CN104774803B - 新的胚胎干细胞培养体系及胚胎干细胞建系方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域、具体涉及新的胚胎干细胞培养体系以及采用本发明所述培养体系提高胚胎干细胞建系效率的方法。本发明所述培养体系包括：DMEMF12、N‑2supplement、B‑27supplement、β‑巯基乙醇、谷氨酰胺、胰岛素、牛血清白蛋白、双抗(青霉素+链霉素)、Pd0325901、Chir99021、白血病抑制因子(LIF)、Knockout Serum Replacement(KoSR)、P53inhibitor、Y‑27632、P38MAPK inhibitor和Forskolin。本发明新型的培养体系及其方法既能保证得到稳定的胚胎干细胞系，又能够显著性提高胚胎干细胞的建系效率，同时还能维持胚胎干细胞的多能性，使其始终处于优良的生长状态，从而更好地推动胚胎干细胞在转基因和疾病模型领域的广泛应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物学技术领域，具体涉及新的用于胚胎干细胞的新的培养体系以及采用所述培养体系提高胚胎干细胞建系效率的方法。
背景技术
1981年，英国科学家马丁·埃文斯首次建立了小鼠胚胎干细胞系，开启了胚胎干细胞领域的研究工作(Evans and Kaufman，1981)。此后，Nicholas M.Gough等发现一种被称之为白血病抑制因子(Leukemia Inhibitory Factors，LIF)的化合物，它能够维持小鼠胚胎干细胞保持未分化状态，使得小鼠ESCs能够在体外长期稳定地传代培养(Williams eta1.，1988)。随着研究的愈发深入，科学家们对小鼠ESCs的多能性调控机制的研究也越来越透彻(Niwa et al.，2009)，这样也推进了小鼠培养体系的跟进和发展。从最初的胎牛血清培养基，到Invitrogen公司推出KoSR替代胎牛血清，再到应用最为广泛的“代胎体系”，培养基的发展实现了从有血清到无血清、从成分不明确到确定化学成分的过程；而且通过培养基的不断更新和发展，具有不同遗传背景的小鼠品系，如C57BL／6、DBA2、CBA、NOD等，均在体外成功地得到了ESC细胞系，这对于疾病模型的建立、转基因及胚学研究都具有重要意义。
然而，具有不同遗传背景的小鼠胚胎体外建立ESCs细胞系的能力是不一样的(Hanna et al.，2009)。远交封闭群来源的ESCs体外建系能力是最容易的，如129Sv、CD-1等，利用传统的胎牛血清培养体系，就可以高效率建立ESCs细胞系，但是近交品系来源的小鼠ESCs在此培养条件下建系则十分困难，如C57BL／6、NOD等，其建系效率几乎为零。随着KoSR血清替代品的出现，近交系小鼠ESCs的建系效率得到了极大的提高，但是其不同细胞系的生长状态差异较大，不是特别稳定。
Evans，M.J等人(′Establishment in culture of pluripotential cellsfrommouse embryos′，Nature(1981)292(5819)：154-6；Williams，R.L.等人(′Myeloidleukaemia inhibitoryfactor maintains the developmental potential of embryonicstem cells′，Nature(1988)336(6200)：684-7)公开了“FBS(15％)的培养体系，但是该体系只限于特殊背景(如封闭群品系小鼠)的胚胎干细胞建系，而对于其他背景(如近交系小鼠)的胚胎干细胞建系则无法实现，且在“FBS(15％)”体系内，胚胎干细胞的生长状态一般，克隆集落相对较小。
Cheng，J等人(′Improved generation of C57BL／6J mouse embryonic stemcells in a defined serum-free media′，Genesis(2004)39(2)：100-4)介绍了“KoSR(20％)的培养体系，从成分上看，“KoSR(20％)”体系与“FBS(15％)”体系相比较，只是用KoSR代替FBS而已，其余成分和浓度均一致。KoSR的使用实现了不同遗传背景的胚胎干细胞均能建系的目的，尤其是对近交系小鼠的胚胎干细胞建系起到了很大的推动作用(Chenget al.，2004)。但是该培养体系培养出的胚胎干细胞的状态不稳定，这主要体现在细胞集落表面不光滑、易出现“白点“(由死细胞产生的)，部分细胞成扁平状生长(表明细胞开始分化)及细胞集落的立体感不强等。
Ying QL等人(The ground state of embryonic stem cell self-renewal′，Nature(2008)453(7194)：519-23)；Hanna，J.等提出了胚胎干细胞“GroundState”的概念，首次提出利用在N2B27基础培养液中添加MEK抑制剂PD0325901、GSK3β抑制剂CHIR99021和LIF(又称“2i体系”)的方法建立小鼠ESCs细胞系，取得了突破性的成果，该体系对于稳定ESCs多能性状态是非常重要的(Theunissen et al.，2011)。但是其对于近交品系ESCs的建系效率并无显著性提高，细胞增殖较慢，细胞集落在“2i”体系中一般都很小，而且对于近交系背景的胚胎干细胞，其建系效率也不是很高。
所以目前仍需研究出一种新的培养体系以达到支持不同遗传背景的胚胎干细胞建系和培养的目的。
发明内容
针对现有技术中存在的现状，本发明提供了用于胚胎干细胞的新的培养体系、以及采用本发明所述培养体系提高胚胎干细胞建系效率的方法。本发明新型培养体系及其方法的意义在于既能保证得到稳定的胚胎干细胞系，又能够显著性提高胚胎干细胞的建系效率，从而更好地推动胚胎干细胞在转基因和疾病模型领域的广泛应用。
本发明所述培养体系包括：DMEMF12、N-2Supplement、B-27Supplement、β-巯基乙醇、谷氨酰胺、胰岛素、牛血清白蛋白、双抗(青霉素+链霉素)、Pd0325901、Chir99021、白血病抑制因子(LIF)、Knockout Serum Replacement(KoSR)、P53inhibitor、Y-27632、P38MAPKinhibitor和Forskolin。
作为本发明实施方式之一，所述培养体系中以培养体系的总量为基础计、DMEMF12为90％～97％，优选为92％～96％；N-2Supplement为1∶50～1∶200，优选为1∶80～1∶120；b-27Supplement为1∶25～1∶100，优选为1∶25～1∶75；β-巯基乙醇为0.05mM～0.2mM，优选为0.07mM～0.15mM；谷氨酰胺为1mM～5mM，优选为2mM～4mM；胰岛素为10μg／mL～50μg／mL，优选为10μg／mL-30μg／mL；牛血清白蛋白为0.001％～0.005％，优选为0.002％～0.004％；双抗(青霉素+链霉素)为1∶50～1∶100，优选为1∶70～1∶100；Pd0325901为0.8μM～2μM，优选为0.8μM～1.5μM；Chir99021为3μM～10μM，优选为3μM～6μM；白血病抑制因子(LIF)为1000U～10000U，优选为1000U～6000U；Knockout Serum Replacement(KoSR)为3％～10％，优选为3％～8％；P53inhibitor为2μM～50μM，优选为2μM～10μM；Y-27632为5μM～10μM，优选为5μM～8μM；P38MAPK inhibitor为5μM～20μM优选为μM5-8μM；和Forsk0lin为10μM～20μM，优选为10μM～15μM。所述体系中涉及比例的及百分比的组分，其均以质量为计量单位。
作为本发明实施方式之一，所述培养体系中，DMEMF12包括但不限于例如由GIBCO公司提供；N-2Supplement包括但不限于例如由GIBCO公司提；B-27Supplement包括但不限于例如由GIBCO公司提供；β-巯基乙醇包括但不限于例如由Sigma公司提供；谷氨酰胺包括但不限于例如由GIBCO公司提供；胰岛素包括但不限于例如由Roche Applied Sciences公司提供；牛血清白蛋白包括但不限于例如由Sigma公司提供；双抗(青霉素+链霉素)包括但不限于例如由GIBCO公司提供；Pd0325901包括但不限于例如由Stemgent公司提供；Chir99021包括但不限于例如由Stemgent公司提供；白血病抑制因子(LIF)包括但不限于例如由Millipore公司提供；Knockout Serum Replacement(KoSR)包括但不限于例如由GIBCO公司提供；P53inhibitor包括但不限于例如由Calbiochem公司提供；Y-27632包括但不限于例如由Calbiochem公司提供；P38MAPKinhibitor包括但不限于例如由Calbiochem公司提供；Forskolin包括但不限于例如由Stemgent公司提供。
作为本发明进一步实施方式之一，所述培养体系以总溶液的量为基础计为:
本发明还提供一种采用本发明所述培养体系提高胚胎干细胞建系效率的方法，所述方法包括：
1)取囊胚，接种在铺有饲养层的孔板内，放置在37℃、5％CO2的培养箱内，用本发明所述的培养体系进行孵育培养；
2)培养至囊胚贴壁后形成生长晕(outgrowths)，用口吸管调取生长晕(outgrowths)，放置在事先37℃预热的0.25％胰酶滴中，37℃消化；然后用口吸管将生长晕(outgrowths)吸出，并直接吹入到含有本发明所述培养体系的新孔内并吹散生长晕(outgrowths)，放置于37℃5％CO2的培养箱内继续培养，记为P1代；
3)培养至克隆集落长大后，弃上清液，用0.25％胰酶消化整个孔；然后用含10％血清的培养液终止胰酶消化，并反复吹吸；之后将细胞和液体统一转移到离心管内，离心；
4)离心完毕后，弃上清，用培养液重悬沉淀，并按照合适的比例将细胞接种在新的培养皿内，记为P2代；
5)重复3)和4)步骤，直至形成稳定的胚胎干细胞系。
本发明上述方法中，步骤5)中重复3)和4)步骤的次数没有特别限定，本领域技术人员可结合常识判断以是否形成稳定的胚胎干细胞为标准，如形成了稳定的胚胎干细胞即可停止重复3)和4)的步骤，本发明所述方法中，作为本发明实施方式之一，可以重复2-10次，3-8次，或5-7次。
作为本发明实施方式之一，所述方法包括：1)取囊胚，接种在铺有饲养层的四孔板内，每孔5～6枚胚胎，放置在37℃5％CO2的培养箱内，用本发明所述的培养体系孵育培养；
2)培养6～7天后，囊胚贴壁后形成生长晕(outgrowths)，用口吸管调取生长晕(outgrowths)，放置在事先37℃预热的0.25％胰酶滴中，37℃消化5分钟；用口吸管将生长晕(outgrowths)吸出，并直接吹入到含有本发明所述的培养系的新孔内并吹散生长晕(outgrowths)，放置于37℃5％CO2的培养箱内继续培养，记为P1代；
3)培养3～4天后，待克隆集落长大后，弃上清，然后直接用0.25％胰酶消化整个孔，消化2分钟左右；然后用含有10％血清的培养液终止胰酶消化，并反复吹吸3～4次；之后，将细胞和液体统一转移到15毫升离心管内，1000rpm离心5分钟；
4)离心完毕后，弃上清，用本发明培养体系重悬沉淀，并按照合适的比例将细胞接种在新的培养皿内，记为P2代；
5)重复3)和4)步骤，直至形成稳定的胚胎干细胞系。
本发明所述提高胚胎干细胞建系效率的方法可以用于不同遗传背景的胚胎干细胞的建系，所述胚胎包括但不限于小鼠胚胎细胞、大鼠胚胎细胞、兔子胚胎细胞等，小鼠胚胎干细胞系包括但不限于例如cES1、dES3、cdES3等。
作为本发明进一步实施方式之一，所述提高胚胎干细胞建系效率的方法包括：
1)取胚胎发育3.5天(E3.5)的小鼠囊胚，接种在铺有饲养层的四孔板内，每孔5～6枚胚胎；
放置在37℃5％CO2的培养箱内，用本发明所述培养体系孵育培养；
2)培养6～7天后，囊胚贴壁后形成生长晕(outgrowths)，用口吸管调取生长晕(outgrowths)，放置在事先37℃预热的0.25％胰酶滴中，37℃消化5分钟；用口吸管将生长晕(outgrowths)吸出，并直接吹入到含有培养基的新孔内并吹散生长晕(outgrowths)，放置于37℃5％CO2的培养箱内继续培养，记为P1代；
3)培养3～4天后，待克隆集落长大后，弃上清，然后直接用0.25％胰酶消化整个孔，消化2分钟左右；然后用含有10％血清的培养液终止胰酶消化，并反复吹吸3～4次；之后，将细胞和液体统一转移到15毫升离心管内，1000rpm离心5分钟；
4)离心完毕后，弃上清，用培养液重悬沉淀，并按照合适的比例将细胞接种在新的培养皿内，记为P2；
5)重复3)和4)步骤，直至形成稳定的胚胎干细胞系。
本发明还进一步提供一种拟胚体体外分化的方法，所述方法包括：
a)取采用本发明方法培养出的长满的小鼠胚胎干细胞，0.25％胰酶消化后，将细胞悬浮于铺有0.2％明胶的培养皿上培养30分钟，以便去掉饲养细胞(feeder)；
b)收集悬浮细胞，用分化培养液悬浮培养小鼠胚胎干细胞，使其形成聚集体(aggregates)，记为day0；
c)分化培养2～3天之后，显微镜下可观察到已形成球状体的拟胚体(EB)；
d)分化培养6天之后，收集拟胚体(EB)，并将拟胚体(EB)贴附于培养上生长，此时培养液换为N-2培养液；
e)分化培养10天之后，从拟胚体(EB)“爬”出的细胞中可以看到神经细胞、内皮样细胞、及成纤维等各种类型的细胞。
本发明所述拟胚体体外分化的方法所述步骤b)中的分化培养液为本领域常规的分化培养液、作为本发明实施方式之一，其包括：DMEM／F12(GIBCO)，10％Knock-out血清(GIBCO)和1×双抗溶液，其用量和它们之间的比例关系没有特别的限定，本领域技术人员可以结合本发明记载和本领域常识确定合适的用量。
本发明所述拟胚体体外分化的方法所述步骤d)中的N-2培养液为本领域常规的分化培养液、作为本发明实施方式之一，其包括DMEM／F12(GIBCO)，1X N2(GIBCO)，2mM谷氨酰胺和1X双抗溶液，其用量和它们之间的比例关系没有特别的限定，本领域技术人员可以结合本发明记载和本领域常识确定合适的用量。
本发明还提供一种免疫荧光染色的技术方案，操作如下：
1)胚胎干细胞用磷酸缓冲溶液(PBS)洗涤，然后用含4％的多聚甲醛(PFA)的PBS室温固定;
2)随后PBS冲洗，加0.3％Triton的2％BSA／PBS孵育；加“一抗”4℃孵育。所述“一抗”选自Oct4(1∶100，Santa cruz)，Nanog(1∶200，Abcam)，Sox2(1∶200，Millipore)。
3)用PBS清洗，加“二抗”室温孵育；所述“二抗”选自：Fluorescein FITC相连的二抗或Cyanine Cy3相连的二抗(均购自Jackson ImmunoResearch公司)
4)洗涤后加50μg／ml PI(10μg／ml；Molecular Probes，OR，USA)中37℃孵育20分钟，随后封片4℃保存。
样品用Zeiss LSM780META激光共聚焦扫描显微镜观察。
本发明还涉及一种RT-PCR的操作方法：
1)取采用本发明方法培养出的长满的小鼠胚胎干细胞，0.25％胰酶消化后，将细胞悬浮于铺有0.2％明胶的培养皿上培养，以便完全去除饲养细胞(feeder)；
2)收集细胞到15毫升离心管内，用PBS洗涤后，用Trizol(Invitrogen)悬浮细胞并提取RNA，按照之前所述的操作方法将RNA反转成cDNA；
3)PCR扩增实验：第一步，95℃5min；第二步，95℃30s、58℃30s、72℃30s、28个循环；第三步，72℃10min。(具体的操作步骤可参照Lian X.等人′Robust cardiomyocytedifferentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation ofcanonical Wnt signaling′，Proc Natl Acad Sci U S A.(2012)109(27)：E1848-57.)中的所述方法操作)
本发明还涉及到一种检验胚胎干细胞体内分化能力的方法，即畸胎瘤技术，其操作方法如下：
1)取小鼠胚胎干细胞，去掉饲养细胞(feeder)后，注射到裸鼠皮下，3周后观察畸胎瘤的形成；
2)将畸胎瘤小鼠断颈处死后取出畸胎瘤，将畸胎瘤称重并拍照；
3)取少量畸胎瘤组织用4％的PFA固定，随后用石蜡包埋进行组织切片，然后HE染色观察三胚层的组织和细胞。
本发明涉及到一种验证胚胎干细胞体外分化能力的方法，即拟胚体技术，其操作方法如下：
1)取采用本发明培养的长满的小鼠胚胎干细胞，0.25％胰酶消化后，将细胞悬浮于铺有0.2％明胶的培养皿上培养，以便去掉饲养细胞(feeder)；
2)收集悬浮细胞，周分化培养液悬浮培养小鼠胚胎干细胞，使其形成聚集体(aggregates)，记为第0天(day0)。分化培养液的组分包括：DMEM／F12(GIBCO)，10％Knock-out血清(GIBCO)和1×双抗溶液。
3)分化培养天之后，显微镜下可观察到已形成球状体的拟胚体(EB)；
4)继续分化培养之后，收集拟胚体(EB)，并将拟胚体(EB)贴附于培养上生长，此时培养液换为N2培养液。N-2培养液的组分包括DMEM／F12(GIBCO)，1X N2(GIBCO)，2mM谷氨酰胺和1X双抗溶液。
5)继续分化培养，从拟胚体(EB)“爬”出的细胞中可以看到神经细胞、内皮样细胞、及成纤维等各种类型的细胞。
从本发明实验例的结果可以看出，本发明培养体系及方法可以用于不同遗传背景的胚胎干细胞的建系，其意义在于既保证了得到稳定的胚胎干细胞系，又能够显著性提高了胚胎干细胞的建系效率，从而更好地推动胚胎干细胞在转基因和疾病模型领域的广泛应用。
附图说明
图1：小鼠胚胎干细胞的建系过程。(A)囊胚，(B)囊胚接种到饲养层6～7天后形成的outgrowth，(C)小鼠ESCs细胞集落；比例尺(Scalebar)，100μM；
图2：在不同培养体系下不同遗传背景的胚胎干细胞建系效率的比较；
图3：在不同培养体系下不同遗传背景的胚胎干细胞建系效率的比较(柱形图)；
图4：不同培养体系下胚胎干细胞的生长状态。(A)“2i+KoSR”体系；(B)“2i”体系；(C)“KoSR(20％)”体系；(D)“FBS(15％)”体系。比例尺(Scale bar)，100μM；
图5：小鼠胚胎干细胞多能性基因表达的免疫荧光分析。(A)-(C)多能性基因Oct4的表达检测，(D)-(F)多能性基因Sox2的表达检测，(G)多能性基因Nanog的表达检测，比例尺(Scale bar)，50μM；
图6：RT-PCR分析小鼠胚胎干细胞多能性基因的表达。Oct4、Nanog，为ESC多能性基因；VIM，波形蛋白基因；GAPDH，内参基因；M，Marker ladder；cES1、dES3、cdES3，近交系小鼠ESCs细胞；MEF，胚胎成纤维细胞；
图7：小鼠胚胎干细胞的体外分化能力检测。(A)拟胚体形成，(B)成纤维样细胞，(C)内皮样细胞，(D)神经样细胞，比例尺(Scalebar)，100μM；
图8：小鼠胚胎干细胞的体内分化能力的检测。(A)畸胎瘤形成，(B)肠上皮样结构(内胚层)，(C)表皮样结构(外胚层)，(D)脂肪样组织(中胚层)，比例尺(Scale bar)，500μM；
图9：不同培养条件下拟胚体的状态比较。(A)和(B)，在添加KoSR的培养液形成的拟胚体，其中(A)是由cES1形成的，(B)是由dES3形成的；(C)和(D)，在添加FBS的培养液形成的拟胚体，其中(C)是由cES1形成的，(D)是由dES3形成的，比例尺(Scale bar)，100μM。
具体实施方式
本发明通过以下实验例进一步说明本发明，但本发明并不受限于此。
本发明以下实施例或实验例中所采用的实验动物，如CD-1小鼠、129Sv、C57BL／6小鼠、DBA／2小鼠、B6D2F1小鼠(C57BL／6X DBA／2)等，均购自北京维通利华有限公司，而且所有的动物实验操作都遵循《北京市实验动物管理条例》的相关规定。
实施例1培养体系的制备：
成分表：
操作流程：
第一步，配制“N2B27基础培养液”，成分如下：
操作方法：将上述成分及用量混合制备即得。
第二步，配制Stemness因子浓储液，成分如下：
操作方法：用无菌去离子水溶解各组分，按上述比例配制即可，放置-20℃保存。
第三步，将N2B27基础培养液与Stemness因子浓储液以100∶1的比例混合，即得“2i+KoSR”体系。
实施例2小鼠胚胎干细胞系的建系
1)取E3.5天的小鼠囊胚，接种在铺有饲养层的四孔板内，每孔5～6枚胚胎，放置在37℃5％CO2的培养箱内，用培养体系(实施例1制备)孵育培养；
2)培养6～7天后，囊胚贴壁后形成生长晕(outgrowths)，用口吸管调取生长晕(outgrowths)，放置在事先37℃预热的0.25％胰酶滴中，37℃消化5分钟；用口吸管将生长晕(outgrowths)吸出，并直接吹入到含有培养基(实施例1制备)的新孔内并吹散生长晕(outgrowths)，放置于37℃5％CO2的培养箱内继续培养，记为P1代；
3)培养3～4天后，待克隆集落长大后，弃上清，然后直接用0.25％胰酶消化整个孔，消化2分钟左右；然后用含有10％血清的培养液终止胰酶消化，并反复吹吸3～4次；之后，将细胞和液体统一转移到15毫升离心管内，1000rpm离心5分钟；
4)离心完毕后，弃上清，用培养液(实施例1制备)重悬沉淀，并按照合适的比例将细胞接种在新的培养皿内，记为P2；
5)重复3)和4)步骤5～7次，直至形成稳定的胚胎干细胞系，即得。
实施例3胚胎干细胞的体外分化方法
a)取长满的小鼠胚胎干细胞(按实施例2制备而得)，0.25％胰酶消化后，将细胞悬浮于铺有0.2％明胶的培养皿上培养30分钟，以便去掉饲养细胞(feeder)；
b)收集悬浮细胞，用分化培养液(分化培养液的组分包括：DMEM／F12(GIBCO)，10％Knock-out血清(GIBCO)和1×双抗溶液)悬浮培养小鼠胚胎干细胞，使其形成聚集体(aggregates)，记为第0天(day0);
c)分化培养2～3天之后，显微镜下可观察到已形成球状体的拟胚体(EB);
d)分化培养6天之后，收集拟胚体(EB)，并将拟胚体(EB)贴附于培养上生长，此时培养液换为N-2培养液(N-2培养液的组分包括DMEM／F12(GIBCO)，1X N2(GIBCO)，2mM谷氨酰胺和1X双抗溶液)；
e)分化培养10天之后，从拟胚体(EB)“爬”出的细胞中可以看到神经细胞、内皮样细胞、及成纤维等各种类型的细胞。
实验例1：不同培养体系的小鼠胚胎干细胞的建系效率对比实验
1实验材料：
1.1培养体系：
“2i+KoSR”体系的组分列表
参照实施例1进行制备。
“2i”体系的组分列表
参照Ying QL等人(The ground state of embryonic stem cell self-renewal′，Nature(2008)453(7194)：519-23)制备。
“KoSR(20％)”体系的组分列表：
参照Cheng，J等人(′Improved generation of C57BL／6J mouse embryonic stemcellsin a defined serum-free media′，Genesis(2004)39(2)：100-4)制备。
“FBS(15％)”体系的组分列表
参照Bao S.等人(′Epigenetic reversion of post-implantation epiblast topluripotent embryonic stem cells′，Nature(2009)461(7268)：1292-5)制备。
1.2细胞系：
实验例中所建立的细胞系均来源于小鼠，其中cES1属于C57BL／6小鼠胚胎干细胞系，dES3属于DBA／2小鼠胚胎干细胞系，cdES3属于B6D2F1杂交小鼠胚胎干细胞系。
1.3实验用液：
除1.1中各培养体系所涉及的组分外，还包括0.25％胰酶(GIBCO)、DMEM(GIBCO)、胎牛血清(GIBCO)等试剂用液。
2.实验方法：
除培养体系不同外，胚胎干细胞的培养方法均按照实施例2的方法进行培养，并对培养的结果进行效率检测。
2.1胚胎干细胞的传代培养方法：
1)弃上清，用0.25％胰酶消化2分钟左右；然后用含有10％血清的培养液终止胰酶消化，并反复吹吸3～4次；之后，将细胞和液体统一转移到15毫升离心管内，1000rpm离心5分钟
2)离心完毕后，弃上清，用培养液重悬沉淀，并按照合适的比例将细胞接种在新的培养皿内；
3)每隔2～3天，重复1)和2)步骤，以保证胚胎干细胞稳定传代。
2.2胚胎干细胞建系效率的检测方法：
统计各培养体系建立的细胞系与接种囊胚的数量，计算二者之间的比值，即得胚胎干细胞的建系效率。
3.实验结果：
表1在“2i+KoSR体系”内小鼠ESCs的建系效率比较
表2在“2i体系”内小鼠ESCs的建系效率比较
表3在“KoSR(20％)体系”内小鼠ESCs的建系效率比较
表4在“FBS(15％)体系”内小鼠ESCs的建系效率比较
4.实验结论：
小鼠胚胎干细胞建系的细胞变化过程如图1所示。在“FBS(15％)”体系下，封闭群小鼠ESCs建系效率在70％以上，与其他培养体系无明显差异，但是此体系并不能很好地支持近交系小鼠ESCs的建系培养(图2，图3)；与之相反，在用KoSR(20％)代替FBS(15％)之后，近交系小鼠的建系效率有明显的提高(C57BL／6，DBA／2，50％～60％vs.0；C57BL／6xDBA／2(B6D2F1)，50％～60％vs.<10％；NOD，<10％vs.0)，表明KoSR有利于近交系小鼠ESCs的形成(图2，图3)；利用“2i体系”进行小鼠ESCs的建系实验，发现封闭群小鼠ESCs的建系效率与“KoSR(20％)体系”和“FBS(15％)体系”并无明显差异，而且在“2i体系”下，封闭群小鼠ESCs的生长状态也明显优于“KoSR(20％)体系”和“FBS(15％)体系”(图4)，而对于近交系小鼠ESCs，2i的建系效率要优于“FBS(15％)体系”(C57BL／6，DBA／2，10％～20％vs.0;B6D2F1，10％～20％vs.<10％；NOD，<10％vs.0)，但是其却明显低于“KoSR(20％)体系”(C57BL／6，DBA／2，10％～20％vs.50％～60％;B6D2F1，10％～20％vs.50％～60％)(图2，图3)；最后，本发明中使用的一种新型培养体系，即“2i+KoSR体系”，不但能够保证封闭群小鼠ESCs的建系效率与其余的小鼠ESCs体系无明显差异，而且更为重要的是，“2i+KoSR体系”能够显著性提高近交系小鼠ESCs的建系效率(C57BL／6，DBA／2，B6D2F1，>70％；NOD，>50％)(图2，图3)，而且其细胞系的生长状态与“2i体系”相近(图4)，
这些结果表明“2i+KoSR体系”适合于不同背景品系的胚胎干细胞高效建系和状态稳定的培养。
实验例2“2i+KoSR”体系下建立的胚胎干细胞系的多能性基因的表达
1.实验材料：
1.1实验用液：
磷酸盐缓冲液(PBS)，多聚甲醛(PFA)，Triton X-100，2％BSA／PBS，0.25％胰酶，0.2％明胶，Trizol
1.2实验仪器：
Zeiss LSM780META共聚焦显微镜，PCR仪，载玻片，盖玻片，Bio-Red凝胶电泳成像系统
1.3细胞系：cES1细胞，dES3细胞，，cdES3细包
2.实验方法：
2.1免疫荧光染色：
1)胚胎干细胞(按实施例2培养获得)用磷酸缓冲溶液(PBS)洗1遍，然后用含4％的多聚甲醛(PFA)的PBS室温固定30分钟；
2)随后PBS冲洗两遍，加0.3％Triton X-100的2％BSA／PBS孵育1小时；加“一抗”4℃孵育过夜。一抗有Oct4(1∶100，Santa cruz)，Nanog(1∶200，Abcam)，Sox2(1∶200，Millipore)。
3)用PBS清洗3遍后，加“二抗”(Fluorescein FITC相连的二抗或Cyanine Cy3相连的二抗(均购自Jackson ImmunoResearch公司))室温孵育一小时；
4)洗涤后加50μg/ml PI(10μg／ml；Molecular Probes，OR，USA)中37℃孵育20分钟，随后封片4℃保存。
样品用Zeiss LSM780META激光共聚焦扫描显微镜观察。
2.2RT-PCR：
1)取长满的小鼠胚胎干细胞(按实施例2培养获得)，0.25％胰酶消化后，将细胞悬浮于铺有0.2％明胶的培养皿上培养60～70分钟，以便完全去除饲养细胞(feeder)；
2)收集细胞到15毫升离心管内，用PBS洗一遍后，用Trizol(Invitrogen)悬浮细胞并提取RNA，按照之前所述的操作方法将RNA反转成cDNA；
3)PCR扩增实验：第一步，95℃5min；第二步，95℃30s、58℃30s、72℃30s、28个循环；第三步，72℃10min。(具体可参照按照Lian X.等人(′Robust cardiomyocytedifferentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation ofcanonical Wnt signaling′，Proc Natl Acad Sci U SA.(2012)109(27)：E1848-57.)的所述方法操作。)
3.实验结果：
(1)小鼠胚胎干细胞多能性基因表达的免疫荧光分析。
实验结果显示，(A)-(C)多能性基因Oct4的表达检测结果表明“2i+KoSR”体系建立的cdES3细胞，Oct4正常表达；(D)-(F)多能性基因Sox2的表达检测表明“2i+KoSR”体系建立的dES3细胞，Sox2正常表达；(G)-(D)多能性基因Nanog的表达检测表明“2i+KoSR”体系建立的cES1细胞，Nanog正常表达(具体参见图5)。
(2)RT-PCR分析小鼠胚胎干细胞多能性基因的表达
实验结果，参见图6。
4.实验结论：
对于“2i+KoSR”建立的小鼠胚胎干细胞系cES1、dES3、cdES3，进行了严格的胚胎干细胞的分子生物学鉴定。免疫荧光染色和RT-PCR结果共同表明cES1、dES3、cdES3三个细胞系均正常表达胚胎干细胞特异性基因oct4、sox2、nanog(图5，图6)，而不表达分化基因vim(图6)，表明在“2i+KoSR体系”下建立的具有不同遗传背景的近交系小鼠ESCs能够正常的表达胚胎干细胞所特有的多能性标记基因。
实验例3“2i+KoSR”体系下建立的胚胎干细胞系多潜能性鉴定
1.实验材料：
1.1实验用液：
0.25％胰酶，0.2％明胶，DMEM／F12(GIBCO)，Knock-out血清(GIBCO)，双抗溶液(GIBCO)，N2(GIBCO)，谷氨酰胺(GIBCO)，多聚甲醛(PFA)，石蜡，苏木精-伊红染液(HE)
1.2实验动物：裸鼠(6～8周龄)
1.3实验仪器
1毫升注射器，电子天平，染色杯，切片机，活细胞工作站(Leica)
1.4细胞系：cES1细胞
2.实验方法：
2.1拟胚体形成与体外分化：
1)取长满的小鼠胚胎干细胞cES1(按实施例2方法培养获得)，0.25％胰酶消化后，将细胞悬浮于铺有0.2％明胶的培养皿上培养30分钟，以便去掉养细胞(feeder)；
2)收集悬浮细胞，用分化培养液悬浮培养小鼠胚胎干细胞，使其形成聚集体(aggregates)，记为day0。分化培养液的组分包括：DMEM／F12(GIBCO)，10％Knock-out血清(GIBCO)和1×双抗溶液。
3)分化培养2～3天之后，显微镜下可观察到已形成球状体的EB；
4)分化培养6天之后，收集EB，并将EB贴附于培养上生长，此时培养液换为N2培养液。N2培养液的组分有DMEM／F12(GIBCO)，1XN2(GIBCO)，2mM谷氨酰胺和1X双抗溶液。
5)分化培养10天之后，从EB“爬”出的细胞中可以看到神经细胞、内皮样细胞、及成纤维等各种类型的细胞。
2.2畸胎瘤形成：
1)取1x107的小鼠胚胎干细胞cES1(按实施例2方法培养获得)，去掉养细胞(feeder)后，注射到裸鼠皮下，3周后观察畸胎瘤的形成；
2)将畸胎瘤小鼠断颈处死后取出畸胎瘤；
3)取少量畸胎瘤组织用4％的PFA固定，随后用石蜡包埋进行组织切片，然后HE染色观察三胚层的组织和细胞。
3.实验结果：
(1)小鼠胚胎干细胞的体外分化结果：
小鼠胚胎干细胞在诱导分化的培养液内悬浮培养6～7后，干细胞可以分化形成拟胚体(图7A)；将拟胚体转移到铺有明胶的培养皿，2天后部分状态较好的拟胚体能够贴壁生长；贴壁生长10天后，镜下可观察到由拟胚体向外生长的多种类型细胞，包括成纤维样细胞(属中胚层分化细胞)(图7B)、内皮样细胞(属内胚层分化细胞)(图7C)及神经样细胞(属外胚层分化细胞)(图7D)等，表明胚胎干细胞具有体外分化并形成三胚层细胞的能力(具体参见图7)。
(2)小鼠胚胎干细胞具有畸胎瘤形成能力
将小鼠胚胎干细胞(如cES1)注射到裸鼠大腿内侧肌肉内，3周之后，可以观察到畸胎瘤的形成(图8A)；取少量畸胎瘤组织，用4％PFA固定后，通过石蜡切片法观察，形成的畸胎瘤组织中含有肠上皮样结构(属内胚层)(图8B)、表皮样结构(属外胚层)(图8C)及脂肪样结构(属中胚层)(图8D)等各种结构组织(具体参见图8)。
4.实验结论：
对于“2i+KoSR”建立的小鼠ESC细胞系cES1、dES3、cdES3，进行了严格的胚胎干细胞功能实验鉴定。首先，体外分化实验表明近交系小鼠ESC细胞可以悬浮培养形成拟胚体(Embryoid Body，EB)，拟胚体贴壁培养10天后，可以观察到有成纤维样、内皮细胞样及神经样细胞等来源于不同胚层的细胞产生，表明“2i+KoSR”体系建立的近交系小鼠ESC细胞具有三胚层分化能力(图7)；通过畸胎瘤实验，观察到“2i+KoSR”体系下建立的近交系小鼠ESC细胞同样具有形成畸胎瘤的能力，而且组织切片检测结果表明，畸胎瘤内包含有三胚层来源的各类组织结构(图8)，说明这些ESCs同样具有体内分化形成三胚层细胞的能力，证明了其具有体内发育的全能性。
实验例4本发明培养法能够提高拟胚体的质量的实验
1.实验材料：
1.1实验用液和仪器：
0.25％胰酶，0.2％明胶，DMEM／F12(GIBCO)，Knock-out血清(GIBCO)，双抗溶液(GIBCO)，N-2培养液(GIBCO)，谷氨酰胺(GIBCO)，胎牛血清(FBS)(GIBCO)，活细胞工作站(Leica)
1.2细胞系：cES1细胞，dES3细胞
2.实验方法：
2.1拟胚体形成与体外分化：
1)取长满的小鼠胚胎干细胞(按实施例2方法培养获得)，0.25％胰酶消化后，将细胞悬浮于铺有0.2％明胶的培养皿上培养30分钟，以便去掉饲养细胞(feeder)；
2)收集悬浮细胞，用分化培养液悬浮培养小鼠胚胎干细胞，使其形成聚集体(aggregates)，记为第0天(day0)。分化培养液的组分包括：DMEM／F12(GIBCO)，10％Knock-out血清(GIBCO)或者10％胎牛血清(FBS)(GIBCO)，及1×双抗溶液。
3)分化培养2～3天之后，显微镜下可观察到已形成球状体的拟胚体(EB);
4)分化培养6天之后，收集拟胚体(EB)，并将拟胚体(EB)贴附于培养上生长，此时培养液换为N-2培养液。N-2培养液的组分有DMEM／F12(GIBCO)，1X N-2(GIBCO)，2mM谷氨酰胺和1X双抗溶液。
5)分化培养10天之后，从拟胚体(EB)“爬”出的细胞中可以看到神经细胞、内皮样细胞、及成纤维等各种类型的细胞。
2.2拟胚体贴壁效率统计：
将分化6天的拟胚体(EB)，用口吸管接种于铺有0.2％明胶的培养皿内，37℃5％CO2培养。类胚胎体(EB)接种2天之后，镜下统计拟胚体(EB)的贴壁数，计算贴壁率：
拟胚体(EB)贴壁率=拟胚体(EB)贴壁数／拟胚体(EB)接种数。
3.实验结果
(1)KoSR分化液与FBS分化液诱导胚胎干细胞形成拟胚体的形态比较：
以“2i+KoSR”体系建立的胚胎干细胞cES1(A和C)与dES3(B和D)为例比较在不同分化诱导液条件下拟胚体形成情况。从形态学上看，KoSR分化液诱导胚胎干细胞形成的拟胚体边缘光滑清晰，且非常饱满(A和B)；而FBS分化液诱导胚胎干细胞形成的拟胚体则形态很不规则，边缘粗糙且很不清晰，细胞碎片或细胞明显增多(C和D)。
(2)KoSR分化液与FBS分化液诱导胚胎干细胞形成拟胚体贴壁率的比较：
表5不同的诱导分化液诱导分化形成的拟胚体的贴壁能力的比较
4.实验结论：
(1)从拟胚体形态上看，添加“KoSR”的培养液，拟胚体的形态更加饱满，拟胚体的边缘更加清晰，而添加FBS的培养液培养的拟胚体，形态上不规则，而且死细胞及碎片的比例较多，拟胚体的边缘不光滑等。(图9)
(2)拟胚体贴壁率的角度看，添加KoSR的培养液培养的拟胚体贴壁效率要显著性高于添加FBS的培养液。
Claims (8)
1.一种胚胎干细胞培养体系，其特征在于，所述培养体系包括：DMEMF12、N-2Supplement、B-27 Supplement、β-巯基乙醇、谷氨酰胺、胰岛素、牛血清白蛋白、青霉素+链霉素的双抗、Pd0325901、Chir99021、白血病抑制因子、Knockout Serum Replacement、P53inhibitor、Y-27632、P38 MAPK inhibitor和Forskolin；其中，所述培养体系以总溶液为计算基础，其中DMEMF12为90％～97％；N-2 Supplement为1:50～1:200；B-27 Supplement为1:25～1:100；β-巯基乙醇为0.05～0.2mM；谷氨酰胺为1mM～5mM；胰岛素为10μg/mL～50μg/mL；牛血清白蛋白为0.001％～0.005％；青霉素+链霉素的双抗为1：50～1：100；Pd0325901为0.8μM～2μM；Chir99021为3μM～10μM；白血病抑制因子为1000U/mL～10000U/mL；Knockout Serum Replacement为3％～10％；P53 inhibitor为2μM～50μM；Y-27632为5μM～10μM；P38 MAPK inhibitor为5μM～20μM；和Forskolin为10μM～20μM。
2.根据权利要求1所述的培养体系，其特征在于，所述培养体系为：DMEMF12为92％～96％；N-2 Supplement为1：80～1：120；B-27Supplement为1：25～1：75；β-巯基乙醇为0.07mM～0.15mM；谷氨酰胺为2mM～4mM；胰岛素为10μg/mL-30μg/mL；牛血清白蛋白为0.002％～0.004％；青霉素+链霉素的双抗为1：70～1：100；Pd0325901为0.8μM～1.5μM；Chir99021为3μM～6μM；白血病抑制因子为1000U/mL～6000U/mL；Knockout SerumReplacement为3％～8％；P53 inhibitor为2μM～10μM；Y-27632为5μM～8μM；P38 MAPKinhibitor为5μM-8μM；和Forskolin为10μM～15μM。
3.根据权利要求2所述的培养体系，其特征在于，所述培养体系为：
4.一种用于小鼠、大鼠或兔子胚胎干细胞系的建系方法，其特征在于，所述方法包括：
1)取囊胚，接种在铺有饲养层的孔板内，放置在37℃、5％CO2的培养箱内，用权利要求1-3任一所述的培养体系进行孵育培养；
2)培养至囊胚贴壁后形成生长晕，用口吸管调取生长晕，放置在事先37℃预热的0.25％胰酶滴中，37℃消化；然后用口吸管将生长晕吸出，并直接吹入到含有权利要求1-3任一所述培养体系的新孔内并吹散生长晕，放置于37℃、5％CO2的培养箱内继续培养，记为P1代；
3)培养至克隆集落长大后，弃上清液，用0.25％的胰酶消化整个孔；然后用含10％的血清的培养液终止胰酶消化，并反复吹吸；之后将细胞和液体统一转移到离心管内，离心；
4)离心完毕后，弃上清，用培养液重悬沉淀，并按照合适的比例将细胞接种在新的培养皿内，记为P2代；
5)重复3)和4)步骤，直至形成稳定的胚胎干细胞系。
5.根据权利要求4所述的建系方法，其特征在于，所述方法包括：
1)取囊胚，接种在铺有饲养层的四孔板内，每孔5～6枚胚胎，
放置在37℃、5％CO2的培养箱内，用权利要求1-3任一所述的培养体系孵育培养；
2)培养6～7天后，囊胚贴壁后形成生长晕，用口吸管调取生长晕，放置在事先37℃预热的0.25％胰酶滴中，37℃消化5分钟；用口吸管将生长晕吸出，并直接吹入到含有权利要求1-3任一所述的培养系的新孔内并吹散生长晕，放置于37℃5％CO2的培养箱内继续培养，记为P1代；
3)培养3～4天后，待克隆集落长大后，弃上清，然后直接用0.25％胰酶消化整个孔，消化2分钟左右；然后用含有10％血清的培养液终止胰酶消化，并反复吹吸3～4次；之后，将细胞和液体统一转移到15毫升离心管内，1000rpm离心5分钟；
4)离心完毕后，弃上清，用培养液重悬沉淀，并按照合适的比例将细胞接种在新的培养皿内，记为P2代；
5)重复3)和4)步骤，直至形成稳定的胚胎干细胞系。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
1)取E3.5天的小鼠囊胚，接种在铺有饲养层的四孔板内，每孔5～6枚胚胎，
放置在37℃5％CO2的培养箱内，权利要求1-3任一所述的培养体系孵育培养；
2)培养6～7天后，囊胚贴壁后形生长晕，用口吸管调取生长晕，放置在事先37℃预热的0.25％胰酶滴中，37℃消化5分钟；用口吸管将生长晕吸出，并直接吹入到含有权利要求1-3任一所述培养体系的新孔内并吹散生长晕，放置于37℃5％CO2的培养箱内继续培养，记为P1代；
3)培养3～4天后，待克隆集落长大后，弃上清，然后直接用0.25％胰酶消化整个孔，消化2分钟左右；然后用含有10％血清的培养液终止胰酶消化，并反复吹吸3～4次；之后，将细胞和液体统一转移到15毫升离心管内，1000rpm离心5分钟；
4)离心完毕后，弃上清，用培养液重悬沉淀，并按照合适的比例将细胞接种在新的培养皿内，记为P2；
5)重复3)和4)步骤，直至形成稳定的胚胎干细胞系。
7.一种拟胚体体外分化的方法，其特征在于，所述方法包括：
a)取权利要求4-6任一方法所得的长满的小鼠胚胎干细胞，0.25％胰酶消化后，将细胞悬浮于铺有0.2％明胶的培养皿上培养30分钟，以去掉饲养细胞；
b)收集悬浮细胞，用分化培养液悬浮培养小鼠胚胎干细胞，使其形成聚集体，记为第0天；
c)分化培养2～3天之后，显微镜下观察到已形成球状体的拟胚体；
d)分化培养6天之后，收集拟胚体，并将拟胚体贴附于N-2培养液上生长，此时培养液换为N-2培养液，N-2培养液的组分包括DMEM/F12、1× N2、2mM谷氨酰胺和1× 双抗溶液；
e)分化培养10天之后，从拟胚体“爬”出的细胞中可以看到神经细胞、内皮样细胞、及成纤维等各种类型的细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤b)中的分化培养液包括：DMEM/F12，10％Knock-out血清和1×双抗溶液；所述步骤d)中的N-2培养液包括DMEM/F12，1×N2，2mM谷氨酰胺和1× 双抗溶液。
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Denomination of invention: New embryonic stem cell culture system and embryonic stem cell establishment method Effective date of registration: 20220915 Granted publication date: 20181113 Pledgee: China Construction Bank Corporation Beijing Daxing Sub-branch Pledgor: ICE BIOSCIENCE Inc. Registration number: Y2022110000218 |
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