达在SSCs，可以用来观测生殖细胞在小鼠睾丸中发育规律。如图2所示，在第6d时，小鼠曲细精管内的生殖细胞已迁移至曲精细管的基底膜处，这个时期的生殖细胞被认为大部分已由生殖母细胞分化为SSCs；在曲靖细管内除了支持细胞外还没有分化的生殖细胞，被认为是获取SSCs的最佳时期(如图2中A)；第2w的小鼠睾丸曲精细管，管腔增大很多，SSCs定位在基底膜处，开始有分化的精原细胞出现(如图2中B)；到第4w时小鼠睾丸内出现大量的分化细胞，但这个时期仍未发现有成熟的精子(如图2中C)；第8w时，小鼠已经性成熟具备繁育功能，这个时期曲精细管管心充盈着成熟精子，SSCs保持自我更新和分化远远不断的生成精子(如图2中D)，根据以上规律，分离相应睾丸细胞，进行体外诱导SSCs精子分化。
实施例2
小鼠睾丸成纤维细胞时期的筛选
根据小鼠睾丸组织切片的情况，发现1w龄只存在具有干性的SSCs；第2w龄就开始出现大量分化精原细胞，第4w生精小管管腔增大，出现大量分化精原细胞，但没有出现成熟精子，直到第8w开始出现成熟精子。根据这个规律，我们分别取1w龄小鼠睾丸成纤维细胞，这个时期睾丸成纤维增殖较快，活力较好，多数是维持干性或未分化的细胞(其中包括，睾丸间质细胞，类肌细胞和支持细胞等)(如图3中A)；第2w龄的小鼠睾丸成纤维细胞，开始出现了分化的细胞，直观的可以看到分化的睾丸间质细胞，这个时期，可能可以合成睾酮(如图3中B)；到第4w我们直观看到大量成熟的睾丸间质细胞，说明应该有大量睾酮产生(如图3中C)；第8w时，小鼠睾丸成纤维细胞，活力很差，贴壁能力不强，其中干细胞比例非常低，多维分化的细胞(如图3中D)，根据以上规律，在诱导SSCs分化精子过程中，2w龄小鼠的睾丸成纤维细胞最合适，这和其正常的发育时期相吻合。
实施例3
睾丸间质细胞成熟与精子分化
将1-5×103数量的2w龄小鼠睾丸成纤维细胞接种到含0.5-1×105数量铺板的小鼠胚胎成纤维饲养层中(Mef)培养1-2d后开始接入SSCs，类圆形的成熟睾丸间质细胞(如图4中箭头所示)，可以产生睾酮，是精子分化和成熟必须诱导剂；接入SSCs，培养至2-3d，开始出现分化精原细胞，这个时期可以看到睾丸间质干细胞集落和少量成熟间质细胞(如图4中A)；随后SSCs分化精原细胞数量增加，成熟间质细胞比例也在增加(如图4中B)；培养至第8-10d，这时期可见更多成熟间质细胞，和相应大量的分化精原细胞(如图中C)；培养至11-14d，成熟间质细胞比例大大增加，发生减数分裂精原细胞数量也增加(如图4中C和D)；对成熟间质细胞进行3β-HSD(如图4中H；成熟间质细胞标记)和SOX9(如图4中G；支持细胞标记)免疫荧光染色，显示细胞中高比例的成熟间质细胞存在。
实施例4
小鼠SSCs体外分化精子过程
SSCs接种到特制的体外精子分化系统中，培养至2-3d，这个时期可以看到SSCs干细胞集落，但出现分化精原细胞(如图5中A)；培养至4-7d分化精原细胞数量增加(如图5中B)；培养至第8-10d，这时期可见更多分化的精原细胞(如图5中C)；培养至11-13d，分化精原细胞数量急剧增加(如图5中D和E)；培养至14-15d，可以看大量大小不一的分化精原细胞，分化精原细胞进入减数分裂，随后产生圆形精子(如图F和G)；也可见长尾精子出现(如图5中H箭头)。
实施例6
小鼠SSCs体外诱导分化圆形精子时期检测
对小鼠SSCs体外诱导分化圆形精子时期进行免疫荧光检测，共聚焦显微镜观察减数分裂蛋白3(SYCP3)表达情况，和细胞所处时期(如图6中A，B，C和D)，结果显示这个时期细胞进入减数分裂期，有的发生第一次减数分裂，有些细胞第二次减数分裂已完成，染色体数量已减半，证明生成了精子，如图7所示RT-PCR结果显示这个时期表达精子特异性顶体基因Acrosin。
本发明所涉及的主要试验方法：
一、小鼠睾丸石蜡切片制作与组织化学染色
1)取材：将出生1w，2w，4w和8w龄小鼠睾丸组织去除脂肪垫和白膜，然后切成小块，使组织块厚约0.5mm；浸入到4％多聚甲醛中固定24h；
2)修块：把已固定组织修至所需大小，力求小而薄；
3)冲水：把已经修好的块状的组织放入流水中冲洗24h，把固定液洗干净；
4)脱水：50％乙醇+20％正丁醇+30％水，6h；50％乙醇+35％正丁醇+15％水，4h；45％乙醇+45％正丁醇+10％水，3h；40％乙醇+55％正丁醇+5％水，3h；25％乙醇+75％正丁醇，2h；5％乙醇+95％正丁醇，2h；100％正丁醇(i)，5h；100％正丁醇(ii)，3h；二甲苯，10mim；软蜡(i)：15min；软蜡(ii)：20min；75％乙醇12h，80％乙醇2h，90％乙醇1h，95％乙醇两次，每次40min，100％乙醇两次，每次30min，两次，每次30min。软蜡30min，硬蜡30min。
5)包埋：把已经脱水完全的组织样品包埋到石蜡块里；
6)切块：厚度3～5μm的超薄切片，切好后捞到玻片上烤干；
7)石蜡组织切片常规脱蜡，经梯度酒精脱水；接下来PH 6.0枸橼酸缓冲液微波加热抗原修复15min；PBS洗三次，每次5min；然后3％H2O2封闭组织内的过氧化物酶15min；PBS洗三次，每次5min；接下来免疫组织化学染色(步骤同免疫荧光4-8。其中NANOG一抗(兔源，Cell Signaling-D73G4)；对应辣根酶标记山羊抗兔IgG二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)。
8)封片：中性树胶封片，观察拍照。
二、细胞免疫荧光检测
1)在24孔板中接种小鼠SSCs进行无饲养培养，进行细胞免疫荧光检测；
2)用4％多聚甲醛固定细胞10～30min后，PBS洗3次，每次3min；
3)加入0.5％Triton穿孔破膜处理10min，PBS洗3次，每次3min；
4)加入1％BSA(10％山羊血清)封闭30min(封闭完不用洗)；
5)加入相应的1％BSA稀释的一抗(兔源3β-HSD一抗-AB61219；兔源SYCP3一抗，AB15093；鼠源SOX9一抗，ab76997)，置于4℃过夜，PBS洗3次，每次5min；
6)加入相应的1％BSA稀释的二抗(红光抗兔二抗Goat Anti-rabbit IgG Alexa568，Invitrogen-A11036；绿光抗鼠二抗Goat Anti-mouse IgG Alexa 488，Invitrogen-A11001)，置于37℃反应1h，PBS洗3次，每次5min；
7)加入终浓度为10μg/mL的Hochest33342(Molecular Probes公司)对细胞核染色5～10min，PBS洗3次，每次3min；
8)抗淬灭剂封片，拍照。
三小鼠睾丸成纤维分离
1)用大镊子处死不同时期雄性公鼠，75％酒精消毒；
2)在超净台上，手术取出不同时期雄性公鼠睾丸，放入盛有PBS的培养皿中，并用PBS洗涤2-3次，除去血污；
3)去掉睾丸白膜，将剩下的睾丸组织转移到10mL离心管；
4)加入10倍体积的PBS，用吸管轻轻吸打，然后静置，待睾丸组织沉到离心管底后，弃掉上清液。如此反复洗涤2-3次；
5)加入10倍体积的Ⅳ型胶原酶1mg/mL和20μg/mL的DNAseⅠ联合消化，于37℃水浴锅消化6～10min，然后用吸管轻轻吹打，直到曲精细管分散开，并且保证曲精细管的完整性。
6)加入5-10mL PBS，轻轻吹打，然后72g(600rpm)离心5min，弃上清，收集曲精细管。如此反复2次；
7)加入5倍体积的0.25％胰酶-EDTA和20μg/mL的DNAaseⅠ混合消化，于37℃水浴锅中消化8-10min，并用吸管轻轻吸打，消化时间的长短据消化程度而定，以观察不到有微小的组织块为宜；
8)用等量的10％FBS的DMEM/F12终止消化，用约60μm的细胞筛过滤细胞悬液，除去未消化完全的组织块。
9)滤液于1000rpm离心6min，弃上清；用不完全培养基清洗2-3次；
10)细胞计数。用差异贴壁培养基重悬细胞调整细胞浓度为5×105个/mL，接种到事先用0.1％明胶包被的25cm2培养瓶，在37℃、5％CO2无菌培养箱条件下培养2-3h，差速贴壁三次，去除上清中SSCs和精原细胞，淋巴细胞和血细胞。
11)用PBS洗两次，然后改为用DMEM/F12+10％FBS继续培养贴壁的细胞，贴壁的细胞即为睾丸成纤维细胞；
四、RT-PCR检测
1、诱导精子细胞总RNA的提取(Qiagen微量抽提试剂盒)
微量样品，加入新配好的裂解液80μL(裂解液：1mL的Buffer RLT中含10μL巯基乙醇，使用前配制)；
加入80μL 70％的乙醇，用枪头混匀，不要离心；
将样品转移至试剂盒中提供的Spin column中，装配2mL收集管，轻轻盖上盖子，8000g离心15s，弃去穿透液，放回收集管；
加入350μL buffer RW1，轻轻盖上盖子，8000g离心15s，弃穿透液，放回收集管；
将80μL DNaseⅠ直接滴到硅质膜上，室温静置15min，务必直接全部滴上，否则DNA会消化不完全；
加入350μL buffer RW1，8000g离心15s，弃穿透液及收集管；
更换新的2mL收集管，加入500μL buffer RPE(已按要求加入了无水乙醇)，轻轻盖上盖子，8000g离心15s，弃穿透液；
加入500μL buffer RPE，轻轻盖上盖子，8000g离心2min，彻底去除乙醇，弃穿透液及收集管，取下Spin column时避免接触到穿透液，乙醇会影响回收；
将Spin column移至新的2mL收集管，并开盖做高速离心2min，弃穿透液和收集管。更换新的1.5mL收集管，直接滴加20～40μL RNase-free water在膜中心，最高转速离心2min。重复洗脱一次可增加回收量，-80℃保存或立即合成cDNA。
2、总RNA浓度测定
2％琼脂糖凝胶电泳跑RNA样品检测RNA是否降解，NANODROP 2000检测RNA的浓度及纯度，纯度控制在OD260/OD280为1.8～2.0之间，根据RNA浓度计算出样本RNA调至1μg的体积。
3、合成cDNA
逆转录检测1st strand cDNA synthesis采用二步法，第一步：反应体系：样本RNA1μg，Random 6mers primer 1μL，dNTP 1μL，蒸馏水配平至10μL，反应条件为：65℃5min，冰上急冷；第二步：反应体系：将第一步变性、退火后反应液10μL，5×PrimeScript TM Buffer4μL，Rnase Inhibitor(40U/μL)0.5μL，PrimeScript TM Rnase(200U/μl)1μL，蒸馏水4.5μL，总体系20μL，反应条件：30℃10min，42℃60min，70℃15min，4℃1h。
4、RT-PCR
20μL PCR体系：2×PrimeStar Buffer/Premix 10μL；上游引物F 0.2μL；下游引物R 0.2μL；模板1μL和ddH2O 8.6μL；反应程序为：预变性95℃3min；95℃30s、60℃30s、72℃40s，循环35个；最后总延伸72℃7min。
本申请所建立的方法是利用性成熟前(2w龄)雄性小鼠睾丸组织细胞作为SSCs诱导分化支持细胞；因为研究发现成年小鼠睾丸细胞活性太低，体外增殖缓慢，操作困难；幼年小鼠睾丸细胞活力强，增殖快，在共培养时吸收太多营养，会抑制SSCs体外分化。本申请发明人通过摸索，2w龄雄性小鼠睾丸组织成纤维细胞更合适，伴随睾丸间质干细胞分化，类圆形成熟间质细胞提供精子发育必要的睾酮激素和相关营养，高效的诱导SSCs体外精子分化；将少量睾丸成纤维细胞混合到小鼠胚胎成纤维细胞饲养层(Mef饲养层)中，Mef饲养层存在有利于诱导分化精原细胞贴附。本申请建立一种体外SSCs分化的“Niche”，无需添加雄性激素和各类添加剂，只在SSCs培养系统中，去除生长因子和添加一定量血清的条件下，就可以实现SSCs高效向精子体外分化，体外发生减数分裂，产生单倍体精子，该方法优化了前期所建立的精子体外分化方案，充分利用睾丸Niche的思路进行体外诱导精子分化，本发明专利方法建立具有明显的创新性，所建立方法操作相对已建立方法简单易行，成功率高，对于其他类干细胞诱导精子分化也提供了新的技术方案。
同时，本发明所建立体外诱导SSCs向精子分化的方法，在研究生殖干细胞生物学性质、辅助生殖和转基因育种和濒危动物保重等方面具有重要的应用前景。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (8)

1.一种小鼠精原干细胞体外向精子高效分化的方法，其特征在于，利用性成熟前小鼠睾丸组织细胞作为精原干细胞诱导分化的体外微环境，促进精原干细胞体外向精子分化。
2.根据权利要求1所述小鼠精原干细胞体外向精子高效分化的方法，其特征在于，性成熟前小鼠睾丸组织细胞为2w龄雄性小鼠睾丸组织，获得此阶段睾丸成纤维细胞用于支持小鼠经原干细胞体外精子分化。
3.根据权利要求2所述小鼠精原干细胞体外向精子高效分化的方法，其特征在于，将少量2w龄雄性小鼠睾丸成纤维细胞混合到小鼠胚胎成纤维细胞饲养层中，构建体外诱导精原干细胞分化的体外微环境，支持精原干细胞体外向精子分化。
4.根据权利要求3所述小鼠精原干细胞体外向精子高效分化的方法，其特征在于，将1-5×103个的2w龄雄性小鼠睾丸成纤维细胞接种到含0.5-1×105个铺板的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层中培养1-2d后开始接入精原干细胞。
5.根据权利要求4所述小鼠精原干细胞体外向精子高效分化的方法，其特征在于，精原干细胞接种到体外精子分化微环境中培养2-3d，出现分化精原细胞，培养至14-15d，分化精原细胞进入减数分裂，随后产生圆形精子。
6.根据权利要求4所述小鼠精原干细胞体外向精子高效分化的方法，其特征在于，2w龄雄性小鼠睾丸成纤维细胞通过如下方法分离得到：
S1、取2w龄雄性小鼠睾丸，放入盛有PBS的培养皿中，并用PBS洗涤2-3次，除去血污；
S2、去掉睾丸白膜，将剩下的睾丸组织转移到10mL离心管，加入10倍体积的PBS，用吸管轻轻吸打，然后静置，待睾丸组织沉到离心管底后，弃掉上清液，如此反复洗涤2-3次；
S3、加入10倍体积的Ⅳ型胶原酶1mg/mL和20μg/mL的DNAseⅠ联合消化，于37℃水浴锅消化6～10min，然后用吸管轻轻吹打，直到曲精细管分散开，并且保证曲精细管的完整性；
S4、加入5-10mL PBS，轻轻吹打，然后600rpm离心5min，弃上清，收集曲精细管，如此反复2次；
S5、加入5倍体积的0.25％胰酶-EDTA和20μg/mL的DNAase Ⅰ混合消化，于37℃水浴锅中消化8-10min，用等量的10％FBS的DMEM/F12终止消化，用约60μm的细胞筛过滤细胞悬液，除去未消化完全的组织块。
S6、滤液于1000rpm离心6min，弃上清，用不完全培养基清洗2-3次；
S7、细胞计数，用差异贴壁培养基重悬细胞调整细胞浓度为5×105个/mL，接种到事先用0.1％明胶包被的25cm2培养瓶，在37℃、5％CO2无菌培养箱条件下培养2-3h，差速贴壁三次，去除上清中精原干细胞、精原细胞，淋巴细胞和血细胞；
S8、用PBS洗两次，然后改为用DMEM/F12+10％FBS继续培养贴壁的细胞，贴壁的细胞即为睾丸成纤维细胞。
7.根据权利要求3所述小鼠精原干细胞体外向精子高效分化的方法，其特征在于，精原干细胞体外精子分化的培养体系中所用培养基为：97％Stro-34培养基+1％ITS+55μM β-巯基乙醇+1％L-谷氨酰胺+2％FBS+1％双抗。
8.根据权利要求3所述小鼠精原干细胞体外向精子高效分化的方法，其特征在于，精原干细胞体外增殖的培养基为：95％Stro-34培养基+1％ITS+55μM β-巯基乙醇+1％L-谷氨酰胺+2％B27+20ng/mL GDNF+10ng/mL EGF+10ng/mL bFGF+1000IU/mL LIF+1％双抗。
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