JP2007501625A - 鳥類精原幹細胞の培養方法及びこれにより収得した鳥類精原幹細胞 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図11a
Description
本発明が鶏に適用される場合、精原幹細胞の培養のための鶏は、発生後70週齢、好ましくは、発生後20週齢、より好ましくは、2〜10週齢の雄を利用する。鶏の精巣は、頚椎骨を分離した後、切開して得られる。
前記過程により分離した精巣の周りの結締組織及び膜などを除去し、精巣組織を覆っている白膜を除去する。次いで、精巣を、解剖用メスを利用して細かく切断した後、様々な分解方法により分解した後、精巣細胞を分離する。
この方法は、Ogawaら(1997)の方法及びその変形された方法により行われる。コラゲナーゼタイプIの溶解されたHBSS(Hank's Balanced Salt's solution)に前記精巣組織を添加して、一定時間反応した後、トリプシンで処理する。
コラゲナーゼタイプI、トリプシン、ヒアルロニダーゼII、及びDNase Iが溶解されたDMEM培地で前記精巣組織を分解する。
コラゲナーゼタイプI及びトリプシンの溶解されたHBSSで精巣組織を分解し、ピペッティングにより精巣組織の分解をさらに促進させる。
前記過程により収得した精巣細胞を、基底細胞上で、細胞成長因子の含まれた培地で培養し、精巣細胞のポピュレーションに含まれている鳥類精原幹細胞を培養する。
前記過程により培養された鳥類精原幹細胞が真正なものであるか否かを確認するために、同定段階を行う。
培養した精原幹細胞を固定液(例えば、リン酸塩緩衝液、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、及びMgCl2を含む)に固定した後、過ヨード酸溶液に反応させ、次いでシフ試薬(Schiff's reagent)に反応させて染色する。細胞質が濃い紫色に染色された場合、即ち陽性反応を示した場合、鳥類精原幹細胞として判定できる。
精原幹細胞に固定液を処理して固定した後、レクチン類の一つであるSTA(Solanum tubersum agglutinin)またはDBA(Doliclos bifflrus agglutinin)に蛍光物質(例えば、FITC(fluorescein isothiocyanate))を接合してなるFITC−STAまたはFITC−DBAと反応させる。次いで、蛍光顕微鏡で観察する。細胞表面で蛍光が観察される場合、即ち、陽性反応を示す場合、鳥類精原幹細胞として判定できる。
精原幹細胞に一次抗体であるα6−インテグリン抗体を処理し、標識物質例えば、蛍光物質(TRITC(tetramethyl rhodamine isothiocyanate))が接合されている二次抗体(抗体のFcドメインに結合する抗体であって、例えば、ヤギ抗−マウスIgG)と反応させた後、蛍光顕微鏡で観察する。細胞表面で蛍光が観察される場合、即ち、陽性反応を示す場合、鳥類精原幹細胞として判定できる。
前記α6−インテグリン抗体方法と同様に行うが、一次抗体として、β1−インテグリン抗体を使用する。
精原幹細胞に、一次抗体であるSSEA−1、SSEA−3、またはSSEA−4抗体を処理し、発色反応触媒(例えば、alkaline phosphatase)の結合された二次抗体を処理する。次いで、前記触媒の基質を添加し反応させて、発色様相を観察する。発色反応が観察される場合、即ち、陽性反応を示す場合、鳥類精原幹細胞として判定できる。
1)供与鶏及び精巣分離
精原幹細胞の培養のための鶏は、(株)アビコアー生命工学研究所で飼育された雄の白色レグホーン種を利用した。鶏の精巣は、供与鶏の頚椎骨を分離した後、切開して得て、鶏の週齢別体重及び精巣の重量を測定した。
分離した精巣は、精巣の周りの結締組織及び膜などを除去し、微細ピンセットを利用して、精巣組織を覆っている白膜(tunica albuginea)を除去した。精巣は、解剖用メスを利用して、実体顕微鏡下で細かく切断した後、多様な分解方法を利用して比較分析した。
この方法は、Ogawaら(1997)の方法を少し変形して行った。即ち、上記のように用意した精巣組織を、HBSS(Hank's Balanced Salt's solution, Invitrogen)にコラゲナーゼタイプI(1mg/ml、Sigma)を溶解した後、37℃振とう培養機(shaking incubator)で15分間処理した。HBSSで洗浄した後、0.25%トリプシン−1mM EDTA(Invitrogen)で15分間処理した。分解した精巣細胞は、70μm細胞濾過機(cell strainer, Falcon 2350)で濾過した後、トリパンブルーを利用して生存率及び細胞数を測定した。
DMEM(Invitrogen)培地にコラゲナーゼタイプI(1mg/ml、Sigma)、トリプシン(1 mg/ml、Sigma)、ヒアルロニダーゼII(1mg/ml、Sigma)及びDNase I(5μg/ml、BMS)を溶解した後、前記培地で、細かく切られた精巣組織を15分間150サイクル/分で分解した。次いで、DMEM培地で3回洗浄した後、2回目の分解を、コラゲナーゼタイプI(1 mg/ml)、ヒアルロニダーゼII(1mg/ml、Sigma)及びDNase I(5μg/ml、BMS)の溶解されたDMEM培地で約30分間行って、精巣組織を完全に分解した。その後、70μm細胞濾過機で濾過した後、生存率及び細胞数を測定した。
HBSS(Invitrogen)にコラゲナーゼタイプI(1mg/ml、Sigma)と0.25%トリプシン(Sigma)を溶かした組織分解培地で、次のような方法により細胞を分離した。37℃振とう培養機(shaking incubator)で30分間、150rpmで組織を分解しながら、5分間隔でピペッティングして、精巣組織を分解した。酵素の活性を停止するために、FCS(fetal calf serum)10%を添加した後、細胞濾過機(cell strainer、70μm、Falcon 2350)を利用し、分解した細胞を回収した。300×gで5分間遠心分離し、精巣細胞(testicular cell)を確保した後、トリパンブルーを利用して、生存率及び細胞数を測定した。
鶏の週齢別精巣組織の形態及び精原幹細胞の分布様相を観察するために、組織分析を実施して、精巣組織の特性を分析し、STA(Solanum tuberosum agglutinin)を利用して、精原幹細胞の数を測定した。
初期培養した精巣細胞は、約7〜10日間培養した後、適宜な基底細胞(feeder layer)に移して培養しなければならないため、鶏の精原細胞培養のための最適な基底細胞の比較試験を行った。まず、精巣細胞の初期培養のために、2〜4週齢の雄のヒヨコから精巣組織を分離した後、上記例のコラゲナーゼ−トリプシンの処理方法により精巣組織を分解した。分解した精巣組織は、細胞数及び生存率を測定した後、培養ディッシュ(100mm)当たり2×106の精巣細胞を接種して、8〜10日間培養した。この際、培地の組成は、基底細胞が含まれていないことを除いては、下記の精原幹細胞の培地の中で最も好ましいものと等しい。
鶏精原幹細胞の培養液組成による培養条件の確立のために、次のような培養液組成で精原幹細胞の培養様相を比較した。
基本培養液の組成のために、DMEM(Invitrogen)培地に10%(v/v)ES細胞用牛胎児血清(FBS, Hyclone, Logan UT)及び1x抗生剤−抗ミコバクテリア剤(Invitrogen)を添加して、培地を組成した。
上記の基本培養液DMEM−B培地に2%鶏血清(Invitrogen)、10mM非必須アミノ酸(Invitrogen)、10mM Hepes緩衝液(Invitrogen)、及び0.55mMβ−メルカプトエタノール(Invitrogen)を添加して、培養液を組成した。
それぞれの成長因子に対する鶏精原幹細胞の培養様相を比較することにより、精原幹細胞の最適培養条件を確立するために、添加剤の含まれた培養液を対照区として、各成長因子に対する培養パターンを比較した。
鶏精原幹細胞培養のための最適の培養温度条件を確立するために、鳥類の体温温度である41℃と、一般的な培養温度である37℃で温度効果を比較した。培養培地は、SSC培地、即ちDMEM−C(対照区)培養液にそれぞれの成長因子、即ち2ng/mlの人間白血病抑制因子(Sigma)、5ng/mlの人間塩基性繊維芽細胞成長因子(Sigma)、及び10ng/mlの人間インシュリン様成長因子−1(Sigma)を添加し、5%CO2培養器で培養した。3週齢の白色レグホーンの精巣細胞を初期培養して、10日間培養した後、精原幹細胞を回収して、細胞数を測定した。
鶏精原幹細胞の体外培養のために、確立された培養温度、培養液、そして基底細胞を利用して、初期精巣分解の後から培養しながら、培養日数による精原幹細胞の数の変化を測定した。即ち、初期分解の後、約2.0×106/dish(100mm)の精巣幹細胞を精原細胞培養液とGSC基底細胞とで培養しながら、約10日間隔で継代(subculture)して、精原幹細胞の数を測定した。
精巣組織から培養した鶏精原幹細胞の特性を糾明するために、PAS(Periodic Acid Schiff's)染色キット(Sigma)、STA(Sigma)、鶏抗−インテグリンβ1抗体(Sigma)、及び鶏抗−インテグリンα6抗体(Chemicon International. Inc, USA)を利用して培養した精原幹細胞における様相を観察した。
培養した精原幹細胞を固定液(50mMリン酸塩緩衝液、2%グルタルアルデヒド、2%ホルムアルデヒド、及び2mM MgCl2)に10分間固定した後、PBSで3回洗浄した。過ヨード酸溶液に5分間反応させた後、PBSで再び3回洗浄した。シフ試薬(Schiff's reagent、Sigma)を10分〜15分間入れておいて、PBSで洗浄した後、顕微鏡で観察した。
精原幹細胞に固定液を処理して固定した後、レクチン類の一つであるFITC−STA(Sigma)を10〜2に希釈して、50μg/mlとなるようにした後、約1時間常温で反応した。次いで、PBSで3回洗浄し、蛍光顕微鏡(Nikon TE2000-U, Japan)で観察した。
精原幹細胞に固定液を処理した後、PBSで洗浄し、2%ノルマルヤギ血清でブロッキングするために、常温で約1時間培養した。一次抗体であるα6−インテグリン(Chemicon Int.)及びβ1−インテグリンの抗体(Sigma)をそれぞれ20μg/mlの濃度に希釈し、室温で1時間ずつ反応した。二次抗体としては、TRITC(tetramethyl rhodamine isothiocyanate)付きヤギ抗−マウスIgG(Jackson Lab)を使用し、室温で1時間培養した後、蛍光顕微鏡で観察した。
精原幹細胞に固定液を処理した後、PBSで洗浄し、レバミゾール(Levamisole)を処理した。二次抗体の非特異的結合を最少化するために、5%ヤギ血清により常温で30分間ブロッキングした。次いで、1:100に希釈された一次抗体の抗−SSEA−1(MC-480)または抗−SSEA−4、1:200 に希釈された抗−SSEA−3(MC-631)(MC-813-70; Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa, IA)を処理して、室温で1時間反応した。その後、二次抗体のヤギ抗−マウスIgM−AP(AK-5010, Vector Laboratories, Inc., Burlingama, CA)を処理した。その後、試料をABC溶液及びBCIP/NBT(Sigma)基質でそれぞれ30分間反応させた後、10mM EDTA(pH 8.0)を添加して反応を停止した。
精原幹細胞に抗−SSEA−1、抗−SSEA−3、または抗−SSEA−4を処理した後、二次抗体としてロダミン(TRITC)−接合ヤギ抗−マウスIgG(115-025-003, Jackson ImmunoResearch Laboratories. Inc, Bar Harbor, ME)を処理した。次いで、PBSで3回洗浄した後、FITC−STAを1時間処理し、蛍光顕微鏡で観察した。
1)精巣細胞の分離方法の比較
鶏の精巣組織の分解のための酵素処理方法は、コラゲナーゼとトリプシンを主成分として分解したが、2段階酵素処理方法(Ogawaら、1997)とvan Pelt(1996)方法、そしてコラゲナーゼとトリプシンとを混合した方法の三つの方法を利用して分離した。分離した精巣細胞は、生殖細胞(germ cell)及びその他の体細胞から構成されており、トリパンブルーを利用して細胞の生存率を測定した(参照:表1及び図1)。三つの精巣細胞分離方法の比較結果、処理3の方法、即ちコラゲナーゼ(1mg/ml)及びトリプシン(0.25%)を利用した分離方法が最も高い細胞生存率を示し、また、2段階酵素処理方法やvan Pelt方法に比べ、簡単で且つ時間もかからないことから、処理3の方法が鶏の精巣組織分解のための最も効率的な方法であることが分かった。
未だに、鶏を始めとした鳥類の精巣内の精原幹細胞数に対する報告はなく、ただ、極めて少ない数が存在すると知られている。マウスの場合、精巣内に約108個の細胞があるが、この中で約2×104個が幹細胞であると推論される(Meistrich & Beek, 1993; Tegelenbosch & de Rooij, 1993)。鶏の精巣組織内の精原幹細胞の数を測定するために、約3週齢の白色レグホーン種の精巣を分解した後、レクチン類の一つであるSTA−FITC接合体を利用して、蛍光を発する細胞を測定し、全体精巣細胞の中で占める精原幹細胞の分布を計算した(参照:表2)。
鶏を始めとした鳥類の精原幹細胞の培養に関する研究は、報告されたものがなく、培養条件もマウスなどの精原細胞の培養と異なる方法を試みた。基本的に、精原幹細胞は、PGC由来の細胞であるため、EG培養液を一部変更して培養液として使用し(Parkら、2000)、PGC、胚芽生殖細胞(Embryonic germ cell)、そして精原細胞も基底細胞依存型(dependent)であるため、最適の基底細胞を探すために、鶏繊維芽細胞(CEF)、鶏生殖器基質細胞(GSC)、鶏精巣基質細胞(TSC)、及びマウスSTO細胞株などを利用して比較した(参照:図2)。
鶏精原幹細胞の培養液組成による培養条件の確立のために、基本培地(DMEM-B)と添加物の入っている培地(DMEM-C)とで9日間培養した後、コロニー数を測定して比較した。測定の結果、鶏精原幹細胞のコロニー形成が、DMEM−Cの方がDMEM−Bに比べ約14倍高く現れた(参照:表3及び図3)。
それぞれの成長因子に対する鶏精原幹細胞の培養様相を比較することにより、精原細胞の最適の培養条件を確立するために、培養添加物の含まれた培養液を対照区として、各成長因子に対する培養様相を比較した。幹細胞因子(SCF)と、白血病抑制因子(LIF)と、塩基性繊維芽細胞成長因子(bFGF)とは、既に、PGCの維持及び増殖を促進させると報告されており(Matsuiら、1992; Resnickら、1992)、GDNFも、in vivoで精原幹細胞の分化を調節する重要な要素であることが立証された(Mengら、2000; Naganoら、2003)。
(i) DMEM−C(対照区)
(ii) DMEM−C+LIF(10ng/ml)
(iii) DMEM−C+bFGF(10ng/ml)
(iv) DMEM−C+SCF(20ng/ml)
(v) DMEM−C+IGF−1(100ng/ml)
(vi) DMEM−C+GDNF(100ng/ml)
鶏を始めとした鳥類は、哺乳類と違って、体温が高く(41℃)、精巣が体内に存在する。したがって、正常的な細胞培養温度である37℃と、鶏の体温である41℃とで精巣細胞を培養して、精原幹細胞の数の変化を観察した結果、37℃で精原幹細胞が約2.2倍よく培養されることが確認された(参照:表6、図7)。これは、マウスの場合、37℃と体外精巣最適温度の32℃とにおいて有意的な差がなかったこととは対照的である(Naganoら、2003)。
マウスを始めとした哺乳動物の精原細胞は、分離時、制限された数の細胞を分離するしかなく、体外培養時、多い精原細胞が死んでしまうため、精原細胞の培養が難しい。鶏を始めとした鳥類の精原幹細胞も同様な様相を示すが、ただ、マウスよりは多い数の精原幹細胞を分離することができるという長所がある。鶏の精原幹細胞は、基底細胞依存型であるため、生殖器基質細胞(GSC)と共に培養し、マウスの場合よりは相対的に多い数の精原幹細胞が存在する(約0.08%)ため、例え培養中に少なくない数の精原幹細胞が死んでも、細胞の数を測定することができた。
鶏を始めとした鳥類の精原幹細胞の培養、特に長期培養に関する研究は、全くない状態であって、ただ、マウス(Naganoら、2001; Kanatsu-Shinoharaら、2003)と牛(Izadyarら、2003)などの精原幹細胞を約5ヶ月間培養したという報告が全てである。一方、大部分の精原幹細胞は、培養初期に多い数が死んでしまうため、培養に困難がある。
鶏を始めとしたマウス及びラット、そして哺乳動物のタイプA精原幹細胞を区別できる確実な形態学的、分子化学的マーカーがないため、多様な研究が試みられている。マウスにおいて、生殖細胞(gonocyte)と精原細胞(spermatogonia)とに特異的なα6−インテグリン及びβ1−インテグリン表面マーカーに対する報告があり(Shinoharaら、1999)、これに基づき、鶏のα6−インテグリン及びβ1−インテグリンに対する抗体とPAS染色、そしてレクチン類であるSTAを利用し、初期分離した精巣細胞と培養された精原幹細胞とを利用して反応様相を観察した。
鶏の始原生殖細胞(PGC)及び胚芽生殖細胞(EG cell)の場合、細胞質内に存在する多量のグリコーゲンのため濃い紫色に染色されて、他の細胞との区別が可能である(Meyer、1964; Parkら、2000)。特に、胚芽生殖細胞の場合、長期間培養の後もPASに特異的に染色される傾向がある。
レクチン類に対する鶏精原幹細胞の特異的な反応様相を糾明するために、DBA(Doliclos bifflrus agglutinin)、STA(Solanum tubersum agglutinin)WGA(Triticum vulgaris agglutinin)、ConA(Canavalia ensiformis agglutinin)などのレクチンを利用した結果、WGAは、精原幹細胞と基底細胞に、そしてConAは、ほとんどが基底細胞に反応した。特に、STAは、基底細胞ではなく、精原幹細胞に特異的に反応したが、長期間の培養後にも(パッセージ8)同一な染色様相を示し、精原幹細胞の特異マーカーとして使用が可能であると判断される(参照:図11a)。このような結果は、STAが認識する(N−アセチルグルコサミン)3が鶏精原幹細胞に特異的に存在するということを意味する。また、DBAも精原幹細胞に特異的に反応したが、長期間の培養後にも(パッセージ3)同一な染色様相を示し、精原幹細胞の特異マーカーとして使用が可能であると判断される(参照:図11b)。
α6−インテグリン及びβ1−インテグリンは、一般細胞においてヘテロダイマーを成して、細胞内外の信号伝達に中枢的な機能を担当する。特に、α6−インテグリン及びβ1−インテグリンは、マウスの精原幹細胞の表面から発現する特異的なマーカーとしての利用が可能である(Shinoharaら、1999)。
SSEA−1、SSEA−3、及びSSEA−4は、マウスの精原幹細胞に対するマーカーとして既に知られているが、鶏精原幹細胞に対する特異マーカーとしての用途は、知られていない。図14から分かるように、鶏精原幹細胞は、SSEA−1、SSEA−3、及びSSEA−4を発現することが観察されて、TSC(testicular stromal cell)は、抗−SSEA−1、抗−SSEA−3、及び抗−SSEA−4により、全く免疫染色されないことが観察された。したがって、SSEA−1、SSEA−3、及びSSEA−4は、鶏精原幹細胞に対する特異マーカーとして利用できることが分かる。
図15から分かるように、鶏精原幹細胞は、抗−SSEA−1及びFITC−STAにより二重染色された。
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Claims (19)
- 次の段階を含む鳥類精原幹細胞の長期培養方法:
(a) 鳥類の精巣を収得する段階;
(b) 前記精巣から精巣細胞ポピュレーション(population)を分離する段階;及び
(c) 前記精巣細胞ポピュレーションに含まれた精原幹細胞を、基底細胞上で、細胞成長因子の含まれた培地で培養する段階。
- 前記段階(b)は、コラゲナーゼ、トリプシン、またはこれらの混合物を、前記収得した精巣の組織に処理して行われることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記段階(b)は、コラゲナーゼ及びトリプシンの混合物を、前記収得した精巣の組織に処理して行われることを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- 前記段階(c)において、基底細胞は、繊維芽細胞、生殖器基質細胞、精巣基質細胞、またはマウスSTO細胞株であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記基底細胞は、生殖器基質細胞または精巣基質細胞であることを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- 前記基底細胞は、生殖器基質細胞であることを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- 前記細胞成長因子は、繊維芽細胞成長因子、インシュリン様成長因子−1、幹細胞因子、神経膠由来の神経栄養因子、及びこれらの組み合せからなる群から選択されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記培地は、分化抑制因子をさらに含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記分化抑制因子は、白血病抑制因子であることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- 前記培地は、繊維芽細胞成長因子、インシュリン様成長因子−1、及び白血病抑制因子の混合物を含む補足物を含有することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記培地は、血清及び抗酸化剤をさらに含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記段階(c)の培養温度は、約37℃であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記鳥類は、鶏、鶉、七面鳥、鴨、鵞鳥、雉、または鳩であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記段階(c)の後に、鳥類の精原幹細胞を同定する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記鳥類精原幹細胞の同定は、(i)PAS(Periodic Acid Shiff's)染色、(ii) STA(Sojanum tuberosum agglutinin)染色、(iii) α6−インテグリン抗体染色、(iv)β1−インテグリン抗体染色、(v)SSEA−1抗体染色、(vi)SSEA−3抗体染色、(vii)SSEA−4抗体染色、(viii)DBA(Doliclos bifflrus agglutinin)染色、または(ix)前記染色方法の組み合せにより行うことを特徴とする、請求項14に記載の方法。
- 精原幹細胞の特性を示す鳥類細胞を含むことを特徴とする鳥類精原幹細胞のポピュレーション。
- 前記精原幹細胞の特性は、(i)PAS(Periodic Acid Shiff's)染色、(ii) STA(Sojanum tuberosum agglutinin)染色、(iii) α6−インテグリン抗体染色、(iv)β1−インテグリン抗体染色、(v)SSEA−1抗体染色、(vi)SSEA−3抗体染色、(vii)SSEA−4抗体染色、(viii)DBA(Doliclos bifflrus agglutinin)染色、または(ix)前記染色方法の組み合せの陽性反応であることを特徴とする、請求項16に記載の鳥類精原幹細胞のポピュレーション。
- 前記鳥類精原幹細胞のポピュレーションは、請求項1〜15のいずれかに記載の方法により得られることを特徴とする、請求項16に記載の鳥類精原幹細胞のポピュレーション。
- 次の段階を含む形質転換鳥類の生産方法:
(a) 請求項16〜18のいずれかに記載の鳥類精原幹細胞のポピュレーションに外来遺伝子を転移させる段階;
(b) 前記鳥類精原幹細胞のポピュレーションを受容体の精巣に移植する段階;及び
(c) 前記受容体の子孫を得て、形質転換鳥類を生産する段階。
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