KR101631172B1

KR101631172B1 - 정원줄기세포를 영양세포 없이 배양하는 방법

Info

Publication number: KR101631172B1
Application number: KR1020140034632A
Authority: KR
Inventors: 고기남; 최나영; 고기성
Original assignee: 건국대학교 글로컬산학협력단
Priority date: 2014-03-25
Filing date: 2014-03-25
Publication date: 2016-06-21
Also published as: KR20150111494A

Abstract

본 발명은 정원줄기세포를 배양하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 정원줄기세포를 장기간 체외 배양하는 방법에 관한 것이다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 높은 생물학적 활성 및 기저막과의 유사성을 갖는 마트리겔로 코팅된 플레이트 상에서 피더세포(영양세포) 없이 정원줄기세포를 배양함으로써, 장기간 안정적으로 정원줄기세포를 체외 배양할 수 있을 뿐만 아니라 종래 시간 및 비용이 소요되는 피더세포(영양세포)를 이용한 생식줄기세포 배양법과 달리 배양시간을 감소시키고 높은 세포 증식률을 나타내는 효과가 있다.

Description

정원줄기세포를 영양세포 없이 배양하는 방법{METHOD FOR CULTURING SPERMATOGONIAL STEM CELLS WITHOUT FEEDER CELLS}

본 발명은 정원줄기세포를 영양세포 없이 배양하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 정원줄기세포를 마트리겔(Matrigel)을 이용하여 장기간 체외 배양하는 방법에 관한 것이다.

정원줄기세포(SSCs, spermatogonial stem cells)는 정소에 존재하면서 자가재생능력을 갖고 생식세포를 생산하는 단능성 줄기세포(unipotent stem cells)로서 정자형성(spermatogenesis)에 있어 중요한 기능을 수행한다. 그 명칭에 있어 포유류 암컷에서 이들의 존재 가능성이 제기되어 이와 구분하기 위해 '남성생식선줄기세포'(雄性, 웅성, male germline stem cells)라고도 불리운다.

이 세포는 성체줄기세포 특유의 자가재생능력과 정자세포로의 분화능력을 동시에 가지고 있으나, 고환 내에 아주 극소수가 존재하기 때문에 그 분리와 임상적 이용에 어려움이 많고 체외에서 증식, 배양하는 기술의 확립이 미흡한 문제점이 있다. 이에, SSCs의 새로운 마커 발굴에 의한 효율적인 분리, 최적의 배양 조건, 충분한 양의 체외 증식과 그 유지 방법에 대한 지속적인 노력이 이어져 왔으나, 아직 체외에서의 정자형성은 기술적인 한계가 있다. 특히, 정원줄기세포 분리가 제한적이고 배양시 많은 정원줄기세포가 죽기 때문에 배양이 어려운 문제가 있다. 관련 선행기술로는 한국 공개특허 10-2007-0030774(생식줄기세포의 체외 분리, 증식 및 분화 방법), 한국 등록특허 10-1173116(신규한 돼지 정조줄기세포 분리 및 배양 방법) 등이 있다.

종래 정원줄기세포는 마우스 배아 섬유아세포와 같은 피더세포(feeder cells), 즉 영양세포 존재 하에서 장기간 체외 배양하였으나, 그 증식을 위해 피더세포를 계대배양마다 준비해야 하는 번거로움이 있다. 더욱 구체적으로, 마우스 배아 섬유아세포를 배양하고 미토마이신 C로 유사분열을 불활성화시키는 시간적 및 실험적 소비 과정을 필요로 한다.

SSCs의 활용도는 남성의 불임과 질환 치료에 유용하게 활용할 수 있고, 생식선 줄기세포의 속성을 이용해 다음 세대에 유전자를 전달하는 도구로써 가축 개량이나 이종간 장기의 형질전환 연구에 응용될 수 있다. 유전자 질환에 기인하는 남성 불임의 경우 불임환자의 정소를 체검하여 SSCs를 분리 및 체외 배양한 후에 유전자 요법에 의한 교정된 SSCs를 다시 환자에 이식함으로써 정상적인 정자의 생산과 그 기능을 기대할 수 있고, 항암요법으로 손상될 위험이 있는 SSCs는 미리 보관하여 추후의 불임 위험으로부터 대처할 수 있다.

본 발명의 목적은 별도의 피더세포(영양세포)를 준비해야 하는 과정 없이 높은 증식률과 효율성을 갖고 안정적으로 정원줄기세포를 장기간 체외 배양하는 방법을 제공함에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 마트리겔(Matrigel)로 코팅된 배양접시에서 정원줄기세포를 영양세포 없이 배양하는 방법을 제공한다.

상기 방법은 (1) 정소조직을 수득하여 정소세포를 분리하는 단계; (2) 상기 분리한 정소세포로부터 정원줄기세포를 동정하는 단계; 및 (3) 상기 동정한 정원줄기세포를 피더세포(feeder cells)가 없는 마트리겔(Matrigel)로 코팅된 배양접시에서 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 (1)단계에서 정소세포는 수득한 정소조직에 콜라게나제, DNAse, 트립신 억제제 및 히알루로니다제를 첨가하고 30 내지 40 ℃에서 5 내지 10분간 1차 처리한 후, 콜라게나제, DNAse 및 트립신 억제제를 첨가하고 30 내지 40 ℃에서 5 내지 10분간 2차 처리하여 분리한 것을 특징으로 한다.

상기 (2)단계에서 정원줄기세포는 분리한 정소세포를 정원줄기세포 배양 배지가 구축된 젤라틴이 코팅된 배양접시에서 배양하여 형성된 정원줄기세포 콜로니로부터 동정한 것을 특징으로 한다.

상기 (3)단계에서 마트리겔은 섬유아세포 성장인자-1(FGF-1), FGF-2(bFGF), FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, 표피세포 성장인자(EGF), 케라티노사이트 성장인자(KGF), 헤파토사이트 성장인자(HGF), 형질전환 성장인자(TGF-α), TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, 혈소판 유래 성장인자(PDGF), 엔지오포이에틴 1, 엔지오포이에틴 2, 에리트로포이에틴, 뉴로필린, 인슐린 성장인자-1(IGF-1), 오스테오폰틴, 플레이오트로핀, 액티빈, 엔도텔린-1 및 혈관내피 성장인자(VEGF)로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 세포성장인자를 함유하는 것을 특징으로 한다.

상기 (3)단계에서 마트리겔로 코팅된 배양접시는 DMEM/F12 전체 100 부피부에 대하여 마트리겔이 0.02 내지 1.05의 부피부로 혼합된 마트리겔 용액을 배양접시에 도포하고, 상기 배양접시를 2 내지 25 ℃에서 40분 내지 15시간 동안 보관한 후, 잔재하는 마트리겔 용액을 제거하여 제조된 것을 특징으로 한다.

상기와 같은 본 발명에 따르면, 높은 생물학적 활성 및 기저막과의 유사성을 갖는 마트리겔로 코팅된 플레이트 상에서 피더세포(영양세포) 없이 정원줄기세포를 배양함으로써, 장기간 안정적으로 정원줄기세포를 체외 배양할 수 있을 뿐만 아니라 종래 시간 및 비용이 소요되는 피더세포(영양세포)를 이용한 생식줄기세포 배양법과 달리 배양시간을 감소시키고 높은 세포 증식률을 나타내는 효과가 있다.

도 1의 (A), (B)는 미토마이신 C가 처리된 피더세포(영양세포) 상에서 완전하게 구축된 정원줄기세포, (C), (D)는 마트리겔 상에서 배양된 정원줄기세포, (E)는 피더 및 마트리겔 기반의 배양에서 증가된 세포수를 나타내는 그래프로 정원줄기세포를 12-웰 플레이트에 5 × 10⁵세포/웰의 밀도로 도말하고 세포수를 5 일 마다 반복하여 카운트함, (F)는 피더 및 마트리겔 기반의 배양에서 세포 증식률을 나타내는 그래프. (A)와 (C)의 스케일바는 100 μm, (B)와 (D)의 스케일바는 50 μm임.
도 2는 다양한 세포외 매트릭스 상에서의 정원줄기세포수를 비교한 그래프로, 정원줄기세포를 마트리겔, 라미닌 및 젤라틴 상의 12-웰 플레이트에 5 × 10⁵세포/웰의 밀도로 도말하고 계대배양마다 세포수를 카운트함.
도 3의 (A)는 정원줄기세포를 마트리겔 상의 12-웰 플레이트에 다양한 밀도(2 내지 7 × 10⁵세포/웰)로 도말하고 배양 5일 경과 후 분석한 세포 증식률, (B)는 피더 또는 마트리겔 상의 12-웰 플레이트에 존재하는 세포(5 × 10⁵세포/웰) 내 살아있는 세포수 측정 결과(*** : P < 0.0004).
도 4는 마트리겔 상에서 배양된 정원줄기세포의 세포 및 분자적 특성에 관한 것으로, (A)는 정원줄기세포 특이적 유전자 발현에 대한 RT-PCR 분석 결과, (B)는 정원줄기세포 표면 단백질 발현에 대한 FACS 분석 결과를 나타냄. 검은색 라인은 isotype controls, 초록색 라인은 정원줄기세포 표면 단백질을 나타내며 배양된 정원줄기세포는 정원줄기세포 마커 integrin α6(CD49f), integrin β1(CD29), EpCAM(CD326) 및 c-kit(CD117)에 대하여 양성반응을 보임.
도 5는 피더 또는 마트리겔 상에서 배양된 정원줄기세포의 각인 유전자(H19, Peg1, Igf2r 및 Snrpn)의 DNA 메틸화 패턴을 바이설파이트 시퀀싱(bisulfite sequencing)으로 분석한 결과로서, 각각의 라인은 분리된 클론을 나타내며 검은색 및 흰색 원은 각각 메틸화된 CpGs, 메틸화되지 않은 CpGs를 나타냄.
도 6은 마트리겔 상에서 배양된 정원줄기세포에서 (A) Oct4-GFP 형광(그린) 및 (B) LacZ-양성 염색(블루) 결과, (C) 수용체 마우스 정소세관에서 이식된 정원줄기세포에 의한 콜로니(그린) 관찰 결과, (D) 이식된 LacZ 정원줄기세포를 나타내는 수용체 마우스 정소세관의 LacZ 염색 결과로서 블루 스트레치는 이식된 세포 유래의 생식세포 콜로니 존재를 나타냄. 스케일바는 50 μm임.
도 7의 (A)는 GFR(growth factor reduced) 마트리겔 및 표준 마트리겔 간의 정원줄기세포 증식률 비교, (B)는 젤라틴, 라미닌 및 GFR 마트리겔 상에서 다양한 성장인자가 미치는 영향을 나타낸 그래프로 인슐린 성장인자-1(IGF-1), 형질전환 성장인자-베타(TGF-β) 및 혈소판 유래 성장인자(PDGF)를 함유하는 젤라틴, 라미닌, GFR 마트리겔 상의 12-웰 플레이트에 정원줄기세포를 5 × 10⁵세포/웰로 도말하고 계대배양마다 세포수를 카운트함. I는 IGF-1, T는 TGF-β, P는 PDGF를 의미함.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 마트리겔을 이용하여 무영양세포 하에서 정원줄기세포(spermatogonial stem cells, SSCs)를 장기간 체외 배양하는 방법을 제공한다.

마트리겔은 EHS(Engelbreth-Holm-Swarm) 마우스의 육종세포에서 추출된 단백질 복합체에 대한 BD Bioscience 사의 제품명으로, 라미닌, 콜라겐, 엔탁틴, 헤파란 황산 프로테오글리칸과 같은 세포외 매트릭스(extracelluar matrix, ECM)와 섬유아세포 성장인자(FGF), EGF, 인슐린 성장인자-1(IGF-1), 형질전환 성장인자-베타(TGF-b), 혈소판 유래 성장인자(PDGF)와 같은 성장인자를 함유한다(Braam, S. R., Zeinstra, L., Litjens, S., Ward-van Oostwaard, D., van den Brink, S., van Laake, L., . . . Mummery, C. L. (2008). Recombinant vitronectin is a functionally defined substrate that supports human embryonic stem cell self-renewal via alphavbeta5 integrin. Stem Cells, 26(9), 2257-2265; Vukicevic, S., Kleinman, H. K., Luyten, F. P., Roberts, A. B., Roche, N. S., & Reddi, A. H. (1992). Identification of multiple active growth factors in basement membrane Matrigel suggests caution in interpretation of cellular activity related to extracellular matrix components. Exp Cell Res, 202(1), 1-8). 마트리겔을 이루고 있는 복합체는 많은 조직에서 발견되는 복잡한 세포외 환경을 제공함으로써 세포 배양을 위한 기질로서 이용되고 있다.

본 발명은 (1) 마우스 또는 포유류로부터 정소조직을 수득하여 정소세포를 분리하는 단계; (2) 상기 분리한 정소세포로부터 정원줄기세포를 동정하는 단계; 및 (3) 상기 동정한 정원줄기세포를 피더세포(feeder cells)가 없는 마트리겔(Matrigel)로 코팅된 배양접시에서 배양하는 단계;를 포함하는 정원줄기세포를 배양하는 방법을 제공한다.

상기 (3)단계에서 마트리겔로 코팅된 배양접시는 DMEM/F12 전체 100 부피부에 대하여 마트리겔이 0.02 내지 1.05의 부피부로 혼합된 마트리겔 용액을 배양접시에 도포하고, 상기 배양접시를 2 내지 25 ℃에서 40분 내지 15시간 동안 보관한 후, 잔재하는 마트리겔 용액을 제거하여 제조된 것이 바람직하다. 정원줄기세포를 효율적으로 체외 배양하기 위해서는 정원줄기세포가 배양접시 내 부착되어 적절한 조건 하에서 안정적으로 증식되어야 한다. 그러나, 정원줄기세포의 부착과 증식을 위해 매트릭스로 마트리겔을 이용하고 있는 본 발명에서 마트리겔과 DMEM/F12의 부피비가 상기 범위를 벗어날 경우 세포가 부착되지 않아 세포사멸이 발생하며 결국 정원줄기세포를 체외 배양할 수 없으므로 DMEM/F12 전체 100 부피부에 대하여 마트리겔이 0.02 내지 1.05의 부피부로 혼합된 마트리겔 용액을 제조하는 것이 중요하다.

더욱 구체적으로, 본 발명에 따른 마트리겔 용액은 DMEM/F12 29 ml에 마트리겔 300 μl를 첨가하여 마트리겔 용액을 제조하거나, 상기 제조한 마트리겔 용액을 DPBS 또는 DMEM/F12 1 ml에 20 μl를 첨가하여 희석해서 사용하는 것이 바람직하다. 즉, 마트리겔은 DMEM/F12에 95 내지 5000배, 바람직하게는 96배로 희석하여 사용하는 것이 최적의 효과를 나타낸다. 또한, 본 발명에서 DMEM/F12는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media)과 Ham's F12가 1 : 1의 부피비로 혼합된 배지를 의미하며, 일반적으로 DMEM/F12는 다양한 세포의 초대배양에 적용하는 무혈청 배지로 사용되고 있다.

본 발명에 따른 정원줄기세포를 배양하는 방법은 시간적 및 비용적인 면에서 효율적이고 더 나은 자가재생능력을 갖는다. 또한, 배양된 정원줄기세포의 생장률은 피더세포 존재 하에서 배양할 때와 동일하다. 본 발명은 피더세포를 배제하고 배양된 정원줄기세포가 mRNA와 단백질 수준에서 생식세포 마커를 발현하는지 확인하였고 생식세포가 결함된 마우스에 이식시켜 그 기능을 확인하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 정원줄기세포의 배양

정원줄기세포(SSCs)를 기 공지된 방법(K. Ko, N. Tapia, G. Wu, J.B. Kim, M.J. Bravo, P. Sasse, T. Glaser, D. Ruau, D.W. Han, B. Greber, K. Hausdorfer, V. Sebastiano, M. Stehling, B.K. Fleischmann, O. Brustle, M. Zenke, H.R. Scholer, Induction of pluripotency in adult unipotent germline stem cells, Cell Stem Cell 5 (2009) 87-96, K. Ko, M.J. Arauzo-Bravo, J. Kim, M. Stehling, H.R. Scholer, Conversion of adult mouse unipotent germline stem cells into pluripotent stem cells, Nat Protoc 5 (2010) 921-928.)에 따라 Oct4-GFP 및 Oct4-GFP/LacZ 이식 마우스로부터 구축하였다. 두 단계의 정소세관 소화과정을 거쳐 정소세포를 정원줄기세포 배양 배지가 구축된 젤라틴이 코팅된 배양 접시(2 × 10⁵cells/3.8 cm²)에 도말하였다. 정원줄기세포 콜로니는 7일 이내 현미경 하에서 관찰되었고, 정원줄기세포 콜로니를 부드러운 피펫팅으로 수집하고 증식을 위해 미토마이신 C가 처리된 영양세포(MEFs, mouse embryonic fibroblasts)에 다시 도말하였다(Ko, K., Tapia, N., Wu, G., Kim, J. B., Bravo, M. J., Sasse, P., . . . Scholer, H. R. (2009). Induction of pluripotency in adult unipotent germline stem cells. Cell Stem Cell, 5(1), 87-96). 정원줄기세포를 영양세포가 없는 마트리겔로 코팅된 플레이트 상에서 보존하고 5일마다 계대 배양하였으며, 세포수는 각 계대마다 카운트하고 12-웰 플레이트에 5 × 10⁵cells/well로 도말하였다.

정원줄기세포 배지는 StemPro 보충물(Invitrogen), 1 × N2 보충물(Invitrogen), 6 mg/ml D-(+)-글루코즈(Invitrogen), 30 mg/ml 피루빅산(Invitrogen), 1 μl/ml DL-락틱산(Sigma), 5 mg/ml 소혈청알부민(BSA; Invitrogen), 1 % 소태아혈청(Invitrogen), 2 mM L-글루타민(Invitrogen), 50 μM β-멀캅토에탄올(Invitrogen), 1 × 페니실린/스트렙토마이신(Welgene), 1 × 최소 필수 배지(MEM) 비필수 아미노산(Invitrogen), 1 × MEM 비타민(Invitrogen), 30 ng/ml β-에스트라디올(Sigma), 60 ng/ml 프로게스테론(Sigma), 20 ng/ml 인간 EGF(Peprotech), 20 ng/ml 인간 bFGF(Peprotech), 20 ng/ml 인간 GDNF(Peprotech) 및 10³U/ml 마우스 백혈병 억제 인자(Prospec)를 함유하는 StemPro-34 SFM(Invitrogen)으로 구성되었다.

실시예 2. 세포외 매트릭스로 코팅된 플레이트

ECM, 마트리겔(BD Biosciences) 또는 라미닌(Sigma)으로 플레이트를 코팅하였다. 마트리겔 병을 4 ℃ 냉장고에서 얼음 상에서 액체가 될 때까지 하룻밤 동안 해동시키고 마트리겔을 300 μl로 나눠 -20 ℃에서 보관하였다. 마트리겔이 코팅된 플레이트의 준비를 위해 마트리겔 300 μl를 29 ml의 DMEM/F12 배지(Invitrogen)에 희석하여 혼합한 마트리겔 용액을 준비하였다. 상기 용액을 12-웰 플레이트(웰당 0.5 ml) 또는 6-웰 플레이트(웰당 1 ml)에 가하여 웰의 전체 표면을 커버한 후, 플레이트를 1 시간 동안 상온 또는 하룻밤 동안 4 ℃에서 보관하였다. 이후, 초과된 마트리겔 용액이 제거됨으로써 세포배양에 이용할 수 있는 상태가 되었다. 상기 방법과 같이 마트리겔로 코팅된 플레이트를 제조함으로써 정원줄기세포를 피더세포 없이 장기간 높은 증식률로 배양할 수 있는 효과가 있다. 라미닌 코팅을 위해, 라미닌 저장 용액(1 mg/ml)을 50 μl로 나눠 -20 ℃에서 보관하였다. 라미닌 워킹 용액(3~40 mg/ml)은 DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)가 함유된 저장 용액으로 희석하여 준비하고 12-웰 플레이트(웰당 0.5 ml) 또는 6-웰 플레이트(웰당 1 ml)에 가하였다. 플레이트는 37 ℃의 세포 배양기에서 최소 2 시간 동안 보관하고, 초과된 라미닌 용액을 제거한 후 DPBS로 두 번 세척하였다.

실험예.

(1) RT-PCR

총 RNA를 miRNeasy Mini Kit(QIAGEN)를 이용하여 분리하고, 총 RNA 500 ng를 전체 부피 20 μl에서 Omniscript RT Kit(QIAGEN)를 사용하여 역전사시켰다. PCR 분석은 유전자 특이적 프라이머(표 1 참고)와 Takara Ex Taq DNA 중합효소를 이용하였다. PCR 조건은 94 ℃에서 30 초간, 50 내지 65 ℃에서 30 초간 및 72 ℃에서 30 초간 32 사이클 실시되었다. RT-PCR 산물은 1% 아가로즈 겔에서 전기영동으로 분석하였다.

(2) 유세포 분석

정원줄기세포를 0.5 % BSA가 함유된 차가운 PBS(phosphate-buffered saline)에 1 × 10⁶cells/ml로 현탁시키고, CD326(EpCAM), CD49f(Intergrin α6), 플루오레세인 이소티오시안산염(FITC)이 결합된 CD29(Intergrin β1) 또는 피코에리트린이 결합된 CD117(c-kit) 항체를 20 분간 얼음 상에서 처리하였다. 이후, 세포를 PBS 중의 0.5% BSA로 세척하고 CD326(EpCAM)에 대해 안티-마우스 IgM-FITC(Sigma), CD49f(Intergrin α6)에 대해 안티-랫 IgG-FITC(BD Biosciences) 2차 항체를 처리하였다. 분석은 CellQuest 소프트웨어(BD Biosciences)를 이용하여 유세포 분석기(BD Biosciences)로 실시되었다.

(3) DNA 메틸렌화

세포를 PBS로 세척하고 총 DNA Extraction kit(iNtRON)를 이용하여 지노믹 DNA를 분리하였다. 지노믹 DNA를 EpiTech Bisulfite(QIAGEN)로 처리하고 PCR 증폭을 실시한 후, PCR 산물을 PCR Cloning kit(QIAGEN)를 이용하여 서브클론하였다. 바이설파이트 시퀀싱(bisulfite sequencing)을 위한 프라이머는 표 1에 나타내었다.

(4) 정소 이식

이식은 기 공지된 방법(Ko, K., Tapia, N., Wu, G., Kim, J. B., Bravo, M. J., Sasse, P., . . . Scholer, H. R. (2009). Induction of pluripotency in adult unipotent germline stem cells. Cell Stem Cell, 5(1), 87-96)을 이용하여 실시되었다. 6주된 C57BL/6 수컷 마우스에 40 mg/kg의 부설팬(busulfan)을 복강내 주사하고, 한 달 후에 이식 수용체로 이용하였다. 5 × 10⁵세포와 0.04% 트리판 블루를 함유하는 정원줄기세포 배지 약 10 μl를 마이크로피펫(40~60 μm 지름 팁)으로 정소와 정소상체를 연결하는 수출관을 통해 수용체 마우스 정소의 정세관에 주입하였다. 2개월 후 마우스를 희생시키고 정소세관을 염색하여 이식된 정원줄기세포에 의해 형성된 콜로니를 확인하였다.

실험결과.

(1) 마트리겔이 코팅된 플레이트 상에서 정원줄기세포의 장기간 증식

도 1에서 보는 바와 같이, 미토마이신 C가 처리된 MEFs상에서 배양된 정원줄기세포 콜로니는 전형적인 포도 형상을 나타냈으며, 마트리겔 상에서 배양된 정원줄기세포는 단일층을 형성하였다. 또한, 정원줄기세포는 5 일 마다 약 2.5의 비율로 증식하였으며, 피더세포 배양 시스템에서의 증식률과 유사하였다.

피더세포 존재 하에서 정원줄기세포를 배양할 때 그 증식을 위해 피더세포를 계대배양마다 준비해야 하는 번거로움이 있다. 더욱 구체적으로, MEFs를 배양하고 미토마이신 C로 유사분열을 불활성화시키는 시간적 및 실험적 소비 과정을 필요로 한다. 정소 내 정원줄기세포는 정소세관의 기저막에 존재하며, 이는 체외 상에서 정원줄기세포의 보존은 피더층과 같은 체내 환경적 요소를 필요로 함을 의미한다. 도 2는 정원줄기세포가 피더세포 없이 젤라틴 또는 라미닌이 코팅된 플레이트에서 부착, 증식될 수 없음을 나타낸다. 본 발명은 정원줄기세포의 부착과 증식을 위해 매트릭스로 마트리겔을 이용하였다.

도 3에서 보는 바와 같이, 정원줄기세포는 세포수 의존적으로 마트리겔 상에서 증식하였으며, 12-웰 플레이트에 5 × 10⁵세포/웰로 도말하여 배양하였을 때 최적의 성장을 나타냈다.

또한, 도 7에서 보는 바와 같이, 마트리겔에서 인슐린 성장인자-1(IGF-1), 형질전환 성장인자-베타(TGF-β) 및 혈소판 유래 성장인자(PDGF)와 같은 성장인자는 피더세포를 배제한 배양 조건에서 정원줄기세포의 증식에 영향을 미치지 않았다. 또한, 젤라틴이 코팅된 플레이트에 성장인자를 가하여도 정원줄기세포의 증식에 영향을 미치지 않았다.

(2) 피더세포 없이 배양한 정원줄기세포의 특성

도 4는 마트리겔 상에서 피더세포 없이 배양된 정원줄기세포의 mRNA 및 표면 단백질에 대한 RT-PCR 및 FACS 분석 결과를 나타낸다. 그 결과, 마트리겔 상에서 피더세포 없이 배양된 정원줄기세포는 정원줄기세포 마커 유전자 Oct4, Rex1, Esg1, Tex18, Vasa, Dazl, Piwil2 및 Zfp 145는 발현하고 Nanog은 발현하지 않은 것으로 나타났다. 또한, FACS 분석 결과, 정원줄기세포 특이적 표면 단백질의 발현이 피더세포 존재 유무와 관계 없이 유사한 것으로 나타났고, 더욱 구체적으로 Integrin α6(CD49f), integrin β1(CD29) 및 EpCAM(CD326)은 강하게 발현되었으나 c-kit(CD117)는 약하게 발현되었고, mESC 특이적 마커 SSEA-1(CD15)는 발현되지 않은 것으로 나타났다(데이터 미도시). 따라서, 마트리겔 상에서 피더세포 없이 배양된 정원줄기세포는 정원줄기세포 특이적 유전자 mRNA와 표면 단백질을 정상적인 수준으로 발현함을 확인하였다.

(3) 피더세포 없이 배양된 정원줄기세포에서 관찰된 유전체 각인(Genomic Imprinting) 패턴의 안정성

피더세포 없이 배양된 정원줄기세포의 후성적 안정성(epigenetic stability)을 관찰하기 위해 바이설파이트 DNA 시퀀싱으로 유전체 각인 패턴을 결정하였다. 그 결과, 도 5에서 보는 바와 같이 부계적 각인 유전자인 H19의 메틸화도는 높은 반면 모계적 각인 유전자인 Peg1, Igf2r, Snrpn의 메틸화도는 낮은 안드로겐 패턴을 나타내었다. 이는 종래 피더세포 존재 하에서 배양된 정원줄기세포와 동일한 패턴으로 본 발명에 따른 배양 시스템이 정원줄기세포에서 각인 유전자의 안정된 DNA 메틸화 상태를 유지시켜 주는 것을 알 수 있었다.

(4) 정조세포 이식에 의한 줄기세포 활성도

배양된 정원줄기세포의 줄기세포 활성도를 알아보기 위해 정조세포 이식을 실시하여 생식력이 없는 마우스의 정세관에서 이식된 정원줄기세포의 콜로니 형성능을 관찰하였다(Brinster, R. L., & Zimmermann, J. W. (1994). Spermatogenesis following male germ-cell transplantation. Proc Natl Acad Sci U S A, 91(24), 11298-11302; Schlatt, S. (2002). Germ cell transplantation. Mol Cell Endocrinol, 186(2), 163-167; Tang, L., Rodriguez-Sosa, J. R., & Dobrinski, I. (2012). Germ cell transplantation and testis tissue xenografting in mice. J Vis Exp(60)). 그 결과를 도 6에 나타내었다. 형광법에 의해 Oct4-GFP 및 LacZ 염색법에 의해 β-갈락토시다아제 발현을 관찰한 결과, 수용체 마우스 정소세관에서 Oct4-GFP/LacZ 세포를 확인하였다.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims

삭제
하기와 같은 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 정원줄기세포를 영양세포 없이 배양하는 방법.
(1) 인간이 아닌 포유류의 정소조직을 수득하여 정소세포를 분리하는 단계;
(2) 상기 분리한 정소세포로부터 정원줄기세포를 동정하는 단계; 및
(3) 상기 동정한 정원줄기세포를 피더세포(feeder cells)가 없는 마트리겔(Matrigel)로 코팅된 배양접시에서 배양하는 단계.
제 2항에 있어서,
상기 (1)단계에서 정소세포는 수득한 정소조직에 콜라게나제, DNAse, 트립신 억제제 및 히알루로니다제를 첨가하고 30 내지 40 ℃에서 5 내지 10분간 1차 처리한 후, 콜라게나제, DNAse 및 트립신 억제제를 첨가하고 30 내지 40 ℃에서 5 내지 10분간 2차 처리하여 분리한 것을 특징으로 하는 정원줄기세포를 영양세포 없이 배양하는 방법.
제 2항에 있어서,
상기 (2)단계에서 정원줄기세포는 분리한 정소세포를 정원줄기세포 배양 배지가 구축된 젤라틴이 코팅된 배양접시에서 배양하여 형성된 정원줄기세포 콜로니로부터 동정한 것을 특징으로 하는 정원줄기세포를 영양세포 없이 배양하는 방법.
제 2항에 있어서,
상기 (3)단계에서 마트리겔은 섬유아세포 성장인자-1(FGF-1), FGF-2(bFGF), FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, 표피세포 성장인자(EGF), 케라티노사이트 성장인자(KGF), 헤파토사이트 성장인자(HGF), 형질전환 성장인자(TGF-α), TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, 혈소판 유래 성장인자(PDGF), 엔지오포이에틴 1, 엔지오포이에틴 2, 에리트로포이에틴, 뉴로필린, 인슐린 성장인자-1(IGF-1), 오스테오폰틴, 플레이오트로핀, 액티빈, 엔도텔린-1 및 혈관내피 성장인자(VEGF)로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 세포성장인자를 함유하는 것을 특징으로 하는 정원줄기세포를 영양세포 없이 배양하는 방법.
제 2항에 있어서,
상기 (3)단계에서 마트리겔로 코팅된 배양접시는 DMEM/F12 전체 100 부피부에 대하여 마트리겔이 0.02 내지 1.05의 부피부로 혼합된 마트리겔 용액을 배양접시에 도포하고, 상기 배양접시를 2 내지 25 ℃에서 40분 내지 15시간 동안 보관한 후, 잔재하는 마트리겔 용액을 제거하여 제조된 것을 특징으로 하는 정원줄기세포를 영양세포 없이 배양하는 방법.