JP2002101889A

JP2002101889A - 新規遺伝子型判定方法

Info

Publication number: JP2002101889A
Application number: JP2000299498A
Authority: JP
Inventors: Kazunori Shimada; 和典島田; Takuya Koshizaka; 卓也越坂; Shikei Azuma; 史啓東; Chiho Suzuki; 千穂鈴木
Original assignee: GENOME SCIENCE LAB CO Ltd; GENOME SCIENCE LABORATORIES CO Ltd
Current assignee: GENOME SCIENCE LAB CO Ltd; GENOME SCIENCE LABORATORIES CO Ltd
Priority date: 2000-09-29
Filing date: 2000-09-29
Publication date: 2002-04-09

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】 HLAを含む従来の遺伝子型判定方法の問題点
を解決した簡便、迅速、かつ正確な点変異検出方法及び
試薬の提供。【解決手段】特異的プライマーを用いた遺伝子増幅反
応と、特異的プローブを用いたハイブリダイゼーション
反応を組み合わせて行うことからなる、同時に複数の点
変異を検出する遺伝子型判定方法。好ましい態様におい
て、目的とする点変異が各々の3’末端近傍に位置する
ように設定したフォワードプライマー及びリバースプラ
イマーからなる特異的プライマーセットを用いて遺伝子
増幅を行うことによりフォワード側とリバース側で各々
１カ所以上の点変異を判別し、遺伝子増幅産物を、目的
とする点変異を含むように設定した特異的プローブとハ
イブリダイゼーションさせることにより更に１カ所以上
の点変異を判別することからなる、３カ所以上の点変異
を同時に検出する遺伝子型判定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、点変異を判別する
方法に関する。より特定すれば、本発明は、特異的プラ
イマーを用いた遺伝子増幅反応と特異的プローブを用い
たハイブリダイゼーション反応を組み合わせることで、
簡便、迅速かつ正確に点変異を判別する方法に関する。

【０００２】

【従来技術】遺伝子型の分析は、PCR法の開発により飛
躍的に進歩した。ヒト白血球抗原（以下、HLAと略す）
を例にとれば、従来の抗血清やモノクローナル抗体を用
いた血清学的タイピングや混合リンパ球培養を用いた細
胞学的タイピングに加え、PCR増幅を基にしたいわゆるD
NAタイピングが用いられるようになった。以下にそのい
くつかの方法の特徴を説明する。＜PCR-SSP法＞判別する点変異を含む特異的プライマー
を用いて遺伝子増幅反応を行い、点変異の有無によって
増幅効率に著しい差が生じることで判別を行う方法であ
る（参考文献２）。本来は特異的プライマー配列中に数
ヶ所の特異的変異箇所があることが望ましいが、目的と
する点変異を特異的プライマーの3’末端近傍になるよ
うに設定し、適正な温度・時間条件で遺伝子増幅を行う
ことにより、１点の変異であっても判別が可能である。
特異的プライマーはフォワード側、リバース側のどちら
か片側で変異の有無は判別が可能だが、フォワード側の
み変異、リバース側のみ変異、および両側変異等の組み
合わせを同時に判別することは不可能である。＜PCR-SSO法＞目的とする点変異の領域を含むように設
計したプライマーセットによって増幅した遺伝子増幅産
物を、目的とする点変異を配列中に含む特異的プローブ
とハイブリダイゼーションさせ、ミスマッチが存在する
場合は、増幅産物がプローブとハイブリダイゼーション
をしないことを利用して判別する方法である（参考文献
３）。ハイブリダイゼーションの条件を適正にすること
で、１点の変異でも判別が可能である。＜PCR-SSCP法＞目的とする点変異の領域を含むように設
計したプライマーセットによって増幅した遺伝子増幅産
物を変性させて一本鎖にした後に、一本鎖再構成させ、
電気泳動での移動度の差異によって点変異の検出を行う
方法である。基本的には複数の点変異の存在と組み合わ
せによって、すべての移動度に差が生じると考えられる
が、適正な電気泳動条件でも差は非常に小さい場合が多
く、手技が煩雑で判断が困難である。＜PCR-RFLP法＞目的とする点変異の領域を含むように設
計したプライマーセットによって増幅した遺伝子増幅産
物を、特定の配列を認識して切断する制限酵素を使用し
て切断し、その切断の有無で点変異を判別する方法であ
る。しかし、目的とする点変異に対応する制限酵素が存
在しなかったり、非常に希少な場合がある。さらに、切
断された増幅産物の長さを検出する必要がある場合が多
く、現状では電気泳動法によって判定する必要があり、
手技が煩雑である。

【０００３】例えば、現在、HLA classII DRB1のロウレ
ゾリューションの遺伝子型判定方法としては、上記の方
法を用いた判定キットが多数市販されている。にもかか
わらず、ヒト抗血清を用いた血清学的手法が主に用いら
れているのが現状である。その理由は、手技が煩雑であ
ること、判定に熟練を要すること、コストが高いこと等
である。しかしながら、血清学的手法で使用するヒト抗
血清は、原材料をヒト由来の血液に頼るため、均一で安
定な原材料の供給に問題がある。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、HLAを含む従来の遺伝子型判定方法の問題点を解決
し、簡便、迅速、かつ正確な点変異検出方法および試薬
を提供することである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、関連性を
持つ複数の点変異により決定される遺伝子型の判定、例
えばHLA classII DRB1のロウレゾリューションの遺伝子
型等を、簡便、迅速、かつ正確に判定する方法として、
従来法であるPCR-SSP法とPCR-SSO法を組み合わせること
により、前記問題点が解決されることを見いだした。

【０００６】本発明によれば、従来の遺伝子型判定方法
の欠点である手技の煩雑さ、高いコスト等を克服するこ
とが可能であり、正確な判定、安定した原材料供給等の
利点を持ち、更に、簡便、低コストな遺伝子型判定方法
が提供される。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明の一つの側面において、特
異的プライマーを用いた遺伝子増幅反応と、特異的プロ
ーブを用いたハイブリダイゼーション反応を組み合わせ
て行うことからなる、同時に複数の点変異を検出する遺
伝子型判定方法が提供される。

【０００８】より好ましい態様において、目的とする点
変異が各々の3’末端近傍に位置するように設定したフ
ォワードプライマー及びリバースプライマーからなる特
異的プライマーセットを用いて遺伝子増幅を行うことに
よりフォワード側とリバース側で各々１カ所以上の点変
異を判別し、そして遺伝子増幅産物を、目的とする点変
異を含むように設定した特異的プローブとハイブリダイ
ゼーションさせることによりさらに１カ所以上の点変異
を判別することからなる、３カ所以上の点変異を同時に
検出する遺伝子型判定方法が提供される。

【０００９】遺伝子型特異的プライマーの設計において
は、目的とする点変異が各々の3’末端近傍に位置する
ようにフォワードプライマー及びリバースプライマーを
設定する。プライマーの3'末端が変異部位になるように
設定することが好ましく、3'末端の数塩基上流が変異部
位になるように設定することも可能であるが、選択性は
低下する。遺伝子型特異的プライマーの長さは任意であ
るが、プローブ設定位置および配列に依存して、設計す
る必要がある。プライマー設定位置とプローブ設定位置
が接近又は一部が重複せざるを得ない場合でも目的とす
る点変異部位にかからなければ判別は可能である。

【００１０】本発明の目的において、遺伝子型特異的プ
ライマーを用いたPCR-SSPに先立って、当該領域の全長
を網羅するように標的遺伝子領域増幅用のプライマーを
設定して増幅することは、選択性を上昇できる点、検体
量を少なくできる点等、様々な面で有用である。標的遺
伝子領域増幅用プライマーの濃度は、遺伝子型特異的プ
ライマーを用いたPCRの段階でコンタミネーションやPCR
-SSPによる判別が不可能になる等の副反応の原因となる
ため、低くする必要がある。

【００１１】判定のためのサンプルは、抽出及び精製し
たゲノム遺伝子、当該遺伝子含有プラスミド、分離・精
製したリンパ球等を用いるのが一般的であるが、検体、
例えば全血等を直接用いることもできる。全血から直接
PCRを行う場合には、全血中に含まれるTaq DNAポリメラ
ーゼの阻害物質の働きをブロックする成分、例えばポリ
アミンを含有し、かつpHを中性域よりやや高めにした反
応バッファーを用いることが好ましい。例えば、島津製
作所社製のバッファーAmpDirectを使用することができ
る。

【００１２】増幅産物を容易に検出するためには、フォ
ワードプライマー及びリバースプライマーの一方を標識
することが好ましい。標識は、限定されないが、ビオチ
ン、ジニトロフェニル（DNP）、ジゴキシゲニン（DIG）
又は蛍光物質、例えばFITC及びCy5等が含まれる。

【００１３】プローブは、担体に効率良く固相化するた
めにプライマーの標識体以外の標識体を含むことが好ま
しい。好ましくは、アミンおよびビオチンであり、最も
好ましいのはアミンである。

【００１４】好ましい態様において、プローブは固相化
される。好ましい固相は、マイクロプレート、ビーズ、
メンブレン等が例示される。本発明の判定方法及びキッ
トに最も好ましい担体は、マイクロプレートである。

【００１５】マイクロプレートにオリゴプローブを固相
する方法は、公知の方法を用いることができる。例え
ば、アビジン固相したプレートに合成の段階でビオチン
標識したプローブをアビジン-ビオチン反応を利用して
固相する方法や、ポリスチレンプレートの疎水性を利用
して固相する方法などがある。前者の場合はプレートで
の検出の段階でアビジン-ビオチン反応を使用すること
ができないため、ジゴキシゲニンやジニトロフェニル等
の標識体と酵素標識したそれらの抗体を使用する。核酸
標識に制限を生じる場合には、サクシイミド基を固相面
に結合させたプレートを用い、合成の段階でアミノ基を
結合させたプローブと反応させて固相することもでき
る。

【００１６】本発明の最も好ましい態様によれば、検出
段階にマイクロプレートを使用し、インキュベーション
温度や使用する試薬に工夫を加えることで、測定系全体
の手技も簡便化される。手技の簡便化は製品としてのコ
ストの削減、さらに測定時の人件費の削減にも寄与し、
トータルのコスト削減を可能にする。最終段階での遺伝
子型判定に関しては、数ヶ所の点変異を１ウェルで判定
できる利点を生かし、１ウェル１遺伝子型の判定を行う
ことで、従来法の複雑な判定表を用いた判定が不要とな
る。

【００１７】本発明の方法は多様な遺伝子型に適用可能
であるが、特に、HLA classII DRB1のロウレゾリューシ
ョンの遺伝子型の判定に有用である。HLA classII DRB1
のロウレゾリューション判定（２桁タイピング）とは血
清学的レベルの型判定のことであり、現在DR1、3、4、
7、8、9、10、11、12、13、14、15、及び16の13種類に
分別される。DRB1をコードする遺伝子は第６染色体上に
存在し、そのエクソン２の領域ではDRB1のハイレゾリュ
ーション（４桁タイピング）の遺伝子型が判別できるこ
とが知られている（参考文献１）。

【００１８】DRB1のエクソン２は270塩基対であり、そ
の中に点在する変異の組み合わせによりDRB1の遺伝子型
が決定される。現在、DRB1のハイレゾリューションでは
200種類以上の型がGenBankに登録され、エクソン２のほ
ぼ全長の配列が解析されている。その配列をロウレゾリ
ューションの型ごとに並べてみると、共通に他の型と区
別される変異を見つけることができる。現存するキット
では、この共通の変異をPCR-SSP法やSSO法により検出す
るが、SSO法では１点（隣接する変異であれば複数点も
可能）、SSP法でも２点の変異しか検出できないため、
一部の遺伝子型では複合的な判定が必要となる。しかし
ながら、DRB1のエクソン２内では、変異の起こりやすい
領域はある程度決まっており、特定の遺伝子型のみが変
異を起こしている箇所はむしろ少ない。そして、変異の
起こりやすい領域内では、複数の遺伝子型間で塩基配列
が相同である。即ち、変異を起こしやすいいくつかの領
域の変異の組み合わせと、遺伝子型特有のいくつかの変
異の組み合わせにより遺伝子型が決まる（図１−３）。
また、同一遺伝子型内でのさらなる点変異も報告されて
おり、例えばDR13遺伝子型においては40数種の配列がGe
nBankに登録されている。

【００１９】さらに、ヒトゲノムが二倍体であることに
起因して、判定はより複雑になる。例えば、ＸとＹの２
つの点変異について考えると、共に変異していない
型、Ｘのみ変異している型、Ｙのみ変異している
型、そして共に変異している型の４種類の態様が存在
する。これが一倍体遺伝子であれば２点の変異で４種類
の判別が可能であるが、二倍体であるために判定は複雑
化する。例えば、Ｘのみに変異を検出した場合、/
のホモ及び/のへテロの２通りの態様が存在する。
更に、Ｘ及びＹの両方に変異を検出した場合は、/
、/、/、/、及び/の５通りの態様が
存在する。即ち、これらの判別のためには、複数の変異
の検出による複合判定が必要となる。したがって、遺伝
子型に特有の変異のみに基づいた１−２点の変異の検出
では、DRB1の上記13種類の明確なタイピングは不可能で
ある。

【００２０】本発明によれば、HLA classII DRB1のロウ
レゾリューションの遺伝子型を、DR1、DR3、DR4、DR7、
DR8、DR9、DR10、DR11、DR12、DR15、及びDR16の11種
類、DR13に関してはDR1301等を含むDR13-1及びDR1303等
を含むDR13-2の２種類、DR14に関してはDR1401等を含む
DR14-1、DR1402等を含むDR14-2、及びDR1405を含むDR14
-3の３種類からなる16種類の何れかに判定する方法が提
供される。

【００２１】本発明によれば、ある特定の領域に存在す
る単独の点変異はもちろん、３種類以上の点変異の組み
合わせを判別することが可能である。例えば、血液中の
有核血球成分に含まれるゲノム遺伝子や、抽出・精製さ
れたゲノム遺伝子から簡便、迅速かつ正確にHLA classI
IのDRB1のロウレゾリューションの遺伝子型を判定する
ことができる。

【００２２】例えば、HLA classII DRB1のロウレゾリュ
ーションの遺伝子型の場合、DR1からDR16までの13種類
（DR2、5、及び6は欠番）を遺伝子レベルで判定するた
めに必要な数ヶ所の点変異とその関連性の検出をマイク
ロプレート上の１ウェルにて、簡便、迅速、かつ正確に
判定することができる。

【００２３】配列を詳細に検討した結果、DR1からDR16
の13種類を判別する場合、DR13とDR14を除く11種類は、
プライマーとプローブを組み合わせたセットにて、他の
型と判別可能であることが確認された。DR13及びDR14に
関しては、DR13について２種類、そしてDR14について３
種類に分類することで判別可能であり、13種類の遺伝子
型を16種類として判別される。

【００２４】例えば、DR1の場合、リバースプライマー
の配列（配列番号19）はDR1遺伝子型内で共通であると
同時に、DR15及び16のほぼ全て並びにDR４及び一部のDR
11と全く相同であるが、フォワードプライマーの3'末端
とプローブに含まれる変異をDR1特異的であって且つDR1
内で共通の配列とすることにより、DR1の特定が可能に
なる。

【００２５】また、DR8の場合、フォワードプライマー
の配列（配列番号８）はDR12の全てとDR13及び一部のDR
14に相同配列が存在し、リバースプライマーの配列（配
列番号23）はDR1，4，13，14,及び16に相同配列が存在
し、そしてプローブの配列（配列番号42）についてもDR
1，9，10,及び12以外に相同配列が存在する。しかしな
がら、３点何れかにおいて他の遺伝子型と相違すること
により、DR8のみを識別できることが明らかとなった。

【００２６】好ましい態様において、HLA classII DRB1
のExon2領域のほぼ全長を遺伝子増幅するため、最初に
配列番号１：tccccmcagc acgtttc（mはa又はc）のフォ
ワードプライマー、及び配列番号２：gcgctcacct cgcc
及び配列番号３：tagttgtgtctgcacacの２種のリバース
プライマーからなるプライマーセットを用いて遺伝子増
幅を行い、増幅産物をHLA classII DRB1の16種類の遺伝
子型に特異的な15種類のオリゴプライマー（配列番号４
-18）並びに19種類のビオチン修飾オリゴプライマー
（配列番号19-37）をセットとして遺伝子増幅を行い、
そして増幅産物をマイクロプレートに固相するためにア
ミン修飾した16種類のプローブ（配列番号38-53）とハ
イブリダイズさせて、ビオチンを検出することからなる
判定方法が提供される。

【００２７】より好ましい態様において、配列番号４-1
8のプライマー及び配列番号19-37のビオチン標識プライ
マーからなる群から選択される２乃至４種類のプライマ
ーセットを用いて遺伝子増幅を行い、増幅産物を一本鎖
にし、担体に固相化した約10から20塩基のオリゴプロー
ブとハイブリダイズさせ、そしてプライマーに標識した
物質を検出する判定方法が提供される。

【００２８】本発明の方法を用いれば、簡便、迅速かつ
正確に複数箇所に点在する点変異を一度に判別すること
が可能であり、例えばHLA DRB1では、現在行われている
ヒト抗血清を用いた方法に代わり、骨髄移植、臓器移植
等の移植医療の発展に寄与するはずである。

【００２９】以下の表１に、各遺伝子型の判定に適した
プライマーセットとプローブの好ましい組み合わせを例
示する。表中、Ｆはフォワードプライマーを、Ｒはリバ
ースプライマーを、そしてＰはプローブを示す。

【００３０】

【表１】遺伝子型 DRB1-DR1 Ｆ：配列番号４：cggagcgggtgcggttg Ｒ：配列番号19：gctgtcgaagcgcacgg Ｐ：配列番号38：gaaagatgcatctataac DRB1-DR3 Ｆ：配列番号５：cttccataaccaggaggaga Ｒ：配列番号20：tctgcagtarttgtccatcc Ｐ：配列番号39：gctgatgccgagtact DRB1-DR4 Ｆ：配列番号６：tttcttggagcaggttaaaca Ｒ：配列番号21：gcacgtactcytcttggtg Ｐ：配列番号40：tcttcaacgggacgg DRB1-DR7 Ｆ：配列番号７：gtataagtgtcatttcttcaac Ｒ：配列番号22：ggcgacaggccgctct Ｐ：配列番号41：cgggtgcagttcctg DRB1-DR8 Ｆ：配列番号８：ttcttggagtactctactgg Ｒ：配列番号23：tccgtcaccgcccggt Ｐ：配列番号42：gatacttctataacca DRB1-DR9 Ｆ：配列番号９：gtttgagtgtcatttcttcaac Ｒ：配列番号24：tcctcttggttatagatgcc Ｐ：配列番号43：tgcggtatctgcaca DRB1-DR10 Ｆ：配列番号９：gtttgagtgtcatttcttcaac Ｒ：配列番号25：ccccacgtcgctgtcgt Ｐ：配列番号44：aagacgcgtccataac DRB1-DR11 Ｆ：配列番号10：cagcgacgtgggggagtt Ｒ：配列番号26：cgcggcccgcctgtct及び配列番号27：cgcggcgcgcctgtct及び配列番号28：cgcggcccgctcgtct Ｐ：配列番号45：cctgatgaggagtac DRB1-DR12 Ｆ：配列番号11：cataaccaggaggagctcc Ｒ：配列番号27：cgcggcgcgcctgtct Ｐ：配列番号46：gccgagtcctggaac DRB1-DR13 Ｆ：配列番号12：cagcgacgtgggggaatt Ｒ：配列番号29：cggcccgcctgtct及び配列番号30：cggcccgctcgtct Ｐ：配列番号47：ctgatgccgagtact DRB1-DR13 Ｆ：配列番号13：gtactctacgtctgagtttc Ｒ：配列番号31：cccgctygtcttccaggat Ｐ：配列番号48：cggcctagcgccgagta DRB1-DR14 Ｆ：配列番号14：ttccataaccaggaggagtt Ｒ：配列番号32：ccacctcggcccgcctcc Ｐ：配列番号49：tgcggagcactgga DRB1-DR14 Ｆ：配列番号15：gggtgcggttcctggag Ｒ：配列番号33：cagtaggtgtccaccgcgg及び配列番号34：cagtaggtgtccaccaggg Ｐ：配列番号50：ggaggagaacgtgcg DRB1-DR14 Ｆ：配列番号16：actctacgtctgagtgtcaa Ｒ：配列番号35：ttctggctgttccagtactca Ｐ：配列番号51：gaggagttcgtgcgc DRB1-DR15 Ｆ：配列番号17：cctggacagatacttctataaycag Ｒ：配列番号36：gtgtccaccgcggcccgcg Ｐ：配列番号52：ggggagttccgggc DRB1-DR16 Ｆ：配列番号18：gtggcagcctaagagg Ｒ：配列番号37：gcggcscgcctgtct Ｐ：配列番号53：cctgacgctgagtac 本発明の別の側面によれば、表１に記載された、判定さ
れる遺伝子型ごとのフォワードプライマー、リバースプ
ライマー及びプローブの３種類からなる、プライマーと
プローブのセットが提供される。好ましい態様におい
て、リバースプライマーはビオチンにより修飾され、そ
してプローブはアミンにより修飾される。

【００３１】本発明のプライマー／プローブセットは、
判定に適した形態にてキットに含ませることができる。
好ましい態様において、キット中のプローブは固相化さ
れる。好ましい固相は、マイクロプレート、ビーズ、メ
ンブレン等が例示される。本発明の判定キットに適した
担体としては、マイクロプレートがもっとも好ましい。

【００３２】マイクロプレートにオリゴプローブを固相
する方法は、公知の方法を用いることができる。例え
ば、アビジン固相したプレートに合成の段階でビオチン
標識したプローブをアビジン-ビオチン反応を利用して
固相する方法や、ポリスチレンプレートの疎水性を利用
して固相する方法などがある。前者の場合はプレートで
の検出の段階でアビジン-ビオチン反応を使用すること
ができないため、ジゴキシゲニンやジニトロフェニル等
の標識体と酵素標識したそれらの抗体を使用する。核酸
標識に制限を生じる場合には、サクシイミド基を固相面
に結合させたプレートを用い、合成の段階においてアミ
ノ基を結合させたプローブと反応させて固相することも
できる。

【００３３】判定のためのサンプルは、抽出及び精製し
たゲノム遺伝子、当該遺伝子含有プラスミド、分離・精
製したリンパ球等を用いるのが一般的であるが、検体、
例えば全血等を直接用いることもできる。全血から直接
PCRを行う場合には、全血中に含まれるTaq DNAポリメラ
ーゼの阻害物質の働きをブロックする成分を含む反応バ
ッファーを用いることが好ましい。例えば、島津製作所
社製のAmpDirectを使用することができる。

【００３４】以下、本発明を実施例により具体的に説明
するが、下記実施例は本発明を例示するためのものであ
り、本発明を限定することを意図しない。

【００３５】

【実施例】実施例１：HLA classII DRB1のロウレゾリュ
ーションの遺伝子型の判定 HLA classII DRB1のロウレゾリューションは13種類の型
判別が必要である。データベースに登録されたDRB1のエ
クソン２の配列とシュードジーンであるDRB2からDRB9の
配列を検討した結果、一部の稀な遺伝子型を除き、プラ
イマーとプローブの組み合わせを適宜選択することによ
り、DR1，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，及
び16の13種類を判別できた。ただし、DR13と14に関して
は配列が複雑に組み合わさっているため１種類としては
判別できず、DR13に関しては２種類、DR14に関しては３
種類として判定し、合計16種類として判定した。

【００３６】一部の稀な遺伝子型とは、各々のDRに特異
的と考えられる点変異の周辺に別の点変異を有するもの
や、他のDRに特異的と考えられる点変異を有するものを
指す。これらの遺伝子型に関しては判定不能や誤判定と
なるが、その多くは頻度が非常に低いので、判定からは
除外した。

【００３７】本発明の方法においては、使用するサンプ
ル量の低減とPCR-SSP法による判別の確実性を向上させ
るため、PCR-SSP法を第２PCRとするネステッドPCR法を
用いた。＜第１PCR＞第１PCRにて使用するプライマーは、DRB1の
エクソン２領域に設定し、フォワード側はエクソン２の
上流側の末端の配列番号１、リバース側はエクソン２の
下流側の末端の配列番号２、そしてDR7及び9に特異的な
配列を末端に持つエクソン２の下流側の配列番号３を混
合して使用した。

【００３８】遺伝子抽出の過程を省略するため、全血を
サンプルとして用いた。よって、バッファーは、Taq DN
Aポリメラーゼ阻害物質の働きをブロックする成分を含
むため直接PCRを行える、島津製作所社製のAmpDirectを
使用した。

【００３９】プライマーの設計はDRB1のエクソン２の全
長を網羅し、全てのDRB1に関して増幅が可能であり、多
少残存した場合でもPCR-SSPに影響しないよう、短く設
計した。更に、後のPCR-SSPの検討において反応性の低
かったDR9の補完のために、リバースプライマーとして
配列番号３を追加した。

【００４０】第１PCRは、90μLスケールで、以下の成
分： AmpDirect1× Ｆプライマー 0.05μM（配列番号１）Ｒプライマー−１ 0.05μM（配列番号２）Ｒプライマー−２ 0.05μM（配列番号３） dNTPs 100μM Taqポリメラーゼ 2.5U 全血サンプル 0.3μL を含んだ。

【００４１】増幅条件は95℃、30秒→58℃、30秒→72
℃、30秒のサイクルを20回行った。この工程では、DRB1
のエクソン２の領域が増幅される。ただし、DRB2-9のシ
ュードジーンに関しても増幅は起こると考えられる。＜第２PCR＞第１PCRにおいて増幅した産物をDR1，3，
4，7，8，9，10，11，12，13-1，13-2，14-1，14-2，14
-3，15，及び16の16種類のプライマーミックスを用いた
PCR-SSP法によって判別した。

【００４２】数ヶ所あるDRB1のロウレゾリューションの
遺伝子型を決定する特異的な点変異のうち、プローブと
の組み合わせも考慮してプライマーの位置を設定した。
また、16種類のプライマーミックスを使用し、同じ温度
・時間条件にて遺伝子増幅を行うため、プライマーの長
さの調整や人為的な変異の導入を行った。その結果、以
下に示すようなプライマーの組み合わせでPCRを行うこ
とにした。

【００４３】

【表２】遺伝子型フォワードプライマーリバースプライマー DR1 配列番号４配列番号19 DR3 配列番号５配列番号20 DR4 配列番号６配列番号21 DR7 配列番号７配列番号22 DR8 配列番号８配列番号23 DR9 配列番号９配列番号24 DR10 配列番号９配列番号25 DR11 配列番号10 配列番号26、27及び28 DR12 配列番号11 配列番号27 DR13-1 配列番号12 配列番号29及び30 DR13-2 配列番号13 配列番号31 DR14-1 配列番号14 配列番号32 DR14-2 配列番号15 配列番号33及び34 DR14-3 配列番号16 配列番号35 DR15 配列番号17 配列番号36 DR16 配列番号18 配列番号37 （下線はArtificial sequenceであることを示す（配列表参照）） PCRは、25μLのスケールで、以下の成分：反応バッファー１×（AmpliTaq用）（20mM MgCl₂を含む）Ｆプライマー１μM（配列番号４-18）Ｒプライマー１μM（配列番号19-37、ミックスの場合も各々同濃度） dNTPs 200μM Taqポリメラーゼ 0.625U 第１PCR産物５μL を含んだ。

【００４４】増幅条件は95℃、30秒→60℃、30秒→72
℃、30秒のサイクルを50回行った。この段階の型特異的
プライマーの選択性を利用したPCR-SSPにより、検体中
の鋳型ゲノム遺伝子の型に応じて、遺伝子増幅効率の差
異が生じる。しかしながら、完全に特定の遺伝子型に対
してのみ増幅が生じるわけではなく、ある程度の非特異
増幅は生じると考えられる。＜プローブ固相マイクロプレートの作製＞固相担体はマ
イクロプレートを用い、そしてオリゴプローブを固相す
る際には、サクシイミド基を固相面に結合させたプレー
トを用い、合成の段階でアミノ基を結合させたプローブ
と反応させた。

【００４５】配列番号38-53の16種類の、5’末端にアミ
ノ基を修飾して合成したプローブをサクシイミドプレー
トの固相した。250nMの各プローブを含む0.5Mリン酸バ
ッファー（pH8.5）100μLずつをプレートの各ウェルに
加え、37℃において２時間放置した。各ウェルから溶液
を除去した後、１％BSAを含む１×PBSを250μL加え、37
℃において30分間ブロッキングを行い、そして0.1％Twe
en-20を含む0.5×PBS洗浄液により洗浄した。＜ハイブリダイゼーション＞上記で作製した検出用プレ
ートにハイブリダイゼーション液（６× SSPE、１%Twee
n-20、0.03M 塩酸）を100μLずつ加え、増幅が終了した
PCR産物に、当量である25μLの0.4M水酸化ナトリウムを
加えて一本鎖に変性させた液を、10μLずつ加えた。そ
の際、PCR産物は以下に示すような対応で各ウェルに加
えた。

【００４６】

【表３】 DR1の遺伝子増幅産物 → 配列番号38を固相したウェル DR3の遺伝子増幅産物 → 配列番号39を固相したウェル DR4の遺伝子増幅産物 → 配列番号40を固相したウェル DR7の遺伝子増幅産物 → 配列番号41を固相したウェル DR8の遺伝子増幅産物 → 配列番号42を固相したウェル DR9の遺伝子増幅産物 → 配列番号43を固相したウェル DR10の遺伝子増幅産物 → 配列番号44を固相したウェル DR11の遺伝子増幅産物 → 配列番号45を固相したウェル DR12の遺伝子増幅産物 → 配列番号46を固相したウェル DR13-1の遺伝子増幅産物 → 配列番号47を固相したウェル DR13-2の遺伝子増幅産物 → 配列番号48を固相したウェル DR14-1の遺伝子増幅産物 → 配列番号49を固相したウェル DR14-2の遺伝子増幅産物 → 配列番号50を固相したウェル DR14-3の遺伝子増幅産物 → 配列番号51を固相したウェル DR15の遺伝子増幅産物 → 配列番号52を固相したウェル DR16の遺伝子増幅産物 → 配列番号53を固相したウェル変性させるために加えた水酸化ナトリウムはハイブリダ
イゼーション液により中和される。このプレートを37℃
において30分間インキュベートした。

【００４７】この工程においては、各々の遺伝子増幅産
物のうち、型特異的プライマーにより選択的に増幅され
た増幅産物が存在し、その増幅産物とプレートに固相さ
れたプローブが完全に相補的な配列であった場合に、ビ
オチン修飾したリバース側のプライマーにより伸長した
側とプローブがハイブリダイゼーションする。この工程
における選択性は非常に高く、１塩基の相違でも判別が
可能であった。＜酵素標識＞0.1％Tween-20含有0.5×PBS洗浄液を用い
てプレートを洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識ストレ
プトアビジンを含む溶液を100μL加えて37℃において30
分間インキュベートして反応させ、PCR産物のビオチン
をペルオキシダーゼで標識した。

【００４８】よって、ビオチンが結合した増幅産物が固
相されたプローブとハイブリダイズしたウェルにのみ、
ペルオキシダーゼが標識される。＜発色反応＞0.1％Tween-20含有0.5×PBS洗浄液を用い
てプレートを洗浄した後、テトラメチルベンジジンと過
酸化水素を含む発色基質を100μLずつ加え、ペルオキシ
ダーゼの作用により青色に発色させた。室温にて20分間
発色させた後に発色停止液を加え、黄色に変色させた
後、吸光度計を使用して450nmの吸光度を測定した。＜結果＞全血サンプルを用いて試験したところ、目的と
するウェルに発色が認められ、判定が可能であった。抽
出したゲノム遺伝子、リンパ球、DRB1のエクソン２領域
を組み込んで作製したプラスミド等でも判定は可能であ
った。

【００４９】

【表４】

【００５０】

【発明の効果】本発明によれば、簡便かつ迅速にHLA cl
assII DRB1のロウレゾリューションの遺伝子型の判定が
可能であった。判定に関しては１ウェル１遺伝子型での
判定が可能となり、複数ウェルの発色を、判定表を用い
て複合的な判定する必要は無くなった。これら、構成す
る試薬の見直し、手技の簡便化、判定の簡素化により、
トータルなコスト削減が可能なHLA classII DRB1のロウ
レゾリューションの遺伝子型判定方法の提供は、今後の
移植医療や疾患特異性とHLA の関係に関する研究等に非
常に有用である。参考文献１．THE HLA facts book. Marsh S.G.E., Parham P.,
Barber L.D. AcademicPress, 2000. ２．Identification of the HLA-DRB1*04, -DRB1*07 an
d -DRB1*09 alleles byPCR amplification with sequen
ce-specific primers (PCR-SSP) in 2 hours. Zetterqu
ist H., Olerup O. Hum. Immunol. 34(1):64-74 1992. ３．Genetic analysis of amplified DNA with immobil
ized sequence-specificoligonucleotide probes. Sai
ki R.K., Walsh P.S., Levenson C.H., ErlichH.A. Pro
c. Natl. Acad. Sci. 86(16):6230-6234 1989

【００５１】

【配列表】ＳＥＱＵＥＮＣＥＬＩＳＴＩＮＧ <110> Genome Science Laboratories <120> Novel Method for Judging Genotype <130> 001688 <160> 53 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Primer employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 1 tccccmcagc acgtttc 17 <210> 2 <211> 14 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Primer employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 2 gcgctcacct cgcc 14 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Primer employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 3 tagttgtgtc tgcacac 17 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Primer employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 4 cggagcgggt gcggttg 17 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Primer employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 5 cttccataac caggaggaga 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Primer employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 6 tttcttggag caggttaaac a 21 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Primer employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 7 gtataagtgt catttcttca ac 22 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed primer. <400> 8 ttcttggagt actctactgg 20 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Primer employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 9 gtttgagtgt catttcttca ac 22 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Primer employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 10 cagcgacgtg ggggagtt 18 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Primer employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 11 cataaccagg aggagctcc 19 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed primer. <400> 12 cagcgacgtg ggggaatt 18 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed primer. <400> 13 gtactctacg tctgagtttc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Primer employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 14 ttccataacc aggaggagtt 20 <210> 15 <211> 17 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Primer employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 15 gggtgcggtt cctggag 17 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Primer employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 16 actctacgtc tgagtgtcaa 20 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Primer employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 17 cctggacaga tacttctata aycag 25 <210> 18 <211> 16 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Primer employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 18 gtggcagcct aagagg 16 <210> 19 <211> 17 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Primer employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 19 gctgtcgaag cgcacgg 17 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed primer. <400> 20 tctgcagtar ttgtccatcc 20 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Primer employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 21 gcacgtactc ytcttggtg 19 <210> 22 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed primer. <400> 22 ggcgacaggc cgctct 16 <210> 23 <211> 16 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Primer employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 23 tccgtcaccg cccggt 16 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Primer employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 24 tcctcttggt tatagatgcc 20 <210> 25 <211> 17 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Primer employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 25 ccccacgtcg ctgtcgt 17 <210> 26 <211> 16 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Primer employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 26 cgcggcccgc ctgtct 16 <210> 27 <211> 16 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Primer employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 27 cgcggcgcgc ctgtct 16 <210> 28 <211> 16 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Primer employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 28 cgcggcccgc tcgtct 16 <210> 29 <211> 14 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Primer employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 29 cggcccgcct gtct 14 <210> 30 <211> 14 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Primer employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 30 cggcccgctc gtct 14 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Primer employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 31 cccgctygtc ttccaggat 19 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Primer employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 32 ccacctcggc ccgcctcc 18 <210> 33 <211> 19 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Primer employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 33 cagtaggtgt ccaccgcgg 19 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Primer employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 34 cagtaggtgt ccaccaggg 19 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Primer employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 35 ttctggctgt tccagtactc a 21 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Primer employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 36 gtgtccaccg cggcccgcg 19 <210> 37 <211> 15 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Primer employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 37 gcggcscgcc tgtct 15 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Probe employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 38 gaaagatgca tctataac 18 <210> 39 <211> 16 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Probe employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 39 gctgatgccg agtact 16 <210> 40 <211> 15 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Probe employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 40 tcttcaacgg gacgg 15 <210> 41 <211> 15 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Probe employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 41 cgggtgcagt tcctg 15 <210> 42 <211> 16 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Probe employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 42 gatacttcta taacca 16 <210> 43 <211> 15 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Probe employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 43 tgcggtatct gcaca 15 <210> 44 <211> 16 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Probe employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 44 aagacgcgtc cataac 16 <210> 45 <211> 15 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Probe employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 45 cctgatgagg agtac 15 <210> 46 <211> 15 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Probe employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 46 gccgagtcct ggaac 15 <210> 47 <211> 15 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Probe employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 47 ctgatgccga gtact 15 <210> 48 <211> 17 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Probe employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 48 cggcctagcg ccgagta 17 <210> 49 <211> 14 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Probe employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 49 tgcggagcac tgga 14 <210> 50 <211> 15 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Probe employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 50 ggaggagaac gtgcg 15 <210> 51 <211> 15 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Probe employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 51 gaggagttcg tgcgc 15 <210> 52 <211> 14 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Probe employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 52 ggggagttcc gggc 14 <210> 53 <211> 15 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Probe employing the naturally occurred sequence of Human leukocyte antigen class II DRB1 Exon2. <400> 53 cctgacgctg agtac 15

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、HLA classII DRB1の16種の各遺伝子
型の代表の配列のイントロン１の最後の10塩基並びにエ
クソン２のヌクレオチド番号１から89のアラインメント
を、プローブ及びプライマーの設定位置と共に示す。記
載した各遺伝子型のGenBankの受け入れ番号は以下のと
おりである。DR0101＝AF142457；DR0301＝AJ237899；DR
0401＝X65587；DR0701＝AF142447；DR0801＝AF142449；
DR0901＝U66826；DR1001＝M20138；DR1101＝AF142465；
DR1201＝AF142448；DR1301＝AF142443；DR1303＝AF1424
45；DR1401＝AJ297582；DR1402＝AJ297583；DR1405＝M6
0209；DR1501＝AF142467；DR1601＝U56640。

【図２】図２は、図１の続きであり、HLA classII DR
B1の16種の各遺伝子型の代表の配列のエクソン２のヌク
レオチド番号90から188のアラインメントを、プローブ
及びプライマーの設定位置と共に示す。

【図３】図３は、図２の続きであり、HLA classII DR
B1の16種の各遺伝子型の代表の配列のエクソン２のヌク
レオチド番号189から270並びにイントロン２の最初の８
塩基のアラインメントを、プローブ及びプライマーの設
定位置と共に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ (72)発明者東史啓福島県福島市松川町美郷四丁目１番地の１株式会社ゲノムサイエンス研究所内 (72)発明者鈴木千穂福島県福島市松川町美郷四丁目１番地の１株式会社ゲノムサイエンス研究所内Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 CA09 CA11 CA20 HA13 HA14 4B029 AA07 AA23 BB20 CC03 CC08 FA15 4B063 QA01 QA13 QA17 QQ03 QQ42 QQ43 QQ52 QR08 QR32 QR35 QR40 QR42 QR56 QR62 QR84 QS25 QS34 QS35 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】特異的プライマーを用いた遺伝子増幅反
応と、特異的プローブを用いたハイブリダイゼーション
反応を組み合わせて行うことからなる、同時に複数の点
変異を検出する遺伝子型判定方法。
【請求項２】以下の工程：目的とする点変異が各々の
3’末端近傍に位置するように設定したフォワードプラ
イマー及びリバースプライマーからなる特異的プライマ
ーセットを用いて遺伝子増幅を行うことによりフォワー
ド側とリバース側で各々１カ所以上の点変異を判別し、
そして遺伝子増幅産物を、目的とする点変異を含むよう
に設定した特異的プローブとハイブリダイゼーションさ
せることによりさらに１カ所以上の点変異を判別するこ
とからなる、３カ所以上の点変異を同時に検出する遺伝
子型判定方法。
【請求項３】特異的プライマーセットを用いた遺伝子
増幅に先立ち、点変異領域を包含するDNA断片を増幅す
る工程をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】 HLA classII DRB1のロウレゾリューショ
ンの遺伝子型を判定する、請求項１乃至３の何れか１項
に記載の判定方法。
【請求項５】 HLA classII DRB1のロウレゾリューショ
ンの遺伝子型を、DR1、DR3、DR4、DR7、DR8、DR9、DR1
0、DR11、DR12、DR15、及びDR16に関して各１種類、DR1
3に関して２種類、そしてDR14に関して３種類からなる1
6種類の何れかに判定する方法であって、以下の工程：（ａ）HLA classII DRB1のExon2領域のほぼ全長を遺伝
子増幅するためのプライマーを用いて遺伝子増幅を行
い、（ｂ）工程（ａ）の増幅産物をHLA classII DRB1の16種
類の遺伝子型に特異的なオリゴプライマー及びビオチン
修飾オリゴプライマーからなる少なくとも１種類のプラ
イマーセットを用いて遺伝子増幅を行い、そして（ｃ）工程（ｂ）の増幅産物をマイクロプレートに固相
するためにアミン修飾した少なくとも１種類のプローブ
とハイブリダイズさせて増幅産物に修飾したビオチンを
検出することからなる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】工程（ａ）において配列番号１のフォワ
ードプライマー及び配列番号２及び３のリバースプライ
マー２種類を用いる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】工程（ｂ）において配列番号４乃至18の
フォワードプライマー及びビオチン標識した配列番号19
乃至37のリバースプライマーからなる群から選択される
少なくとも１種類のプライマーセットを用いて遺伝子増
幅を行う、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】工程（ｃ）において配列番号38乃至53か
らなる群から選択される少なくとも１種類のプローブを
用いる、請求項５乃至７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】以下の判定：工程（ｂ）において配列番
号４及び19のプライマーセットを用い、そして工程
（ｃ）において配列番号38のプローブを用いるDRB1-DR1
遺伝子型の判定；工程（ｂ）において配列番号５及び20
のプライマーセットを用い、そして工程（ｃ）において
配列番号39のプローブを用いるDRB1-DR3遺伝子型の判
定；工程（ｂ）において配列番号６及び21のプライマー
セットを用い、そして工程（ｃ）において配列番号40の
プローブを用いるDRB1-DR4遺伝子型の判定；工程（ｂ）
において配列番号７及び22のプライマーセットを用い、
そして工程（ｃ）において配列番号41のプローブを用い
るDRB1-DR7遺伝子型の判定；工程（ｂ）において配列番
号８及び23のプライマーセットを用い、そして工程
（ｃ）において配列番号42のプローブを用いるDRB1-DR8
遺伝子型の判定；工程（ｂ）において配列番号９及び24
のプライマーセットを用い、そして工程（ｃ）において
配列番号43のプローブを用いるDRB1-DR9遺伝子型の判
定；工程（ｂ）において配列番号９及び25のプライマー
セットを用い、そして工程（ｃ）において配列番号44の
プローブを用いるDRB1-DR10遺伝子型の判定；工程
（ｂ）において配列番号10、26、27及び28のプライマー
セットを用い、そして工程（ｃ）において配列番号45の
プローブを用いるDRB1-DR11遺伝子型の判定；工程
（ｂ）において配列番号11及び27のプライマーセットを
用い、そして工程（ｃ）において配列番号46のプローブ
を用いるDRB1-DR12遺伝子型の判定；工程（ｂ）におい
て配列番号12、29及び30のプライマーセットを用い、そ
して工程（ｃ）において配列番号47のプローブを用いる
DRB1-DR13遺伝子型の判定；工程（ｂ）において配列番
号13及び31のプライマーセットを用い、そして工程
（ｃ）において配列番号48のプローブを用いるDRB1-DR1
3遺伝子型の判定；工程（ｂ）において配列番号14及び3
2のプライマーセットを用い、そして工程（ｃ）におい
て配列番号49のプローブを用いるDRB1-DR14遺伝子型の
判定；工程（ｂ）において配列番号15、33及び34のプラ
イマーセットを用い、そして工程（ｃ）において配列番
号50のプローブを用いるDRB1-DR14遺伝子型の判定；工
程（ｂ）において配列番号16及び35のプライマーセット
を用い、そして工程（ｃ）において配列番号51のプロー
ブを用いるDRB1-DR14遺伝子型の判定；工程（ｂ）にお
いて配列番号17及び36のプライマーセットを用い、そし
て工程（ｃ）において配列番号52のプローブを用いるDR
B1-DR15遺伝子型の判定；及び工程（ｂ）において配列
番号18及び37のプライマーセットを用い、そして工程
（ｃ）において配列番号53のプローブを用いるDRB1-DR1
6遺伝子型の判定；からなる群から選択される少なくと
も一つの判定を同時に実施する、請求項５乃至８の何れ
か１項に記載の方法。
【請求項１０】 HLA classII DRB1のロウレゾリューシ
ョンの遺伝子型の判定に使用される、配列番号１乃至37
からなる群から選択されるプライマー。
【請求項１１】 HLA classII DRB1のロウレゾリューシ
ョンの遺伝子型の判定に使用される、配列番号38乃至53
からなる群から選択されるプローブ。
【請求項１２】請求項１０に記載のプライマーから選
択される２種類以上のプライマー及び請求項１１に記載
のプローブから選択される１種類以上のプローブを含
む、HLA classII DRB1のロウレゾリューションの遺伝子
型判定用キット。
【請求項１３】プローブがマイクロプレートに固相化
されている、請求項１２記載のキット。