CN105316282B - 一种达氏鲟精原细胞培养液及应用 - Google Patents

一种达氏鲟精原细胞培养液及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105316282B
CN105316282B CN201510905841.1A CN201510905841A CN105316282B CN 105316282 B CN105316282 B CN 105316282B CN 201510905841 A CN201510905841 A CN 201510905841A CN 105316282 B CN105316282 B CN 105316282B
Authority
CN
China
Prior art keywords
spermatogonium
acipenser dabryanus
cell
culture solution
culture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201510905841.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105316282A (zh
Inventor
颉璇
厉萍
危起伟
叶欢
杨晓鸽
马杰
曾令兵
李创举
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yangtze River Fisheries Research Institute CAFS
Original Assignee
Yangtze River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yangtze River Fisheries Research Institute CAFS filed Critical Yangtze River Fisheries Research Institute CAFS
Priority to CN201510905841.1A priority Critical patent/CN105316282B/zh
Publication of CN105316282A publication Critical patent/CN105316282A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105316282B publication Critical patent/CN105316282B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种达氏鲟精原细胞培养液及应用，本发明提供了一种无胎牛血清、以各种生长因子、非必须氨基酸、丙酮酸钠等添加剂作为替代物，同时辅以少量雄性达氏鲟血清的低血清培养基，可保证精原细胞的大量增殖且精巢细胞增殖率较低，将培养至第13天的精巢细胞13d掺入25μM BrdU标记新增殖细胞，24h免疫组化实验显示掺入BrdU 24h后新增殖细胞中带有生殖细胞标记的细胞的比例为85.78%。本发明解决了目前达氏鲟精原细胞原代无法大量培养的问题，为达氏鲟生殖发育研究提供有效的细胞平台。

Description

一种达氏鲟精原细胞培养液及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及的是一种达氏鲟精原细胞培养液及应用。
背景技术
达氏鲟(Acipenserdabryanus)属鲟形目，鲟科，鲟属，又名沙腊子、长江鲟，是我国特有物种，为淡水定居性鲟鱼类(丁瑞华1994)。主要分布于金沙江下游及长江上游，具有较高的经济价值和科研价值。近年来，由于环境污染、生境破坏、航运和过度捕捞等因素,野生达氏鲟种群数量急剧下降。近20年来，由于葛洲坝工程的兴建以及长江上游的环境污染、过度捕捞等原因，达氏鲟的资源已极为稀少(ZhuangPing et al 1996,Zhanghui et al2011)。1988年，达氏鲟被世界自然与资源保护联盟(International Union for theConservation of Nature and Natural Resources)红色名录列为极度濒危(Criticalendangered,CR)物种。因此，开展达氏鲟种质资源保护技术的研究，对于保护达氏鲟物种资源，对于品种的开发利用等都有重要的意义。
2006年，日本学者Okutsu等建立了虹鳟的精原细胞移植技术。将A型精原细胞的一部分移植到腹膜受体虹鳟胚胎，向受体胚胎生殖腺移动，并在其内增殖，然后产生了大量功能性的精子。这些结果在功能上证实鱼精巢中存在精原细胞。此外，Okutsu还发现精原细胞合并到雌鱼卵巢中，分化为功能齐全的卵，表明整合的精原细胞具有双性潜能。最后，正常生物个体可以通过来自供体精原细胞形成的配子受精产生。2007年，代理亲鱼技术建立，可将精原细胞异种移植入近缘种。通过这种技术，可将苗种生产昂贵、世代时间长的大型鱼类的精原细胞移植到亲缘关系相近但体型较小，世代时间较短的鱼种中，缩短世代时间。因此达氏鲟精原细胞移植可作为达氏鲟物种保护的对策之一。通过建立一种达氏鲟精原细胞体外培养方法，可使精原细胞长时间在体外扩增和维持，并同时保持其原有的特性，可以保证用于移植的精原细胞长期大量稳定的供应。
目前鱼类精原细胞体外培养研究大多集中在斑马鱼(Danio rerio)(Sakai 2002，Kurita2004)青鳉(Oryziaslatipes)(Hong 2004)、日本鳗鲡(Anguilla japonica)(Miuraet al.2006，Ozaki et al.2006，Ohta et al.(2007))、红罗非鱼(Oreochromisniloticus)(Lacerda 2010)、南亚野鲮(Labeorohita)(Panda 2011)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)(Okutsu 2007,Shikina 2008,2010)等物种上。但目前未发现达氏鲟精原细胞分离培养方法的相关报道。
达氏鲟精原细胞培养液是进行精原细胞长期培养的关键因素之一。本发明提供一种多种成分所组成的适用于达氏鲟精原细胞培养的培养液。这种培养液不含胎牛血清，能够实现达氏鲟精原细胞的长期培养。本发明的培养液可用来建立达氏鲟精原细胞系，用于长期培养达氏鲟精原细胞。本发明还涉及所述的精原细胞培养液在长期保存达氏鲟精原细胞中的用途。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种达氏鲟精原细胞培养液。该培养液特异性的针对精原细胞的培养，使得达氏鲟原代精原细胞在体外生长更容易增殖，为达氏鲟生殖发育研究提供有效的细胞平台。
本发明还有一个目的是提供了一种达氏鲟精原细胞培养液在培养精原细胞中的应用。
本发明解决所述技术问题的方案，包括以下步骤：
一种达氏鲟精原细胞培养液，包括：
其余为SFM培养液；
所述的达氏鲟精原细胞培养液pH为7.7-8.3。
优选的，所述的达氏鲟血清为2龄雄性达氏鲟血清。
一种达氏鲟精原细胞培养液，包括：
其余为SFM培养液；
所述的达氏鲟精原细胞培养液pH为7.8-8.2。
一种达氏鲟精原细胞培养液，包括：
其余为SFM培养液；
所述的达氏鲟精原细胞培养液pH为7.8-8.2。
一种达氏鲟精原细胞培养液，包括：
其余为SFM培养液；
所述的达氏鲟精原细胞培养液pH为7.9-8.1。
一种达氏鲟精原细胞培养液，包括：
其余为SFM培养液；
所述的达氏鲟精原细胞培养液pH为8.0。
以上保存液的pH通过1M NaHCO3或25mM HEPES调节。
一种达氏鲟精原细胞培养液在培养精原细胞中的应用，包括利用所述的培养液为有效成分制备成达氏鲟精原细胞培养液，或直接将该培养液用于达氏鲟精原细胞的培养。
具体的，将该培养液用于达氏鲟精原细胞的培养步骤包括：
(1)达氏鲟精巢细胞悬液制备：
以下操作均在无菌生物安全柜中进行。
1)清洗干净的达氏鲟精巢组织移到培养皿中，将精巢组织剪碎，以消化液：组织块＝4:1(v/w)的比例添加0.25％胰蛋白酶消化液，20℃培养箱中消化，每30min吹打一次。
2)将步骤1)中的精巢组织消化3h后，加L-15培养基+20％胎牛血清终止消化，40μm滤网过滤。4℃，200g离心5min，L-15培养基+20％胎牛血清重悬。
3)细胞计数，并用台盼蓝：细胞悬液＝1:1(v/v)染色，在显微镜下计算活细胞率后，用L-15+20％胎牛血清以1×105个/ml稀释细胞。
4)将稀释后的细胞悬液接种至细胞培养瓶中，21℃培养箱中培养36h后，用移液管轻轻吹打培养瓶瓶壁，使未贴壁的细胞落下，收集培养液，1000r，室温离心5min。
5)离心后弃上清，用达氏鲟精原细胞培养液重悬细胞，，21℃培养箱中培养。
6)每3d-4d换液一次。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明首次提供了一种专用于达氏鲟精原细胞的培养液，解决了目前达氏鲟精原细胞原代无法大量培养的问题，为达氏鲟生殖发育研究提供有效的细胞平台。
常用的细胞培养基中含有胎牛血清成分，它对维持细胞生长、贴壁、解毒、抑制蛋白酶的活性及维持培养液的酸碱度等都具有重要作用。但是胎牛血清成分复杂、品质不稳定，常影响实验结果的准确性。目前有关精原细胞培养的报道表明，培养基内胎牛血清浓度过高，能显著地促进精巢体细胞的增殖，形成生长优势，从而抑制精原细胞的增殖。本发明提供了一种无胎牛血清、以各种生长因子、非必须氨基酸、丙酮酸钠等添加剂作为替代物，同时辅以少量雄性达氏鲟血清的低血清培养基，可保证精原细胞的大量增殖且精巢细胞增殖率较低。
附图说明
图1为实施例7中原代培养12d的精原细胞。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术，所述试剂或材料，如未特备说明，均来自于商业渠道。
实施例1：
一种达氏鲟精原细胞培养液，包括：
其余为SFM，培养液pH为8.0。
所述的达氏鲟精原细胞培养液的制备方法，包括以下步骤：
1.各成分母液的配置：
(1)10ml 500g/L BSA母液(100X)的配置：
用天平精确称取所需0.05g BSA的重量，精确度为0.0001g：
根据公式：量取重量＝配方浓度×BSA母液总体积
将称量好的BSA放入烧杯中，加入6mlSFM基础培养液，使BSA充分溶解，继续加入SFM基础培养液，将溶解后的BSA溶液定容10ml。
(2)10ml 200mmol/L L-Glutamine母液(100X)的配置：
用天平精确称取0.3654g L-Glutamine的重量，精确度为0.0001g：
根据公式：量取重量＝配方浓度×L-Glutamine母液总体积
将称量好的L-Glutamine放入烧杯中，加入6mlSFM基础培养液，使L-Glutamine充分溶解，继续加入SFM基础培养液，将溶解后的L-Glutamine溶液定容至10ml。
(3)10ml 2g/L L-Lys母液(100X)、10ml 2g/L L-Pro母液(100X)、10ml 2g/L L-Asp母液(100X)的配置：
用天平精确称取20mg L-Lys，精确度为0.0001g：
根据公式：量取重量＝配方浓度×L-Lys母液总体积
将称量好的L-Lys固体放入烧杯中，加入6mlSFM基础培养液，使其充分溶解，继续加入SFM基础培养液，将溶解后的溶液定容至10ml。
(4)10ml 2g/L L-Pro母液(100X)的配置方法同步骤(3)。
(5)10ml 2g/L L-Asp母液(100X)的配置方法同步骤(3)。
(4)达氏鲟血清室温静置1h，3000r，4℃离心5min，取上清，0.2μm无菌过滤，分装至2.0ml冻存管中，-20℃保存。
(5)2.5g/L LIF母液(100X)的配置：
在无菌生物安全柜内，根据LIF固体质量，用移液枪精确吸取需配置母液体积的无菌SFM基础培养液溶解LIF，振荡混匀，分装至2.0ml冻存管中，-20℃保存。
(6)2.5g/L GDNF母液(100X)的配置：
在无菌生物安全柜内，根据GDNF固体质量，用移液枪精确吸取需配置母液体积的无菌SFM基础培养液溶解GDNF，振荡混匀，分装至2.0ml冻存管中，-20℃保存。
(7)2.5g/L bFGF母液(100X)的配置：
在无菌生物安全柜内，根据bFGF固体质量，用移液枪精确吸取需配置母液体积的无菌SFM基础培养液溶解bFGF，振荡混匀，分装至2.0ml冻存管中，-20℃保存。
2.50ml细胞培养液的配置：
(1)在无菌的生物安全柜内，用移液枪从各组分母液中精确量取配制细胞培养液所需体积的各组分。量取各组分所需的体积根据细胞培养液配方中各组分的浓度、各组分母液的浓度、以及所需配制的培养液体积，按如下公式计算：
量取体积＝(配方浓度×培养液体积)÷母液浓度
(2)分别精确量取500μl 500g/L BSA母液、1ml B27 Supplement、500μl 200mmol/L L-Glutamine母液、2g/L L-Lys母液、2g/L L-Pro母液、2g/L L-Asp母液各1ml，500μl2.5g/L LIF、500μl 2.5g/L GDNF、500μl2.5g/LbFGF，3.5ml达氏鲟血清，青霉素，链霉素及两性霉素B混合均匀，加SFM基础培养液，定容至50ml。
(3)配制好的细胞培养液用0.2μm滤膜过滤除菌。现用现配。
实施例2-6：
一种达氏鲟精原细胞培养液，包括：
所述的达氏鲟血清为2龄雄性达氏鲟血清,其余为SFM培养液。
实施例8：
一种达氏鲟精原细胞培养液在培养精原细胞中的应用，包括
(1)达氏鲟精巢细胞悬液制备：
以下操作均在无菌生物安全柜中进行。
1)清洗干净的达氏鲟精巢组织移到培养皿中，将精巢组织剪碎，以消化液：组织块＝4ml:1g(v/w)的比例添加0.25％胰蛋白酶消化液，20℃培养箱中消化，每30min吹打一次。
2)将步骤1)中的精巢组织消化3h后，加L-15培养基+20％胎牛血清终止消化，40μm滤网过滤。4℃，200g离心5min，L-15培养基+20％胎牛血清重悬。
3)细胞计数，并用台盼蓝：细胞悬液＝1:1(v/v)染色，在显微镜下计算活细胞率后，用L-15+20％胎牛血清以1×105个/ml稀释细胞。
4)将稀释后的细胞悬液接种至25cm3细胞培养瓶中(5ml/瓶)，21℃培养箱中培养36h后，用移液管轻轻吹打培养瓶瓶壁，使未贴壁的细胞落下，收集培养液，1000r，室温离心5min。
5)离心后弃上清，用5ml实施例1所述配方制备的达氏鲟精原细胞培养液重悬细胞，加入至新的25cm3细胞培养瓶中，21℃培养箱中培养。
6)每3d-4d换液一次。
6-8天可见呈念珠状精原细胞，13-15天可见精原细胞呈簇状成团生长。
细胞观察鉴定：在10X和20X倒置显微镜下观察细胞，其中精原细胞较大、呈圆形、成团生长，支持细胞呈纤维状，观察后采用标记生殖干细胞的vasa抗体进行鉴定。
通过细胞计数本次消化后所得的细胞数量为3.75×107，接种浓度为5×106/瓶(5ml，1×106个/ml)，7d细胞数量约为9.34×106/瓶，14d细胞数量约为3.14×107/瓶。
培养第13d掺入25μM BrdU标记新增殖细胞，24h免疫组化实验显示掺入BrdU 24h后新增殖细胞中带有生殖细胞标记的细胞的比例为85.78％。

Claims (7)

1.一种达氏鲟精原细胞培养液，包括：
其余为培养液；
所述的达氏鲟精原细胞培养液pH为7.7-8.3。
2.一种达氏鲟精原细胞培养液，包括：
其余为培养液；
所述的达氏鲟精原细胞培养液pH为7.8-8.2。
3.一种达氏鲟精原细胞培养液，包括：
其余为培养液；
所述的达氏鲟精原细胞培养液pH为7.8-8.2。
4.一种达氏鲟精原细胞培养液，包括：
其余为培养液
所述的达氏鲟精原细胞培养液pH为7.9-8.1。
5.一种达氏鲟精原细胞培养液，包括：
其余为培养液；
所述的达氏鲟精原细胞培养液pH为8.0。
6.权利要求1所述的达氏鲟精原细胞培养液在培养达氏鲟精原细胞中的应用。
7.权利要求1所述的达氏鲟精原细胞培养液为有效成分在制备达氏鲟精原细胞培养液中的应用。
CN201510905841.1A 2015-12-09 2015-12-09 一种达氏鲟精原细胞培养液及应用 Active CN105316282B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510905841.1A CN105316282B (zh) 2015-12-09 2015-12-09 一种达氏鲟精原细胞培养液及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510905841.1A CN105316282B (zh) 2015-12-09 2015-12-09 一种达氏鲟精原细胞培养液及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105316282A CN105316282A (zh) 2016-02-10
CN105316282B true CN105316282B (zh) 2018-10-30

Family

ID=55244603

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510905841.1A Active CN105316282B (zh) 2015-12-09 2015-12-09 一种达氏鲟精原细胞培养液及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105316282B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109402046A (zh) * 2018-10-15 2019-03-01 卢克焕 一种水牛睾丸单细胞悬浮液的制备方法
CN112852716B (zh) * 2021-03-12 2022-09-23 集美大学 一种大黄鱼精巢组织细胞系及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001045503A2 (en) * 1999-12-10 2001-06-28 Regents Of The University Of Minnesota Cryopreservation compositions and methods for peripheral blood lymphocytes
CN1821391A (zh) * 2006-03-02 2006-08-23 扬州大学 一种鸡精原细胞分离纯化方法
CN104350145A (zh) * 2012-02-14 2015-02-11 华盛顿州立大学 用于无饲养细胞培养牛和猪的精原干细胞的方法
CN104774803A (zh) * 2014-01-10 2015-07-15 北京爱思益普生物科技股份有限公司 新的胚胎干细胞培养体系及胚胎干细胞建系方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001045503A2 (en) * 1999-12-10 2001-06-28 Regents Of The University Of Minnesota Cryopreservation compositions and methods for peripheral blood lymphocytes
CN1821391A (zh) * 2006-03-02 2006-08-23 扬州大学 一种鸡精原细胞分离纯化方法
CN104350145A (zh) * 2012-02-14 2015-02-11 华盛顿州立大学 用于无饲养细胞培养牛和猪的精原干细胞的方法
CN104774803A (zh) * 2014-01-10 2015-07-15 北京爱思益普生物科技股份有限公司 新的胚胎干细胞培养体系及胚胎干细胞建系方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Isolation and cryopreservation of early stages of germ cells of tench ( Tinca tinca);Z. Linhartová 等;《Czech J. Anim. Sci.》;20141231;第59卷(第8期);第381-390页 *
以KnockoutTM SR无血清培养基培养小鼠精原干细胞的研究;王庆忠;《潍坊学院学报》;20080331;第8卷(第2期);80-82 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN105316282A (zh) 2016-02-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102550542B (zh) 用于脂肪干细胞的无血清冻存液及脂肪干细胞库的建立
Hernandez et al. Growth and maintenance of chick embryo fibroblasts (CEF)
Villegas et al. Establishment and culture of human skin fibroblasts
CN100389193C (zh) 安全连续封闭式细胞培养、病毒生产和灭活的方法
CN101979519A (zh) 一种制备伪狂犬病疫苗的方法
CN108795850A (zh) 一种精原干细胞体外无饲养层长期培养方法
Kasten Mammalian myocardial cells
Uhrig et al. Improving cell recovery: freezing and thawing optimization of induced pluripotent stem cells
Gritti et al. Cultures of stem cells of the central nervous system
CN105925523A (zh) 一种赤眼鳍条细胞系及其建立方法与应用
CN105907721A (zh) 一种稳定表达Cas9蛋白的猪肠道上皮细胞系
CN105462884A (zh) 鸭支原体培养基及鸭支原体的分离纯化方法
CN105316282B (zh) 一种达氏鲟精原细胞培养液及应用
CN102178946A (zh) Bhk-21细胞无血清悬浮培养技术在口蹄疫疫苗生产中的应用
Hu et al. A quality assurance initiative for commercial-scale production in high-throughput cryopreservation of blue catfish sperm
Ryan Introduction to animal cell culture
CN107365738A (zh) 一种奶牛与黄牛异种体外受精胚胎的制备方法
CN105441386A (zh) 一种猪极小胚胎样干细胞培养与鉴定方法
CN104178451B (zh) 从乳汁中分离和培养奶牛乳腺上皮细胞的方法及专用培养基
CN103074297B (zh) 家畜精原干细胞培养液
CN104818241A (zh) 鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系及其构建方法
CN106520694A (zh) 一种人体外周血淋巴细胞培养基及其制备方法
CN109536437A (zh) 一种维持稳定性、高滴度病毒抗原生产的悬浮细胞病毒的培养方法
CN108866012A (zh) 一种猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法
CN106754672A (zh) 一种贴壁细胞的培养方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant