CN102154195A

CN102154195A - 一种山羊雄性生殖干细胞的体外分离及培养方法

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Publication number: CN102154195A
Application number: CN2010106005208A
Authority: CN
Inventors: 华进联; 朱海鲸
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2009-09-04
Filing date: 2009-09-04
Publication date: 2011-08-17
Anticipated expiration: 2029-09-04
Also published as: CN102154195B

Abstract

本发明公开了一种山羊雄性生殖干细胞的体外分离及培养方法，从雄性山羊的睾丸的曲细精管得到精原细胞，山羊雄性生殖干细胞的分离纯化方法采用0.2％明胶和Matrigel差速贴壁结合克隆法，将未贴壁的山羊雄性生殖干细胞与贴壁培养的其他细胞区分、分离。分离到的山羊雄性生殖干细胞的培养为MEF有饲养层培养或者无饲养层培养。分离到的山羊雄性生殖干细胞具有ES细胞特性和向神经细胞、心肌细胞和精子样细胞的分化潜能。

Description

一种山羊雄性生殖干细胞的体外分离及培养方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及动物干细胞的体外增殖、分化、分离，特别涉及一种山羊雄性生殖干细胞的体外分离及培养方法。

背景技术

生殖细胞的发生、增殖、分化的研究是生命科学研究的重要课题之一。在动物繁殖育种中，高产、优质的遗传资源完全依赖于生殖细胞来完成遗传；在人类，由于精子细胞的发生、成熟障碍等引起的不育症更是困扰众多患者的一个现实问题；在基础研究中，精子更是发育生物学研究的最重要研究对象之一；因此生殖细胞的发生、分化的研究，在畜牧业生产和生物医学研究中具有重要的意义。然而高等哺乳动物生殖细胞的发生、转移、分化完全在体内完成，因此很难动态实时地检测和研究其中的分子事件(Hua等，Recent advances in the derivation of germ cells from the embryonic stem cells.Stem Cells and Development，2008，17：399-411)。

干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体。胚胎干细胞(ES细胞或ESCs)是由早期胚胎内细胞团(ICM)或原始生殖细胞(PGCs)分离而来的多能干细胞。由于胚胎干细胞的独特生物学特性，使干细胞在细胞替代治疗、组织器官修复与重建、基因治疗以及发育生物学模型、新药开发和毒理实验等，几乎所有的生命科学和生物医药领域均具有重要的意义。

近年来，一些著名的研究(Sesndel等，Generation of functional multipotent adult stem cells from GPR125⁺ germline progenitors.Nature；2007，449：346-350；Bukovsky等，Generation of pluripotent stem cells from adult human testis.Nature，456，344-349)发现从胚胎期动物生殖嵴的原始生殖细胞或雄性的睾丸可以得到类似于ES细胞的多能性分化潜能的雄性生殖干细胞(mGSCs)。一般认为，这些雄性生殖干细胞(mGSCs)来源于原始生殖细胞(primordial germ cells，PGCs)，终生存在于性分化后的睾丸中，包括性分化后到精子发生过程中，具有自我增殖和分化潜能的细胞总称；不同于精原干细胞(SSCs)，mGSCs可以分化为机体所有的类型细胞，精原干细胞指未分化的A型精原细胞，一般认为其只有向精子分化的潜能(Ko等，2009)。但也有人认为目前生殖干细胞的起源并不清楚(Yu等，Pluripotent stem cell lines.Genes & Dev，2008，22：1987-1997)。

由于成年动物睾丸的精原细胞在体外合适的条件下，可能转化为多能性的雄性生殖干细胞(Matsui等，Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture.Cell，1992，70：841-847；董武子等，新生牛雄性生殖细胞源类ES的培养及检测，畜牧兽医学报，2007，38(2)：144-148；Guan等，Pluripotency of spermatogonial stem cells from adult mouse testis.Nature，2006，440：1199-1203；Sesndel等，Generation of functional multipotent adult stem cells from GPR125⁺ germline progenitors.Nature；2007，449：346-350；Kanatsu-Shinohara等，Pluripotency of a single spermatogonial stem cell in mice.Biol Reprod.，2008，78(4)：681-687；Kanatsu等，Generation of pluripotent stem cells from neonatal mouse testis.Cell，2004，119：1001-1012；Bukovsky等，Generation of pluripotent stem cells from adult human testis.Nature，456，344-349；Kanatsu-Shinohara等，Pluripotency of asingle spermatogonial stem cell in mice.Biol Reprod.，2008，78(4)：681-687)。所以，mGSCs成为转基因动物和克隆动物的理想载体细胞，而且比起正常的ES细胞，mGSCs细胞来源数量多，培养相对容易。但对于生殖细胞研究来说，更为重要的是mGSCs能够有效地分化产生出精子(Ko等，Induction of pluripotency in adult unipotent germline stem cells.Cell Stem Cell，2009，5：87-96)。

mGSCs在线虫、果蝇和小鼠等模式动物上取得了一些进展，如建立了精原干细胞的培养体系，基本了解各种动物雄性生殖干细胞维持的机理(Ko等，Induction of pluripotency in adult unipotent germline stem cell s.Cell Stem Cell，2009，5：87-96)。但对大家畜如牛、羊、猪等的生殖干细胞，人们了解的仍很不够，仅见的几篇研究报道涉及到mGSCs细胞的分离培养，但未见有生殖干细胞的标准化分离培养方法(董武子等，山羊胎儿睾丸细胞体外分离培养及雄性生殖系干细胞的生长行为.农业生物技术学报，2004，12(6)：648-652.；董武子等，胎牛雄性生殖干细胞源类ES细胞的分离培养与多能性研究.生物工程学报，2007，23(4)：751-755；董武子等，新生牛雄性生殖细胞源类ES的培养及检测.畜牧兽医学报，2007，38(2)：144-148)。

山羊是一种重要的经济动物，生产肉、绒、奶等经济产品，特别是在利用山羊乳腺作为生物反应器生产生物制品方面具有巨大的市场潜力。如何获得、保持优质的种质遗传资源，对现有种群进行改良，成为山羊大规模养殖的迫切问题，对山羊生殖细胞的研究成为解决种质遗传资源的重要手段。

发明内容

本发明的解决的问题在于提供一种山羊雄性生殖干细胞的体外分离及培养方法，从雄性山羊的睾丸体外分离克隆雄性生殖干细胞，并对分离到的山羊雄性生殖干细胞离体培养，为研究山羊的生殖细胞奠定基础。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种山羊雄性生殖干细胞的体外分离方法，包括以下步骤：

1)分离细胞

将从无菌采集的山羊睾丸中分离的曲细精管剪碎至碎块，用包含体积分数10％FBS的DMEM培养液重悬2～3次曲细精管碎块，静置之后得到下层曲细精管细胞团；然后用包含质量分数0.1％的Collagenase、10μg/ml DNase和质量分数0.1％透明质酸酶的混合液消化处理下层曲细精管细胞团2～3次，每次20～30分钟，用包含体积分数10％FBS的DMEM培养液重悬，分离得到精原细胞；

2)雄性生殖干细胞的原代培养

将得到的精原细胞以5×10⁵个/mL的密度接种在经质量分数0.2％的明胶37℃包被30min的塑料培养皿，培养液为山羊雄性生殖干细胞分离培养液；

所述山羊雄性生殖干细胞分离培养液以DMEM高糖培养基为基础培养基，还包括以下组分：体积分数20％的胎牛血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸钠、0.1mmol/Lβ-巯基乙醇、0.1mmol/L非必需氨基酸、5～10ng/ml的碱性成纤维生长因子、1000U/ml的白血病抑制因子、100IU/ml青霉素和100mg/mL链霉素；

培养12h后将未贴壁的细胞转到经Matrigel 4℃包被1小时的塑料培养皿培养，培养液为山羊雄性生殖干细胞分离培养液或人胚胎干细胞无血清无饲养层培养液；

未贴壁的细胞第一次转移培养2h后，将转移培养后再次未贴的壁细胞转移培养到经Matrigel 4℃包被1小时的塑料培养皿培养，培养液为山羊雄性生殖干细胞分离培养液或人胚胎干细胞无血清无饲养层培养液；

未贴壁细胞第二次转移培养后，2天更换一次培养液；细胞生长3～7天后，开始出现致密胚胎干细胞样集落；

3)雄性生殖干细胞的传代培养

待致密胚胎干细胞样集落生长至周边开始出现分化细胞时，将致密胚胎干细胞样集落吸出，在PBS中洗涤2次；再移到TrypLE细胞消化液或质量分数0.05％的胰蛋白酶中消化2～3min，并吹吸5～20次；将离散开的单细胞或小细胞团转移到经Matrigel 4℃包被1小时的塑料的培养皿培养，培养液为山羊雄性生殖干细胞分离培养液；37℃、5％CO₂饱和湿度条件下培养；

培养3～7天后，开始出现致密胚胎干细胞样集落，即为山羊雄性生殖干细胞。

进一步，本发明还公开了分离得到的山羊雄性生殖干细胞的体外培养方法：

将山羊雄性生殖干细胞接种到MEF饲养层上，培养液以DMEM高糖培养基为基础培养基，还包括以下组分：体积分数10％的胎牛血清、体积分数10％的血清替代品、2mM谷氨酰胺、0.1mM β-巯基乙醇、100IU/ml青霉素、100mg/mL链霉素、质量分数的1％非必需氨基酸、1000IU/ml白血病抑制因子、5～10ng/ml碱性成纤维生长因子、质量分数1％的ITS；2天更换一次培养液；

或者将山羊雄性生殖干细胞接种到Matrigel 4℃包被1小时的塑料培养皿无饲养层培养，培养液为人胚胎干细胞无血清无饲养层培养液，2天更换一次培养液。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

1、分离克隆的山羊雄性生殖干细胞形成典型的致密胚胎干细胞样集落，具有ES细胞特性，其碱性磷酸酶(AP)呈阳性，OCT4、SSEA1、SSEA3、SSEA4、β1-INTEGRIN、NANOG、CD49f、CD133、C-MYC、SOX2、KLF4也呈阳性；

2、分离克隆的山羊雄性生殖干细胞具有三胚层的分化潜能，能分化形成神经细胞、心肌细胞和精子样细胞；尤其是具有精子样细胞的分化潜能对于山羊优质种质资源的获得、保持、改良具有重要的意义；

3、分离培养的山羊雄性生殖干细胞较大，细胞透亮、遮光性强、核大，培养后3～7天形成典型的致密细胞克隆，类似ES细胞克隆。

附图说明

图1为山羊雄性生殖干细胞的生物学特性和染色检测结果；其中，图A为单个山羊雄性生殖干细胞，较大，细胞透亮、遮光性强、核大；图B、C为山羊雄性生殖干细胞集落，致密；图D、E为碱性磷酸酶染色显示山羊雄性生殖干细胞呈红色，为AP阳性；图F为山羊雄性生殖干细胞集落的Gimesa染色，核大；Bar＝100μm。

图2为山羊雄性生殖干细胞表面标记的免疫荧光化学检测结果；其中，图A表示为OCT4阳性；图B表示为SSEA1阳性；图C表示为SSEA3弱阳性；图D表示为SSEA 4阳性；图E表示为β1-INTEGRIN阳性；图F表示为NANOG阳性；图G表示为CD49f阳性；图H表示为CD133阳性；图I表示为VASA弱阳性；图J表示C-MYC阳性、图K表示SOX2阳性、图L表示KLF4阳性；Bar＝20μm。

图3为山羊雄性生殖干细胞的分化潜能检测，其中，图A为山羊雄性生殖干细胞悬浮培养形成的类胚体(EB)；图B为EB贴壁培养后周边分化出神经样细胞；图C为山羊雄性生殖干细胞分化出神经样细胞；图D为EB贴壁培养后分化出的心肌样细胞融合的肌管样结构；图E为EB贴壁培养后分化出的心肌样细胞呈心肌α-actin阳性；图F为EB贴壁培养后分化出的心肌样细胞呈心肌特异性肌钙蛋白T阳性；图G为EB贴壁培养后分化出的脂肪样细胞呈油红O阳性；图H为EB贴壁培养后分化出的精子样细胞；图I为EB贴壁培养后分化出的精子样细胞呈Analine Blue阳性；图J为山羊雄性生殖干细胞分化出的细胞呈VASA阳性；图K为山羊雄性生殖干细胞分化出的细胞呈FE-J1阳性；图L为山羊雄性生殖干细胞分化出的细胞呈EMA1阳性。

图4为无饲层体外培养的山羊雄性生殖干细胞呈现较典型的致密胚胎干细胞样集落。

具体实施方式

本发明提供一种高效分离克隆山羊雄性生殖干细胞的培养体系，包括山羊雄性生殖干细胞的分离、山羊雄性生殖干细胞的检测和体外培养。

以2月龄以上胎羊、新生羊或成年羊睾丸作为原始材料来源；山羊雄性生殖干细胞的分离纯化方法采用0.2％明胶和Matrigel差速贴壁结合克隆法，将未贴壁的山羊雄性生殖干细胞与贴壁培养的其他细胞区分、分离。

a、山羊雄性生殖干细胞的体外分离方法，具体包括以下步骤：

1)分离山羊睾丸细胞

用无菌含双抗(500IU/ml青霉素、500mg/mL链霉素)的生理盐水将无菌采集的山羊睾丸洗涤3遍，再用含双抗的PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤3遍，在无菌培养皿内剥去睾丸外膜，分离开曲细精管与睾丸梁，去除小梁，得到曲细精管；

将曲细精管剪碎至1mm³的小碎块，用包含体积分数10％FBS的DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle Media)培养液重悬(500转以下离心)曲细精管碎块，重复2～3次，静置2～5分钟之后，得到下层曲细精管细胞团；

然后用包含质量分数0.1％的Collagenase、10μg/ml DNase和质量分数0.1％透明质酸酶的混合液消化处理2～3次，每次20～30分钟，再用DMEM+10％FBS重悬培养液(500转以下离心)，分离得到精原细胞；

如果细胞团仍较大，则用质量分数为0.25％的胰蛋白酶处理3～5分钟，用包含体积分数10％FBS的DMEM培养液重悬，细胞计数；

2)雄性生殖干细胞的原代培养

将得到的精原细胞以5×10⁵个/mL的密度接种在经质量分数为0.2％的明胶37℃包被30min的塑料培养皿，添加山羊雄性生殖干细胞分离培养液；

所述山羊雄性生殖干细胞分离培养液以DMEM高糖培养基为基础培养基，还包括以下组分：体积分数20％的胎牛血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸钠、0.1mmol/Lβ-巯基乙醇、0.1mmol/L非必需氨基酸(NEAA，美国Invitrogen公司产品)、5～10ng/ml的碱性成纤维生长因子(bFGF)、1000U/ml的白血病抑制因子(mLIF)、100IU/ml青霉素、100mg/mL链霉素；

培养12h后将未贴壁的细胞转到经Matrigel基质膜(BD公司)4℃包被1小时的塑料培养皿培养，培养液为山羊雄性生殖干细胞分离培养液或人胚胎干细胞无血清无饲养层培养液(mTeSR培养液，商品化的人类胚胎干细胞培养液，Stemcell技术公司生产)；

未贴壁的细胞第一次转移培养2h后，将转移培养后再次未贴壁的细胞转移培养到经Matrigel基质膜4℃包被1小时的培养皿培养，培养液为山羊雄性生殖干细胞分离培养液或人胚胎干细胞无血清无饲养层培养液；

未贴壁细胞第二次转移培养后，2天更换一次培养液；细胞生长5～7天后，开始出现较典型的致密胚胎干细胞样集落；

3)雄性生殖干细胞的传代培养

待致密胚胎干细胞样集落生长至周边开始出现分化细胞，即周边细胞变大，界限明显时，将致密胚胎干细胞样集落吸出，在100μl PBS中洗涤2次；再移到100μl TrypLE细胞消化液(商品化的细胞消化液，Invitrogen公司的TrypLE^TM Express)或质量分数0.05％的胰蛋白酶中消化2～3min，并用10μl移液枪吹吸5～20次离散细胞；将离散开的单细胞或小细胞团移到经Matrigel4℃包被1小时的塑料培养皿培养，培养液为山羊雄性生殖干细胞分离培养液；37℃、5％CO₂饱和湿度条件下培养；

细胞生长3～7天后，开始出现较典型的致密胚胎干细胞样集落，即为分离得到的山羊雄性生殖干细胞。

b、分离到的山羊雄性生殖干细胞的细胞检测

1)碱性磷酸酶检测

将传代培养分离到的致密胚胎干细胞样集落的山羊雄性生殖干细胞用4％多聚甲醛固定3～5min后，用无钙镁的PBS洗两遍，用碱性磷酸酶染液(2mgα-萘酚磷酸盐和10mg坚固红溶于10ml PH 8.2～8.4的Tris-Cl溶液中)染色8min，吸出染色液，PBS洗2次，照相记录；

分离克隆的山羊雄性生殖干细胞具有ES细胞特性和生殖干细胞的生物学特性，形成典型的集落，如图1B～F所示；山羊雄性生殖干细胞的碱性磷酸酶染色呈红色，如图D～E所示，为碱性磷酸酶(AP)阳性，即具有多能性干细胞的特性(Hua等，2009；Ko等，2009)。

2)免疫组化或免疫荧光检测

将培养的山羊雄性生殖干细胞用4％多聚甲醛固定15min，用PBS洗两遍，3％H₂O₂室温孵育10min，PBS洗两遍，10％胎牛血清(PBS稀释)封闭，室温孵育30min，倾去血清，分别滴加OCT4(1∶500)、SSEA1(1∶200)、SSEA3(1∶200)、SSEA4(1∶200)、β1-INTEGRIN(1∶200)、NANOG(1∶200)、CD49f(1∶200)、CD133(1∶500)、VASA(1∶1000)、C-MYC(1∶200)、SOX2(1∶200)、KLF4(1∶200)一抗工作液，4℃过夜，PBS洗两遍，滴加二抗(羊抗兔FITC或羊抗鼠FITC，1∶500)工作液，室温孵育1h，PBS洗两遍，每次5min，荧光显微镜下观察照相记录结果；

上述免疫荧光的一抗标志均为ES细胞和生殖干细胞的标记，检测结果分别如图2所示，OCT4(A)、SSEA1(B)、SSEA4(D)、β1-INTEGRIN(E)、NANOG(F)、CD49f(G)、CD133(H)、C-MYC(J)、SOX2(K)、KLF4(L)检测呈阳性，SSEA3(C)、VASA(I)检测弱阳性，表明山羊雄性生殖干细胞具有生殖干细胞和ES细胞特性(Hua等，2009；Ko等，2009)。

3)细胞体外分化潜能

以600个细胞/25μl的小滴悬滴培养制作类胚体(EB，Hua等，2009)，3天后体视显微镜下检查类胚体形成情况，山羊雄性生殖干细胞悬浮培养形成的类胚体(EB)，如图3A所示；收集EB，培养在0.1％明胶贴附的48空培养板上(培养基为去除bFGF和LIF的山羊雄性生殖干细胞分离液，即以DMEM高糖培养基为基础培养基，添加体积分数20％的胎牛血清、2mmol/LL-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸钠、0.1mmol/Lβ-巯基乙醇、0.1mmol/L非必需氨基酸、100IU/ml青霉素和100mg/mL链霉素)，1～3周检查EB脱落出的细胞类型；

分离克隆的山羊雄性生殖干细胞具有三胚层的分化潜能，能够分化形成EB(图3A所示)、神经细胞(图3B、C所示)、心肌细胞(图3D、E、F所示)、脂肪样细胞(图3G所示，油红O阳性)和精子样细胞(图3H、I所示)；图3J、K、L分别为分化细胞呈精子及生殖细胞特异性标记VASA(图3J)、FE-J1(图3K)和EMA1(图3L)，表明分离克隆的山羊雄性生殖干细胞具有分化为精子样的潜能(Toyooka等，2003；Hua等，2009)，这对于山羊优质种质资源的筛选研究尤其重要。

c、对于分离得到的山羊雄性生殖干细胞，其体外离体培养方法为：

1)有饲养层培养

将山羊雄性生殖干细胞接种到MEF饲养层上(即小鼠胚胎成纤维细胞饲养层，用怀孕12-16天的昆白小鼠胚胎成纤维细胞经10μg/mL丝裂霉素处理2-3小时，以50000个/cm²的密度铺附在经0.1％明胶处理的塑料培养板上)，培养液以DMEM高糖培养基为基础培养基，还包括以下组分：体积分数10％的胎牛血清(FBS)、体积分数10％的血清替代品(KSR，Invitrogen)、2mM谷氨酰胺、0.1mMβ-巯基乙醇、100IU/ml青霉素、100mg/mL链霉素、1％非必需氨基酸(NEAA)、1000IU/ml白血病抑制因子(LIF)、5～10ng/ml碱性成纤维生长因子(bFGF)、1％ITS(胰岛素+转铁蛋白+亚硒酸钠，Sigma公司)；

培养2天更换一次培养液，细胞生长3～7天后，开始出现的较典型的致密生殖干细胞集落，如图1B所示。

2)无饲养层培养

或者将山羊雄性生殖干细胞接种到Matrigel(BD公司)4℃包被1小时的塑料培养皿无饲养层培养，培养液为人胚胎干细胞无血清无饲养层培养液(mTeSR培养液，Stem cells公司)；

培养2天更换一次培养液，细胞生长3～7天后，开始出现的较典型的致密生殖干细胞集落，如图4A所示的无饲养层培养的山羊雄性生殖干细胞集落，图4B无饲养层培养的山羊雄性生殖干细胞集落免疫染色呈AP阳性。

Claims

1.一种山羊雄性生殖干细胞的体外培养方法，其特征在于，将山羊雄性生殖干细胞接种到MEF饲养层上，培养液以DMEM高糖培养基为基础培养基，还包括以下组分：体积分数10％的胎牛血清、体积分数10％的血清替代品、2mM谷氨酰胺、0.1mMβ-巯基乙醇、100IU/ml青霉素、100mg/mL链霉素、质量分数1％的非必需氨基酸、1000IU/ml白血病抑制因子、5～10ng/ml碱性成纤维生长因子、质量分数1％的ITS；2～3天更换一次培养液；

或将山羊雄性生殖干细胞接种到Matrigel基质膜4℃包被1小时的塑料培养皿无饲养层培养，培养液为人胚胎干细胞无血清无饲养层培养液，2天更换一次培养液。