WO2007116836A1

WO2007116836A1 - 前腸細胞の検出方法及び分離方法

Info

Publication number: WO2007116836A1
Application number: PCT/JP2007/057225
Authority: WO
Inventors: Masahiro Yasunaga; Yoko Nakano
Original assignee: Stem Cell Sciences Kk
Priority date: 2006-04-03
Filing date: 2007-03-30
Publication date: 2007-10-18

Abstract

　本発明は、哺乳類の前腸細胞を含み得る細胞集団に対し、前記前腸細胞の表面に存在する細胞表面分子マーカーに感応する物質を作用させて前記前腸細胞を検出することを含む前腸細胞の検出方法及び分離方法を提供する。

Description

明細書

前腸細胞の検出方法及び分離方法

技術分野

[0001] 本発明は、哺乳類の前腸細胞の検出方法及び分離方法に関する。

背景技術

[0002] 胚幹 (ES)細胞の分化につ!、ての研究は、再生医療の発展のために重要な位置を占める。通常、この分野の研究は、細胞の取り扱いが容易であるヒト以外の哺乳動物、例えばマウスについてまず行なわれ、次いでヒトについても同様の研究が行なわれることが多い。マウスに存在する遺伝子がヒトにも存在する確率が 99%以上であることが知られており (非特許文献 1)、マウスなどのヒト以外の哺乳動物について得られた研究結果が、ヒトにお、ても同様に確認されることが当該分野にお!、て知られて!/、る

[0003] 哺乳動物の細胞は、分化の過程で内胚葉、中胚葉及び外胚葉の各細胞に分化し、このうち内胚葉系細胞は、前腸細胞、中腸細胞及び後腸細胞に分化する。前腸細胞は、発生初期に存在する未分化な細胞の集団であり、甲状腺、胸腺、唾液腺、食道、肺、肝臓及び脾臓という前方内胚葉系成熟細胞に分ィ匕可能である。前腸細胞と後腸細胞は、性質、特に分ィ匕の細胞運命が明らかに異なることが報告されており、これらの細胞を区別する方法を開発することは、発生生物学及び幹細胞生物学の発展 ·応用を考える上で重要である。

[0004] 前腸細胞が発生する時期には、前腸細胞以外に内胚葉系細胞として中腸細胞及び後腸細胞が共に存在する。よって、前腸細胞についての研究を行うためには、これらの内胚葉系細胞及びその他の細胞を含む細胞集団から前腸細胞を検出し、分離することが必要となる。

[0005] 従来、前腸細胞は、解剖学的位置情報を元に中腸細胞及び後腸細胞と区別されていた。し力しながら、解剖学的方法では、得られる細胞の純度に限界があり、また多くの手間と技術とを必要とする。したがって、近年では、生化学的に前腸細胞を検出し、分離することが試みられている。 [0006] 唾液腺細胞由来幹細胞、肝由来幹細胞及び脾由来幹細胞の分離法が知られている。

例えば、特開 2005— 204590号 (特許文献 1)は、ヒト及びマウスの成体の唾液腺由来の内胚葉系幹細胞に特有な表面抗原を用、た細胞の分離法を開示して!/、る。

[0007] また、国際公開第 02Z103033号 (特許文献 2)は、未分化肝細胞の検出及び分離方法を開示している。この文献は、胎生肝細胞表面に特異的に発現している膜タンパク質 dlkに対する抗体を用いて、マウス胎児肝臓から未分化の胎生肝細胞を精製することを記載している。

[0008] さらに、国際公開第 95Z13697号 (特許文献 3)、国際公開第 00/03001号 (特許文献 4)、国際公開第 00Z43498号 (特許文献 5)、国際公開第 01/53462号（特許文献 6)、国際公開第 02Z28997号 (特許文献 7)、国際公開第 03/33697号 (特許文献 8)及び特開 2004— 344031号 (特許文献 9)は、肝臓幹細胞の分子マ一力一について開示し、国際公開第 01Z1039784号 (特許文献 10)及び国際公開第 02Z88335号 (特許文献 11)は、脾臓幹細胞の分子マーカーについて開示している。

[0009] これらの方法は、成熟した内胚葉系器官である唾液腺、肝臓や脾臓中に存在するそれぞれの幹細胞 (各器官に分ィ匕することができる細胞）を区別するために用いることはできるが、臓器形成前の内胚葉初期発生時に存在する前腸細胞と中腸細胞及び後腸細胞の区別に用いることはできな、。

[0010] 最近、前腸細胞に特異的な分子マーカーとして Proxl、 Hoxbl及び Blimplが報告されている（非特許文献 2〜4)。これらはいずれも転写因子であり、前腸細胞の細胞内に存在することが知られて、る。これらの分子マーカー遺伝子の上流のプロモーター制御下に、遺伝子組み換えにより蛍光タンパク質などの目印となるタンパク質を発現させて前腸細胞を検出及び分離することが考えられる。

[0011] 発生生物学や幹細胞生物学に関する研究において、遺伝子組み換えされていない前腸細胞を検出して分離することができれば、より本来の状態に近い細胞の分ィ匕を研究できると考えられる。

特許文献 1：特開 2005— 204590号公報特許文献 2：国際公開第 02Z103033号パンフレット

特許文献 3 :国際公開第 95Z13697号パンフレット

特許文献 4 :国際公開第 OOZ03001号パンフレット

特許文献 5：国際公開第 00Z43498号パンフレット

特許文献 6 :国際公開第 01Z53462号パンフレット

特許文献 7：国際公開第 02Z28997号パンフレット

特許文献 8：国際公開第 03Z33697号パンフレット

特許文献 9：特開 2004— 344031号公報

特許文献 10：国際公開第 01Z1039784号パンフレット

特許文献 11：国際公開第 02Z88335号パンフレット

非特干文献 1： Waters on R.H. et ai., (2002) Initial sequencing and comparative anal ysis of the mouse genome." Nature 420, 520-62.

非特許文献 2 : Burke Z., Oliver G. (2002) "Proxl is an early specific marker for the developing liver and pancreas in the mammalian foregut endoderm. MechDev. 118, 147-55.

非特許文献 3 : Huang D., Chen S.W., Gudas L.J. (2002) "Analysis of two distinct ret inoic acid response elements in the homeobox gene Hoxbl in transgenic mice." Dev Dyn. 223, 353—70.

非特許文献 4 : Chang D.H., Cattoretti G.， Calame K.L. (2002) "The dynamic expres sion pattern of B lymphocyte induced maturation protein- 1 (Blimp- 1) during mouse embryonic development. Mech Dev. 117, 305—9.

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0012] 本発明は、前方内胚葉系成熟細胞に分化可能な前腸細胞を検出し、前腸細胞以外の内胚葉系細胞から分離できる方法を提供することを目的とする。また、そのような方法により分離された前腸細胞を提供することも目的とする。

課題を解決するための手段

[0013] 本発明者らは、まず、マウスの胎生 8日胚から前腸及び中腸を分離し、 RNAを抽出し、逆転写酵素を用いて cDNAを合成した。この cDNAを用いて DNAマイクロアレイ解析を行い、前腸由来の cDNAと中腸由来の cDNAとの比較により、前腸の細胞に特異的に存在する分子マーカーを選択した。

[0014] この結果、本発明者らは、前腸細胞に特異的に発現する細胞表面分子マーカーを初めて見出し、これらの少なくとも 1種を検出することにより、前腸細胞を検出して分離することが可能であることを見出し、本発明を完成した。

前腸細胞に特異的に発現する細胞表面分子マーカーは、現在まで知られて、なかった。

[0015] よって、本発明によれば、哺乳類の前腸細胞を含み得る細胞集団に対し、前記前腸細胞の表面に存在する細胞表面分子マーカーに感応する物質を作用させて前記前腸細胞を検出することを含む前腸細胞の検出方法が提供される。

また、本発明によれば、上記の検出方法により検出された前腸細胞を分離することを含む前腸細胞の分離方法も提供される。

発明の効果

[0016] 本発明の前腸細胞の検出方法及び分離方法によれば、前腸細胞を好ましくは遺伝子組み換えせずに検出して前腸細胞以外の内胚葉系細胞から分離することができる。本発明の分離方法により分離された前腸細胞を用いて発生生物学的及び幹細胞生物学的な研究を行うことができ、このような研究結果に基づいて、肝臓や脾臓などの再生医療に有用な知見を得ることができる。

図面の簡単な説明

[0017] [図 1]マウスの胚に対して行なった in situハイブリダィゼーシヨンの結果を示す。

[図 2]マウスの胚に対して行なった免疫染色の結果を示す。

発明を実施するための最良の形態

[0018] 本明細書において、哺乳類とは、ヒト、サル、ゴリラ、マウス、ラット、モルモット、ゥサギ、ャギ、ゥマ、ゥシ、ィヌ、ネコなどを含む。

[0019] 本明細書において、「前腸細胞」とは、内胚葉系細胞のうち前方内胚葉系成熟細胞に分ィ匕可能な細胞を意味する。本発明における前腸細胞は、前腸細胞に分化し得る細胞が分ィヒして得られる前腸細胞であれば特に限定されない。上記の「前腸細胞に分ィ匕し得る細胞」とは、受精卵、胚又は胎児の細胞及び培養細胞 (例えば胚幹 (ES

)細胞、胎性生殖 (EG)細胞など)を含む。前腸細胞は、一般に、マウスでは妊娠約 7 〜10日の胚に存在し、ヒトでは例えば約 3〜6週齢の胎児に存在することが知られている (例えば、 Kauftnan M.H.,"The Atlas of mouse development", ACADEMIC PRES S; William J. Lars en, "Human Embryology 3rd Edition, Churchill Livingstone Elsevi er; Ronan R. O'Rahilly, Fabiola Muller "Human Embryology & Teratology «3rd Editi on, WiLey- Lissを参照)。

[0020] 本明細書において、「前腸細胞の検出」とは、前腸細胞を含み得る細胞集団に前腸細胞が存在することを検出すること、前腸細胞の存在する割合を定量すること、前腸細胞を他の細胞力区別すること及び前腸細胞を同定することを含む。

[0021] 上記の「前腸細胞を含み得る細胞集団」は、前腸細胞に分化し得る細胞が分化して前腸細胞を含むこととなった細胞の集団であれば特に限定されず、例えば前腸細胞を含む胚又は胎児そのもの、胚又は胎児の細胞を単離して（ばらばらにして)得られた細胞混合物、 ES細胞などの培養細胞を分化誘導させて得られた細胞培養液、該細胞混合物又は細胞培養液をある程度分画して得られる細胞画分などを含む。このような細胞集団は、従来公知の方法に従って得ることができる。例えば、上記の細胞集団が胚から単離した細胞集団である場合、 Brigid Hogan, Rosa Beddington, Fra nk Costantini, Elizabeth Lacy, Manipulating the Mouse Embryo, A LABORATORY MANUAL" 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press又は Wells, J.M., Mel ton D.M., (2000) "Early mouse endoderm is patterned by soluole factors from adjace nt germ layers." Development. 127, 1563- 72に記載の方法に従って抽出した胚を適当な酵素、例えばコラゲナーゼで処理することにより、細胞集団を得ることができる。

[0022] 本明細書にぉ、て、「前腸細胞の分離」とは、前腸細胞又は該細胞を含む細胞画分をそれ以外の細胞集団から分離することを含む。前腸細胞の分離は、細胞集団中の前腸細胞の割合を高めることであればよぐ該細胞の「純化」、「精製」、「分画」、「回収」及び「濃縮」を含む。前腸細胞の分離は、細胞集団中の前腸細胞の割合を、細胞集団中の前細胞の少なくとも 50%、好ましくは少なくとも 60%、より好ましくは少なくとも 70%、さらに好ましくは少なくとも 80%、特に好ましくは少なくとも 90%にすることである。

[0023] 本明細書において、「前腸細胞の表面に存在する細胞表面分子マーカー」とは、少なくとも一部分が前腸細胞表面に存在する分子を意味する。分子の少なくとも一部分が前腸細胞表面に存在していれば、残りの部分は細胞内及び Z又は細胞膜に存在していてもよい。

[0024] 本明細書において「細胞表面分子マーカー」とは、前腸細胞の細胞表面に存在して、前腸細胞の存在を明らかにする全ての分子を含む。このような細胞表面分子マ一力一としては、例えば細胞表面抗原などのタンパク質、糖鎖などを挙げることができる。なかでも、細胞表面分子マーカーとしては、タンパク質が好ましい。なお、本明細書にぉ、ては、「細胞表面分子マーカー」を単に「マーカー」 t 、うことがある。本発明の検出及び分離方法において検出する細胞表面分子マーカーは、前腸細胞の表面に存在する力中腸細胞及び後腸細胞の表面には存在しない。好ましくは、前腸細胞の表面に存在するが、前腸細胞を含み得る細胞集団中の前腸細胞以外の細胞の表面には存在しな、ものである。

[0025] 本発明の前腸細胞の検出及び分離方法において、上記の細胞表面分子マーカーは、 PTPRD (Protein tyrosine phosphatase, receptor type, D)、 Slco4ci solute carrier organic anion transporter family, member 4C1)、 Flrt3 (Pioronectin Leucine rich tra nsmembrane protein 3)、 Dplll (Deleted in polyposis 1- like 1)、 GPR85 (G protein- co upled receptor 85)、 Colecl2 (Collectin sub-family member 12)、 CCKAR (Cholecysto kinin A receptor) ^ CD47 (Rh- related antigen, integrin- associated signal transducer) 、 CD49f (Itga6; integrin alpha 6)、 CD121a (Illrl; Interleukin 1 receptor, type 1)、 Ra etlc (Retinoic acid early transcript gamma) ^ FZD2 (Frizzled 2)、 FZD4、 FZD7、 FZD8 及び TGFbR2 (TGF jS receptor 2)から選択される少なくとも 1種であることが好ましいこれらの分子マーカーは、 1種で用いても 2種以上で用いても前腸細胞を検出して分離することができる。

[0026] 上記の好ましい細胞表面分子マーカーについては、その遺伝子配列が既に知られおり、例えば Entrezデータベースから以下の表 1に示すァクセッション番号によりその遺伝子配列を得ることができる。

[0027] [表 1]

分子マーカ一ァクセッション番号

PTPRD NM 01 1 21 1

S l co4c 1 NM 1 72658

F l rt3 NM 1 78382

Dpi 1 1 (Reep6) NM 1 39292

GPR85 NM 1 45066

Co l ec 12 NM 1 30449

CC AR NM 009827

CD47 NM 010581

CD49f NM 008397

CD1 21 a ( I I 1 rl ) NM 008362

Rael tc NM 00901 8

FZD2 NM 020510

FZD4 NM 008055

FZD7 NM 008057

FZD8 NM 008058

TGFbR2 NM 009371、 NM 029575

[0028] 本発明の前腸細胞の検出方法において、上記の細胞表面分子マーカーの検出は、該細胞表面分子マーカーを有する前腸細胞を他の細胞画分と区別できる方法を用いて行なわれればよぐその具体的な方法は特に限定されないが、該細胞表面分子マーカーに感応する物質を用いて行うことができる。該細胞表面分子マーカーに感応する物質は、該マーカーに対する抗体が好ましい。また、該細胞表面分子マーカーに感応する物質は、該マーカーに対するアブタマ一でもあり得る。

[0029] 上記の細胞表面分子マーカーに対する抗体は、該マーカーに結合できる抗体である。このような抗体は、公知の方法に従って、細胞表面分子マーカーの全体又は一部分を抗原として用いる力、又は該マーカーを発現する細胞を免疫原として用いて動物を免疫することにより得ることができる。抗体を作製する方法は、例えば Levy, R.,

Dilley, J. (1977) The in vitro antibody response to cell surface antigens. II. Monocl onal antibodies to human leukemia cells." J Immunol. 119, 394— 400【こ己載されたものを用いることもできる。また、上記の抗体としては、巿販のものを用いることができ、例えば CD47、 CD49f、 CD121a又は Raetlcに対する抗体は、 Becton Dickinson社から販売されて、るものを用いることができる。

上記の抗体は、細胞表面分子マーカーに結合して前腸細胞を他の細胞画分から区別可能にするために、標識されていてもよい。該標識は、当該技術分野で通常用いられているものを用いることができる。例えば蛍光標識 (例えば、フルォレセインイソチオシァネート (FITC)、テトラメチルローダミンイソチオシァネート (TRITC)など)、生物発光標識 (例えば緑色蛍光タンパク質 (GFP)など)、酵素標識 (ペルォキシダーゼ、ァルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼなど)、フェリチン標識、ハプテン標識 (例えばビォチン、ジゴキシゲニン、ストレプトアビジンなど)、放射性標識 (例えば³² P、 ³³P、 ³⁵S、 ³H 、 ¹²⁵iなど)などが挙げられるが、これらに限定されない。

[0031] 本発明の検出方法は、上記の抗体を用いて検出を行う場合、（1)前腸細胞を含み得る細胞集団と上記の抗体とを接触させる工程、及び (2)前腸細胞と結合した該抗体を検出する工程を含むのが好まし、。

[0032] 上記の工程 (1)において細胞集団と抗体とを接触させる条件は、抗体の種類により適宜選択することができる。例えば抗 CD47抗体を用いる場合、 0.1-1 μ g/mlの抗体濃度の条件下、 0〜4°C程度の温度で、 10〜20分間程度の条件を挙げることができる

[0033] 上記の工程 (1)の後に、細胞表面分子マーカーに結合しな力つた過剰の抗体を除くために、洗浄を行うことが好ましい。洗浄は、公知の方法に従って行うことができ、例えば界面活性剤を含む緩衝生理食塩水を用いて行うことができる。

[0034] 上記の工程 (2)において、工程 (1)で用いた抗体が上記のように標識されている場合は、該標識を検出することにより抗体を検出することができる。例えば、蛍光標識を用いた場合は、各標識に応じて適当な波長の光を照射して、放射される蛍光を検出することができる。酵素標識を用いた場合は、各標識に応じて適当な基質を作用させて、反応産物を検出することができる。また、ハプテン標識を用いた場合は、該ハプテンを認識する標識した抗体に次抗体)を、上記の抗体-前腸細胞の複合体に接触させて二次抗体を検出することができる。この場合、該二次抗体は、蛍光標識、生物発光標識、酵素標識又は放射性標識により標識されるのが好ましい。

[0035] また、上記の抗体を標識して!/、な、場合は、該抗体に結合可能な標識した抗体 (二次抗体)を、上記の抗体一前腸細胞の複合体に接触させ、二次抗体を検出すればよい。該二次抗体は、蛍光標識、生物発光標識、酵素標識又は放射性標識により標識されるのが好ましい。 [0036] また、細胞表面分子マーカーの検出を、該マーカーに対するァプタマ一を用いて行う場合、該ァプタマ一は、公知の方法に従って製造することができ、例えば Murphy , M.B., Fuller, S.T., Richardson, P.M., Doyle, S.A, (2003) "An improved method for the in vitro evolution of aptamers and applications in protein detection and purificat ion." Nucleic Acids Res. 31, el 10に記載された方法に従って得ることができる。得られたアブタマ一を用いて細胞表面分子マーカーを検出するには、公知の方法を用いることができ、例えば Mi, J. et al, (2005) "Targeted inhibition of alphavbeta 3 integrin with an RNA aptamer impairs endothelial cell growth and survival. Biochem Biophy s Res Commun. 338, 956-63に記載された方法を用いることができる。

[0037] 本発明の前腸細胞の検出方法にお!、て検出される前腸細胞は遺伝子組み換えされないことが好ましいが、本発明の前腸細胞の検出方法は、上記の細胞表面分子マ一力一の遺伝子レベルでの組換えにより細胞表面分子マーカーの検出を行うことを排除するものではな、。細胞表面分子マーカーの遺伝子レベルでの組換えにより該マーカーを検出する方法としては、当該技術において公知の方法を用いることができる。このような方法としては、例えば該細胞表面分子マーカーの遺伝子の上流に、検出可能なタンパク質をコードする遺伝子を挿入する方法が挙げられる (例えば、 Hisat une, H., et al. (2005) high level of endothelial cell- specinc gene expression by a co mbination of the 5' flanking region and the 5' half of the first intron of the VE- cadhe rin gene." Blood. 105, 46⁵⁷- 63を参照)。該検出可能なタンパク質をコードする遺伝子は、当該技術において通常用いられているものであればよぐ例えば蛍光タンパク質遺伝子 (例えばルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質 (GFP)など)、薬剤耐性遺伝子 (例えばネオマイシン而性、ピューロマイシン而性、ハイグロマイシン而性、ゼォシン耐性など)を用いることができる。なお、本明細書において「細胞表面分子マーカーの遺伝子」とは、細胞表面分子マーカーの構造遺伝子のみならず、プロモーター、オペレーター、ェンノヽンサ一などの制御機能をもつ領域も含む。

[0038] 上記の細胞表面分子マーカーを検出することにより、哺乳動物の前腸細胞に分ィ匕し得る細胞から、甲状腺、胸腺、唾液腺、食道、肺、肝臓、脾臓などの前方内胚葉系成熟細胞に分化誘導する際に、前腸細胞を経由して分化が行なわれているかをモ二タリングすることができる。よって、本発明は、哺乳類の前腸細胞の表面に存在する細胞表面分子マーカーを検出することを含む、前腸細胞に分化し得る細胞から前方内胚葉系成熟細胞への分ィ匕過程をモニタリングする方法でもある。

[0039] 上記のモニタリングする方法は、（1)前腸細胞に分化し得る細胞に適当な分化誘導因子を加えて一定期間培養する工程、及び (2)培養して得られた培養液の一部を回収し、回収した培養液中の前腸細胞の表面に存在する細胞表面分子マーカーを検出する工程を含むのが好まし!/、。

[0040] 上記の工程 (1)で用いられる分ィ匕誘導因子は、当該技術において通常用いられるものであれば特に限定されず、例えばトランスフォーミング増殖因子 β (TGF |8；例えば TGF- 1および TGF- β 3)、骨开成因子（BMP) (例えば BMP- 2、 BMP- 4、 BMP- 6)およびダルココルチコイド (例えばデキサメタゾン）、インヒビン A、軟骨形成刺激活性因子（CSA)、コンドロモジュリン（ChM) (ChM-l)、カドヘリンを挙げることができる力これらに限定されない。

[0041] 上記の前腸細胞に分ィ匕し得る細胞を培養するための培地は、当該技術において通常用いられるものであれば特に限定されない。また、これらの培地には血清や増殖因子などを適宜カ卩えることができる。上記の培地としては、例えばイーグル培地のような最少必須培地（MEM)、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM)、 a -MEM, Ha m's F- 12及び F- 10培地、 DMEM/F12培地、 Williams培地 E、 RPMI- 1640培地、 MCD B培地、 199培地、 Fisher培地、 Iscove改変ダルベッコ培地（IMDM)、 McCoy改変培地などを挙げることができる力これらに限定されない。これらの培地には、必要であれば、ペニシリン、ストレプトマイシンなどのような抗生物質も添加してもよい。また、必要に応じて、種々の成長因子/増殖因子、栄養因子、接着因子、血清などの添加剤を培地に添加することができる。このような添加剤としては、例えば、塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF又は FGF-2)、トランスフェリン、インスリン、インスリン様成長因子（IG F)、ヒアルロン酸、ァスコルビン酸、亜セレン酸、リノレイン酸、ピルビン酸を挙げることができる。

[0042] 培養条件は、当該技術において通常用いられるものであれば特に限定されない。

例えば、 37°C、 5%CO、 90%RHの条件を用いることができる。上記の工程 (1)は、モニタリングを行うことが望まれる期間継続して培養を行うことができる。

[0043] 上記の（2)の工程は、上記の細胞表面分子マーカーの検出方法と同様にして行うことができる。

[0044] 本発明の分離方法において、上記の検出方法により検出された前腸細胞を分離する工程としては、上記の細胞表面分子マーカーに対する抗体を用いて検出を行なつた場合、該抗体又は該抗体を認識する二次抗体に結合した標識を用いて、他の細胞から区別可能となった細胞の分離を行うことができる装置により、前腸細胞を分離する方法が挙げられる。

上記の装置としては、フローサイトメータを好適に用いることができる。そのような装置は巿販されており、例えば細胞ソーター付きフローサイトメータ Aria (Becton Dickin son社製)などを用いることができる。

[0045] 上記の分離する工程としては、細胞表面分子マーカーに対する抗体又は該抗体を認識する二次抗体に結合し得るリガンドを固定ィ匕したビーズやマトリックスなどの水不溶性担体と、上記の抗体と結合した前腸細胞とを接触させてこれらを結合させることを利用して分離する方法を用いることもできる。

また、上記の抗体に例えば磁性粒子を結合させて、該抗体と結合した前腸細胞を磁気ビーズを用いて分離することもできる。このような方法としては、例えば Semple, J. W., Allen, D., Chang, W., し astak , P., Freedman, J. (1993) Rapid separation of C D4+ and CD 19+ lymphocyte populations from human peripheral blood by a magnetic activated cell sorter (MACS)." Cytometry. 14, 955- 60に記載の方法を挙げることができる。

[0046] また、上記の分離は、細胞表面分子マーカーの遺伝子レベルでの糸且換えにより発現させた蛍光タンパク質遺伝子を利用して行うこともできる。この際、例えば上記の細胞ソーター付きフローサイトメータ Aria (Becton Dickinson社製)を用いることにより分離を行うことができる。

[0047] 上記の分離方法により分離された前腸細胞も、本発明の一つである。本発明の分離方法により分離された前腸細胞を用いて肝臓、脾臓などの各器官への分化を研究することは、本来の細胞の動態により近い知見が得られることから、発生生物学及び幹細胞生物学の分野にぉ、て好まし、。

実施例

[0048] 以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は以下の実施例により限定されるものではない。

細朐表 rif分子マーカーの選択

顕微鏡観察下に、マウス胎生 8日胚力前腸と中腸を分離して採取した。採取した前腸及び中腸から、トリゾール (登録商標)試薬 Onvitrogen社製)を用いてそれぞれ RN Aを抽出した。エタノールを用いて沈殿させた RNAを再び RNAフリー水に溶解し、オリゴ dTプライマ (Amersham社製)及び逆転写酵素 (Invitrogen社製)を用 V、て逆転写反応を行い、 cDNAを合成した。得られた cDNAを、ラベリングキット (Aifymetrix社製 )を用いてピオチン標識した。得られたピオチン標識 cDNAを、 40 mMトリス—ァセテート (ナカライテスタ社製)、 100 mM酢酸カリウム (ナカライテスタ社製)、 30 mM酢酸マグネシゥム (ナカライテスタ社製)を含む溶液中で、 94°C、 35分間インキュベートして断片化した。断片化した cDNAを、ジーンチップ (登録商標)マウスゲノム U74v2 (MGU4 A, Bと Cv. 2)アレイ (Aflfymetrix社製)と反応させた。得られたデータは、 Microarray Sui teソフトウェア (MAS) (Aifymetrix社製)を用いて解析した。

[0049] 中腸から得られた RNAに由来するデータと、前腸から得られた RNAに由来するデ一タとを比較し、前腸細胞に特異的な分子マーカー候補を選択した。これらの分子マーカー候補は、細胞表面に存在するマーカーであることは、 Entrezからの情報により確認した c

選択した分子マーカー候補は、 PTPRD、 Slco4cl、 Frt3、 Dplll、 GPR85、 Colecl2、 C CKAR、 CD47、 CD49f、 CD121a、 RAEcゝ FZD2、 FZD4、 FZD7、 FZD8及び TGFbR2であった。

[0050] In situハイブリダィゼーシヨン

(i) RNAプローブの作製

in situハイブリダィゼーシヨンのプローブとして用いるために、 PTPRD、 Frt3、 GPR85 、 Colecl2、 CCKAR、 CD47、 FZD4、 FZD7及び TGFbR2のそれぞれに特異的なジゴキシゲニン (DIG)標識 RNAプローブを、次のようにして作製した。

Mouse 11 -day Embryo Marathon— Ready cDNA、 Mouse Brain Marathon— Ready cD NA及び Mouse Kidney Marathon-Ready cDNA (全て Clonetech社製)を铸型として用い、以下の表 2に示すプライマを用いて PCRを行なった。 PCR反応液の組成は、次のとおりである。

蒸留水 (dH 0) 36〜38 μ 1

10 Xバッファー (Stratagene社製） 5 μ 1

dNTPs (2.5 mMの各 NTP) (Takara社製） 4 μ 1

铸型 DNA (10〜500 ng/ 1) 1〜2 1

フォワードプライマ (10 ρΜ/ μ 1) 0.5〜1 μ 1

リバースプライマ (10 ρΜ/ 1) 0.5〜1 1

Pfii DNAポリメラーゼ (2.5U/ a 1) (Stratagene朴-製） 1 a 1

計 50 /z l

PCRは、 95°Cで 30秒、 55〜60°Cで 30〜60秒及び 72°Cで 30〜90秒を 1サイクルとして、 25〜35サイクルで行なった。

[0051] [表 2]

[0052] 得られた PCR断片を pGEM- T- easy vectorシステム (Promega社製)にクローユングして各 PCR断片がそれぞれ挿入されたベクターを得た。このベクターを用いて、 DIG R NAラベリングキット (Roche社製)を使用説明書に従って用いて DIG標識 RNAプローブを作製した。

[0053] (ii) in situハイブリダィゼーシヨン

妊娠 8日目のマウス胚を PBS (リン酸バッファー） pH 7.2 (Invitrogen社製)中で摘出し、 4%パラホルムアルデヒド中でー晚反応させて固定した。この胚を、脱水処理して 1 00%メタノール中に保存した。保存された胚を、 75%メタノール ZPBST (0.1% Twee n20を含有するリン酸バッファー）、 50%メタノール ZPBST、 25%メタノール ZPBST の順に置換して水和した。 PBSTに置換して室温で 5分間、 3回振とうした。これを、 1 〜10 /z g/mlプロティナーゼ K(Roche社製)を含む PBST中で 3分間処理した。 PBST で 2回洗浄後、 0.2%ダルタルアルデヒド (Sigma社製)を含む PBSTに置換して、室温で 20分間振とうした。 PBSTに置換して、室温で 5分間、 2回振とうした。次いで、ハイブリダィゼーシヨン反応液 (50%ホルムアルデヒド (ナカライテスタ社製)、 SSC、 5mM EDTA (ナカライテスタ社製)、 50 μ g/ml酵母 RNA(Invitrogen社製)、 50 μ g/mlへパリン (和光純薬社製)、 0.1〜1.0% CHAPS (ナカライテスタ社製)、 0.1〜0.2% Tween 20 (ナカライテスタ社製》中に、 65°Cで 1〜3時間反応させた。

[0054] この胚を、上記の DIG標識した RNAプローブの!/、ずれかを含む (0.2〜1 μ g/ml)ハイブリダィゼーシヨン反応液中で、 55〜65°Cで一晩反応させた。その後、胚を洗浄液 1(50%ホルムアルデヒド、 SSC、 5 mM EDTA, 0.5% SDS (ナカライテスタ社製)、 0.2% Tween 20)中に 65°Cで 2回リンスし、さらに 30分間で 2回洗浄した。次いで、洗浄液 2( 洗浄液 1 : MABT液 (100 mMマレイン酸ナトリウム (ナカライテスタ社製)、 150 mM NaC 1け力ライテスタ社製)、 0.1% Triton X100け力ライテスタ社製》の 1： 1(容量比)混液）中に、 65°Cで 10分間洗浄した。さらに、 MABT液を用いて室温で 3回リンスし、室温で 15分間洗浄した。胚を 2%ブロッキング液 (Roche社製)中に室温で 1時間ブロッキングした後、 20%熱処理ヒッジ血清 (Sigma社製)含有 2%ブロッキング液中に、室温で 1時間反応させた。 DIG核酸検出キット (Roche社製)の使用説明書に従って、アルカリホスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体と 4°Cで一晩反応させた。胚を MABT液を用いて 4°Cで 2回リンスし、 4°Cで 1時間、 3回洗浄した。次いで、 NTMT液 (100 mM Tri s-HCl (ナカライテスタ社製)、 0.1〜0.2% Tween 20、 1〜2 mMレバミゾール (levamisole ) (Sigma社製》中に室温で 10分間洗浄した。アルカリホスファターゼによる発色は、 N BT/BCIP液（Roche社製、 0.16〜40 mg/mlの-トロブルーテトラゾリゥム塩 Ζθ.18〜18 mg/mlの 5-ブロモ -4-クロ口- 3-インドリルリン酸）中に、室温で 2〜30分間反応させることにより行った。発色後、胚を 50%メタノール ZPBST中に室温で 15分間インキュべートした。 100%メタノールで脱水後、 0.1% Tween 20を含む 4%パラホルムアルデヒド含有リン酸バッファ一中に、室温で 30分間反応させ、次いで 1 mM EDTAを含むリン酸バッファ一中に室温で 2回インキュベートした。 25%グリセロール ZPBST中に室温 5 分間、 50%グリセロール ZPBST中に室温 5分間、 2回処理した後、 4°Cで写真撮影まで保存した。

[0055] 写真撮影は、デジタルカメラシステム、ライカ DFCシリーズ（Leica microsystem社製

)を用いて行った。結果を図 1に示す。

[0056] 免疫染色

妊娠 8日目のマウス胚を PBS (リン酸バッファー） pH 7.2 (Invitrogen社製)中で摘出し、 4%パラホルムアルデヒド中でー晚固定した。この胚を、固定液 (メタノール:ジメチノレスノレホキシドを 5： 1(容量比)で含む混液)を用いて固定した。固定後、メタノーノレ： 3 0% H 0 (Santoku Chemical社製）を 5 : 1(容量比)で含む混液で反応させ、内因性ぺ

2 2

ルォキシダーゼを不活ィ匕させた。親水化した胚をブロッキング液 (2%スキムミルク (Bee ton Dickinson社製)、 0.1%BSA (Sigma社製)、 0.1% Triton X100を含むリン酸バッファ一）中に室温で 1時間反応させた。その後、一次抗体を含む (100〜1000倍希釈)プロッキング液中に、 4°Cでー晚反応させた。一次抗体としては、抗 CD47抗体 miap301、抗 CD49航体 GoH3、抗 CD121a抗体 35F5及び抗 Raeltc抗体 CXI (全て Becton Dicki nson社製)を用いた。その後、胚をブロッキング液で 5回洗浄した。次いで、セィヨウヮサビペルォキシダーゼ (HRP)標識抗ラッ HgG抗体 (Biosource社製)を含む (100〜10 00倍希釈)ブロッキング液中に、 4°Cで一晩インキュベートした。胚を、ブロッキング液で 5回洗浄後、 0.1% Triton X100を含むリン酸バッファーで一度軽く洗浄した。発色は、 0.05% NiCl、 250 μ g/mlジァミノべンジジン (Dojin Chem社製)、 0.1% Triton X100を含むリン酸バッファ一中に、室温で 1〜10分間インキュベーションすることにより行った。 0.1% Triton X100を含むリン酸バッファーで 3回洗浄した後、写真撮影を行なった。写真撮影は、デジタルカメラシステム、ライカ DFCシリーズ（Leica microsystem社製 )で行った。結果を図 2に示す。

[0057] 以上の結果から、マウスの胎児由来の前腸細胞表面に存在する細胞表面分子マ一力一を初めて特定することができた。

マウスの ES細胞由来の内胚葉系幹細胞に特異的な表面マーカーは、ヒトにおいても特異的なマーカーとして用いることができることが知られていることから (McGrath, K • E" Koniski, A.D., Maltby, K.M., McGann, J.K., Palis, J. (1999) Dev Biol. 213. 442 —56.; Yasunaga, M.'Tada, S., Tonkaト Nishikawa, S., Nakano, Y., Okada, M., Jakt, L .M., Nishikawa, S.， Chiba, T.， Era, T.， Nishikawa, S. (2005) Nat Biotechnol. 23.154 2-50. ; D 'Amour K.A., Agulnick, A.D., Eliazer, S., Kelly, O.G., Kroon, E., Baetge, E.E.(2005) Nat Biotechnol. 23.1534-41.)、マウスにおいて有用な細胞表面分子マーカーは、ヒトにおいても有用な細胞表面分子マーカーとして用いることができる可能性が高い。よって、本実施例において同定された細胞表面分子マーカーも、ヒトの前腸細胞の表面分子マーカーとして用いることができる。

[0058] この出願は、 2006年 4月 3日に出願された日本国特許出願 2006— 102178及び 2006年 4月 5日に出願された日本国特許出願 2006— 104297に関し、これらの特許請求の範囲、明細書、図面及び要約書の全ては、本明細書中に参照として組み込まれる。

Claims

請求の範囲

[1] 哺乳類の前腸細胞を含み得る細胞集団に対し、前記前腸細胞の表面に存在する細胞表面分子マーカーに感応する物質を作用させて前記前腸細胞を検出することを含む前腸細胞の検出方法。

[2] 前記細胞表面分子マーカーが、 PTPRD、 Slco4cl、 Flrt3、 Dplll、 GPR85、 Colecl2、

CCKAR、 CD47、 CD49f、 CD121aゝ Raetlcゝ FZD2、 FZD4、 FZD7、 FZD8及び TGFbR2 の少なくとも 1種である請求項 1に記載の検出方法。

[3] 前記前腸細胞の表面に存在する細胞表面分子マーカーに感応する物質が、前記細胞表面分子マーカーに対する抗体である請求項 1又は 2に記載の検出方法。

[4] 請求項 1〜3のいずれか 1項に記載の検出方法により検出された前腸細胞を分離することを含む前腸細胞の分離方法。

[5] 請求項 4に記載の分離方法により分離された前腸細胞。