CN105316282A

CN105316282A - 一种达氏鲟精原细胞培养液及应用

Info

Publication number: CN105316282A
Application number: CN201510905841.1A
Authority: CN
Inventors: 颉璇; 厉萍; 危起伟; 叶欢; 杨晓鸽; 马杰; 曾令兵; 李创举
Original assignee: Yangtze River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Yangtze River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2015-12-09
Filing date: 2015-12-09
Publication date: 2016-02-10
Anticipated expiration: 2035-12-09
Also published as: CN105316282B

Abstract

本发明公开了一种达氏鲟精原细胞培养液及应用，本发明提供了一种无胎牛血清、以各种生长因子、非必须氨基酸、丙酮酸钠等添加剂作为替代物，同时辅以少量雄性达氏鲟血清的低血清培养基，可保证精原细胞的大量增殖且精巢细胞增殖率较低，将培养至第13天的精巢细胞13d掺入25μM？BrdU标记新增殖细胞，24h免疫组化实验显示掺入BrdU？24h后新增殖细胞中带有生殖细胞标记的细胞的比例为85.78%。本发明解决了目前达氏鲟精原细胞原代无法大量培养的问题，为达氏鲟生殖发育研究提供有效的细胞平台。

Description

一种达氏鲟精原细胞培养液及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及的是一种达氏鲟精原细胞培养液及应用。

背景技术

达氏鲟(Acipenserdabryanus)属鲟形目，鲟科，鲟属，又名沙腊子、长江鲟，是我国特有物种，为淡水定居性鲟鱼类(丁瑞华1994)。主要分布于金沙江下游及长江上游，具有较高的经济价值和科研价值。近年来，由于环境污染、生境破坏、航运和过度捕捞等因素,野生达氏鲟种群数量急剧下降。近20年来，由于葛洲坝工程的兴建以及长江上游的环境污染、过度捕捞等原因，达氏鲟的资源已极为稀少(ZhuangPingetal1996,Zhanghuietal2011)。1988年，达氏鲟被世界自然与资源保护联盟(InternationalUnionfortheConservationofNatureandNaturalResources)红色名录列为极度濒危(Criticalendangered,CR)物种。因此，开展达氏鲟种质资源保护技术的研究，对于保护达氏鲟物种资源，对于品种的开发利用等都有重要的意义。

2006年，日本学者Okutsu等建立了虹鳟的精原细胞移植技术。将A型精原细胞的一部分移植到腹膜受体虹鳟胚胎，向受体胚胎生殖腺移动，并在其内增殖，然后产生了大量功能性的精子。这些结果在功能上证实鱼精巢中存在精原细胞。此外，Okutsu还发现精原细胞合并到雌鱼卵巢中，分化为功能齐全的卵，表明整合的精原细胞具有双性潜能。最后，正常生物个体可以通过来自供体精原细胞形成的配子受精产生。2007年，代理亲鱼技术建立，可将精原细胞异种移植入近缘种。通过这种技术，可将苗种生产昂贵、世代时间长的大型鱼类的精原细胞移植到亲缘关系相近但体型较小，世代时间较短的鱼种中，缩短世代时间。因此达氏鲟精原细胞移植可作为达氏鲟物种保护的对策之一。通过建立一种达氏鲟精原细胞体外培养方法，可使精原细胞长时间在体外扩增和维持，并同时保持其原有的特性，可以保证用于移植的精原细胞长期大量稳定的供应。

目前鱼类精原细胞体外培养研究大多集中在斑马鱼(Daniorerio)(Sakai2002，Kurita2004)青鳉(Oryziaslatipes)(Hong2004)、日本鳗鲡(Anguillajaponica)(Miuraetal.2006，Ozakietal.2006，Ohtaetal.(2007))、红罗非鱼(Oreochromisniloticus)(Lacerda2010)、南亚野鲮(Labeorohita)(Panda2011)、虹鳟(Oncorhynchusmykiss)(Okutsu2007,Shikina2008,2010)等物种上。但目前未发现达氏鲟精原细胞分离培养方法的相关报道。

达氏鲟精原细胞培养液是进行精原细胞长期培养的关键因素之一。本发明提供一种多种成分所组成的适用于达氏鲟精原细胞培养的培养液。这种培养液不含胎牛血清，能够实现达氏鲟精原细胞的长期培养。本发明的培养液可用来建立达氏鲟精原细胞系，用于长期培养达氏鲟精原细胞。本发明还涉及所述的精原细胞培养液在长期保存达氏鲟精原细胞中的用途。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种达氏鲟精原细胞培养液。该培养液特异性的针对精原细胞的培养，使得达氏鲟原代精原细胞在体外生长更容易增殖，为达氏鲟生殖发育研究提供有效的细胞平台。

本发明还有一个目的是提供了一种达氏鲟精原细胞培养液在培养精原细胞中的应用。

本发明解决所述技术问题的方案，包括以下步骤：

一种达氏鲟精原细胞培养液，包括：

其余为SFM培养液；

所述的达氏鲟精原细胞培养液pH为7.7-8.3。

优选的，所述的达氏鲟血清为2龄雄性达氏鲟血清。

一种达氏鲟精原细胞培养液，包括：

其余为SFM培养液；

所述的达氏鲟精原细胞培养液pH为7.8-8.2。

一种达氏鲟精原细胞培养液，包括：

其余为SFM培养液；

所述的达氏鲟精原细胞培养液pH为7.8-8.2。

一种达氏鲟精原细胞培养液，包括：

其余为SFM培养液；

所述的达氏鲟精原细胞培养液pH为7.9-8.1。

一种达氏鲟精原细胞培养液，包括：

其余为SFM培养液；

所述的达氏鲟精原细胞培养液pH为8.0。

以上保存液的pH通过1MNaHCO₃或25mMHEPES调节。

一种达氏鲟精原细胞培养液在培养精原细胞中的应用，包括利用所述的培养液为有效成分制备成达氏鲟精原细胞培养液，或直接将该培养液用于达氏鲟精原细胞的培养。

具体的，将该培养液用于达氏鲟精原细胞的培养步骤包括：

(1)达氏鲟精巢细胞悬液制备：

以下操作均在无菌生物安全柜中进行。

1)清洗干净的达氏鲟精巢组织移到培养皿中，将精巢组织剪碎，以消化液：组织块＝4:1(v/w)的比例添加0.25％胰蛋白酶消化液，20℃培养箱中消化，每30min吹打一次。

2)将步骤1)中的精巢组织消化3h后，加L-15培养基+20％胎牛血清终止消化，40μm滤网过滤。4℃，200g离心5min，L-15培养基+20％胎牛血清重悬。

3)细胞计数，并用台盼蓝：细胞悬液＝1:1(v/v)染色，在显微镜下计算活细胞率后，用L-15+20％胎牛血清以1×10⁵个/ml稀释细胞。

4)将稀释后的细胞悬液接种至细胞培养瓶中，21℃培养箱中培养36h后，用移液管轻轻吹打培养瓶瓶壁，使未贴壁的细胞落下，收集培养液，1000r，室温离心5min。

5)离心后弃上清，用达氏鲟精原细胞培养液重悬细胞，，21℃培养箱中培养。

6)每3d-4d换液一次。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明首次提供了一种专用于达氏鲟精原细胞的培养液，解决了目前达氏鲟精原细胞原代无法大量培养的问题，为达氏鲟生殖发育研究提供有效的细胞平台。

常用的细胞培养基中含有胎牛血清成分，它对维持细胞生长、贴壁、解毒、抑制蛋白酶的活性及维持培养液的酸碱度等都具有重要作用。但是胎牛血清成分复杂、品质不稳定，常影响实验结果的准确性。目前有关精原细胞培养的报道表明，培养基内胎牛血清浓度过高，能显著地促进精巢体细胞的增殖，形成生长优势，从而抑制精原细胞的增殖。本发明提供了一种无胎牛血清、以各种生长因子、非必须氨基酸、丙酮酸钠等添加剂作为替代物，同时辅以少量雄性达氏鲟血清的低血清培养基，可保证精原细胞的大量增殖且精巢细胞增殖率较低。

附图说明

图1为实施例7中原代培养12d的精原细胞。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术，所述试剂或材料，如未特备说明，均来自于商业渠道。

实施例1：

一种达氏鲟精原细胞培养液，包括：

其余为SFM，培养液pH为8.0。

所述的达氏鲟精原细胞培养液的制备方法，包括以下步骤：

1.各成分母液的配置：

(1)10ml500g/LBSA母液(100X)的配置：

用天平精确称取所需0.05gBSA的重量，精确度为0.0001g：

根据公式：量取重量＝配方浓度×BSA母液总体积

将称量好的BSA放入烧杯中，加入6mlSFM基础培养液，使BSA充分溶解，继续加入SFM基础培养液，将溶解后的BSA溶液定容10ml。

(2)10ml200mmol/LL-Glutamine母液(100X)的配置：

用天平精确称取0.3654gL-Glutamine的重量，精确度为0.0001g：

根据公式：量取重量＝配方浓度×L-Glutamine母液总体积

将称量好的L-Glutamine放入烧杯中，加入6mlSFM基础培养液，使L-Glutamine充分溶解，继续加入SFM基础培养液，将溶解后的L-Glutamine溶液定容至10ml。

(3)10ml2g/LL-Lys母液(100X)、10ml2g/LL-Pro母液(100X)、10ml2g/LL-Asp母液(100X)的配置：

用天平精确称取20mgL-Lys，精确度为0.0001g：

根据公式：量取重量＝配方浓度×L-Lys母液总体积

将称量好的L-Lys固体放入烧杯中，加入6mlSFM基础培养液，使其充分溶解，继续加入SFM基础培养液，将溶解后的溶液定容至10ml。

(4)10ml2g/LL-Pro母液(100X)的配置方法同步骤(3)。

(5)10ml2g/LL-Asp母液(100X)的配置方法同步骤(3)。

(4)达氏鲟血清室温静置1h，3000r，4℃离心5min，取上清，0.2μm无菌过滤，分装至2.0ml冻存管中，-20℃保存。

(5)2.5g/LLIF母液(100X)的配置：

在无菌生物安全柜内，根据LIF固体质量，用移液枪精确吸取需配置母液体积的无菌SFM基础培养液溶解LIF，振荡混匀，分装至2.0ml冻存管中，-20℃保存。

(6)2.5g/LGDNF母液(100X)的配置：

在无菌生物安全柜内，根据GDNF固体质量，用移液枪精确吸取需配置母液体积的无菌SFM基础培养液溶解GDNF，振荡混匀，分装至2.0ml冻存管中，-20℃保存。

(7)2.5g/LbFGF母液(100X)的配置：

在无菌生物安全柜内，根据bFGF固体质量，用移液枪精确吸取需配置母液体积的无菌SFM基础培养液溶解bFGF，振荡混匀，分装至2.0ml冻存管中，-20℃保存。

2.50ml细胞培养液的配置：

(1)在无菌的生物安全柜内，用移液枪从各组分母液中精确量取配制细胞培养液所需体积的各组分。量取各组分所需的体积根据细胞培养液配方中各组分的浓度、各组分母液的浓度、以及所需配制的培养液体积，按如下公式计算：

量取体积＝(配方浓度×培养液体积)÷母液浓度

(2)分别精确量取500μl500g/LBSA母液、1mlB27Supplement、500μl200mmol/LL-Glutamine母液、2g/LL-Lys母液、2g/LL-Pro母液、2g/LL-Asp母液各1ml，500μl2.5g/LLIF、500μl2.5g/LGDNF、500μl2.5g/LbFGF，3.5ml达氏鲟血清，青霉素，链霉素及两性霉素B混合均匀，加SFM基础培养液，定容至50ml。

(3)配制好的细胞培养液用0.2μm滤膜过滤除菌。现用现配。

实施例2-6：

一种达氏鲟精原细胞培养液，包括：

所述的达氏鲟血清为2龄雄性达氏鲟血清,其余为SFM培养液。

实施例8：

一种达氏鲟精原细胞培养液在培养精原细胞中的应用，包括

(1)达氏鲟精巢细胞悬液制备：

以下操作均在无菌生物安全柜中进行。

1)清洗干净的达氏鲟精巢组织移到培养皿中，将精巢组织剪碎，以消化液：组织块＝4ml:1g(v/w)的比例添加0.25％胰蛋白酶消化液，20℃培养箱中消化，每30min吹打一次。

4)将稀释后的细胞悬液接种至25cm³细胞培养瓶中(5ml/瓶)，21℃培养箱中培养36h后，用移液管轻轻吹打培养瓶瓶壁，使未贴壁的细胞落下，收集培养液，1000r，室温离心5min。

5)离心后弃上清，用5ml实施例1所述配方制备的达氏鲟精原细胞培养液重悬细胞，加入至新的25cm³细胞培养瓶中，21℃培养箱中培养。

6)每3d-4d换液一次。

6-8天可见呈念珠状精原细胞，13-15天可见精原细胞呈簇状成团生长。

细胞观察鉴定：在10X和20X倒置显微镜下观察细胞，其中精原细胞较大、呈圆形、成团生长，支持细胞呈纤维状，观察后采用标记生殖干细胞的vasa抗体进行鉴定。

通过细胞计数本次消化后所得的细胞数量为3.75×10⁷，接种浓度为5×10⁶/瓶(5ml，1×10⁶个/ml)，7d细胞数量约为9.34×10⁶/瓶，14d细胞数量约为3.14×10⁷/瓶。

培养第13d掺入25μMBrdU标记新增殖细胞，24h免疫组化实验显示掺入BrdU24h后新增殖细胞中带有生殖细胞标记的细胞的比例为85.78％。

Claims

1.一种达氏鲟精原细胞培养液，包括：

其余为培养液；

所述的达氏鲟精原细胞培养液pH为7.7-8.3。

2.一种达氏鲟精原细胞培养液，包括：

其余为培养液；

所述的达氏鲟精原细胞培养液pH为7.8-8.2。

3.一种达氏鲟精原细胞培养液，包括：

其余为培养液；

所述的达氏鲟精原细胞培养液pH为7.8-8.2。

4.一种达氏鲟精原细胞培养液，包括：

其余为培养液

所述的达氏鲟精原细胞培养液pH为7.9-8.1。

5.一种达氏鲟精原细胞培养液，包括：

其余为培养液；

所述的达氏鲟精原细胞培养液pH为8.0。

6.权利要求1所述的达氏鲟精原细胞培养液在培养达氏鲟精原细胞中的应用。

7.权利要求1所述的达氏鲟精原细胞培养液为有效成分在制备达氏鲟精原细胞培养液中的应用。