JP2000511430A

JP2000511430A - Ｈｌａｄｑｂ１タイピングを決定するためのヌクレオチドプローブおよび方法

Info

Publication number: JP2000511430A
Application number: JP10500276A
Authority: JP
Inventors: ムーガン，ブルーノ
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 1996-06-03
Filing date: 1997-06-03
Publication date: 2000-09-05
Also published as: EP0910667A1; FR2749308A1; FR2749308B1; CA2257182A1; WO1997046700A1

Abstract

(57)【要約】特に下記配列ＴＧＣＧＴＴＡＴＧＴＧＡＣＣＡＧＡ，ＧＴＧＣＧＴＣＴＴＧＴＧＡＣＣＡＧＡ，ＧＴＣＴＴＧＴＡＡＣＣＡＧＡＣＡＣＡＴ，ＣＧＴＣＴＴＧＴＡＡＣＣＡＧＡＴＡＣＡＴ，ＣＧＴＣＴＴＧＴＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＡＴ，ＣＧＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＴＧＣＧＧＣＧＴＧ，ＧＴＡＣＣＧＧＧＣＡＧＴＧＡＣＧＣ，ＧＡＣＧＣＣＧＣＴＧＧＧＩＣＣＧＣＣＴＧ，ＧＡＣＧＣＣＧＣＴＧＧＧＧＣＣＧＣＣＴＧ，ＧＧＡＧＧＧＩＡＣＣＣＩＧＧＣＩＧＡＧＴ，ＧＧＡＧＧＧＧＡＣＣＣＧＧＧＣＧＧＡＧＴ，ＴＣＧＧＴＧＧＡＣＡＣＣＧＴＡＴＧＣＡＧＡＣ，ＧＧＡＣＧＧＡＧＣＧＣＧＴＧＣＧ，ＣＡＴＣＴＡＴＡＡＣＣＧＡＧＡ，およびそれらの相補的配列から選択されるヌクレオチドプローブであり、該プローブは、少なくとも下線部の配列を有し、さらに、配列の連続性は妨げないで下線部以外の塩基から選択される１または２個の塩基を含むことができる。これらのプローブは、人のHLA DQベータ遺伝子型の決定に有用である。それらは特に、単一のハイブリッド形成温度、特に37℃で安定であるという利点を有する。

Description

【発明の詳細な説明】 HLA DQB1タイピングを決定するためのヌクレオチドプローブおよび方法本発明の主題は、個々のHLA DQベータ（DQB）遺伝子型を決定するための方法、プローブおよびキットである。本発明の方法、プローブおよびキットは、特に、多型性HLA DQB1遺伝子の検出に関する。本発明のこの方法ならびにこれらのプローブおよびキットは、特に、移植におけるHLAタイピング、医療診断および法医学に適用できるが、HLA DQB1 対立遺伝子の有無はインシュリン依存性糖尿病などの或る種の病気に対する感受性の指標としても役に立つと考えられる。 HLA（ヒトリンパ球抗原）系は、ヒトの主要組織適合性複合体によってコードされる。それは、自己と非自己とを区別することにより、個人間の臓器移植の際の主な束縛となる。従って、HLA系の抗原は、臓器移植の際のドナーとレシピエントとの間の特徴および或る種の病気に対する個人の素質を決定するためのタイピング方法において使用されている。遺伝的観点から、HLA系は十分解析され、第６染色体の短腕上に約２センチモルガンの間隔で位置する、多かれ少なかれ多型性の一連の遺伝子座から成る。この系の３個の遺伝子座（HLA−A、BおよびC）は、共優生的に発現される一群のアロ抗原（クラスＩ）をコードする。別の領域(HLA−D）は実際にいくつかの遺伝子を含み、高度の多型性で共優生的に発現される第二群のアロ抗原（クラスII）をコードする。他の特に成分C2、C4を制御するいくつかの遺伝子座および相補カスケード因子BfもHLA系に属する（クラスIII)。臓器移植の成功は、かなりの部分が、レシピエントとドナーとの間のHLA同一性（クラスＩおよび゛I I）に依存する。従って、HLAタイピングはできる限り正確であるべきである。この要求は、主に、腎臓移植および骨髄移植に当てはまる。骨髄移植の場合は、クラスIIHLA抗原のレベルでの完全な同一性が移植成功のための、すなわち、移植片拒絶反応または移植片対宿主病の進行の回避のための決定的な因子を表す。 HLA−D領域に関する遺伝子の発現産物の多型性は、通常は、細胞表而で発現されるHLA遺伝子の産物のアロ抗血清を使用した分析に基づく血清学的技法によって明確にされた。しかし、最良の条件下でさえも、存在する多数の対立遺伝子は、これらの血清学的技法によって検出できない。 HLA DQB1遺伝子座のレベルでの多型性は、DQ w1、2、3および４特異性を定義する血清学的タイピング試薬を使用して検出された(WH0 Nomenclature Committe e,1990)。DQ w1特異性は、次いで、血清学的サブタイプDQ w5および６にさらに分類され、DQ w3は、DQ w7、８および９にさらに分類された。しかし、決まって使用される血清型の分類法では、DQ w1、DQ w2、DQ w3の特異性が区別されるに過ぎない。本発明では、分子生物学を使用することにより、以前考えられていたよりも多くのHLA遺伝子が存在し、特に多くのより異なる対立遺伝子が存在することが分かった。そこで、この多様性を、異なる遺伝子および対立遺伝子のＤＮＡ配列のレベルで解析する。HLA−D領域で公知の構造、配列および多型性は、TR0WSDALE ら、1985，Immunol.Rev.85：5−43に掲げられている。遺伝子型分析は、クラスII HLA系、特にHLA DQの多様性を遺伝子のレベルで直接分析することを可能にする新規方法である。遺伝子型分析は、分子ハイブリッド形成の原理に基づいており、提案された最初の方法は、制限酵素の使用によるＤＮＡの断片化および得られた断片のサイズの分析で構成されるいわゆる「RFLP 」法である。例えば、米国特許第4,582,788号を参照。 RFLP法は、７個のDQ特異性の同定に使用できる。しかし、RFLP分析は、血清学では検出できない或る種の対立遺伝子の相違のみの確認を可能にするものであり、この方法によって提供される可能性は限られている。実際、対立遺伝子は、突然変異が使用される制限酵素の認識部位に位置することを特徴とする場合にのみ同定でき、従って、多くの対立遺伝子はこの分析では確認されない。さらに、RF LP分析は、コード配列における修飾をめったに同定せず、修飾の正確な性質に関する情報を提供するものではない。最後に、この方法は、使用に時間がかかり、困難である。クラスII HLA遺伝子型を分析するための別の方法が提案されており、いわゆる「オリゴヌクレオチドをべースとするタイピング」法である。これは、クラスII HLA遺伝子、特にDQB遺伝子のＤＮＡ配列の知識により、その遺伝子の配列の所与の部位で特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドを多型性分析のためのトレーサーとして使用する。これらのオリゴヌクレオチドは、それらの配列の相違に基づいてそれらのハイブリッド形成またはハイブリッド形成の欠如により可能な最大量の情報が得られ、種々の対立遺伝子が同定されるように選択される。たとえそれらが単一のヌクレオチドに影響を及ぼすとしても、配列のいかなる相違も検出が可能であるべきである。オリゴヌクレオチドをベースとするタイピング法は、ANGELINIら、Nat．Acad ．Sci．USA vol.83：4489−4493（1986）の文献に記載されているようにＤＮＡに適用することができ、またＲＮＡにも適用可能である(Ｃ．UCLA,J.J.VAN ROOD ，J．GORSKI，Ｂ．MACH(1987)Ｊ．Clin．Invest.80，1155を参照)。ＰＣＲなどの核酸増幅法は、個々人のクラスII HLAのＤＮＡの分析を容易にした。クラスII HLAのためのオリゴヌクレオチドをベースとするタイピングの最初の適用は、上記で引用した文献にANGELINIらが示しており、標的ＤＮＡをナイロン膜に付着させ、標識されたオリゴヌクレオチドプローブによって検出を行ういわゆる「サザン」法を使用している。そのとき、その方法は、通常の血清学では同定できないクラスII HLA対立遺伝子の検出に適用された（J.M．TIERCY，J．G0 RSKI，M．JEANNETおよびB．MACH(1988)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85，198ならびにJ．M．TIERCY，J．GORSKI，H．BETUEL，A.C．FREIDEL，L．GEBUHRER,M.JE ANNETおよびB.MACH(1989)HumanImmunol.24，１を参照)。クラスII HLAタイピングへの別の直接の適用は、いわゆる「ドット−ブロット」法を使用した国際特許出願PCT W0 89／11547に記載されたものである。いわゆる「逆ドット」法は、紙またはニトロセルロース膜にヌクレオチドプローブを結合し、標識された標的とのハイブリッド形成の検出を行うことから成るが、これは、HLADQAタイピングおよび地中海性β−サラセミア突然変異の検出に適用されている（R.K．SAIKIら、 Proc．Nat．Acad.Sci．USA vol ：86，ｐ.6230-6234；(1989))。細胞のタイピングは、ゲノムの点変異の検出を必要とし、一つのヌクレオチド内の相同配列の検出および相同配列間の区別に十分感受性のあるプローブの開発を伴う。そのために、一般には30ヌクレオチド未満であり、テストに関して高い特異性を与えるが、良好な感受性は保持したままである短いプローブを使用する。短いオリゴヌクレオチドの使用は、広い選択性を持つことを可能にする。さらに、高い特異性および良好な感受性を示すだけでなく、さらには使用が簡単であり、迅速に行うことができ、安価であり、容易に自動化することができるタイピング方法の開発が望まれている。本発明は、これらの要件を満たすHLA DQB1タイピングのための方法ならびにプローブおよびキットに関する。本発明の方法は、ｃＤＮＡ鋳型などの各種起源の異型接合性サンプルをタイピングするのに使用することができ、また、通常の血清学的方法では区別できない対立遺伝子変異体の検出に使用することができる。本発明のプローブは以下に説明するが、サザン型の方法において検出プローブの形（通例のトレーサーで標識）で使用することができ、あるいは、好ましくは、固体担体上に固定化した捕獲プローブの形（サンドイッチまたは逆ドットブロット法）で使用できる。本発明のタイピング系は、好ましくは、DUNN A.R.,HASSEL J.A. (Cell，12， 23，1977）で最初に記載されたいわゆる「サンドイッチ」プロトコールを使用する。それは、固体担体に結合し、サンプル中の標的遺伝子に特異的である捕獲プローブという第一のヌクレオチドプローブおよびその標的の別の領域に相補的であり、マーカーによって示すことによりハイブリッド形成の検出を可能にする、第二の標識されたプローブ、いわゆる検出プローブを使用することから成る。本発明の系では、マーカーは例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼなどの酵素であり、他の適する任意のマーカーも使用できる。本発明の方法は、その長さおよび組成物が、必要とされる特異性および感受性を付与するだけでなく、規定された温度での使用を可能にするように選択されたオリゴヌクレオチドプローブの選択に基づく。すなわち、本発明のタイピング系は、特に、 37℃±2℃の単一温度での操作を可能にするという利点を有する。しかし、明らかなように、所与の温度で点変異を検出することを意図したプローブの場合ですら、特にハイブリッド形成複合体の安定性を多かれ少なかれ促進する緩衝溶液を使用することによりその長さが或る程度変えられるプローブの使用を意図することが可能である。本発明のプローブは、従って、特に、操作を37 ℃付近であるが、37℃ではない（実際には、温度検定において誤差を生じることが多い）温度で行うことが望ましい場合、その長さが一般に最大であると考えられる配列によって規定され、さらに、37℃の温度に最適な配列も示される。専門家であれば、各特定のオリゴヌクレオチドプローブに対応する相補プローブももちろん、捕獲または検出プローブと同じ役割を果たし得ることは明らかである。本発明は従って、下記に説明するプローブと相補的な配列を有するプローブおよびこれらの相補的配列を使用する方法にまで拡張される。本発明の主題は、上記した要件を満たすように選択されたヌクレオチド配列を有するプローブである。特に、本発明は、その併用により種々の対立遺伝子間を区別し、必要であれば、今日までに知られている種々のHLA DQ特異性（HLA系因子の命名、1995，Bodmer Julia Ｇら、TissueAntigens，1995，46，1-18）を同定することすら可能にする新規プローブに関する。本発明のヌクレオチドプローブは、特に下記に示すものから選択される（配列は、左から右へ５’端→３’端を示す。)。アルフアベット文字は通常の命名によるヌクレオチド（または塩基）を表す。下線部の配列は、本発明に係る好ましい操作条件下での最適配列を表す。従って、プローブは、少なくとも下線部の配列を含み、さらに、下線部以外の塩基から選択される１または２個の別の塩基を含むことができる。すなわち、場合に応じて（もちろん、その配列の連続性は保存して)、５’端に１または２個の別の塩基、あるいは、３’端に１または２個の別の塩基、あるいは、５’端に１個の別の塩基および３’端に１個の別の塩基を含むことができる。ハイブリッド形成および洗浄温度ならびにハイブリッド形成および／または洗浄緩衝剤の性質などのハイブリッド形成結合強度を変えることを可能にする操作条件に応じて使用されるプローブの長さが調節可能であることは実際、公知である。修飾塩基（例えば、イノシン）のプローブへの導入は、同様の役割を果たすと考えられる。本発明のプローブは、特に、下記配列（各プローブに対して、認識される特異性が示されている）またはそれらの相補配列から選択される。（26B）：これは、DQBl 06011、06012、0301および0304特異性を認識する；（26C）：DQBI 0602、0302および03032特異性；（26D）：DQB1 0603、0604、0607および0608特異性；（26F）： DRQBI O6O51、06052、0606および0609特異性；（26E）：0201および0202特異性；（23A）：DQB1 0401特異性；（49A）：DQB1 0501特異性；（55A）：DRB1 0301、0302、03032、0304および0305特異性；（55’A）：DRB1 0301、0302、03032、0304および0305特異性；（70A）：DRB1 0602、0603および0608特異性；（70’A）：DRB1 0602、0603および0608特異性；（70B）：DRB1 0401および0402特異性。本発明のプローブはまた、下記にそれらのヌクレオチド配列を定義するプローブ23a、23B、26c、26f、37C、37a、45a、57D、57E、57Fおよび70Cでもあり、それらが認識する特異性は、添付の表４に示す。もちろん、所望ならば、添付する表１および２に示されるように、追加のプローブとして使用される他のプローブによって或る一定の特異性間の区別を行うことができる。本発明の新規プローブはまた、下記に説明するプローブHRP１およびHRP２も含む。上記したオリゴヌクレオチドプローブの配列において、Ｉはイノシンを表す。イノシンは、プローブの判別能を、このプローブがこのプローブを有するサンプル中の試験標的のものと厳密には同一でない核酸配列と形成するハイブリッドをさらに不安定にすることにより高めるために、本発明の或る種のプローブで使用される非天然のヌクレオチドである。本発明の記載において、23A、26A、26Bなどの後ろに文字が付いた数字または後ろに数字が付いた文字（HRP１など）を含む任意の名称は、このように定義したプローブ全体（下線部の配列のみを含むもの、およびさらに１または２個の下線部以外の別の塩基を含むもの）を示すが、ただし、下記の実験部分および添付の表においては、これらの名称は下線部の最適配列を有するプローブのみを示す。本発明の主題はまた、サンプル中に存在する核酸のDQB1タイピングを少なくとも部分的に決定する方法である。該方法では、公知の方法に従って、サンプル中の該核酸のオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリッド形成の試験を行い、37±2℃に等しい単一の温度でハイブリッド形成が効果的に観察される試験を陽性の試験として選択し、該オリゴヌクレオチドプローブは、下記：またはそれらの相補的配列から成る群から選択される少なくとも１つのプローブを含み、理解されるように、該プローブは、少なくとも下線部の配列を含み、さらに、配列の連続性は保持しながら下線部以外の塩基から選択される１または２個の塩基を含んでいてもよい。本発明は特に上記した方法に関し、該方法では、 −プローブ26D、26E、49A、70Aおよび70Bの少なくとも一つ、 −プローブ26E、49A、70Aおよび70Bの少なくとも一つ、 −および／またはプローブ57D、57Eおよび57Fの少なくとも一つ、一および／またはプローブ23a、23B、26c、37C、37a、45aおよび70Cの少なくとも一つが使用される。本発明はまた、上記した方法において、さらに、サンプル中の核酸と下記プローブ：（26A）；認識されるDQB1特異性：0501、0502、05031、05032、0602、0604、060 7および0608；（57A）；認識されるDQBI特異性：0501、0604、06051、0606、0608および0609；（57B）；認識されるDQB1特異性：0502および0504；（57C）；認識されるDQB1特異性：05032、0602、0603および0607；（45A）；認識されるDQB1特異性：0301および0304； (37A)；認識されるDQBI特異性：06011および06012；またはそれらの相補的配列の少なくとも一つとのハイブリッド形成の試験を行う方法にも関する。本発明は特に、上記した方法において、３個のプローブ57D、57Eおよび57Fをプローブ57A、57Bおよび57Cの少なくとも一つと組み合わせて使用する方法に関する。もちろん、陽性であるとして選択される試験はなおも上記した通りである。本発明の方法において、使用されるハイブリッド形成条件は、明らかなように、標的がプローブのものと完全に相補的である配列を含む場合のみ、各プローブとのハイブリッド形成が選択した単一温度で生じるように予め決められた条件である。これらの条件は、通常の簡単な実験によって決定することができる。標的はもちろん、サンプル中に存在し、個人のHLA DQ遺伝子の多型性領域を含む核酸である。専門家であれば、本発明方法で使用できる各種プローブが、選択した技術に応じて、標識されたプローブまたは固体担体への結合を容易にすることを意図したリガンドに結合したプローブ、あるいは、固体担体にすでに結合したプローブのいずれであってもよいことは容易に理解される。特に、プローブは、公知方法に従って、固体担体上に固定してあってもよく、または、固定可能であってもよく、その場合は、捕獲プローブとして使用できる。特定の態様によれば、ハイブリッド形成試験を、捕獲プローブとして上記したプローブ、すなわち固体担体に結合したプローブを使用して行う。所与の捕獲プローブとのハイブリッド形成によって固体担体に結合した核酸の可能な存在を示すために、該捕獲プローブによって認識される以外の標的の領域とハイブリッド形成できる標識された検出プローブを使用することができる。特に、下記（下線部は、上述したように、最小配列に相当する。）：から選択される検出プローブを使用することが可能である。添付した表１を見ると、これらの検出プローブの中でどれが所与の捕獲プローブとともに使用可能であるかを容易に決定することができる。本発明方法によれば、対立遺伝子の同定は、各々個々のプローブがHLA DQ遺伝子の異なる部分に特異的である一連のプローブの結合モデルから推定できる。いくつかのプローブを選択することによって、本発明のオリゴヌクレオチドをベースとするタイピング法は、所望ならば、全てのDQB1対立遺伝子の同定を可能にする。たとえ新しい対立遺伝子が発見されても、これらはクラスII HLA配列の記録に掲載され、これは別のプローブによる特定のプローブの集合の更新を可能とし、従って、その方法を任意の新規対立遺伝子の検出に適応することが可能となる。完全なクラスII HLAタイピングを合理化するために、まず第一に可能なことは、一定の数のプローブの使用により主なHLA DQB特異性の同定を可能にする第一のDQBタイピング工程を行うことである。この工程は、多数の臨床用途にとって十分であることが多い。しかし、本発明は、多数のプローブにより、今日までに公知の全てのHLA DQB特異性の認識を可能にするDQBタイピングの第二の工程も許容する。本発明のオリゴヌクレオチドをベースとするタイピング法によるHLA DQB特異性の分析は、血清学に代わるものとして、通常のDQBタイピングのための組織適合性研究室で使用でき、特に、腎臓移植を待っている名簿にある患者のDQBタイピングまたは可能性のある腎臓ドナーのタイピング、骨髄移植を予定している白血病患者のDQBタイピングおよびその家族または血縁関係のない可能性のあるドナーのタイピング、ボランティアとしての骨髄ドナー名簿作成のための大規模な DQBタイピングを行い、あるいは、予防医学への適用または実父調査および他の法的確認のための、例えばインシュリン依存性糖尿病の場合の病気とHLA系との関連性を決定することができる。 HLA DQB核酸を含むどの型の組織も本発明方法におけるサンプルとして使用できる。また、サンプルに存在する核酸の化学的または酵素的切断などの後に得られた核酸の断片（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を使用することもできる。しかし、実際には、ＤＮＡまたはＲＮＡの増幅予備工程を行うべきである。個々のHLA DQB1タイピング用キットも本発明の主題である。該キットは、次のプローブ：26B、26C、26D、26F、26E、23A、49A、55A、70A、70B、23a、23B、26 c、26f、37C、37a、45a、57D、57E、57F、70C、HRP1およびHRP2の少なくとも一つを含み、さらに、26A、57B、57C、37A、45A、57AおよびHRP3から選択される１以上のプローブを含むことができる。本発明方法および対応するキットにおいて、示したプローブは、もちろん、それらの相補的配列で置き換えることができる。本発明は特に、次のプローブ（特に捕獲プローブ）：26B、26C、26D、26E、26 F、23A、49A、55A、70A、70B、26A、57B、57C、57Aならびに所望によりプローブ 45Aおよび37Aの少なくとも一つを含むキットに関する。このキットは、さらに、 HRP1、HRP2およびHRP3から選択される１以上の検出プローブを含むことができる。本発明はまた、下記： −プローブ26D、26E、49A、70Aおよび70Bの少なくとも一つ、 −またはプローブ26E、49A、70Aおよび70Bの少なくとも一つ、 −および／またはプローブ57D、57Eおよび57Fの少なくとも一つ、 −および／またはプローブ23a、23B、26c、26f、37C、37a、45aおよび70Cの少なくとも一つを含むキットに関する。本発明は、特に、下記プローブ： 23a、23B、26c、26D、26E、26f、37a、37C、45a、49A、57A、57B、57C、57D、57 E、57F、70A、70Bおよび70Cを含むキットに関する。これらのプローブの使用により集められた情報は、次いで、使用したプローブならびにリストに記載されたHLADQBタイプおよび／または関連のサブタイプの知見を考慮して、確立されたタイピング計画によるタイピングの決定に使用される。この作業は、タイピング計画、すなわち、タイプおよび／またはサブタイプを認められる陽性反応（ハイブリッド形成）の関数として直接示す表の使用により簡略化される。タイピング計画の例は、添付の表３および５に示す。本発明で使用されるプローブは、適切な条件下でそれらの相補的配列に特異的に結合し得る配列に特異的なオリゴヌクレオチド（OSS）である。ある特定のプローブが唯一のプローブの同定に使用できる場合、そのプローブはOSAと言う。すなわち、一つの対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドである。すでに上記したように、一つのプローブでは、特異的なDQB対立遺伝子をそれ自身で同定することができない。本発明で使用するいくつかの用語の定義を以下に示す。「遺伝子型」とは、遺伝子の発現産物、特にタンパク質の分析によって示される個々の特徴である「表現型」とは反対の、個々のゲノムの特徴を意味する。「対立遺伝子」は、同じ遺伝子の別の種々の型を示し、核酸配列のレベルで相違を示す。これらの相違は、ＤＮＡのレベル、ＲＮＡのレベルおよびそれらのタンパク質への翻訳のレベルで示される。「多型性」は、同じ遺伝子の異なる対立遺伝子の存在によって一つの集団にもたらされる多様性を特徴とする。本明細書で使用する「オリゴヌクレオチド」は、プライマー、プローブまたは検出しなければならない核酸断片などを示す。オリゴヌクレオチドは、適切な任意の公知方法によって調製できる。本発明の説明および以下の実験部分では、添付する表１〜４を参照する。なお、同じプローブ名（26A、HRP3など）は、下線部の最小配列を示すことによりいくつかのプローブが規定できる配列（上記の説明の場合）のみだけでなく、下線部の最小配列に対応する配列（下記実施例および添付する表１〜４の場合）も示し得ることに注意すべきである。添付の表１には、DQBI^*0501である選択したコンセンサス配列に関して、表２に表したアミノ酸突然変異（一文字コードによって指定）に対応する突然変異の位置を規定することによるDQB遺伝子の種々の対立遺伝子のＤＮＡの配列が表してある。ＤＮＡの突然変異は、非サイレント突然変異、すなわち、その翻訳によりアミノ酸の変化をもたらす突然変異であってもよい。種々の対立遺伝子のタイピングの場合は、大多数において明らかにそうである、非サイレント突然変異に相当するＤＮＡ上の突然変異を使用することが非常に多いが、例えば２個の非常に類似した対立遺伝子間を区別することにより、サイレント型の突然変異を検出することが可能である。今日までに公知の文献で知られ、発表された全ての対立遺伝子に関するDQB1遺伝子のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を表１および２に示す。添付する表３は、プローブと認識される特異性との間の対応をまとめたものであり、ある列の四角が黒く塗られている場合、これは、この列で挙げた特異性が、対応の欄のプローブによって認識されることを意味する。添付の表４は、プローブおよびHLA DQB1特異性の間の対応を再現したものであり、さらに、サイレント突然変異または変異アミノ酸を示す。下記実施例により本発明を説明する。実施例１：固体担体への結合を促進するリガンドに結合した各種プローブを作製した。使用したリガンドは、Aminolink２（Applied Biosystems社製、参照番号400808）という市販の化合物である。リガンドのオリゴヌクレオチドへのカップリングは、下記の一般的プロトコールに従って行行われる。オリゴヌクレオチドを、ホスホルアミダイト化学を使用してApplied Biosyste ms社製の自動381A装置上で製造者のプロトコールに従って合成する。オリゴヌクレオチドの合成が完了すると、無水アセトニトリルに0.2Mの濃度で溶解したホスホルアミダイトリガンドを合成機の位置Ｘに置き、標準的な自動合成プロトコールに従ってオリゴヌクレオチドの５'端によりリガンドの付加を行う。 33%水酸化アンモニウム溶液中、55℃で一夜脱保護を行い、次いで-20℃でエタノール沈殿を行った後、修飾オリゴヌクレオチド（リガンドに結合したもの）を真空下で乾燥し、１mlの水に吸収させる。５'端が修飾されたオリゴヌクレオチドをBrownlee RP18カラム（10mm-25cm）上での逆相高性能液体クロマトグラフィーにより精製する。条件：流速４.６ml/分勾配10%→35%の緩衝液Ａ、３０分；35%→100%の緩衝液Ｂ、３分緩衝液Ａ：0.1モルの酢酸トリエチルアンモニウム(TEAA)、pH7 緩衝液Ｂ：50%の緩衝液Ａ＋50%のCH₃CN 実施例２：検出プローブの作製実施例１と同様に使用し、活性化し、乾燥したオリゴヌクレオチドを200μｌの0.IMホウ酸ナトリウム緩衝液(pH9.3)における1.25ｘ10^-7モル（5mg）のホースラディッシュペルオキシダーゼ(Boehringer Mannheim413470)に吸収させる。精製プロトコールは同じである。コンジュゲートを-20℃で40%のグリセロールを含むトリス-HC1緩衝液(pH7)に保存する。実施例３：標的ＤＮＡの増幅増幅は、下記のプライマーを使用してＰＣＲにより行う。 −プライマー１： −プライマー２：これらのプライマーは、表１ではDQBAMP-AおよびDQBAMP-Bの名称で示す。実施例４：マイクロタイタープレート(Nunc 43454)のウェルに、3xPBS（0.45MのNaCL、0. 15Mのリン酸ナトリウム、pH7）における10〜400nMの濃度の所与のDQ特異性の捕獲オリゴヌクレオチド溶液100μｌを入れる（１個の捕獲オリゴヌクレオチド／ウェルの割合)。従って、タイピングに必要な捕獲プローブと同じほどの多くのウェルを使用する。プレートを37℃ で２時間、または室温で15〜22時間インキュベートする。全てのケースにおいて、増幅工程および検出工程をチェックするために陽性の対照を添加する。陽性の対照(C+とする)として使用する捕獲プローブは、今日までに公知の全ての対立遺伝子上に存在する。その配列は次の通りである。５'GAG TAC TGG AAC AGC CAG AAG GA３' 捕獲プローブを陰性の対照（C-とする）として使用する。配列は次の通りである：５'TAT GAA ACT TAT GGG GAT AC3'。プレートを300μｌのPBSトゥイーン（0 .15MのNaCL、0.05Mのリン酸ナトリウム、pH7;0.5%トゥイーン20（MERCK822184)) で３回洗浄する。増幅産物を室温で５分間、10μｌの2NのNaOHで変性する。この溶液に、10μｌの2N酢酸、次いで2.3mlのハイブリッド形成緩衝液（PEG:0.1Mのリン酸ナトリウム、pH7、0.5MのNaCl、0.65％のトゥイーン20、0.14mg/mlのサケの精子ＤＮＡ(SigmaＤ9156)、PEG 4000(Merck 807490 2%))および0.25mlの標識された検出プローブ（オリゴヌクレオチドーペルオキシダーゼコンジュゲート）を順次添加する。最終溶液を0.1ml/ウェルの割合で各ウェルに分配する。プレートを37℃で60分間インキュベートする。プレートを300μｌのPBSトゥイーンで３回洗浄する。オルト−フェニレンジアミン(OPD)基質(Cambridge Medical Biotechnology参照番号456)のOPD緩衝液(0.05Mのクエン酸、0.1MのNa₂HPO₄、pH4.9)における4mg/ml濃度のもの100μｌを各ウェルに添加し、使用直前に1/1000に希釈した30倍体積の過酸化水素を添加する。20分の反応の後、酵素活性を100μｌの1N H₂SO₄でブロックし、492nmで読み取りを行う。実施例５： 10個のＤＮＡをＰＣＲ法に従って増幅する。次いでタイピングを行う。タイピングのプロトコールは、一般には、上記したものに従う。ハイブリッド形成は、サンドイッチ法に従って行う。タイピングのプロトコールでは、上記した捕獲プローブおよびケースに応じて検出プローブHRP1、HRP2またはHRP3を使用する。記載した方法は、試験した10個のＤＮＡのタイピングを可能にする。いくつかのタイピング結果を説明として下記に示す。ケースNo.1: プローブ ODｘ1000(492nm) 26A 15 49A 12 57B 38 57c 12 37A 12 26B 100 26C 1309 26D 10 26F 18 70A 32 26E ＊＊＊＊ 55A 316 70B 12 23A 13 ^****は飽和を意味する。結果：患者はDQB1^*0201または0202/0302または0303である。ケースNo.2: プローブ ODｘ1000(492nm) 26A 887 49A 12 57B 459 57c 11 37A 57 26B 80 26C 10 26D 14 26F 10 70A 14 26E 11 55A 11 70B 688 23A 302 結果：患者はDQB1^*0502/0401である。実施例６：実施例５に記載の方法と同様の手順を行うが、添付の表５に列挙した捕獲プローブを使用する。結果を添付の表６にまとめる。

Claims

【特許請求の範囲】１．下記：およびそれらの相補的配列から選択されるヌクレオチドプローブであって、該プローブが少なくとも下線部の配列を有し、さらに、その配列の連続性を保持しながら下線部以外の塩基から選択される１または２個の塩基を含んでいてもよいヌクレオチドプローブ。２．下記配列：およびそれらの相補的配列によって定義されるものから選択される、請求項１に記載のプローブ。３．下記：およびそれらの相補的配列から選択される、請求項１に記載のプローブ。４．下記：から選択される、請求項１に記載のプローブ。５．下記：から選択される、請求項１に記載のプローブ。６．下記配列：およびそれらの相補的配列によって定義されるものから選択される、請求項１に記載のプローブ。７．配列が下線部の配列およびそれらの相補的配列に対応する、請求項１〜６のいずれか一つに記載のプローブ。８．該プローブが標識されているか、固体担体へのそれらの結合を容易にするためのリガンドにカップリングしているか、固体担体に結合していることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一つに記載のプローブ。９．サンプルに存在する標的核酸のHLA DQB1 タイピングを少なくとも部分的に決定する方法において、サンプル中の該核酸のオリゴヌクレオチドプローブとの公知方法によるハイブリッド形成の試験を行い、ハイブリッド形成が37±2℃に等しい単一の温度で効果的に観察される試験を陽性の試験として選択し、該オリゴヌクレオチドプローブは請求項２で定義したものまたはそれらの相補的配列から選択される少なくとも一つのプローブを含み、該プローブは少なくとも下線部の配列を含み、さらに、配列の連続性は保持しながら下線部以外の塩基から選択される１または２個の塩基を含んでいてもよい方法。１０．下記配列：によって定義されるものまたはそれらの相補的配列から選択される少なくとも一つのプローブとサンプル中の核酸とのハイブリッド形成の試験をさらに行う、請求項９に記載の方法。１１．下記配列：によって定義されるものまたはそれらの相補的配列から選択される少なくとも一つのプローブとサンプル中の標的核とのハイブリッド形成の試験をさらに行う、請求項９および１０のいずれかに記載の方法。１２．請求項３〜５のいずれか一つで定義した少なくとも一つのプローブを使用する、請求項９〜１１のいずれか一つに記載の方法。１３．該プローブを捕獲プローブとして使用する、請求項９〜１２のいずれか一つに記載の方法。１４．捕獲プローブとのハイブリッド形成により固体担体に結合された核酸の可能性のある存在が、該捕獲プローブによって認識される以外の標的の領域とハイブリッド形成可能な標識された検出プローブによって示される、請求項１３に記載の方法。１５．検出プローブが、下記配列：によって定義されるものまたはそれらの相補的配列から選択される、請求項１４に記載の方法。１６．該プローブが請求項７と同様に定義されることを特徴とする、請求項９〜１５のいずれか一つに記載の方法。１７．請求項ｌ〜６のいずれか一つで定義されるものから選択される少なくとも一つのプローブを含み、さらに、下記配列：によって定義されるものまたはそれらの相補的配列から選択される１以上のプローブを含み得る、HLA DQB1タイピング用キット。１８．下記配列：によって定義されるプローブまたはそれらの相補的配列を含み、さらに、下記配列：によって定義されるものまたはそれらの相補的配列から選択される１以上のプローブを含み得る、請求項１７に記載のキット。１９．下記配列：またはそれらの相補的配列によって定義されるプローブおよび所望により下記：またはそれらの相補的配列を含む、請求項１７に記載のキット。２０．請求項３〜５のいずれか一つに記載の少なくとも一つのプローブを含む、請求項１７に記載のキット。２１．請求項３および／または請求項４および／または請求項５で定義したプローブを含む、請求項２０に記載のキット。２２．該プローブが捕獲プローブとして使用できる、請求項１７〜２１のいずれか一つに記載のキット。２３．さらに、下記：から選択される少なくとも一つの標識された検出プローブを含む、請求項１８〜２２のいずれか一つに記載のキット。２４．該プローブが請求項７と同様に定義される、請求項１７〜２３のいずれか一つに記載のキット。