KR101408936B1

KR101408936B1 - 돼지의 미분화 정원줄기세포의 표면 마커

Info

Publication number: KR101408936B1
Application number: KR1020120010000A
Authority: KR
Inventors: 류범용; 김용희; 김방진
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2012-01-31
Filing date: 2012-01-31
Publication date: 2014-06-19
Also published as: KR20130088632A

Abstract

본 발명은 항 SSEA-1 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 미분화 정원줄기세포의 고순도 분리방법에 관한 것이다.
본 발명의 SSEA-1 (Stage-specific embryonic antigen-1)는 전사춘기 (pre-pubertal stage, 13-14주령)의 돼지의 미분화 정원줄기세포에서 발현하며, 이를 마커로 이용할 경우 정원세포 (spermatogonia)를 효과적이고 풍부하게 수득할 수 있어, 미분화 정원줄기세포를 필요로 하는 분야인 이식 실험 등에서 유용하게 이용할 수 있다.

Description

돼지의 미분화 정원줄기세포의 표면 마커 {Specific surface marker of undifferentiated spermatogonia in the pre-pubertal boar testis}

본 발명은 항 SSEA-1 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 미분화 정원줄기세포의 고순도 분리방법에 관한 것이다.

최근 줄기세포 (stem cell) 에 관한 연구가 전세계적으로 일어나고 있다. 줄기세포는 현재의학이 해결하지 못한 질병의 치료에서 획기적인 시도가 되고 있다. 이러한 줄기세포 가운데 정원줄기세포 (spermatogonial stem cell; SSC)는 원시생식세포 (primordial germ cell; PGCs)에서 유래한 것으로 정자형성과정이 일어나는 초기단계의 세포를 말한다.

정원줄기세포 (spermatogonial stem cells)는 정자형성과정 (spermatogenesis)에 있어서 토대가 되는 세포로서 다른 종류의 성체줄기세포들과 마찬가지로 자가증식 (self-renewal) 능력과 분화 (differentiation) 능력을 지닌 줄기세포이며, 이들로부터 최종적으로 분화가 완료된 생식세포 (germ cells)인 정자가 생산된다. 현재까지 단일 정원세포 (A single spermatogonia; As spermatogonia)군 중 정원줄기세포가 존재한다고 알려져 있지만 아직까지 정확히 정원줄기세포를 구분할 수 있는 형태학적인 기준이나 마커로 활용될 수 있는 생화학적 혹은 분자생물학적 특성이 명확히 밝혀져 있지 않은 실정이다. 또한 정소 (testis) 내 정원줄기세포의 수적인 제한으로 인하여 연구에 어려움이 있다. 따라서 과거 여러 해 동안 정원줄기세포의 생물학적인 특성에 관한 연구들은 정원줄기세포를 구분하고 연구할 수 있는 분석기법이 개발되지 못한 관계로 형태학적인 관찰에 의지한 이론적인 지식에 의존되고 있었다.

이에 본 발명자들은 정원줄기세포를 동정하기 위한 바이오 마커를 개발하고자 연구를 계속한 결과, SSEA-1(stage-specific embryonic antigen-1)에 대한 항체를 이용하여 전사춘기 (pre-pubertal stage)의 돼지의 미분화 정원줄기세포를 동정할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

국내특허출원번호 : 10-2009-7019462

본 발명의 목적은 미분화 정원줄기세포의 고순도 분리방법을 제공하는 것이다.

삭제

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 (a)분리된 정소를 세절한 다음, 콜라게나제로 처리하는 단계; (b)상기 콜라게나제로 처리된 정소조직을 트립신으로 처리한 다음, 원심분리하여 세포를 수득하는 단계; (c)상기 수득된 세포를 퍼콜 (Percoll) 침전법으로 침전시켜 퍼콜 40% 내지 50% 층의 세포를 분리하는 단계; 및 (d)상기 분리된 세포를 형광물질이 결합된 항 SSEA-1 (anti stage-specific embryonic antigen-1) 항체와 접촉시켜 SSEA-1을 발현하는 세포를 형광분석장치를 사용하여 분리하는 단계를 포함하는 PGP 발현 세포를 40% 이상 함유하는 미분화 정원줄기세포의 분리방법을 제공한다.

삭제

본 발명의 SSEA-1 (Stage-specific embryonic antigen-1)는 전사춘기 (pre-pubertal stage, 13-14주령)의 돼지의 미분화 정원줄기세포에서 발현하며, 이를 마커로 이용할 경우 정원세포 (spermatogonia)를 효과적이고 풍부하게 수득할 수 있어, 미분화 정원줄기세포를 필요로 하는 분야인 이식 실험 등에서 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 13주령의 돼지 정소의 세정관 세포 중 PGP 9.5 (그린) 발현 세포를 확인한 면역조직분석 결과이다.
도 2은 light-scattering에 따라 돼지 정소 세포를 G1, G2 부분으로 분리한 것이다. PI-positive (dead) 세포는 분석 전에 제외되었으며, G2 부분의 PI-negative 세포는 약 87%로 나타났다.
도 3는 FACS를 이용하여 정소 세포의 형태학적 특성을 확인한 결과이다 (항체로 Thy-1, α6-integrin, β1-integrin, CD9, c-kit, SSEA-1을 이용).
도 4는 FACS를 통해 분리된 세포 집단에서 PGP 9.5 염색된 세포 (그린)를 나타낸 것이다.
도 5은 FACS를 통해 분리된 세포 집단에서 PGP 9.5 발현을 정량화한 것이다.
도 6은 돼지 정소에서 유래된 비선택 또는 FACS로 분리된 세포 집단을 PGP 9.5, PLZF(미분화 정원줄기세포 마커) 및 VASA (생식세포 마커)로 염색한 결과이다.
도 7은 FACS로 분리된 SSEA-1 + 세포 집단에서 PGP 9.5, PLZF 또는 VASA 양성 세포를 정량화한 것이다.
도 8는 SSEA-1+세포를 이식하였을 때, 수여 동물의 정소에서 콜로니 형성 능력을 확인 콜로니 수를 정량화한 것이다.

이하 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

일 양태로서, 본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 (a)분리된 정소를 세절한 다음, 콜라게나제로 처리하는 단계; (b)상기 콜라게나제로 처리된 정소조직을 트립신으로 처리한 다음, 원심분리하여 세포를 수득하는 단계; (c)상기 수득된 세포를 퍼콜 (Percoll) 침전법으로 침전시켜 퍼콜 40% 내지 50% 층의 세포를 분리하는 단계; 및 (d)상기 분리된 세포를 형광물질이 결합된 항 SSEA-1 (anti stage-specific embryonic antigen-1) 항체와 접촉시켜 SSEA-1을 발현하는 세포를 형광분석장치를 사용하여 분리하는 단계를 포함하는 PGP 발현 세포를 40% 이상 함유하는 미분화 정원줄기세포의 분리방법을 제공한다.

상기 SSEA-1(stage-specific embryonic antigen-1)은 마우스 배아의 상실기 (morula stage)에 발현되는 것으로 알려져 있으며, 압축 과정 (compaction process)에서 세포-세포 상호작용 리간드의 역할을 한다.
상기 SSEA-1을 발현하는 세포를 분리하는 단계는 형광물질이 결합된 항체 및 형광분석장치, 자기 비드가 연결된 항체 및 자기장치 또는 효소가 결합된 항체와 기질의 반응으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 용어“항체”란 항원성 부위에 대해서 지시되어 특이적으로 결합하는 단백질 분자를 의미한다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다. 본 발명의 "항체"는 통상적으로 생체 내에 존재하는 형태의 항체 이외에, 항체의 H쇄 또는 L쇄의 가변영역 또는 그의 조합으로 형성되는 항원 결합 부위를 적어도 1개 갖는 분자를 포함한다. 예를 들면, H쇄의 가변영역만 포함하는 펩티드, 1조의 H쇄 단편과 L쇄 단편으로 이루어진 Fab, 2조의 H쇄 단편과 L쇄 단편으로 이루어진 (Fab')2, H쇄 단편과 L쇄 단편이 동일 펩티드 상에 직렬로 결합된 단쇄 항체 "ScFv" 등도 포함된다. 상기 항체는 모노클론 항체이거나, 폴리 클론 항체 또는 단쇄 항체 또는 재조합 항체 일 수 있다. 상기 항체와의 결합의 확인을 용이하게 하기 위하여 상기 항체에 리간드, 자기 비드, 효소 등을 결합시킬 수 있다. 상기 리간드는 이에 한정되는 것은 아니나, 바이오틴, 아비딘 또는 스트렙토아비딘 일 수 있고, 상기 효소는 이에 한정되는 것은 아니나, 루시퍼라아제, 퍼옥시다아제 또는 베타 갈락토시다아제 일 수 있다. 당업자는 항체의 확인을 위하여 적절한 리간드, 비드 및 효소를 선정하여 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 돼지 SSEA-1 단백질은Santa cruz biotechnology 사의 SSEA-1(480)(sc-21702) 항체에 의해 확인될 수 있다.

본 발명에서 사용하는 용어인 “마커”란 미분화 정원줄기세포를 구분할 수 있는 물질로, 미분화 정원줄기세포에 따라 특이적으로 존재하는 폴리펩타이드 또는 핵산 (예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 마커를 포함하는 미분화 정원줄기세포의 동정용 키트를 제공한다.

상기 동정 키트로는 상기 항-SSEA-1 항체를 확인하기 위하여 형광물질이 결합된 항체 및 형광분석장치를 이용하여 확인할 수 있고, 자기 비드가 연결된 항체와 자기 장치를 이용하여 확인할 수 있으며, 특정 효소와 기질 반응을 통하여 확인할 수 있다. 상기 동정 키트는 구체적으로 항- 항-SSEA-1 항체를 포함하는 미분화 정원줄기세포 동정용 단백질 칩일 수 있다. 상기 항체를 이용하여 단백질의 존재 여부와 그 양 또는 패턴을 측정하는 방법으로는, 웨스턴 블롯, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석(Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테를로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역 전기영동, 조직 면역 염색, 면역 침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 (a) 시료 세포를 항- SSEA-1 항체와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 항- SSEA-1 항체와 상기 세포의 결합 여부를 확인하는 단계를 포함하는 동정 방법을 제공한다

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 정소 세포의 분리 및 준비

13-14 주령된 전사춘기 (pre-pubertal stage)의 미니 돼지(Harvard minipig)로부터 정소 (testis)을 수득하였다. 수득된 정소는 DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline; Gibco Laboratories, Grand Island, NY, USA)에 담아 4℃에서 보관하였다. 돼지의 정소 세포 (testis cell)을 분리하기 위하여, 먼저 포셉과 가위를 이용하여 정소를 자르고, 콜라게나제(collagenase) IV (1mg/ml; Sigma, St. Louis, MO, USA)가 포함되어 있는 배양액에서 37℃에서 15분간 교반 배양하였다. 배양 후 콜라게나제가 처리된 정소 조직을 DPBS에서 3회 세척하고, 0.25% trypsin/1mM EDTA (Gibco) 및 DNase I (7 mg/ml in DPBS; Roche, Basel, Switzerland)이 4:1로 포함된 솔루션에서 37℃, 5-10분간 배양하였다. 트립신 처리를 비활성화하기 위하여, FBS (fetal bovine serum ; Hyclone)를 전체 부피의 10%로 첨가하였다. 정소 세포 배양액을 40-m의 nylon mesh (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)로 필터하고, 600g, 4℃의 조건에서 7분간 원심분리하여 세포를 모았다. 수득된 세포를 DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium (Gibco), 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 0.1 mM β-mercaptoethanol, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin 포함) 기본 배지 (basic media)에 풀었다.

보다 높은 순도의 정원줄기세포를 분리하고 혈구세포 및 세포 debris를 제거하기 위하여, 상기에서 수득한 세포 농도를 5 X 10⁶cells/ml로 준비하고, Percoll density gradient 침전 방법을 이용하였다. 퍼콜 침전법 (Percoll sedimentation)은 세포의 사이즈에 따라 세 개의 층으로 이루어지며, 각 층을 미분화된 정원줄기세포 (undifferentiated spermatogonia)의 존재를 확인하기 위해 분석하였다. 30% 및 50% Percoll 사이인 중간층을 600g, 4℃의 조건에서 10분간 원심분리하여 세포를 모으고, 펠렛을 기본 배지에 풀어, 향후 실험을 위한 정원줄기세포를 준비하였다. 상기 과정을 통해 수득한 세포가 미분화 정원줄기세포인지를 확인하기 위하여 돼지 생식모세포 (gonocyte) 및 타입 A 정원세포에서 발현하는 특이적 마커인 PGP9.5로 염색하였다 (도 1). 염색 결과, 퍼콜 40~50% 층에서 모아진 세포의 대부분은 PGP 9.5를 발현하였으며, 이들의 순도는 3.1%로 확인되었다.

실시예 2. FACS 를 통한 돼지 정소세포의 분석

전사춘기의 돼지 정소세포의 특성을 분석하기 위하여, FACS 및 면역형광 (immunofluorescent) 분석을 수행하였다. 먼저 forward scatter (FSc) 및 side scatter (SSc)를 포함하고 있는 light scatter를 파라미터로 이용하여 전체 정소 세포를 분석하였으며, 그 결과 세포 분포의 특성에 따라 두 가지 부분 (fraction)으로 나누었다. G1 및 G2 부분의 미분화 정원줄기세포를 확인하기 위하여, type A spermatogonia marker인 PGP 9.5로 염색하였다. 면역형광분석 결과, PGP 9.5를 발현한 세포의 대부분이 G2 부분에 위치함을 확인하였다. 따라서 모든 차후의 FACS 분석은 죽은 세포 (PI-positive)를 제외한 FSC (G2)로 수행되었다 (도 2).

지난 연구를 통해 마우스에서 정원줄기세포 (spermatogonial stem cell, SSC) 및 정원세포 (spermatogonia)를 동정하기 위하여 이용된 항체를 이용하였으며, 상기 항체는 전사춘기의 돼지의 생식세포에서도 발현되었다. 마우스의 SSC 마커인 Thy-1, α6-integrin, β1-integrin 및 CD9의 항체와 생식세포 마커인 c-kit를 이용하여 돼지 정소세포에서의 발현을 확인하였다. 또한 FACS 분석을 통해 돼지 정소세포에서의 SSEA-1의 발현을 확인한 결과, SSEA-1⁺ 세포는 PI-negative 집단에서 0.3 ± 0.1% 로 나타났으며, Thy-1, α6-integrin, β1-integrin, CD9 및 c-kit에 양성을 보인 세포는 각각 3.4 ± 0.7%, 5.6 ± 2.0%, 63.2 ± 5.0%, 0.2 ± 0.1%, 및 0.2 ± 0.0%로 확인되었다 (도 3).

실시예 3. SSEA -1 양성 세포의 분석

실시예 2를 통해 FACS를 통해 분리된 세포를 다시 확인하기 위하여, 면역형광분석을 수행하였다. PGP 9.5로 면역형광분석을 수행한 결과, SSEA-1+ 집단을 제외하고는 다른 모든 양성 집단에서 PGP 9.5+ 세포는 적은 수로 나타났으며, 반면에 SSEA-1+ 집단은 현저하게 높은 PGP 9.5의 발현을 보였다 (도 4). Thy-1, α6-integrin, β1-integrin, CD9 및 c-kit에 양성을 보인 집단에서는 각각 1.0 ± 0.1%, 2.3 ± 0.4%, 2.0 ± 0.4%, 1.4 ± 0.0% 및 1.5 ± 0.1%의 PGP 9.5 양성 발현을 보였으며, 이와 비교하여 SSEA-1⁺ 집단에서는 48.2 ± 3.2%의 PGP 9.5 양성 발현을 보였다 (도 5). 이러한 결과를 통해 표면항원 SSEA-1을 발현하는 세포의 선택은 정소 세포 군집에서 다시 말해 type A spermatogonia의 순도를 매우 풍부하게 함을 확인하였다.

지난 연구를 통해, 소나 돼지와 같은 인간이 아닌 대형 동물에서는 PLZF가 미분화 정원줄기세포의 마커로 이용되었다. 따라서, 다른 양성 집단에 비해 현저하게 높은 퍼센트의 PGP 9.5+를 가지고 있는 SSEA-1+ 집단을 미분화 정원줄기세포의 마커인 PLZF로 염색하였다 (도 6). 면역세포화학 (immunocytochemistry)으로 유전자의 발현을 분석한 결과, SSEA-1⁺ 집단에서 45.0 ± 7.0% 의 세포가 PLZF 양성을 나타냈다. 따라서 SSEA-1 항체를 이용한 FACS 결과 26.5배 (45.0/1.7) 의 풍부한 PLZF+세포를 확인했으며, 이것은 미분화 정원줄기세포의 증가로 판단된다. 또한 지난 연구를 통해 마우스, 돼지, 인간의 생식세포에서 발현한다고 확인된 생식세포 혈통 마커인 VASA의 발현을 확인한 결과, 24.6배(41.8/1.7)의 높은 증가를 보였다 (도 7). 상기 실험 결과를 통하여, PLZF 및 VASA의 발현은 PGP 9.5의 염색 결과와 유사하게 FACS를 통해 분리한 SSEA-1+ 세포 집단에서만 거의 독점적으로 관찰됨을 확인하였으며, 미분화 정원줄기세포는 SSEA-1 항체를 이용한 FACS 분리를 통해 높게 수득될 수 있음을 확인하였다. 따라서 SSEA-1은 미분화 정원줄기세포를 분리하기 위한 바이오 마커로 유용하게 이용될 수 있다.

실시예 4. 이식 분석

정원 줄기세포 (SSC) 이식 분석은 수컷 생식 줄기세포의 존재를 확인하기 위한 기술이다. SSEA-1 항체를 이용하여 FACS를 통해 분리한 전사춘기의 돼지 정소 세포의 줄기세포 활성을 평가하기 위하여, 상기 세포를 PKH26 붉은색 형광으로 라벨링한 후 면역 결핍된 마우스의 정소의 세정관에 이식하였다. 상기 마우스는 이식 6주 전에 부설판 (40mg/kg of body weight)을 처리하여 정자형성 (spermatogenesis)을 제거하였다. 세 마리의 수여 동물에 FACS로 분리한 SSEA-1+ 정소 세포 또는 비선택된 정소세포를 이식하였으며, 상기 실험은 3회 반복하였다. 이식 3달 후 수여 동물을 희생시켜, 줄기세포의 활성 및 PKH26으로 라벨링된 콜로니를 관찰하였다. PKH26으로 라벨링된 콜로니의 수를 확인한 결과, 비 선택된 정소세포를 이식한 그룹에서는 평균적으로 10⁵ 이식 세포당 2.5 ± 0.6 콜로니가 형성되었다. 이와 비교하여, SSEA-1+ 세포를 이식한 그룹에서는 39.2 ± 3.6 콜로니가 형성되었으며, 이러한 결과는 비선택된 정소세포군에 비하여 현저하게 증가한 수치 (약 15.7배 (39.2/2.5)였다 (도 8). 상기 실험 결과를 통하여, SSEA-1+ 집단은 군체 형성 능력을 가지고 있는 생식 세포를 매우 풍부하게 가지고 있음을 확인하였으며, 이를 통해 SSEA-1을 미분화 정원줄기세포용 동정 마커로 이용할 경우, 미분화 정원줄기세포를 효과적이고 풍부하게 수득할 수 있어, 이식 실험 등에서 유용하게 이용할 수 있음을 확인하였다.

Claims

다음 단계를 포함하는 PGP 발현 세포를 40% 이상 함유하는 미분화 정원줄기세포의 분리방법:
(a)분리된 정소를 세절한 다음, 콜라게나제로 처리하는 단계;
(b)상기 콜라게나제로 처리된 정소조직을 트립신으로 처리한 다음, 원심분리하여 세포를 수득하는 단계;
(c)상기 수득된 세포를 퍼콜 (Percoll) 침전법으로 침전시켜 퍼콜 40% 내지 50% 층의 세포를 분리하는 단계; 및
(d)상기 분리된 세포를 형광물질이 결합된 항 SSEA-1 (anti stage-specific embryonic antigen-1) 항체와 접촉시켜 SSEA-1을 발현하는 세포를 형광분석장치를 사용하여 분리하는 단계.
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