JP2004313184A - 未分化細胞を選別する方法およびその利用 - Google Patents
未分化細胞を選別する方法およびその利用 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】 単一のES細胞株には、細胞表面マーカーにより分画される性質の異なる細胞亜集団が存在し、ES細胞株によるキメラ形成率の相違は、細胞株としての性質によるのではなく、それらに含まれる亜集団の構成の違いを反映したものであることを見出した。この亜集団の選別は、細胞表面マーカーを指標に行うことができ、これにより高率にキメラを形成する細胞集団を分取することが可能となった。
【選択図】 なし
Description
(1) 未分化細胞を細胞表面抗原に対する抗体により染色し、その染色の有無により該未分化細胞を選別する、未分化細胞の選別方法。
(2) 細胞表面抗原がPECAM-1、SSEA-1、SSEA-3およびSSEA-4からなる群より選択される、(1)に記載の方法。
(3) 未分化細胞が哺乳動物由来の胚性幹細胞(ES細胞)または生殖幹細胞(EG細胞)である、(1)に記載の方法。
(4) 未分化細胞が遺伝子組換体である、(1)に記載の方法。
(5) PECAM-1、SSEA-1、SSEA-3およびSSEA-4からなる群より選択される細胞表面抗原のうち、少なくともPECAM-1が陽性の未分化細胞を分取する、(1)に記載の方法。
(6) PECAM-1およびSSEA-1が陽性の未分化細胞を分取する、(5)に記載の方法。
(7) PECAM-1、SSEA-3およびSSEA-4が陽性の未分化細胞を分取する、(5)に記載の方法。
(8) (5)から(7)のいずれかに記載の方法により分取された未分化細胞。
(9) (8)に記載の未分化細胞の、受精胚への注入または受精胚との凝集により構築されるキメラ胚。
(10) (8)に記載の未分化細胞の、染色体を除去した未受精胚への注入または該未受精胚との融合により構築される核移植胚。
(11) (8)に記載の未分化細胞を、体外培養あるいは生体内移植により分化誘導することにより構築される分化組織複合体。
(12) (10)に記載の核移植胚が移植された仮腹動物。
(13) (12)に記載の仮腹動物から取得される胎子、産子またはそれらの子孫。
ES細胞(ROSA26xCBAF1系マウス胚盤胞由来)とEG(TM1)細胞はフィーダー細胞(STO)上で培養し、培地には20%KSR添加ES培地を用いた。EC(F9)細胞はゼラチンコートディッシュ上で2-ME、NEAA添加高グルコースDME培地で培養した。細胞をAccutase (Innovative Cell Technologies)で分散し、PE標識抗PECAM-1抗体(40ng/106 cells, Pharmingen)および抗SSEA-1抗体(200ng/106 cells, Kyowa Medex)で染色した。FITC標識2次抗体(抗マウスIgM, 100ng/106 cells, Pharmingen)で染色後、フローサイトメトリーによる解析を行った。
ソーティングした細胞より全RNAを精製し、DNase処理後、常法によりcDNAを合成した。定量的PCRにはLightCycler(Roche社)を用いた。最初に増幅が認められたサイクル数をもとに、PECAM-1+SSEA-1-の値を100とし、Hprtの値で補正した相対値を示した。これにより、PECAM-1-SSEA-1-、PECAM-1+SSEA-1-およびPECAM-1+SSEA-1+の各ポピュレーション間で、分化を制御・反映する遺伝子の発現に差があるかを調べた(図2)。
ZHBTc4は20%FCS添加ES培地を用い、ゼラチンコートディッシュで常法に従って培養した。Dox(1mg/ml)を添加後、12時間おきに48時間後まで細胞を経時的に回収し、フローサイトメトリーによってPECAM-1の発現量を調べた。さらに全RNAを採取し、定量的RT-PCRによって遺伝子発現の経時変化を調べた。誘導前の発現量を100とし、Hprtで補正した値を示した。フローサイトメトリー及び定量的RT-PCRの条件は実施例1および2と同様である。
ホスト胚にはICRマウスの8細胞期胚 (2.5d.p.c.)を用いた。注入後、10%FCS添加M16培地で培養し、18あるいは36時間後に0.2% NP-40,0.1% glutaraldehyde-PBSで固定してX-gal染色に供した。一部の胚はレシピエントマウス(ICR)の子宮に移植し、4日後(6.0-7.0d.p.c.)に胚を回収してx-gal染色を行った(ES細胞注入後、36時間目の胚のX-gal染色像を図4に示す)。
6.0-7.0日胚におけるES由来細胞の寄与率および寄与部位を調べた。その結果、PECAM-1+SSEA-1+の細胞は、β-gal陽性細胞が検出されたすべての胚(16.7%)において原始外胚葉への分化が認められ、そのほとんどを占有していた(iv,v)。一方、PECAM-1-/+SSEA-1-の細胞はβ-gal陽性となる胚が少なく、発生が進む過程で細胞が脱落している可能性が示唆された。原始外胚葉に分化した1例でも占有率が低く、また、臓側内胚葉(viceral endoderm)や壁側内胚葉(pariental endoderm)など、原始外胚葉以外の組織への分化が認められた。6.0および7.0日マウス胚の組織の模式図を図5に、移植後4日目に回収した胚のX-gal染色像を図6に、β-gal陽性細胞の出現頻度を表2に示す。
ES細胞の応用を考える上で、キメラ個体の形成効率の向上は大きなメリットとなる。そこで実際に分画濃縮したPECAM-1+SSEA-1+細胞を用いてキメラ個体を作出し、その効率を調べた。
Claims (13)
- 未分化細胞を細胞表面抗原に対する抗体により染色し、その染色の有無により該未分化細胞を選別する、未分化細胞の選別方法。
- 細胞表面抗原がPECAM-1、SSEA-1、SSEA-3およびSSEA-4からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 未分化細胞が哺乳動物由来の胚性幹細胞(ES細胞)または生殖幹細胞(EG細胞)である、請求項1に記載の方法。
- 未分化細胞が遺伝子組換体である、請求項1に記載の方法。
- PECAM-1、SSEA-1、SSEA-3およびSSEA-4からなる群より選択される細胞表面抗原のうち、少なくともPECAM-1が陽性の未分化細胞を分取する、請求項1に記載の方法。
- PECAM-1およびSSEA-1が陽性の未分化細胞を分取する、請求項5に記載の方法。
- PECAM-1、SSEA-3およびSSEA-4が陽性の未分化細胞を分取する、請求項5に記載の方法。
- 請求項5から7のいずれかに記載の方法により分取された未分化細胞。
- 請求項8に記載の未分化細胞の、受精胚への注入または受精胚との凝集により構築されるキメラ胚。
- 請求項8に記載の未分化細胞の、染色体を除去した未受精胚への注入または該未受精胚との融合により構築される核移植胚。
- 請求項8に記載の未分化細胞を、体外培養あるいは生体内移植により分化誘導することにより構築される分化組織複合体。
- 請求項10に記載の核移植胚が移植された仮腹動物。
- 請求項12に記載の仮腹動物から取得される胎子、産子またはそれらの子孫。
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