CN115747140A

CN115747140A - 一种诱导鸡胚胎干细胞分化生成原始生殖细胞的方法

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Publication number: CN115747140A
Application number: CN202211487333.2A
Authority: CN
Inventors: 左其生; 赵娟娟; 李碧春; 丁颖; 邹艺琛; 靳锴
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2022-11-25
Filing date: 2022-11-25
Publication date: 2023-03-07

Abstract

一种诱导鸡胚胎干细胞分化生成原始生殖细胞的方法，属于生物技术领域。其特征是，鸡胚胎干细胞分离培养后，采用诱导培养基，至诱导分化后，收集细胞。本发明提供的方法和诱导培养基可以将鸡胚胎干细胞诱导分化为原始生殖细胞，质量稳定，安全性高，为研究鸡胚原始生殖细胞的发生机制提供理论基础，为组织工程、药物开发和细胞治疗提供大量的细胞来源，为基因修饰、基因打靶、基因敲除、基因转染及生产转基因动物奠定实验基础。

Description

一种诱导鸡胚胎干细胞分化生成原始生殖细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种诱导鸡胚胎干细胞分化生成原始生殖细胞的方法，属于生物技术领域。

背景技术

原始生殖细胞(PGCs)是一类多能干细胞，起源于早期囊胚，是配子的前体细胞，负责世代间遗传信息的传递。研究发现禽类PGCs与哺乳动物发育过程完全不同，鸡PGCs具有独特的迁移规律，使其不仅在家禽品种保护、转基因动物的研究、育种等方面具有广泛的应用前景，还能够为禽类胚胎发生、细胞分化机制、发育相关调控基因等相关研究提供模型。

但是，目前鸡PGCs在胚胎中的起源及特化机制仍不清楚，其在体外培养扩增存在较大难度，这也一直是其应用于生殖技术或医学相关研究的主要障碍。所以，寻找影响鸡胚PGCs形成的因素和调控机制成为科学家们亟需解决的问题。另一方面，鸡胚胎干细胞(Embryonic stem cells，ESC)具有自我更新和无限增殖的能力，能分化为包括PGCs在内的几乎所有类型的细胞，为研究生殖细胞发育提供了有效的体外模型。

已有研究表明在小鼠中小鼠胚胎干细胞(mESCs)能够被诱导分化形成小鼠原始生殖细胞样细胞(mPGCLC)，而关于鸡胚胎干细胞诱导成原始生殖细胞的方法没有详细报道，也没有得到系统的优化，这就限制了对鸡胚胎干细胞的分化及PGCs的研究，需要进一步的优化和改进。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简便、可重复性强，在体外将鸡胚胎干细胞诱导分化形成原始生殖细胞的方法，从而为研究鸡胚原始生殖细胞的发生机制提供理论基础。

本发明的技术方案如下：

1、一种诱导鸡胚胎干细胞分化生成原始生殖细胞的方法，包括：

(1)鸡胚胎干细胞的分离培养

对X期胚蛋进行消毒，取出胚盘，PBS(磷酸盐缓冲盐溶液)清洗，吹散后收集细胞，400目滤布过滤，计数后接种到60mm细胞皿中差速过夜，收集上清接种鼠尾胶原包被的24孔板中培养。

(2)鸡胚胎干细胞诱导形成鸡胚原始生殖细胞

鸡胚胎干细胞培养48h后，将原有基础培养基更换为诱导培养基，每孔每两天弃掉200ul诱导培养基，并添加300ul新鲜诱导培养基，至诱导分化至8天后，收集细胞进行间接免疫荧光(CVH)鉴定。

其中，基础培养基配方：knockoutDMEM、15％KSR(KnockOut血清替代物，体积百分比)、100IU/ml青霉素、100ug/ml链霉素、2mmol/L GlutaMAX(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液)、40ng/ml SCF(造血细胞因子)、40ng/ml LIF(白血病抑制因子)、40ng/ml FGF2(碱性成纤维细胞生长因子)、2％的鸡血清(体积百分比)、1mmol/L丙酮酸钠、5.5X10-5mol/Lβ-巯基乙醇、10ul/ml非必需氨基酸。

诱导培养基配方：knockout DMEM、10％KSR(体积百分比)、100IU/ml青霉素、100ug/ml链霉素、2mmol/L GlutaMAX、40ng/ml BMP4(骨形态发生蛋白4)、40ng/ml BMP8b(骨形态发生蛋白8b)、40ng/ml EGF(上皮生长因子)、2％的鸡血清(体积百分比)、1mmol/L丙酮酸钠、5.5X10-5mol/Lβ-巯基乙醇、10ul/ml非必需氨基酸。

2、鸡胚原始生殖细胞的检测

(1)实时荧光定量PCR检测

收集诱导分化第8天形成的细胞，以PGCs作为阳性对照。提取待测细胞的基因组DNA并以其作为模板，实时荧光定量PCR检测PGC特异表达基因(CXCR4、BLIMP1、CVH、CKIT)的相对表达量(以β-actin基因为内参基因)。

(2)间接免疫荧光

收集诱导分化第8天形成的细胞，用4％多聚甲醛固定(体积百分比)，之后用CVH相关抗体进行免疫荧光染色，在荧光显微镜下观察荧光。

(3)流式细胞分析

收集诱导分化第8天形成的细胞，胰酶消化成单细胞，之后进行CVH抗体染色标记，通过流式细胞术进行CVH阳性细胞比例的分析。

3、有益效果

1)本发明提供的诱导培养基可以有效的将鸡胚胎干细胞诱导分化为原始生殖细胞，其主要成分为BMP4因子。BMP4是一种多功能细胞因子，属于转化生长因子TGF-β家族，由早期胚胎的外胚层释放，对生殖细胞的发育起着重要作用。

前期研究表明BMP4能够调控鸡PGCs的形成。为此，本发明利用BMP4，通过与BMP8b及EGF来联合在体外诱导鸡ESCs分化形成PGCs，成分清楚，易获得，可重复性强，能够为体外研究鸡PGCs的发育过程奠定基础，生殖细胞发育的研究提供了有效的体外研究模型。

2)本发明提供的方法可以将鸡胚胎干细胞诱导分化为原始生殖细胞，质量稳定，安全性高，为组织工程、药物开发和细胞治疗提供大量的细胞来源，为基因修饰、基因打靶、基因敲除、基因转染及生产转基因动物奠定实验基础。

3)本发明中制备鸡胚原始生殖细胞的方法操作简单，分析流程清晰，且可行性高，也可以应用于其他禽类研究中，具有广泛的应用前景和很好的推广价值。

附图说明

图1是鸡胚胎干细胞培养48h形成的克隆形态；

图2是从鸡胚胎干细胞诱导分化得到的PGCLCs的形态；

图3为实时荧光定量PCR检测PGCs特异表达基因的相对表达量；

图4是从鸡胚胎干细胞诱导分化得到的PGCLCs间接免疫荧光染色结果；

图5是从鸡胚胎干细胞诱导分化得到的PGCLCs流式分析结果。

具体实施方式

实施例1

一种诱导鸡胚胎干细胞分化生成原始生殖细胞的方法，包括：

1、鸡胚胎干细胞的分离培养

(1)本实施例中采用如皋黄鸡进行胚胎干细胞分离；

(2)消毒：取新鲜受精蛋，使用1％新洁尔灭清洗蛋壳(体积百分比)，再用75％酒精(体积百分比)擦拭蛋壳表明进行消毒；

(3)用镊子敲开种蛋露出卵黄，用药勺拨动卵黄找到胚盘位置；用镊子在胚盘周围剪开，用镊子取出带有胚盘的卵黄膜放入含有PBS(磷酸盐缓冲盐溶液)的培养皿中，轻轻的晃动使得胚盘脱落；

(4)在PBS中清洗后将胚盘收集干净的离心管中，用400目滤布过滤，滤液离心去除上清；

(5)细胞沉淀使用基础培养基进行重悬，接种至培养皿中，差速24h后收集上清；

使用细胞计数仪对细胞进行计数，以5×105个/ml的密度接种到明胶包被好的24孔板中，置于37℃，5％CO₂(体积百分比)的细胞培养箱中进行培养。

基础培养基成分包括：

knockout DMEM、15％KSR、100IU/ml青霉素、100ug/ml链霉素、2mmol/L GlutaMAX、40ng/ml SCF、40ng/ml LIF、40ng/ml FGF2、2％的鸡血清、1mmol/L丙酮酸钠、5.5X10-5mol/Lβ-巯基乙醇、10ul/ml非必需氨基酸。

2、鸡胚胎干细胞诱导形成原始生殖细胞

鸡胚胎干细胞在培养48h后，形成边缘清晰，鸟巢状克隆(如图1所示)，将原有培养基更换为诱导培养基，诱导培养基成分包括：

knockout DMEM、10％KSR、100IU/ml青霉素、100ug/ml链霉素、2mmol/L GlutaMAX、40ng/ml BMP4、40ng/ml BMP8b、40ng/ml EGF、2％的鸡血清、1mmol/L丙酮酸钠、5.5X10-5mol/Lβ-巯基乙醇、10ul/ml非必需氨基酸；

每孔每两天弃掉200ul诱导培养基，并添加300ul新鲜诱导培养基，至诱导分化至8天后，细胞形态如图2所示，收集细胞进行下一步的检测。

实施例2

在实施例1基础上，检测鸡胚胎干细胞诱导形成的原始生殖细胞：

1、实时荧光定量PCR检测

收集诱导第8天形成的细胞，以PGCs作为阳性对照。提取细胞RNA，反转录为cDNA，并以其作为模板，实时荧光定量PCR检测PGC特异表达基因(CXCR4、Blimp1、Cvh、Ckit)的相对表达量(以β-actin基因为内参基因)。引物序列如表1所示：

表1 PCR检测PGC特异表达基因引物序列表

引物名称	F(上游引物)	R(下游引物)
			β-actin	CAGCCATCTTTCTTGGGTAT	CTGTGATCTCCTTCTGCATCC
CXCR4	GCCCTTGCGTTCTTCCATTG	TCCCCCACGTTTGCTTTTTG
			Dazl	CAGCCTAGACCATIGGCTTT	ATTGAGTCACAAAGTTAGGC
Cvh	AGGAGGACTGGGACACG	TGCCACGCAGAGGACTA
			Ckit	TGAGGCGGAAGCGAGAT	CTTCACAGGGAGACGAG

检测结果见图3。结果表明，诱导第8天收集的细胞表达PGCs的标记基因CXCR4、DAZL、CVH、CKIT。

②间接免疫荧光检测

收集诱导第8天形成的细胞，以PGCs作为阳性对照。离心后弃掉培养基。加入PBS清洗后，离心后弃上清，用4％多聚甲醛重悬沉淀(体积百分比)，固定30min，固定结束后离心去上清，加入PBST清洗，再加入0.5％的TritonX-100(PBS稀释，体积百分比)，室温透膜15min。

离心后弃上清，加入10％FBS-PBS(体积百分比)室温封闭2h。离心后弃掉封闭液，加入稀释后的一抗(抗体稀释液稀释)，4℃过夜。PBST清洗一抗，离心后弃上清，加入二抗，避光孵育2h。

孵育结束后清洗二抗，再加入DAPI避光染色10min，加入PBST清洗后，用PBS重悬细胞沉淀，滴片。滴加抗荧光淬灭剂，盖上盖玻片后，中性树脂封片，避光晾干。

结果如图4所示，诱导分化至第8天的的细胞表达PGCs相关基因VASA。

③流式细胞分析

收集诱导第8天形成的细胞，离心后弃掉培养基。加入PBS清洗后，离心后弃上清，加入PBST清洗，再加入0.5％的TritonX-100(PBS稀释)，室温透膜15min。离心后弃上清，加入10％FBS-PBS室温封闭2h。

离心后弃掉封闭液，加入稀释后的一抗(抗体稀释液稀释)，4℃过夜。PBST清洗一抗，离心后弃上清，加入二抗，避光孵育2h。孵育结束后清洗二抗，流式上机操作，进行阳性细胞比例分析。结果如图5所示，鸡PGCs相关的蛋白Cvh阳性细胞比例高达32.6％。

Claims

1.一种诱导鸡胚胎干细胞分化生成原始生殖细胞的方法，其特征是，鸡胚胎干细胞分离培养后，采用诱导培养基，至诱导分化后，收集细胞；所述诱导培养基包括：

knockout DMEM、KSR、青霉素、链霉素、GlutaMAX、BMP4、BMP8b、EGF、鸡血清、丙酮酸钠、β-巯基乙醇、非必需氨基酸。

2. 根据权利要求1所述的一种诱导鸡胚胎干细胞分化生成原始生殖细胞的方法，其特征是，所述KSR为10％ KSR；所述青霉素为100IU/ml青霉素；所述链霉素为100ug/ml链霉素；所述GlutaMAX为2 mmol/L GlutaMAX；所述BMP4为40ng/ml BMP4；

所述BMP8b 为40ng/ml BMP8b；所述EGF 为40ng/ml EGF；所述鸡血清为2%的鸡血清；所述丙酮酸钠为1 mmol/L丙酮酸钠；所述β-巯基乙醇为5. 5X10-5mol/L β-巯基乙醇；所述非必需氨基酸为10ul/ml非必需氨基酸。

3.根据权利要求1所述的一种诱导鸡胚胎干细胞分化生成原始生殖细胞的方法，其特征是，所述鸡胚胎干细胞的分离培养，包括：

对X期胚蛋依次进行：消毒、取出胚盘、PBS清洗、吹散后收集细胞、400目滤布过滤、计数后接种到60mm细胞皿中差速过夜，收集上清接种鼠尾胶原包被的24孔板中培养。

4.根据权利要求3所述的一种诱导鸡胚胎干细胞分化生成原始生殖细胞的方法，其特征是，鸡胚胎干细胞的分离培养，所采用的基础培养基配方：

knockout DMEM、15％KSR、100IU/ml青霉素、100ug/ml链霉素、2 mmol/L GlutaMAX、40ng/ml SCF、40ng/ml LIF、40ng/ml FGF2、2%的鸡血清、1 mmol/L丙酮酸钠、5. 5X10^-5mol/L β-巯基乙醇、10ul/ml非必需氨基酸。

5.根据权利要求2或4所述的一种诱导鸡胚胎干细胞分化生成原始生殖细胞的方法，其特征是，将鸡胚胎干细胞培养48h。

6.根据权利要求5所述的一种诱导鸡胚胎干细胞分化生成原始生殖细胞的方法，其特征是，采用诱导培养基后，每孔每两天弃掉200ul诱导培养基，并添加300ul新鲜诱导培养基。

7.根据权利要求6所述的一种诱导鸡胚胎干细胞分化生成原始生殖细胞的方法，其特征是，诱导分化至8天后收集细胞。