CN116286612A - 以mTOR、SMAD信号通路和p53基因为靶点在提高鸡PGCs体外建系效率中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以mTOR、SMAD信号通路和p53基因为靶点在提高鸡PGCs体外建系效率中的应用，属于鸡原始生殖细胞体外建系技术领域，本发明发现mTOR、SMAD信号通路和p53基因与鸡PGCs体外建系效率相关，并以此为基础开发了组合物，可以显著提高鸡PGCs的体外建系效率。

Description

以mTOR、SMAD信号通路和p53基因为靶点在提高鸡PGCs体外建 系效率中的应用

技术领域

本发明涉及鸡原始生殖细胞体外建系技术领域，更具体地说是涉及以mTOR、SMAD信号通路和p53基因为靶点在提高鸡PGCs体外建系效率中的应用。

背景技术

不同于哺乳动物利用体细胞核移植技术和胚胎移植技术获得基因修饰动物，原始生殖细胞(Primordial Germ Cells，PGCs)是目前家禽中最理想的可以结合CRISPR/Cas9开展基因组编辑的技术，并有望成为通用的家禽离体保种技术。

PGCs是精原细胞和卵原细胞的祖先细胞，可以将遗传物质传递给下一代。在以鸡PGCs为载体进行基因操作过程中面临一些难题，如主流的培养体系--有饲养层、有血清和条件培养基，该体系下PGCs体外建系难度大，总体建系成功率4～25％，大部分文献报道在10％左右，阻碍了鸡遗传修饰技术的发展。

近年来，随着对PGCs调控机制研究的加深，鸡PGCs体外培养体系得到了进一步优化。bFGF通过激活MEK/ERK信号通路来促进鸡PGCs的体外扩增。最新研究表明FGF、Insulin和SMAD信号通路可以维持禽类PGCs体外自我更新，在主流培养体系--有饲养层有血清培养基上添加生长因子ActivinA，并用胰岛素或IGF-1代替生长因子SCF，分离的26枚雄性鸡胚中有8枚建系成功，雄性成功率为31％。同时，他们提出了以生长因子FGF2、ActivinA和胰岛素为核心的无饲养层无血清培养体系，显著提高了鸡PGCs的体外建系效率，雄性建系成功率最高为61％。但在该培养体系并不是主流培养体系，用到的试剂十多种，配置非常复杂且不稳定，在不同实验室结果差异大，对细胞培养人员要求高，而且该体系下进行的基因操作，获得供体鸡后代的效率也很低，而用于分离鸭PGCs进行体外培养只能维持1个月。

因此，发现与鸡PGCs体外建系相关的信号通路和基因，并以mTOR、SMAD信号通路和p53基因为靶点提高鸡PGCs体外建系效率是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明发现mTOR、SMAD信号通路和p53基因与鸡PGCs体外建系效率相关，并以此为基础开发了组合物，可以显著提高鸡PGCs的体外建系效率。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

以mTOR、SMAD信号通路和p53基因为靶点在提高鸡PGCs体外建系效率中的应用。

作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种同时促进mTOR、SMAD信号通路表达，且抑制p53基因表达的组合物在提高鸡PGCs体外建系效率中的应用。

作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种提高鸡PGCs体外建系效率的组合物，包括：基础培养液、XAV-939、Y-27632、ActivinA、SF1670、白藜芦醇和p53-Snail抑制剂。

优选地，各组分的终浓度分别为XAV-93910μM、Y-276325μM、ActivinA20ng/μL、SF16705μM、白藜芦醇15μM、p53-Snail结合抑制剂5μM。

优选地，所述基础培养液包括：50％KO-DMEM、36％BRL条件培养液、7.5％胎牛血清、2.5％鸡血清、1％非必需氨基酸、1％GlutaMAXTM、1％青霉素和链霉素、0.1mmol/Lβ-巯基乙醇、8ng/μL重组人碱性成纤维细胞生长因子、12ng/μL人干细胞因子。

经由上述的技术方案可知，与现有技术(分离和维持小鼠滋养层干细胞的培养体系中含有20ng/ml Activin A、10nM XAV939和5nM Y27632)相比，本发明发现，含有20ng/mlActivinA、5μM XAV939和5μM Y27632的培养体系可以显著提高鸡PGCs体外扩增效率，成功建系平均时间由29天降低到23天，但其建系成功率没有显著变化。又因，白藜芦醇是一种天然多酚小分子化合物，可以提高体细胞重编程为iPSC的效率，还可以降低作用于乙酰化底物和NAD+的SIRT1的Michaelis常数，通过促进SIRT1依赖性的p53脱乙酰作用增加细胞存活。p53基因的敲除或抑制，可以显著提高小鼠单倍体胚胎干细胞的建系效率。肿瘤抑制因子Pten的缺失可以维持胚胎干细胞的多能性并调节分化，而Pten抑制剂SF1670有助于胚胎干细胞多能性的维持。PGCs体外建系的过程是PGCs在维持多能性的同时获得了几乎无限的增殖能力，即自我更新。因此，在上述培养体系中添加5μMp53抑制剂、5μM SF1670和15μM白藜芦醇，建系所需时间最短、建系成功率最高，成功建系平均时间由23天降低到15天，雄性PGCs建系成功率由25％提高到57％以上。其机理可能是SF1670通过抑制Pten增强了mTOR等因子活性，白藜芦醇和p53抑制剂共同作用于p53基因，它们联合使用提高了鸡PGCs的建系效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为不同培养体系分离培养鸡PGCs形态观察图；A，建系不成功的B组PGCs体外培养7天后死亡；B，建系成功的B组PGCs体外培养7天的形态；C，建系成功的C组PGCs体外培养7天的形态；D，建系成功的C组PGCs体外培养15天的形态，黄色细箭头代表透明状且变大的PGCs，红色粗箭头代表边缘破裂并结团的PGCs，A、B、C图标尺为50μm,D图标尺为100μm；

图2附图为将荧光标记的PGCs转化至受体鸡中，分离鸡胚性腺的观察结果和PCR结果图；A为免疫荧光法观察C组的PGCs检测到生殖细胞表面标志蛋白SSEA-1的表达；B为PCR结果显示，建系成功的鸡PGCs均为雄性；C为红色标记PGCs注射到2.5胚龄鸡胚，继续孵化6天后分离性腺观察到PGCs可以在体内继续发育。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例记载了不同的组合物对于鸡PGCs体外建系的影响，其中用到的材料如下：

种蛋来源于广东省农业科学院动物科学研究所原种鸡场，在38.5℃、相对湿度60％孵化至所需日龄。小分子化合物XAV-939、Y-27632和SF1670购自selleck公司。HumanActivinA购自PeproTech公司。p53-Snail结合抑制剂、白藜芦醇、PKH26、β-巯基乙醇和秋水仙素购自sigma公司；基础培养液KO-DMEM、PBS溶液、胎牛血清、鸡血清、非必需氨基酸、GlutaMAXTM、丙酮酸钠、B27补充液、氨基酸溶液、Trypsin以及人激活素A购自Gibco公司；rmSCF和rhFGF购自R&D systems公司，大鼠肝细胞(BRL)细胞系购自ATCC公司；HotShot裂解液和中和液购自天根生化科技(北京)有限公司。

实施例1BRL饲养层的制备

复苏BRL在37℃、5％CO₂条件下培养至细胞密度为90％以上，用2mL浓度为0.01ng/mL的胰酶消化细胞5min，1000g/min离心5min，收集细胞，钴源160gray/min辐射12min，即得到BRL饲养层。

实施例2BRL条件培养液的制备

复苏BRL细胞到10cm细胞培养皿中，37℃、5％CO₂条件下培养箱培养9天，每3天收一次液，培养体系为：体积比为89％的KO-DMEM、体积比为10％的胎牛血清和体积比为1％的GlutaMAXTM。收集的上清液混合后，即为BRL条件培养液。

实施例37天龄胡须鸡胚PGCs的分离

准备孵育至7天的胡须鸡种蛋若干，灭菌处理过的5号手术镊子、普通镊子等，提前开紫外照射细胞房30min。用酒精棉球擦拭种蛋尖端，普通镊子敲开一个口子，用镊子小心将胚胎取出，放置于装有PBS溶液的培养皿中，除去胚胎表面的蛋黄颗粒。将清洗好的胚胎转移至新的PBS溶液中，用镊子将腹部剖开，找到中肾上的一对白色透明的性腺组织。轻轻将一对性腺从中肾上剥离并转移至装有300ul PBS溶液的1.5ml离心管中，加入100ul的0.25％Trypsin/EDTA溶液放置于37℃培养箱中消化15min。加入400ul培养液中和，之后500g常温离心5min，弃掉上清；用300ul的PGCs培养基重悬细胞沉淀，转移至48孔板放置3～4小时，之后将上清转至饲养层细胞上进行培养。

鸡胚性别鉴定

分离鸡胚性腺过程中，收集鸡胚组织抽提DNA跑PCR进行性别鉴定。引物为5’-GTTACTGATTCGTCTACGAGA-3’和5’-ATTGAAATGATCCAGTGCTTG-3’，分别如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示；PCR程序为：94℃5min，之后30个循环(94℃30s,57℃45s,72℃30s)，最后72℃延伸5min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳。

试验分组

将分离的鸡PGCs随机分组：A组为对照组，试验全程用鸡PGCs基础培养液；B组试验全程在鸡PGCs基础培养液上添加10μM XAV-939、5μMY-27632和20ng/μL Human Activin A；C组试验全程在B组基础上添加5μMSF1670、15μM白藜芦醇和5μM p53-Snail结合抑制剂。

鸡PGCs基础培养液中含50％KO-DMEM、36％BRL条件培养液、7.5％胎牛血清(FBS)、2.5％鸡血清、1％非必需氨基酸、1％GlutaMAXTM、1％青霉素和链霉素、0.1mmol/Lβ-巯基乙醇、8ng/μL重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhFGF)、12ng/μL人干细胞因子(human SCF)。培养箱条件37℃、5％CO₂。细胞每2天半量换液1次，每3-4天传代1次。转移到T25后，细胞每3～4天离心去掉上清换新液传代1次。

各组建系的结果见图1。可知，A和B组建系不成功的鸡PGCs大量呈现出细胞边缘破裂并结团、少量呈现透明状并变大的现象，结团细胞用移液枪吹打也不会散开，最终团状物变黑贴到饲养层上死掉(图1A)。A和B组建系成功的鸡PGCs也会出现这种情况，但是结团细胞和透明状细胞比较少，而且成串的细胞比较少，通常呈现单个或两个连到一起(图1B)，体外培养20天左右，几乎所有的结团细胞贴壁死掉，符合鸡PGCs形态特征的细胞(又大又圆、边缘光亮)则持续增殖。C组鸡PGCs也会出现上述情况，但是相对于结团细胞，单个或两个细胞的数量更多，而且几乎没有透明状细胞(图1C)；体外培养15天左右，C组几乎观察不到结团现象(图1D)。

然后进行PCR鉴定性别，收集1×10⁵个PGCs，用HotShot裂解液和中和液处理后对PCR进行性别鉴定。性别鉴定引物为5’-GTTACTGATTCGTCTA CGAGA-3’和5’-ATTGAAATGATCCAGTGCTTG-3’，PCR程序为：94℃5min，之后30个循环(94℃30s,57℃45s,72℃30s)，最后72℃延伸5min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳。见图2B。

鸡PGCs的鉴定体外培养60天以上的PGCs离心去掉上清后，转移到24孔板中用4％多聚甲醛固定10min。用PBS洗涤3次、每次5min(以下PBS洗涤均如此)，再用0.5％Triton X-100通透5min。PBS洗涤，然后用含1％(v/v)BSA的PBS封闭液固定细胞45min。PBS洗涤，在4℃的湿盒内与一抗SSEA-1(1：50)或DAZL(1：200)孵育过夜。PBS洗涤，孵育二抗(1：400)。PBS洗涤后，用DAPI复染细胞核，晾干后滴加DAPI染液，室温避光孵育10min。最后通过共聚焦显微镜进行分析，表达SSEA-1蛋白可以表明该细胞为鸡PGCs。见图2A。

不同培养体系分离培养鸡PGCs所需时间及建系成功率见表1。来源于单个胚胎的PGCs转移到1个6孔板，细胞量约1.0×10⁵，之后均能继续扩增到T25和T75皿，被认为已成功建立了品系。可知，C组建系成功率最高，总体建系成功率为31％，雄性建系成功率57％，建系时间在12～18天。

表1不同培养体系分离培养鸡PGCs所需时间及建系成功率统计

实施例4验证建系成功后的鸡PGCs注射回体内继续分化的能力

PKH26对鸡PGCs的标记

操作过程均在室温下进行。提前配置1％BSA溶液，并过滤。鸡PGCs传到T75细胞培养瓶3天后，500g/min离心5min，收集鸡PGCs，细胞密度为1×10⁶。无血清培养基清洗1次，再次离心5min，吸去上清液，剩余液体不超过25μL。加入250μL稀释液C，用移液管轻轻吹打混匀，制备2×细胞悬液。配置染色液，将1μL PKH26乙醇溶液加入250μL稀释液C。快速将2×细胞悬液加入染色液中，并立即用移液管混匀，孵育2min。加入等体积1％BSA 500μL，终止反应，并孵育1min以结合多余的染料。500g/min离心5min，小心吸弃上清，细胞团转入新试管，用PBS清洗3次。加入PBS，重悬细胞到所需浓度，吸取少量细胞置于荧光显微镜下观察PGCs是否含有标记荧光，细胞膜呈红色荧光为标记成功。

红色标记鸡PGCs移植受体鸡

用拉针仪、断针仪和磨针仪制备显微注射针(注射针直径25-30μm，针尖30°斜面)。取所需红色荧光标记PGCs加入10％台盼蓝，混匀。取2～2.5天龄鸡胚，鸡蛋尖端处开壳0.5～1cm，在体视显微镜下找到鸡胚背主动脉，针斜面向下，沿着血流方向轻轻吹入3μL、含有约2000～3000个PGCs的溶液。在开口周围涂上蛋清，用膜封好开口，待蛋清干了之后，放入孵化箱继续孵化。继续孵化5天后取出活胚，在体视显微镜下用镊子分离鸡胚性腺，置于滴有80μL PBS的载玻片上，倒置荧光显微镜下观察并拍照。见图2c。

实施例56天龄清远鸡胚PGCs的分离

准备孵育至6天的清远鸡种蛋若干，灭菌处理过的5号手术镊子、普通镊子等，提前开紫外照射细胞房30min。用酒精棉球擦拭种蛋尖端，普通镊子敲开一个口子，用镊子小心将胚胎取出，放置于装有PBS溶液的培养皿中，除去胚胎表面的蛋黄颗粒。将清洗好的胚胎转移至新的PBS溶液中，用镊子将腹部剖开，找到中肾上的一对白色透明的性腺组织。轻轻将一对性腺从中肾上剥离并转移至装有300ul PBS溶液的1.5ml离心管中，加入100ul的0.25％Trypsin/EDTA溶液放置于37℃培养箱中消化15min。加入400ul培养液中和，之后500g常温离心5min，弃掉上清；用300ul的PGCs培养基重悬细胞沉淀，转移至48孔板放置3～4小时，之后将上清转至饲养层细胞上进行培养。培养体系为实施例3中试验C组：50％KO-DMEM、36％BRL条件培养液、7.5％胎牛血清(FBS)、2.5％鸡血清、1％非必需氨基酸、1％GlutaMAXTM、1％青霉素和链霉素、0.1mmol/Lβ-巯基乙醇、8ng/μL重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhFGF)、12ng/μL人干细胞因子(human SCF)、10μM XAV-939、5μM Y-27632和20ng/μL Human Activin A、5μM SF1670、15μM白藜芦醇和5μM p53-Snail结合抑制剂。分离鸡胚性腺过程中，收集鸡胚组织抽提DNA跑PCR进行性别鉴定。培养箱条件37℃、5％CO₂。细胞每2天半量换液1次，每3-4天传代1次。转移到T25后，细胞每3～4天离心去掉上清换新液传代1次。

本次试验成功分离到12枚鸡胚性腺，7枚雌性，5枚雄性，其中3枚雄性建系成功，雄性建系成功率60％，培养至1孔/6孔板的时间分别为14、15和19。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (5)

1.以mTOR、SMAD信号通路和p53基因为靶点在提高鸡PGCs体外建系效率中的应用。

2.一种同时促进mTOR、SMAD信号通路表达，且抑制p53基因表达的组合物在提高鸡PGCs体外建系效率中的应用。

3.一种提高鸡PGCs体外建系效率的组合物，其特征在于，包括：基础培养液、XAV-939、Y-27632、ActivinA、SF1670、白藜芦醇和p53-Snail抑制剂。

4.根据权利要求3所述的一种提高鸡PGCs体外建系效率的组合物，其特征在于，各组分的终浓度分别为XAV-93910μM、Y-276325μM、ActivinA20ng/μL、SF16705μM、白藜芦醇15μM、p53-Snail结合抑制剂5μM。

5.根据权利要求3所述的一种提高鸡PGCs体外建系效率的组合物，其特征在于，所述基础培养液包括：50％KO-DMEM、36％BRL条件培养液、7.5％胎牛血清、2.5％鸡血清、1％非必需氨基酸、1％GlutaMAXTM、1％青霉素和链霉素、0.1mmol/Lβ-巯基乙醇、8ng/μL重组人碱性成纤维细胞生长因子、12ng/μL人干细胞因子。

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