JP3117083B2

JP3117083B2 - Ｈｌａｄｐタイプ分け方法

Info

Publication number: JP3117083B2
Application number: JP01506051A
Authority: JP
Inventors: エー．アーリッチ，ヘンリー; ティー．ホーン，グレン; エル．ブガワン，テオドリカ
Original assignee: エフ．ホフマン―ラロシュアクチェンゲゼルシャフト
Priority date: 1988-05-20
Filing date: 1989-05-18
Publication date: 2000-12-11
Anticipated expiration: 2015-12-11
Also published as: JPH03504325A; IE891642L; AU3690889A; EP0417160A1; DE68926784T2; AU633830B2; US5310893A; DE68926784D1; WO1989011547A1; EP0417160B1; IE74898B1; IL90357A0; IL90357A; US5541065A; ATE140035T1

Description

【発明の詳細な説明】本発明は個体のHLA DP遺伝子型を決定するための方法
及び組成物に関する。好ましい態様において、本発明
は、米国特許No.4,683,195及びNo.4,683,202に開示され
ておりそして請求の範囲に記載されている遺伝子増幅方
法並びに米国特許No.4,683,194に開示されておりそして
請求の範囲に記載されているドットブロット及び対立遺
伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ法の使用に関す
る。本発明の方法及びプローブは特に多形成クラスII H
LA DP遺伝子の検出に関する。本発明は分子生物学、診
断医学及び法医学に関する。

ヒト主要組織適合性複合体遺伝子のクラスII遺伝子座
は、Ｂ−リンパ球、活性化されたＴ−リンパ球、マクロ
ファージ及び樹枝状突起細胞上で発現されるHLAD細胞表
面糖蛋白質をコードしている。個々にDR,DQ及びDPと称
されるこれらの蛋白質はα及び高多形性βサブユニット
かや構成され、そしてＴ細胞に対する抗原のプレゼンテ
ーションを担当している。この高多形性βサブユニット
における可変性はアミノ末端細胞外ドメインに位置して
おり、このドメインはＴ細胞受容体及び抗原ペプチド断
片と相互作用すると考えられる。クラスII HLA蛋白質を
コードする遺伝子はヒトにおける染色体６の短片上に位
置している。HLA DPα鎖及びHLA DPβ鎖をコードする遺
伝子はこの領域のセントロマー端にクラスター状となっ
ており、そしておそらく発現レベルが低いためにHLA D
遺伝子の中で最後に発見されたものであり、そしてそれ
故に最も少なく特性決定がなされている。HLA D領域の
構造、配列及び多形性はTrowsdaleら、1985、Immunol.R
eu.85:5−43に総説されており、その記載を引用により
本明細書に組み入れる。

HLA D領域遺伝子産物の多形性タイプ分けは一般に血
清学的タイプ分け試薬により、及び混合リンパ球培養
（MLC）反応により定義され、この場合ホモ結合タイプ
分け細胞（HTC）に応答してＴ細胞の増殖が培養物中で
測定される。HLA DP抗原は最初、特異的にプライムされ
たＴ細胞において強い二次応答を刺激するそれらの能力
により定義されたものであり、この方法はプライムされ
たリンパ球タイプ分け（PLT）として知られており、そ
してMawasら、1981、Tissue Autigens,15:458−466;Wan
tら、1978,Immunogenetics,６:107−115;及びShawら、1
980、J.Exp.Med.152:565−580により記載されている。H
LA DP抗原は一次MLCにおいて弱い応答のみ惹起し、そし
てHLA DR及びHLA DQ多形の研究とは異なり、HLA DPにお
ける対立遺伝子変化の分析は血清学的試薬及びタイプ分
け細胞の欠如におり複雑なものとされている。さらに、
PLTアッセイにおいて使用される特異的細胞系は発生さ
せることが困難であり、そしてタイプ分けアッセイは遅
く且つ実験室により幾分異る。

細胞性多形（Odumら、1987、Tissue Autigens,29:101
−109を参照のこと）、生化学的多形（Lotteauら、198
7、Immunogenetics,25:403−407を参照のこと）及び制
限断長多形（RFLP;Hyldig−Nielsenら、1987、Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA,84:1644−1648を参照のこと）の分析が
示すところによれば、DP領域における多形性の程度は、
現在血清学的に、免疫的に、又はPLTにより定義されるD
Pw1〜DPw6タイプより広範である。RFLPアプローチが示
すところによれば、DP領域のRFLPは相対的に広範であ
り、そして断片の幾つかはある種のDP抗原と強く会合す
る。しかしながら、RFLP技法は幾つかの制限を有する。
変異配列を担持する対立遺伝子は、変化ヌクレオチドが
分析に使用される制限酵素の認識部位内にある場合にの
み、又は多形性制限部位が特異的コード配列変化とリン
ケージ非平衡（linkage disequilibriom）にある場合に
のみ、同定可能である。さらに、RFLP分析は単にコード
配列変化が存在する証拠を提供するが、しかしその変化
の正確な性質についての情報は提供しない。さらに、分
析のためにはゲノム核酸の比較的大きな断片を使用しな
ければならない。この後者の要求はしばしば、ゲノムDN
Aの分析をもたらす条件下に保持されていたサンプルの
使用を排除する。

正確なDPタイプ分けが幾つかの医療用途において重要
であることが明らかであろう。DP遺伝子座と血清学的に
タイプ分けされたDP遺伝子座との間の遺伝子組織が起っ
て血清学的に同一のsibがDPにおいてマッチしないこと
が起り得る。Amarら、1987、J.Immunology,138:1947−1
953により記載されているように、見かけ上HLAが同一の
提供者と受容者との対の間での急性の移植片対宿主病の
幾つかの症例においてRFLP分析によりHLA DPの相違が示
されている。さらに、腔腸病を含めての幾つかの自己免
疫疾患が特異的DPタイプと関連することが示されてお
り、このタイプはPLT分析（Odumら、1986、Tissue Auti
gens,28:245−250）により又はRFLP分析（Howellら、19
88、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:222−226）により定義
されるものである。

DNA増幅における有意な改良、すなわちポリメラーゼ
連鎖反応（PCR）技法がMullisにより米国特許No.4,683,
195において開示されており、そして核酸のクローニン
グ及び検出においてPCRを用いる方法がMullisらにより
米国特許No.4,683,202に開示されており、この両特許の
開示を引用により本明細書に組み入れる。PCR技法にお
いては増副されるべき配列の相対する末端にマッチする
ように短いオリゴヌクレオチドプライマーが調製され
る。これらのプライマー間の配列は知られる必要がな
い。核酸（DNA又はRNA、但しRCR法においてRNAはまずDN
Aに転換される）のサンプルが抽出され、そして好まし
くは熱によって変性され、そしてモル過剰で存在するオ
リゴヌクレオチドプライマーとハイブリダイズされる。
重合は、デオキシヌクレオチドトリホスフェート（dNT
P）の存在下でポリメラーゼにより触媒される。これが
２個の「長い生成物」をもたらし、これらの生成物はも
との鎖の新たに合成された相補体に共有結合したそれぞ
れのプライマーをそれらの５′−末端に含有する。複製
されたDNAはやはり変性され、オリゴヌクレオチドプラ
イマーとハイブリダイズされ、重合条件にもどされ、そ
して第二サイクルの複製が開始される。この第二サイク
ルは、２本のもとの鎖、第一サイクルからの２本の長い
生成物及び第二サイクルからの２本の長い生成物、並び
に第二サイクルにおいて生成した長い生成物から複製さ
れた２本の「短い生成物」をもたらす。これらの短い生
成物は標的配列に由来する配列（センス又はアンチセン
ス配列）を含有し、そして５′末端におけるプライマー
と３′−末端におけるプライマーに相補的な配列とより
挟まれている。各追加のサイクルの際、短い生成物の数
は指数的に増加する。従って、PCR法は特定の標的配列
の増幅を惹起し、そして最初に非常に少量のみサンプル
中に存在する配列の検出を可能にする。

Saikiら、1986、Nature,324:163−166に記載されてい
るように、ヘモグロビンのβ−グロビンをコードする遺
伝子におけるHLA DQαをコードする遺伝子における対立
遺伝子配列変化が、それらと完全にマッチする配列との
みアニールするであろう対立遺伝子特異的オリゴヌクレ
オチド（ASO）を用いることにより検出されている。こ
れらの研究もまた、サンプル中に存在するDNA配列を増
幅するためにPCR法を用い、そして該サンプルへのプロ
ーブのハイブリダイゼーションを検出するためにドット
−ブロット法を使用した。

本発明は、HLA DPタイプ分けにおける上記の問題点を
解決するものであり、そしてHLA DP遺伝子型の決定のた
めの比較的迅速で、便利で、実際的で正確でしかも再現
性ある方法を提供するものである。この方法は部分的
に、今まで知られていない多数のDPβ対立遺伝子が存在
する、という知見に基くものである。対立遺伝子間の差
異は高度に分散した性質のものである。本発明はまた、
この方法において使用するための異るDP対立遺伝子間を
区別するに際して最も情報に富むHLA DPβ遺伝子の領域
についての核酸プローブを提供するものである。

これらのオリゴヌクレオチドプローブはSSO（配列特
異的オリゴヌクレオチド）と称され、適切な条件下でそ
れらの相補的配列と特異的に結合することができるもの
である。

１つの対立遺伝子をもっぱら同定するために特定のプ
ローブを使用することができる場合、このプロープを対
立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ASO）と称する。D
Pβ対立遺伝子間の差異の分散した性質のため、いずれ
か１つのプローブが特定のDPβ対立遺伝子もっぱら同定
することができるのはまれである。むしろ、本発明の方
法に従えば、対立遺伝子の同一性は複数のプローブの１
つのパネルの結合パターンから推定され、ここで該パネ
ルの各個のプローブはHLA DP遺伝子の異るセグメントに
特異的である。これらのプローブは、DP遺伝子の可変セ
グメントの変化配列に全体的に相補的なヌクレオチド配
列を含んで成る。プローブの相補的配列は通常10〜30ヌ
クレオチドの長さを有し、最もしばしば17〜19ヌクレオ
チドの長さを有する。

前記のごとく、PCRは核酸に基く診断法において非常
に重要な道具である。言うまでもなく本発明の新規なプ
ローブはPCRにより増幅されたDNA中の特異的配列を検出
するために用いることができる。PCRに基くHLA DP DNA
タイプ分けを可能にするため、本発明はPCRによる情報
に富むDP領域の増幅を可能にするオリゴヌクレオチドプ
ライマーを提供する。

従って、本発明の１つの観点は、固体から得られた核
酸含有サンプルからの個体のHLA DP遺伝子型を決定する
ための方法であり、この方法は、（ａ）HLA DP遺伝子の
多形成領域を含有する前記核酸の標的領域を増幅し；
（ｂ）該増幅された核酸をHLA DP遺伝子の変異セグメン
トについて特異的な配列特異的オリゴヌクレオチド（SS
O）プローブのパネルと該SSOプローブと増幅された核酸
とが安定なハイブリド二本鎖を形成することを許容する
条件下でハイブリダイズせしめ；そして（ｃ）前記増幅
された核酸とSSOプローブとの間で形成されたハイブリ
ドを検出する、ことを含んで成る。

本発明の他の観点は個体のHLA DP遺伝子型を決定する
のに有用なキットに関し、これらのキットは（ａ）前記
標的領域中の対立遺伝子変異配列のためのSSOプローブ
のパネル；及び（ｂ）キット成分を用いることにより遺
伝子型を決定するための指示書を含んで成る。

本発明の理解の一助として、幾つかの用語を下に定義
する。「遺伝子型」は、個体（又はサンプル）中に存在
する対立遺伝子の遺伝子型変化の記述に関する。個体の
遺伝子型は、例えば、血清学的試薬を使用することによ
り、タイプ分け細胞を使用することにより、ゲノムのRF
LP分析により、そして後で検討するようにSSOを用いる
ことにより決定することができる。

「HLA DP領域」又は「DP」は、Trowsdaleら、前掲に
より記載されたHLA D複合体に関し、これはHLAD領域の
セントロマー側に存在しそして２個のα遺伝子及び２個
のβ遺伝子を含有しその一対は偽遺伝子（pseudogene）
である。

「オリゴヌクレオチド」は、プライマー、プオーブ、
検出されるべき核酸断片、核酸対照、及び未標識のブロ
ッキングオリゴマーに関しそして２個以上のデオキシリ
ボヌクレオチド及びリボヌクレオチドから成る分子とし
て定義される。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは多
くの因子及びオリゴヌクレオチドの最終的機能又は用途
に依存するであろう。オリゴヌクレオチドは任意の適当
な方法により調製することができる。この様な方法に
は、例えば、適切な配列のクローニング及び制限酵素処
理、並びにNarangら、1979、Meth.Enzymol.68:90、ホス
ホジエステル法、Brownら、1979、Meth.Enzymol.68:109
のホスホジエステル法、Beaucageら、1981、Tetrahedro
n Lett.,22:1859−1862のジエチルホスホラミダイト
法、及び米国特許No.4,458,066の固体支持体法のごとき
方法による直接化学合成により調製することができる。

「多形性」又は「DNA多形」は、同一の交配集団（sam
e interbreeding population）に特定のDNA配列の２以
上の変異が共存する状態を意味する。

「プライマー」は、核酸鎖に対して相補的なプライマ
ー延長生成物の合成が誘導される条件下、すなわち適当
な緩衝液中及び適当な温度での４種類の異るヌクレオチ
ドトリホスフェートと重合剤（すなわち、DNAポリメラ
ーゼ又は逆転写酵素）の存在下でDNA合成の開始点とし
て機能することができるオリゴヌクレオチドに関し、こ
れは天然物でも合成品でもよい。プライマーは好ましく
はオリゴデオキシリボヌクレオチドであり、そして増幅
における最大効率のためには単鎖であるが、しかし二本
鎖であることもできる。二本鎖であれば、そのプライマ
ーは延長生成物を調製するために使用される前にその鎖
を分離するためにまず処理される。プライマーの正確な
長さは多くの因子に依存するが、しかし典型的には15〜
25ヌクレオチドの範囲である。短いプライマーヌクレオ
チドは一般に、鋳型と十分に安定なハイブリド複合体を
形成するために一層低い温度を必要とする。プライマー
は鋳型の正確な配列を反映する必要はないが、しかし鋳
型とハイブリダイズするために十分なだけ相補的でなけ
ればならない。プライマーに導入され得る非相補的配列
の例は制限酵素認識部位コードする配列である（米国特
許No.4,800,159を参照のこと）。

ここで用いられる「プライマー」は、増幅されるべき
標的の一端又は両端に関する情報に幾分の不明瞭さが存
在する場合には特に、複数のプライマーを意味すること
ができる。例えば、核酸配列が蛋白質配列から推定され
る場合、「プライマー」は実際には、遺伝コードの縮重
に基くすべての可能性あるコドン変化を代表する配列を
含む複数のプライマーオリゴヌクレオチドの集合であ
る。この集合中のプライマーオリゴヌクレオチドの１つ
が標的配列の末端と相同であろう。同様に、「保存され
た」（conserved）領域が一集団中の有意なレベルの多
形性を示す場合、隣接する配列を増幅するであろうプラ
イマーの混合物を調製することができる。所望により、
分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的又は化学的手
段により検出可能な標準を導入することによりプライマ
ーを標識することができる。例えば、有用な標識には、
³²P、蛍光色素、電子密度試薬、酵素（ELISAにおいて一
般に使用されるようなもの）、ビオチン、又はそれに対
する抗血清もしくはモノクローナル抗体が得るハプテン
もしくは蛋白質が含まれる。プライマー又は増幅された
DNAの固体支持体への固定化を促進するように、プライ
マーを「捕捉する」ために標識を使用することもでき
る。

「制限エンドヌクアージ」及び「制限酵素」は、特定
の核酸配列において又はその近傍で二本鎖DNAを切断す
る。通常は細菌由来の酵素を意味する。

「制限断片長多形」又は「RFLP」は、全ゲノムを通じ
てランダムに分配されておりそしてゲノムDNAの消化の
後に異る固体について異る制限エンドヌクレアーゼパラ
ーンを生成するDNAヌクレオチド配列の相違に関する。

「配列特異的オリゴヌクレオチド」又は「SSO」は、
検出されるべき配列に対して正確に相補的な配列、典型
的には、「配列特異的」ハイブリダイゼーション条件下
でその正確に相補的な標的配列のみとハイブリダイズす
るであろう。特定のDP対立遺伝子に特異的な配列、を有
するオリゴヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼー
ションはストリンジエント条件下である。ストリンジエ
ントハイブリダイゼーション条件は当業界において知ら
れており、そして例えばManiatisら、Molecular Clonin
g;A Laboratory Manual（New York,Cold Spring Harbor
Laboratory,1982）に記載されている。分析されるべき
配列に依存して、各配列につき１又は複数の配列特異的
オリゴヌクレオチドを使用することができる。用語「プ
ローブ」及び「SSOプローブ」はSSOと相互交換可能に用
いられる。

「標識領域」は、非常多形成DNA配列を含有する分析
されるべき核酸の領域を意味する。

「熱安定性ポリメラーゼ酵素」は、熱に対して比較的
安定であり、且つ標的配列の核酸鎖の１つに相補的なプ
ライマー延長生成物を形成するためのヌクレオチドの重
合を触媒する酵素に関する。一般にこの酵素はプライマ
ーを用いて標的配列の３′−末端において合成を開始し
そして鋳型にそって５′−方向に合成が終るまで進行す
る。精製された熱安定性ポリメラーゼ酵素はヨーロッパ
出願公開No.258,017により十分に記載されており、そし
てPerkin−Elmer Cetus Instrumentsから商業的に入手
可能であり、この出願公開を引用により本明細書に組み
入れる。

本発明は、個体のHLA DP遺伝子語を決定するための方
法及び試薬を提供する。本発明は部分的に、PCR増幅
法、クローニング法及びDNA配列決定法の組合せによるH
LA DPβ遺伝子の可変法第二エクソン中の多型性の発現
に基く。その結果、22DPβ（DPB）対立遺伝子変異体が
発見された。これらのDP遺伝子の新規な配列に基づい
て、変異体遺伝子型の検出のためにSSOプローブが提供
される。従って１個のプローブが特定のDPβ対立遺伝子
を特異的に同定することができるのはまれである。むし
ろ、対立遺伝の同一性は複数のプローブから成る１つの
パネルの結合のパターンから推定され、該パネルの各個
のプローブはDP遺伝子の異るセグメントに対して特異的
である。

本発明の好ましい態様において、HLA DP遺伝子型のDN
Aに基くタイプ分けの方法は、HLA DP遺伝子の可変部分
を含む核酸配列を増幅し、SSOを用いて存在する変異体H
LA DP配列を決定し、そして該増幅された標的配列へのS
SOプローブの結合パターンからHLA DP遺伝子型を推定す
ることから成る。この好ましい態様の実施を促進するた
め、本発明はHLA DP標的領域をPCRにより増幅するため
に有用なプライマーを提供する。

この好ましい方法において、HLA DP遺伝子型を決定す
べき個体から核酸を含有するサンプルが得られる。本発
明の目的のためにHLA DP核酸を含有する任意のタイプの
組織を用いることができる。本発明はまた増幅された核
酸と適合性であるから、そしてPCR法は極めて少量の核
酸を増幅することができるから、本発明の方法により非
常に少量の核酸を含有するサンプルを特定のHLA DP変異
体の存在についてタイプ分けすることができる。例え
ば、Higuchiら、1988、Nature,332:543−546により記載
されたDQαを用いての研究により証明されるように、１
本の毛でさえ本発明の目的のために十分なDNAを含有す
る。

一般に、サンプル中の核酸はDNAであり、最も普通に
はゲノムDNAであろう。しかしながら、本発明はまた他
の核酸、例えばメッセンジャーRNA又はクローン化され
たDNAを用いて実施することもでき、そして核酸はサン
プル中で単鎖でも二本鎖でもよく、そして本発明の目的
のためになお適当である。核酸の性質がどうであろう
と、単に方法の有意義な段階で適切な工程をとることに
より本発明の方法により核酸をタイプ分けすることがで
きることを認識する。サンプル中の核酸を増幅するため
にPCRが使用される場合、本発明の新規プローブにより
タイプ分けされる時にはサンプルは通常は二本鎖DNAを
含んで成るであろう。

前記のごとく、好ましい態様においては、本発明のHL
A DPタイプ分け法及びプローブはPCRで増幅された標的D
NAと組合わせて用いられる。しかしながら、サンプル中
のHLA DP標的配列の増幅は、標的配列がSSOプローブへ
の核酸ハイブリダイゼーションにより検出され得るのに
十分な増幅をもたらす既知の任意の方法により達成する
ことができることを、本発明の実施者は注目すべきであ
る。PCR法は当業際においてよく知られている（米国特
許No.4,683,195及びNo.4,682,202を参照のこと）が、そ
して種々の商業的売り主、例えばPerkin−Elmer/Cetus
instrumenetsがPCR試薬を販売そしてPCR処方を公表して
いるが、PCR法に親しみのない者に本発明を十分に理解
してもらいそして本発明を明確にするために幾らかのRC
Rの一般的情報を下に記載する。

サンプル中の標的核酸配列をPCRにより増幅するた
め、配列は増幅系の成分に接近可能でなければならな
い。一般に、この接近可能性はサンプルから核酸を単離
することにより保証される。生物学的サンプルから核酸
を抽出するための種々の方法が当業界において知られて
いる。例えば、Maniatisら、Molecular Cloning:A Labo
ratory Manual（New York,Cold Spring Harbor Laborat
ory,1982）により記載されているものを参照のこと）。
あるいは、サンプルが全く容易に分解可能であれば、PC
R法による増幅に先立って核酸を精製する必要はない。
すなわち、サンプルが細胞、特に末梢血リンパ球又は羊
膜細胞である場合、細胞を単に低張緩衝液中に懸濁する
ことにより細胞溶解及び細胞内成分の分解を達成するこ
とができる。

PCR法を開始するためにサンプル中の核酸がまず変性
される（サンプルの核酸が二本鎖であると過程して）た
め、及び幾つかのサンプルの単なる加熱が細胞の破壊を
もたらすため、サンプルからの核酸の単離は時として鎖
分離との組合せにおいて達成される。鎖分離は任意の適
当な変性法によって達成され得るが、これには物理的、
化学的、又は酵素的手段が含まれる。典型的な熱変性は
約１〜10分間にわたる約80℃〜150℃の範囲の温度を用
いる。鎖分離はまた、ヘリカーゼ活性を示すことができ
る酵素であるヘリカーゼによっても誘導され得る。例え
ば酵素RecAはATPの存在下でヘリカーゼ活性を有する。
ヘリカーゼによる鎖分離のために適当な反応条件は当業
界において知られている（Kuhn Hoffman−Berling,197
8、CSH−Quantitative Biology,43:63、及びRadding,19
82、Ann.Reu.Genetics,16:405−436を参照のこと）。

上記のことく、鎖分離はサンプルの核酸の単離と組合
わせて、又は別の段階として達成することができる。さ
らに、鎖分離はPCR法における次の段階、すなわちプラ
イマーのアニーリング及びプライマー延長生成物の合
成、と同時に達成することができる。PCR法のこの態様
において、鎖分離及びプライマーアニーリング及び延長
が平衡して起こるように温度が非常に注意深く制御され
る。PCR法のこの具体例において、反応は熱安定性ポリ
メラーゼにより触媒されそして上昇した温度において行
われる。この温度は酵素が熱安定である温度であり、そ
して十分なプライマーが鋳型鎖とアニールして重合の合
理的な速度が可能なように核酸が単鎖と二本鎖との平衡
状態にあるような温度である。しかしながら、PCR温の
好ましい態様においては、二本鎖の変性を生じさせるが
しかしポリメラーゼの非可逆的変形を生じさせないよう
な有効時間にわたる十分高い温度に反応混合物を加熱す
ることにより達成される（EP.No.258,017を参照のこ
と）。

しかしながら、鎖分離がいかにして達成されようと、
鎖が一旦分離されればPCRにおける次の段階は分離され
た鎖と標的配列を挟むプライマーとのハイブリダイゼー
ションを含む。次に、プライマーを延長して標的鎖の相
補的コピーを生成せしめ、そして変性、ハイブリダイゼ
ーション及び延長のサイクルを、所望量の増幅された核
酸を得るのに必要なだけ多数回反復する。

前記のごとく、本発明のHLA DP DNA増幅及びタイプ分
けのためのPCRプライマーを提供する。これらのプライ
マーは、HLA DP遺伝子座の変異領域中の標的配列を挟む
保存領域中の配列に対して相補的である。この発明の目
的のため、HLA DP遺伝子座の好ましい変異領域はDPα遺
伝子及びDPβ遺伝子の第二エクソンである、好結果のPC
R増幅のため本発明のプライマーは次の様に設計され
る。すなわち、二本鎖にそって各プライマーがハイブリ
ダイズする位置は、一方のプライマーから合成された延
長生成物が、その鋳型（相補体）から分離された時、他
方のプライマーの延長のためのプライマーとして機能し
て定義された長さの核酸の増幅されたセグメントを生成
するようなものである。さらに、選択的アニーリング条
件下でHLA DP領域に優先的に結合するであろうプライマ
ーが提供される。

PCRにおけるプライマーの鋳型−依存的延長は、適当
な塩、金属陽イオン及びpH緩衝系を含んで成る反応媒体
中適当量の４種類のデオキシリヌクレオチドトリホスフ
ェート（dATP,dGTP,dCTP及びdTTP）の存在下で重合剤に
より触媒される。適当な重合剤は鋳型依存的DNA合成を
触媒することが知られている酵素である。例えば、鋳型
がRNAである場合、該RNAを相補的DNA（cDNAに転換する
適当な重合剤は逆転写酵素（RT）、例えばトリ筋芽球症
ウイルスRTである。一旦、増幅のための標的がDNAとな
れば、適当なポリメラーゼには、例えば、大腸菌DNAポ
リメラーゼＩ又はそのKlenow断片、T₄DNAポリメラー
ゼ、及びテルムス・アクアチクス（Thermus aquaticu
s）から単離されそしてPerkin−Elmer/Cetus Instument
s（PECI）から市販されている熱安定性DNAポリメラーゼ
であるTaqポリメラーゼである。後者の酵素が核酸の増
幅及び配列決定において広く使用されている。DNAポリ
メラーゼを用いるための反応条件は当業界において知ら
れており、そして例えば論文Methods in Enzymology,及
びManiatisら、Molecular Cloning:A Laboratory Manua
l、前掲、に記載されている。

PCR法は段階的に行うことができ、この場合、各段階
の後に新たな試薬が添加され、あるいはすべての試薬を
同時に添加する態様で行うことができ、あるいは部分的
段階的に行うことができ、この場合は所定数の段階の後
新鮮な又は異る試薬が添加される。例えば、鎖分離が熱
により行われそしてポリメラーゼは熱感受性であれば、
各回の鎖分離の後に添加されなければならないであろ
う。しかしながら、例えばヘリカーゼが変性のために用
いられるならば、又は熱安定性ポリメラーゼが延長のた
めに用いられるならば、すべての試薬を最初に加えるこ
とができ、あるいはこれに代えて、試薬のモル比が反応
にとって重要であれば、試薬が合成反応により消耗され
るに従ってそれを定期的に補供することができる。PCR
法が熱安定性酵素を用いて自動化された工程として最も
普通に行われる。この方法においては、反応混合物は変
性領域、プライマーアニーリング領域、及び反応領域を
通して循環される。熱安定性酵素と共に使用するために
適合された装置はEP236,069により完全に開示されてお
り、そしてPECIから市販されている。

前記のように、本発明の方法においてPCR法が重要で
ある１つの理由は、HLA DP DNAタイプ分けに先立ってサ
ンプル核酸を増幅するためにPCR法を使用することがで
きることである。しかしながら、本発明の目的のための
PCRの他の重要な用途は、HLA DP領域中に存在するまだ
発見されていない対立遺伝子変異体のヌクレオチド配列
を決定して、それらの変異体のためのプローブを編成し
そして本発明の方法において使用され得るようにするた
めである。PCR法のこの用途において、DPα遺伝子及びD
Pβ遺伝子の多形性領域が増幅され、そしてこれらの多
形性標的領域、例えばDPα遺伝子及びDPβ遺伝子の第二
エクソンが決定される。前に説明したように、特定の変
異を含有する細胞を血清学的タイプ分け、混合リンパ球
タイプ分け又はプライムされたリンパ球タイプ分けによ
りタイプ分けし、特定の変異体の核酸配列を従来技術の
方法により確立されたDPタイプと関連づけることも有用
である。

DP変異体対立遺伝子の標的領域のヌクレオチド配列の
分析はPCR生成物の直接分析により容易に行うことがで
きる。好ましい配列決定法はInnisら、1988、Proc.Nat
l.Acad.Sci.,85:9436−9440に記載されており、この記
載を引用により本明細書に組み入れる。PCR増幅生成物
の直接配列分析の方法は、Saikiら、1988、Science,23
9:487−491に記載されている。あるいは、Schafら、198
6、Science,233:1076−1078に記載されているように、
配列分析に先立って、増幅された標的配列をクローニン
グすることができる。

下記の実施例において検討するように、多数の異るハ
プロタイプを代表するDPwタイプ分けされた細胞のパネ
ルをPCR及びDPβ遺伝子の第二エクソンのヌクレオチド
配列決定により分析した。後で非常に詳細に検討する自
己免疫疾患に罹った種々の個体から得られたサンプルを
用いてこの成果及び他の類似体の成果の結果として、こ
の遺伝座における22の異る対立遺伝子変異体が発見され
た。一般に、この結果が示すところによれば、特定のDP
β配列は標準PLT−定義DPw1〜DPw6特異性に関連する。
まれな例外は標準的で且つ再現性あるPLT DPwタイプ分
けを得ることの困難さを反映しており、この困難は本発
明の方法の利点を強調するものである。これに関して、
もともとDPw1としてタイプ分けされた細胞系Coxが最近D
Pw3として再タイプ分けされそしてDPB3対立遺伝子を含
有することは重要である。

血清学的に定義されたDPタイプとDP変異体ヌクレオチ
ド配列との間の他の興味ある且つ重要な相関々係が本発
明によりもたらされた進歩の結果として発見された。例
えば、従来技術のDPw4タイプは今や本発明の方法により
２種類のDPβサブタイプ（DPB4.1及びDPB4.2と命名され
る）に細分類され得る。DPB4.2対立遺伝子が、異常なDP
w4タイプを有することが知られている２種の（APD及びL
BI）DPw4ホモ接合タイプ分け細胞（HTC）中に見出され
た。DPw2タイプについてのDPβサブタイプ（DPB2.1及び
DPB2.2と命名する）も本発明の結果として発見された。

本発明により提供された他の有意義な進歩は、従来技
術の方法によりDP“blank"としてタイプ分けされた種々
の細胞における多数の変異体DPβ対立遺伝子の発見に関
する。これらの変異体対立遺伝子はDPB番号７以上によ
り命名されている。DPw blankの更なる分析はおそら
く、本発明の方法によりタイプ分けされ得る追加のDPβ
対立遺伝子の同定及び特徴付けを導くであろう。DPw bl
ank細胞は、Ｔ細胞試薬の既存のPLTパネルを刺激しない
ものである。Hornら、1988、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
5:6012−6016、により記載されたようにユニークDQB配
列によりコードされる血清学的DQw blank特異性とは異
り、DPw blank特異性は不均一である。DPw blankハプロ
タイプ頻度が40％と予想されるから、本発明は、この大
きなDPwタイプのサブタイプ分けを初めて可能にする点
において重要である。

DPwタイプ分けされた細胞からのDPβ DNA配列の入手
可能性は血清学的DPwタイプの細分類を可能にするのみ
ならず、血清学的タイプ分け試薬及び細胞性タイプ分け
試薬により定義される線状エピトープの同定を可能にす
る。例えば、抗体SP42はDPw2及びDPw4細胞と反応する。
これら２種類の特異性に対してユニークな唯一の配列84
〜87位のGly Gly Pro Met（GGPM）であり、従ってこれ
らはSP42エピトープを構成すると信じられる。同様に、
抗体SP3はDPw3及びDPw6細胞、並びにDPw blank細胞系To
k及びAkibaのごとき幾つかの他の細胞と反応する。これ
らの細胞系は特異性Cp63を担持しそして密接に関連する
DPβ対立遺伝子DPB9及びDPB12を含有する。SP3反応性細
胞に対してユニークな唯一の配列は55〜57位のAsp Gly
Asp（DED）配列である。従って、SP3エピトープはDPβ
鎖のこの領域に位置するようである。

本発明の新規なDP配列がいかにして血清学的に定義さ
れたエピトープのマッピングを可能にするかの他の例と
して、抗体DP11.1はDPw2及びDPw4細胞と反応する。Bodm
erら、1987、Proc.Acad.Sci.USA 84:1644−1648は、ウ
エスタンブロット分析により、この抗体がDPα鎖に結合
することを示した。本発明により提供されるDPβ多形性
のパターンが与えられれば、この観察は、DP11,1抗体
が、84〜87位にGly Gly Pro Met（GGPM）を含有するDP
α鎖及びDPβ鎖により形成されるコンホーメーション決
定基に結合する。

HLA DP領域の多形性残基はまたＴ細胞クローンにより
認識されるエピトープを形成することができる。クロー
ン1666からの細胞はDPw5及び幾つかのDPw2細胞と反応す
る。第10回国際組織適合性ワークショップにおいて開示
されたように、ABL（DPB2.2）は陽性であり、そしてWPV
（DPB2.1）は陰性である。これらのC1666細胞は55〜57
位のGlu Ala Glu（EAE）残基を認識することができる。
なぜならこの配列はDPB2.2及びDPB5細胞にユニークだか
らである。35位のLeu（Pheではなく）もC1666反応性細
胞にユニークである。

特定の多形性残基をDPw特異性に関連付ける同じアプ
ローチを用いてPTLタイプ分けにより定義されるエピト
ープをマップすることができる。例えば、DPB2.1及びDP
B4.2対立遺伝子間の唯一の差異は69位におけるGluからL
ysへの変化である。これらの対立遺伝子を含有する細胞
はPLT系において相互に区別されるので、多形性69位残
基の変化はPTTタイプ分け細胞により認識されるエピト
ープに含まれると信じられる。同様に、DPB3及びDPB6対
立遺伝子の差異は69位のLysからGluへの置換及び76位の
ValからMetへの変化のみである。

前記のごとく、本発明により提供される新規なDPβ配
列は非常に有用なDPβDNAタイプ分け法の基礎を提供す
るのみならず、血清学的DPβタイプ分け結果の解釈にお
いて非常に有用な情報を提供する。本発明はまた、DPβ
遺伝子座においてのみならず同様にDPα遺伝子座におい
てもHLA DNAタイプ分けを行うことを可能にする。後で
説明するように、現在、DPα遺伝子座の第二エクソンに
２個のみの対立遺伝子が存在することが知られている
（Trowsdaleら、前掲、を参照のこと）。これら２個の
対立遺伝子（これらの対立遺伝子はDPA1及びDPA2と命名
される）の第二エクソンによりコードされる蛋白質配列
はわずか３個のアミノ酸によってのみ相互に異り、そし
てこれらの差異はいずれの特定のPLTで定義されるタイ
プとも関連しないようである。すなわち、DPα変化はDP
αプローブ（Hyldig−Nielsenら、1987、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,84:1644−1648）により検出されるRFLP変化
により推定されるのよりも広範ではなく、RFLP分析によ
りDPα遺伝子中に検出される多形のほとんどが非コード
領域又は近くのDPβ遺伝座中にあることが示される。従
っておそらく、DPwタイプとDPαRFLPマーカーとの間の
観察される相関々係は、DPαRFLPマーカーとDR特異性と
の間の連係（Stetlerら、1985、Proc.Natl.Acad.Sci.US
A,82:8100−8104を参照のこと）がそうであるのと同様
に、DPβ配列変化とDPαプローブにより検出される多形
性制限部位との間の連結不安定反映している。

DPα遺伝子及びDPβ遺伝子のDPB配列は本発明の配列
特異的オリゴヌクレオチドプローブの設計において有用
な出発点として役立つ。これらのプローブは、ストリン
ジエントハイブリダイゼーション条件下で該プローブが
DPα及びDPβ対立遺伝子の変異体セクメント中の正確に
相補的である配列にのみ特異的にハイブリダイズするよ
うに設計される。これらのSSOプローブは、変異領域中
の変異配列を含有しそして配列特異的ハイブリダイゼー
ションを許容する任意の長さのものでよいが、しかし好
ましくは、プローブのハイブリダイズする領域は10〜30
塩基の範囲であり、そしてさらに好ましくは約17〜19塩
基の長さである。固定化のため、プローブは、照射によ
り固体支持体に固定され得るポリＴの長いストレッチを
も含有することができる。

本発明のSSOプローブはまた、DP対立遺伝子の特定の
変異体セグメントと特異的にハイブリダイズしそして該
特定のセグメントについて知られている他の変異体配列
との不安定化ミスマッチを有するように設計される。好
ましくは、プローブはDPα及びDPβ遺伝子の可変的第二
エクソン中の変異体DNAセグメントに対して特異的であ
り、そしてさらに好ましくはプローブは該第二エクソン
の８−11,36,55−57,65−69,76、及び84−87行近傍の残
基をコードするDNAセグメントに対して特異的である。D
Pβ及びDPα対立遺伝子の第二エクソンに特異的にハイ
ブリダイズするように設計されたオリゴヌクレオチドプ
ローブを後に及び実施例中にさらに詳細に記載する。

本発明のプローブはPCRプライマーの検討において前
に記載した技法を用いて合成しそして標識することがで
きる。例えば、プローブはその５′−末端において、該
プローブを³²P−ATP及びキナーゼと共にインキュベート
することにより標識することができる。SSOプローブの
ための適当な非放射性ラベルは西洋ワサビパーオキシダ
ーゼ（HRP）である。この標識を含有するプローブを調
製しそして検出する方法は実施例において後記する。こ
の様な標識されたプローブについての追加の情報のた
め、米国特許No.4.789,630;Saikiら、1988、N.Eng.J.Me
d.,319:537−541;及びBugawanら、1988、Bio/Technolog
y,６:943−947を参照のこと。これらの記載を引用によ
り本明細書に組み入れる。有用な色原体にはレッド・ロ
イコ色素及びTMBが含まれる。

本発明のプローブは、サンプル中に存在するHLA DP配
列にどのSSPプローブが結合するかを決定することによ
りサンプル中に存在する対立遺伝子配列を同定するため
に使用することができる。SSOプローブとサンプル中の
核酸配列との間に形成されるハイブリドを検出する本発
明の目的のために適当なアッセイ法は当業界において知
られている。例えば、実施例に記載されるようなドット
ブロット方式を用いて検出を行ことができる。このドッ
トブロット方式においては、未標識の増幅されたサンプ
ルを膜に結合させ、該膜を標識されたプローブと共に適
当なハイブリダイゼーション条件下でインキュベート
し、ハイブリダイズしていないプローブを洗浄し、そし
て該フィルターを結合したプローブの存在についてモニ
ターする。複数のサンプルが少数のプローブを用いて分
析される場合、完全にマッチしたハイブリドのみの存在
を許容するように、好ましい方法は高ストリンジエンシ
ハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件を必要とす
る。

他の方法は「逆」ドットブロット方式であり、この方
式においては増幅された配列がラベルを含有する。この
方式においては、未標識のSSOプローブが膜に結合さ
れ、そして適当なストリンジエントハイブリダイゼーシ
ョン条件下で、標識されたサンプルに暴露される。次
に、ハイブリダイズしなかった標識されたサンプルが適
当なストリンジエント条件下で洗浄により除去され、そ
して次にフィルターが結合した配列の存在についてモニ
ターされる。

「逆」ロットブロット方式の他の変法においては、SS
Oプローブが標識され、そしてサンプルの核酸が標識さ
れない。ハイブリダイゼーション及び洗浄の後、標識さ
れたプローブ又はプローブの標識された断片が横から放
出され、そして検出されることにより、サンプル中の配
列が標識されたオリゴヌクレオチドひハイブリダイズし
たか否かが決定される。二本鎖ハイブリド中の制限部位
を認識する制限酵素を用いる消化により標識の放出が達
成される。オリゴマー制限法として知られるこの方法
は、米国特許No.4,683,194及び対応するEP出願公開No.1
64,054に一層十分に記載されており、これらの記載を引
用により本明細書に組み入れる。

本発明のどのDP SSOプローブがサンプル中のDP配列に
ハイブリダイズするかを決定するための方法のいかんに
拘らず、DP DNAタイプ分け法の中心的特徴は、SSOプロ
ーブのパネルの結合のパターンを分析することによりサ
ンプル中に存在するHLA DP対立遺伝子を同定することを
含む。本発明の単一プロブは有用な情報を得るために使
用することが確かにできるが、DPβ対立遺伝子中の変化
は分散しているので、特定のDP変異体をいずれか１つの
プローブにより特異的に同定できるのはまれである。む
しろ、実施例に示すように、対立遺伝子の同一性は、DP
α及びDPβ遺伝子の異るセグメントに対して特異的な複
数のSSOプローブから成る１つのパネルの結合のパター
ンから推定される。

HLA DP対立遺伝子のタイプ分けは多くの異る目的のた
めに有用である。例えば、DPβ多形性は同種移植片の組
織拒絶に関与する。Amarら、J.Immunology,138:1947に
より記載されているように、骨髄移植の研究が示すとこ
ろによれば、急性移植片対宿主病及び弱いMLC反応性を
示す３組の見かけ上同じHLAの提供者−受容者対は、RFL
P分析によりすべてのDP領域において異っていた。従っ
て、移植片拒絶を防止するための有用な方法は、HLA DP
DNAタイプ分けの本発明の方法を適用することにより、
すなわち、提供者及び宿主の両者から得られるサンプル
中に存在するDPβ及び／又はDPα核酸配列へのSSOプロ
ーブのハイブリダイゼーションのパターンから提供者及
び宿主中に存在するHLA対立遺伝子を推定して、提供者
及び受容者のHLA DPタイプをマッチさせることを含むで
あろう。

HLA DP DNAタイプ分けの本発明の方法の他の重要な用
途はある種のHLA DP対立遺伝子に関連する自己免疫疾患
に対する個体の感受性の決定においてである。自己免疫
疾患に罹っている個体の所与の対立遺伝子が存在する頻
度を本発明の方法を用いて決定し、そしてその頻度を、
他のHLAタイプ分け系を用いて行われているような対照
群の健康な個体について決定された頻度の比較すること
により、特定のDP対立遺伝子と自己免疫疾患との関連性
を見出すことができる。例えば、Howellら、1988、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA,85:222−226は小児脂肪便症と一
対のHLA DPα及びHLA DPβRFLPとの間の有意な関係を報
告した。この様な研究はしばしば、患者及び対照の両群
において、今まで特徴付けられていないDP対立遺伝子の
発見の追加の利点を与える。例えば、その配列が本発明
の重要な観点であるDPB13〜DPB16対立遺伝子は、自己免
疫疾患患者群及び対照群を含む研究の過程で発見され
た。

このようにして、本発明の方法によりタイプ分けされ
た４人のCD患者の最初の研究が示したところによれば、
DPB4.2対立遺伝子はCD感受性を与える。イタリア人の個
体からのサンプルに基く一層広範な研究はまた、DPB4.2
対立遺伝子についてのCDの計算された相対危険度（RR）
が9.3であること、及び本発明の方法によりタイプ分け
された11人のCD患者の内６人がDPB3対立遺伝子を担持し
ていることを示した。本発明の方法により試薬されたCD
患者の約78％がDPB4.2又はDPB3対立遺伝子を担持してお
り、これらの対立遺伝子のいずれかの存在のRRは13.5で
ある。CDを有する米国人の個体の他の研究において、DP
B1対立遺伝子頻度の増加及びDPB4.2対立遺伝子の増加
が、対照群におけるこれらの対立遺伝子の頻度と比較し
た場合に観察された。これらの研究がさらに示すところ
によれば、DPβ対立遺伝子（DQB2）、DWQ対立遺伝子（D
QA4）及びDPβ対立遺伝子（DPB4.2又はDPB3）の特定の
組合わせがCD感受性の危険の増加と関連する。

前に示したように、本発明は個体のCD感受性を決定す
るための重要な新規な方法を提供し、この方法はCD感受
性と関連するDP対立遺伝子を個体が担持するか否かを決
定することを含んで成る。ここに示すように、CD感受性
付与対立遺伝子にはDPB4.2、DPB3及びDPB1対立遺伝子が
含まれ、そしてDPB4.1は相対的に一般的な対立遺伝子で
あるので、CD感受性個体における遺伝子型DPB4.1/4.2の
頻度の増加が存在する。

CDの場合と同様に、本発明は他の深刻な自己免疫疾患
について類似の進歩を提供する。例えば、対立遺伝子頻
度を疾患と関係付ける研究が示すところによれば、特定
のDPβ対立遺伝子の頻度はインシュリン依存性真性糖尿
病（IDDM）及び筋無力症（MG）の患者において、他のHL
Aマッチ対照に比べて高い。MGについては、第二エクソ
ンの３′末端の配列DEAVをコードするDP対立遺伝子、例
えばDPB3及びDPB5の頻度が増加する。さらに、MC遺伝に
おけるDPB4.1対立遺伝子の頻度（健康な対照個体に比べ
て）が劇的に上昇し、DPB4.1がMGからの保護を提供する
ことができる。IDDMについては、DPβ対立遺伝子DPB2.
1,DPBB1,DPB4.1及びDPB13の頻度が上昇する。DPB13対立
遺伝子を担持する研究されたIDDM患者の多くがさらにHL
A対立遺伝子B18及びDR3を担持していた。

本発明のDPタイヴ分け法はまた、個体がある形の関節
炎に感受性であるか否かの決定において重要な進歩を提
供した。例えば、古典的類リウマチ因子陽性の成人関節
リウマチ（ARA）を有する患者はDPB4.2対立遺伝子の頻
度の増加を示した。但し、この増加が統計的に有意であ
ることを保証するためにはさらなる研究を行わなければ
ならない。さらに、DPw2血清型が特定の小児性関節リウ
マチ（JRA）と関連することを長年知っている。前記の
ごとく、本発明は２つのDPB DNAタイプに細分類される
血清学的DPw2タイプを認め、そして本発明の疾患感受性
タイプ分け法が示すところによれば、JRAに対する既知
のDPw2関連感受性がDPB2.1対立遺伝子にさらに特異的に
寄与する。試験したJRA患者の約55％がDPB2.1について
陽性であり、他方対照個体のわずか16％がこの対立遺伝
子を有しており、DPB2.1対立遺伝子を有する個体におい
てJRAについて6.3のRRを与えた。JRAとDPB2.1の関連は
前に定義されたHLA DP領域マーカーとの連結から独立し
ており、そしてこのJAAとDPB2.1との関連の有意性は、D
PB2.2配列がB1ドメインの69位の唯一個のアミノ酸によ
りDPB4.2対立遺伝子（JRA感受性とは関連しないようで
ある）と異ることを考えるとき、一層容易に評価され得
る。しかしながら、DPB2.1対立遺伝子を有するほとんど
のJRA患者はさらに疾患関連DRマーカー、例えばDRw8,DR
w5、又はDRw6を有することに注意すべきである。

従って、本発明はまた、JRA感受性を検出する方法を
提供し、この方法は、好ましくは増幅の後に個体のHLA
DPゲノム性DNAをDPB2.1対立遺伝子について特異的なオ
リゴヌクレオチドプローブにより処理し、そしてハイブ
リダイゼーションが生じたか否かを決定することを含ん
で成る。しかしながら、本発明の一般的実施はDPβプロ
ーブの全パネルを用いるであろう。前記のように、本発
明の方法は、JRAのみではなく広範囲の種類の自己免疫
疾患とDPの関連を決定するのに有用である。この事実は
下記の表を考慮することにより一層容易に理解すること
ができ、この表には多数の患者群及び１つの対照群にお
ける種々のDP対立遺伝子について対立遺伝子頻度（示さ
れたDPタイプの対立遺伝子の数を存在するDP対立遺伝子
の合計数で除し、そして次に100倍したもの）が示され
る。表中でMSは多発生硬化症患者を示す。

一般に、自己免疫疾患のこれらの研究が示すところに
よれば、DPβ鎖の55,56及び69位の多形性残基の変化が
自己免疫疾患に対する遺伝的感受性に関与する。例え
ば、55位におけるアラニンからアスパラギン酸への変化
がDPB2.1及びDPB4.2対立遺伝子の両方に存在するが、し
かしながらDPB2.1に関連するらしいIDDMにおいては、69
位のアミノ酸の変化がさらに存在する。但し、感受性を
付与するのは対立遺伝子全体であって単に１つの場所の
アミノ酸ではないことに注目すべきである。

自己免疫疾患感受性に対するHLA DP対立遺伝子の効果
はHLA DR及びHLA DQ遺伝子座における類似の知見に反映
する。例えば、Scharfら、1988、Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA,85:3504−3508:及びHormら、1988、Proc.Natl.Acad.
Sci.USA,85:6012−6016は、DQβ鎖の57位及びDRβＩ鎖
の70位の多形性残基が自己免疫疾患である尋常性天疱瘡
（PV）及びIDDMに対する遺伝的感受性に関連することを
報告している。

前記のように、医療技術が発達するに従って、グレー
ブス病、全身性紅斑性狼瘡及びショーグレン（Sjgre
n）症候群を含めてのより多くの疾患又は病的状態が種
々のDP対立遺伝子と関連することが知られてきている。
本発明はこの様な対立遺伝子を多の対立遺伝子から区別
する方法を提供し、そしてそれ故に自己免疫疾患につい
て高い危険性のある個体を同定する手段を提供する。好
ましい態様においては、その感受性が決定されるべき個
体が、HLA DP遺伝子座の標的領域を増幅するためにPCR
法を用いてまずHLA DPタイプについて分析される。次
に、SSOプローブが増幅された標的領域にハイブリダイ
ズされ、そして増幅されたDNA中に存在する特定のDP対
立遺伝子がSSOプローブの結合パターンから決定され
る。最後に、増幅されたDNA中に存在する対立遺伝子が
自己免疫疾患に関連する対立遺伝子であるか否かを決定
する。

本発明はしかしながら、有意義な利益を提供する能力
において医科学の分野に限定されない。DNAタイプ分け
法は今やさらに、犯罪の現場に残された証拠と個体とを
関連付けることにより犯罪者又は犠牲者の特定が達成さ
れる場合のように犯罪事件を解決するために、又は個体
の母系又は父系を決定するために生物学的材料が使用さ
れる場合のように非犯罪的性質の他の事件を解決するた
めに、個体特定の重要な分野において有意義な役割を演
ずる。

本発明を用いる目的のいかんに拘らず、種々のDP対立
遺伝子間の相違がこの方法の成功の鍵である。対立遺伝
子によりコードされている種々のアミノ酸が配列されそ
して試験される場合、DP対立遺伝子間の最も有意な相違
が非常に容易に検出され得る。この様な並列を下に示
す。ここではダッシュはDPB4.1対立遺伝子（SXBと称す
る種々のDPβ対立遺伝子及びDPβ偽遺伝子について）と
又はDPA1対立遺伝子（SXAと称するDPαDPA2対立遺伝子
及びDPα偽遺伝子について）と同一であることを示す。
この表示において、番号位置は成熟蛋白質サブユニット
についてのものであり、対立遺伝子の標示は左にあり、
そして代表的な細胞源は右に示してある。

しかしながら、実際的且つ経済的な態様でDP対立遺伝
子を検出しその間を区別するためには、対立遺伝子のヌ
クレオチド配列を知らなければならない。種々のDPα及
びDPβ対立遺伝子のヌクレオチド配列の部分を下に示
す。配列は前記と同じである。本発明の代表的なプライ
マーがDNAの生産を可能にし、そのコドン８〜90の配列
を決定することができる。本発明の種々のプローブとの
ハイブリダイゼーションのための好ましい標的配列であ
る対立遺伝子配列の位置は｜…Ａ…|,|…Ｂ…|,|…Ｃ…
|,|…Ｄ…|,|…Ｅ…Ｅ、及び｜…Ｆ…｜として示され
る。

上記のDNA配列は本発明の重要な観点である。配列の
一方のみの鎖が示されているが、当業者は、上記の情報
から配列の他方の鎖が推定され得ることを認識する。こ
の情報は本発明のプローブの構成を可能にする。本発明
の多くの例示的なプローブが後記の実施例に示される。
しかしながら、DPβ対立遺伝子のハイブリダイゼーショ
ン分析のための適当なSSOプローブはある種の多形性配
列を含んでなる（又はそれに対して相補的である）であ
ろう。本発明の６セットの例示的プローブを下に記載す
る。各セットはHLA DPβ遺伝子の第二エクソンの特定の
セグメント中の多形間を区別するように設計されてい
る。セグメント表示は前記の通りである。それに対して
プローブがハイブリダイズする対立遺伝子変異体内にコ
ードされている多形性残基を１文字アミノ酸コードで
（ダッシュはプロトタイプ残基がそれらの位置に存在す
ることを示す）プローブ配列の左に示す。プローブは、
多形性アミノ酸残基をコードする領域を含み、そして約
18ヌクレオチドの長さを有するものとして示される。多
形性アミノ酸残基をコードしそしてそれ故に表示された
セグメントをコードする対立遺伝子を検出するためのプ
ローブ内に含まれなければならないプローブ中の配列
は、配列中のスラッシュ記号の間に存在する。それに対
してプローブがハイブリダイズするであろうDP対立遺伝
子をプローブの右に示す。

本発明のプローブはハイブリダイゼーションにおいて
使用するために単鎖であるから、例えばコード鎖とハイ
ブリダイズするようにプローブが設計されていること
は、非コード鎖上に存在する相補鎖にハイブリダイズす
るであろう。同様に有用なプローブを設計することがで
きないことを意味するものではないことをに注目すべき
である。

上記の配列情報は本発明の多の重要な観点にも関連す
る。多くの異るDP対立遺伝子を増幅するために本発明の
好ましいプライマーが設計される。多くの場合、下記の
実施例において記載するように、この様なプライマーは
非常に有用である。しかしながら、当業者は、前記の配
列情報が、対立遺伝子特異的増幅を可能にするであろう
プライマーを設計するためにも使用され得ることを認識
する。この様な対立遺伝子特異的プライマーは単一の対
立遺伝子又は既知対立遺伝子のある１つのサブセットの
みを増幅するであろう。例えば、本発明の「DEAV」プロ
ーブは、「DEAV」DPβ対立遺伝子の対立遺伝子特異的増
幅を提供するためのプライマー対の一方のプライマーと
して使用することができる。

本発明はまた、本発明の方法を実施するために重要な
構成要素を含んで成る多容器ユニットを含むキットに関
する。例えば、PCRのためのプライマーは本発明の好ま
しい態様において必要であるから、このキットはPCRの
ためのプライマーを含有することができる。これらのプ
ライマーは少なくともDPβ遺伝子を増幅し、そして適当
な場合には、例えば法医学文析において、DPα遺伝子を
増幅するプライマーも含まれ得る。キットはまた、少な
くともDPβ遺伝子のためのSSOプローブを含有しなけれ
ばならず、そして適当な場合には、同様にDPα遺伝子の
ためのプローブも含有する。幾つかの場合には、SSOプ
ローブをハイブリダイゼーション分析のために有用な適
当な支持膜に固定することができる。キットの容器に収
容することができる他の任意成分には、例えば、プライ
マー延長生成物の合成を触媒するための試薬、基質ヌク
レオチド、標識するために用いる手段（例えば、標識が
ビチオンである場合には、アビジン−酵素接合体及び酵
素基質並びに色原体）、並びにPCR又はハイブリダイゼ
ーション反応のための適当な緩衝剤が含まれる。上記の
成分に加えて、キットは本発明の方法を実施するための
キットを含むことができる。

本発明の多くの実施例を下に示すが、これらは例示の
ためにも与えられそして本発明の範囲を限定するもので
はない。請求の範囲内の本発明の多くの態様が、前記の
記載及び後記の実施例を読むことにより、当業者には明
らかであろう。下記の実施例において、ある種の技法は
特にことわらない限り標準的なものである。これらの技
法には、Shawら、1980、J.Exp.Med.152:565−580により
実質的に記載されているようにして実施されるPLTが含
まれる。一般に、リンパ球プライミングのためには、リ
スポンダー及びスティムレーター細胞が解凍され、洗浄
され、そしてグルタミン及び抗生物質を補充されたRPMI
−1640培地（完全培地）中に再懸濁される。リスポンダ
ー細胞が照射されたスティムレーター細胞と2:1の比率
で混合され、そしてこの細胞混合物が37℃にて10日間イ
ンキュベートされた。照射されたプライムされたスティ
ムレーター細胞が照射されたスティムレーター細胞と共
に完全培地中で同時培養された。48時間後、³H−チミジ
ンが培養物に添加された。細胞が18時間後に回収され、
そしてトリチュウムの取込みがβ−放射の計数により評
価された。

DNA配列分析はManiatisら、Molecular Cloning:A Lab
oratory Manual（New York,Cold Sring Harbor Laborat
ory,1982）により記載されているようにして行われた。
一般に、分析されるべき配列はM13クローニングベクタ
ーにクローニングされ、そしてMaxam−G₁lbert技法によ
り又はジデオキシチェインターミネーション技法により
分析された。プライマー及びプローブの両者の合成オリ
ゴヌクレオチドは市販の装置及び当業界において知られ
ている技法を用いて合成された。

実施例１ HLA DP対立遺伝子のDNA配列の分析 DPα遺伝子及びDPβ遺伝子の種々の対立遺伝子の可変
第二エクソンのDNA配列を決定した。使用したDNAサンプ
ルは、できるだけ広範囲のPLTで定義されるDP対立遺伝
子を代表するように選ばれた。DNAを、標準的６タイプ
のDPwについてホム接合性である細胞系から、異常なタ
イプ分け反応を示す細胞から、及びDPブランク反応を示
す細胞から抽出した。DNAの抽出は、Maniatisら、Molec
ular Cloning:A Laboratory Manualにより記載されてい
る標準的技法により行った。DPα遺伝子及びDPβ遺伝子
の可変第二エクソンは、前記のようにしてRCR法により
増幅した。増幅されたDNA配列をM13由来のベクターにク
ローニングし、そしてチェインターミネーション法によ
りDNA配列を決定した。使用した細胞系、それらのDP血
清型、それらのPLTで定義される。DPwタイプ、及びこれ
らが含有することが見出されたDNAで定義される対立遺
伝子を下記の表に示す（空欄はデータが決定されていな
いことを示す）。

DP“MAS"はDPB4.2対立遺伝子に関連する新しく定義さ
れたDP特異性についての仮の表示である。“CD"細胞系
は実際にCD遺伝からのサンプルである。

＊は異常なDPw表現型を有する細胞である。

前記から示されるように、HLA DPサブタイプのDNA分
析が示すところによれば、特定の配列が既知のPLTで定
義されるDPwタイプ分けと相関し、プライムドＴ−細胞
により認識される多形性エピトープがDPβ鎖上に存在す
ることが示される。幾つかのDPタイプ、例えばDPw2及び
DPw4については、配列分析がサブタイプ変形体（varian
t）を示した。DPw2についての変形体はDPw2.1及びDPB2.
2と命名され;PLTについてDPw4“new"例えばLB1）又はDP
w4^＊（例えばAPD）としてタイプ分けされた細胞はさら
にまれなDPB4.2サブタイプを含有する。DPB4.2サブタイ
プは配列によりDPB4.1対立遺伝子によりもDPB2.1対立遺
伝子により一層関連付けられる。個々のCD11はDPw2とし
てタイプ分けされるPLTであるが、密接に関連するDPB2.
1及びDPB4.2対立遺伝子を含有する。

上記の結果はまた、ユニークなDPβ配列がDPw1,DPw3,
DPw5及びDPw6特異性に関連することを示し、そしてこれ
らの対立遺伝子はこの相関々係を反映するように命名さ
れた。しかしながら、少数の例外においては、細胞系DK
YはDPw5としてタイプ分けされているがしかしDPB2.1対
立遺伝子を含有し、そして個々のCD2はDPw2としてタイ
プ分けされるPLTであるがしかしDPB4.2及びDPB10対立遺
伝子を含有する。

実施例２ DPα及びDPβ遺伝子のPCR増幅実施例１に記載した細胞の幾つかのDPα及びDPβ遺伝
子をPCRにより増幅した。使用された合成プライマーを
下に示す。この表示において、左側のプライマーGH98及
びDB01は上方鎖からものであり、そしてDNAポリメラー
ゼが右側に延長するのを指令する。右側のプライマーGH
99及びDB03は下方鎖からのものであり、そして左側への
合成を指令する。プライマーが結合する及びプライマー
延長のための鋳型として作用する遺伝子の領域も示され
ている。小文字、標的ゲノムDNA（反対の鎖に示され
る）に相補的でないプライマー中の塩基を示す。プライ
マー中のこれらの変化が増幅されたDNAの末端に制限酵
素部位（BamH I又はPst I）を導入し、そして増幅され
たDNAのクローニングを促進する。DPαの第二エクソン
の増幅のために使用されるオリゴヌクレオチドプライマ
ーGH98及びGH99は243bpセグメントを増幅する。PCR生成
物の最初の2bpはこのエクソンを挟む介在配列からのも
のである。オリゴヌクレオチドプライマーDB01及びDB03
はDPβの第二エクソンの249bpセグメントを増幅する。
この生成物の左の13bp及び右の17bpは介在配列からのも
のである。プライマーのハイブリダイゼーション及び延
長されたプライマー含有生成物の合成は、ED258,017、
及びPCRを実施するために使用されるThermal Cyclerの
製造者PECIにより提供される処方中に実質的に記載され
ている。

DPβ対立遺伝子の第二エクソンを増幅するための本発
明の他の２つのプライマーはUG19及びUG21と称される。
これらのプライマー、及び本発明の他のDPβプライマー
の配列を下記する。

実施例３ DPβ対立遺伝子のハイブリダイゼーション分析のための
SSOプローブ他の実施例を通して言及される本発明の例示的プロー
ブを下記の表に記載する。表中には、プロブの名称、プ
ローブの配列、該プローブがハイブリダイズする対立遺
伝子中にコードされている多形性アミノ酸配列、セグメ
ントの名称、並びにハイブリダイゼーション及び洗浄の
条件が示される。プローブは³²P又は「Ｘ」標識を有す
るものとして示され、ここでＸは後の実施例に示される
ようにHRPを表わす。プローブ配列がＸ及びこれに続く
プローブの名称により示される場合、プローブの配列は
Ｘの後に名称が付されたプローブのそれと同一である
が、但し³²P標識がHRP標識により置換えられている。

当業者は、使用される標識のタイプに依存してハイブ
リダイゼーション及び洗浄の条件が異ることを認識す
る。好ましい態様においてはプローブは非放射性標識さ
れる（例えばHRPにより）であろうが、アイソトープ
（例えば³²P）標識を有するプローブの幾つかが使用さ
れている。従って、³²P−標識プローブ及びHRP−標識プ
ローブについてハイブリダイゼーション及び洗浄の条件
が示され、これらの条件は実験的に決定された〔Bugawa
nら、1988、J.Immunol.141（２）:4024−4030を参照の
こと〕。表において、言及される条件は5x Denhardt溶
液、0.5％SDSから成るハイブリダイゼーション溶液及び
示される量（すなわち、0.1x,3x,5x）のSSPEを仮定して
いる。5x Denhardt溶液は500ml当り0.5gのFicoll、0.5g
のポリビニルピロリドン、0.5gのBSA（Pentax Fractio
n）を含有する。洗浄溶液は0.1x SSPE及び0.1％SDSを含
有する（HRP−標識プローブのためには0.1％Triton x−
100がSDSの代りに使用される）。洗浄段階は10分間にわ
たって同じ温度で行われる。しかしながら、実施例11に
記載するように、サンプル中のDP対立遺伝子のタイプを
決定するためにパネル中の多数のプローブが使用される
場合の好ましい条件である、より均一なハイブリダイゼ
ーション及び洗浄条件を可能にすようにテトラメチルア
ンモニウムクロリド又は類似の塩を使用することができ
る。

上記の表に関してDB28はDB32と交叉ハイブリダイズす
るので、DB及びDB32の代りにそれぞれプローブDB58及び
DB59を用いて卓越した結果が得られることに注目すべき
である。さらに、プローブDB63はDB39より好ましい。

実施例４ DPα対立遺伝子はハイブリダイゼーション分析のための
SSOプローブ DPα対立遺伝子のハイブリダイゼーション分析のため
の適当なSSOプローブの例を下に示す。２セットのプロ
ーブが例示され、各セットは、HLA DPα遺伝子の第二エ
クソンの特定のセグメントにおける多形性の間を識別す
るように設計されている。ASO1及びASO2はそれぞれ、メ
チオニン（Ｍ）及びグルタミン（Ｑ）を含有する多形性
セグメントを含む領域におけるDPA1対立遺伝子に結合す
る。ASO3及びASO4はそれぞれ、グルタミン及びアルギニ
ン（Ｒ）を含有する多形性セグメントを含む領域のDPA2
対立遺伝子に結合する。ASO2及びASO4はグルタミンを含
有する多形性セグメントからアルギニンを含有するそれ
を区別する。これらのプローブは、これらの多形性アミ
ノ酸残基をコードする領域を含む。これらのプローブを
用いるハイブリダイゼーションは通常、5x SSPE,5x Den
hardt及び0.5％SDSを含有する溶液中で42℃にて少なく
とも１時間にわたり行われる。これらのプローブと共に
使用される洗浄条件も下される。

実施例５ SSOプローブを用いるハイブリダイゼーションによる増
幅されたDPβ配列の分析 24HTCsからのPCR増幅されたDPβ配列を³²P−標識SSO
プローブのパネル（ｎ＝９）により、ドッポブロット法
で分析し、そしてDPタイプをプローブ結合のパターンか
ら推定した。細胞からのDNAの抽出は実施例１に記載し
た通りであった。細胞ゲノム標的領域、すなわちDPβ遺
伝子の第二エクソンを実施例２に記載したようにしてPC
R法により増幅したが、DNAは前記の表に挙げた細胞から
のものであった。

増幅されたDNAをフィルター上にドットブロットし、
サンプルのパネルを含む個別のフィルターを調製して、
各SSOプローブとのハイブリダイゼーションにより分析
を行った。サンプルをドットブロットするため、５μ
の各増幅されたサンプルを0.4N NaOH及び25mM EDTAを含
有する溶液195μで希釈し、そして次の様にしてGenat
ron 45（Plasco）ナイロンフィルターにスポットした。
まずフィルターを水で湿し、これらをドットプロットの
調製のためのBio−dot装置（Bio−Rad、リッチモンド、
CA）中に置き、そして各ウエルを0.4mlの20x SSPE（3.6
M NaCl、200mM NaH₂PO₄及び20mM EDTA）によりすすい
だ。フィルターを取り出し、2x SSPE中ですすぎ、そし
て真空オーブン中で80℃にて30分間ベークした。

フィルター上のサンプルを本発明のSSOプローブとハ
イブリダイズせしめた。ハイブリダイゼーションは0.25
〜0.5pmoleのプローブを用いて２〜5mlのハイブリダイ
ゼーション溶液中で行った。このDPαタイプ分けの効果
を下に示す。この結果は、フィルター上のサンプルがハ
イブリダイズしたプローブ及びプローブにより検出され
たコードされているアミノ酸を示す。

SSOプローブを用いるハイブリダイゼーション分析に
基く細胞のDPβタイプの決定を上に検討した。サンプル
のDPβタイプを決定するため、サンプルへのプローブの
結合を試験した。存在する対立遺伝子をプローブ結合の
パターンから推定した。例えば、サンプル１はSSOプロ
ーブDB11,DB17及びDB20と共にハイブリドを形成した。D
B11,DB17及びDB20によりコードされるアミノ酸はそれぞ
れVYQL,DED及びLEEKである。DPβ対立遺伝子アミノ酸配
列のセグメントA,C及びＤの試験が示すところによれ
ば、配列VYQLがDPB6,DPB11及びDPB13中に存在し；配列D
EDがDPB17,DPB14,DPB12,DPB9,DPB6及びDPB3中に存在
し；配列LEEK（L____K）がDPB18,DPB14,DPB4.1,DPB4.2,
DPB5,DPB7,DPB3及びDPB1中に存在する。このプローブと
ハイブリダイズする３つの配列を含有する唯一の対立遺
伝子はDPB3である。従って、SSOタイプ分けに基くサン
プル１のDPタイプはDPB3である。

他のサンプルのDPBタイプを同じ型の分析により推定
し、そして決定されたタイプを上に示す。この表示にお
いて、星印（＊）は配列分析によりDPβ遺伝子型も決定
されている細胞を示す。細胞系COX（最初w1→w3）及びB
M21（最初w1→ブランク）のDPwタイプが最近、示された
タイプに変更された。記号±はプローブにより得られる
弱いシグナルを意味する。幾つかの場合（BM2及びTOK）
において、この弱いシグナルは、アミノ酸残基VHYLをコ
ードする領域Ａ中の追加の多形性配列であってDB11プロ
ーブと交叉ハイブリダイズするものの存在を反映してい
る。この配列は領域ＡプローブDB22を用いて一層便利に
タイプ分けすることができる。他の細胞系（BM92）につ
いては、DB10プローブにより認識される配列へのDB11プ
ローブのバックグラウンド交叉ハイブリダイゼーション
が存在するようである。同様に、DB18プローブに相補的
な配列上でDB19プローブによる交叉ハイブリダイゼーシ
ョンシグナルが生ずるようである。

この実施例で使用されるSSOのパネルは５個の多形性
領域の内の３個のみにおいて変化を検出し、そしてこれ
ら３個の領域においてすべての対立遺伝子変異は検出し
ない。この実施例の方法を用いるタイプ分け系は単純で
ありそしてHTCについて明瞭であるが、しかし多形性の
寄せ集めが与えられる場合、種々のプローブのハイブリ
ダイゼーションパターンが対立遺伝子のユニークな一対
より多いものとして解釈され得る場合、時としてヘテロ
接合性個体について不明瞭なタイプ分けを生じさせる場
合がある。この不明瞭性は異るDPβ対立遺伝子を構成す
るDPβ配列変異体を多くの異る組合せから生ずる。しか
しながら、残りの多形性領域を含む本発明により提供さ
れる追加のSSOプローブを用いて、ヘテロ接合性固体に
ついて明瞭なタイプ分けを得ることができる。

実施例６ PCR増幅された標的領域のDNA配列分析による小児脂肪便
症患者のHLA DPタイプ分け小児脂肪便症（CD）を有する４人の患者の細胞をPLT
−タイプ分けし、そしてDPβの第二エクソンのDNA配列
を実施例１に記載したようにして決定した。CD診断は臨
床症状に基いた。

CD細胞のDPβ（第二エクソン）のDNA配列決定により
得られた分析の結果を上に検討した。これらの結果か
ら、CD細胞が非−CD細胞と比較される場合にDPB4.2対立
遺伝子の頻度に見かけ上の増加が存在することが観察さ
れる。さらに、30の非CD−細胞系の１つのみに観察され
たDPB10対立遺伝子配列が２人の独立のCD患者に存在す
る。

実施例７ SSOプローブハイブリダイゼーション分析による小児脂
肪便症患者のタイプ分け CDを有する19人の患者及び43人の非−CD対照の細胞
を、SSOプローブハイブリダイゼーション分析によりHLA
DPタイプについて分析した。CDの診断は臨床症状に基
づいた。CD患者及び対照個体はすべてイタリア人であっ
た。DNAの抽出は実施例１に記載したようにして行っ
た。サンプルのPCR増幅は実施例２に記載したようにし
て行った。増幅された配列の分析は実施例４に記載され
ているようにして行った。

分析の結果が示すところによれば、非−CD対象に比べ
てCD患者においてDPB4.2対立遺伝子の有意な増加が存在
した。すなわち、この対立遺伝子は19人のCD患者中12人
に存在したが、43人の対照者中わずか３人に存在した。
DPB4.2及びDPB3対立遺伝子は、19人のCD患者の内17人及
び43人の対照の内15人に存在した。遺伝子型DPB4.1/4.2
は19人のCD患者の内10人及び43人の対照の内わずか１人
に存在した。

実施例８法医学的サンプルのHLA DPタイプ分け容疑者のゲノム核酸を含有するサンプルを得る。該ゲ
ノムの標的領域、すなわちDPα及びDPβ遺伝子の第二エ
クソンを含有する領域を実施例２に記載したようにして
PCR法により増幅するが、該実施例における細胞からの
核酸の代りに容疑者かやの核酸を用い、そして増幅され
たサンプルは³²P−標識を含有する。同じフィルターに
ドットブロットされておりそしてポリ−αＴテインによ
りフィルターに固定されている本発明プローブと上記の
増幅さたサンプルとをハイブリダイズさせる。このフィ
ルターのためのハイブリダイゼーション及び洗浄の条件
は完全にマッチしたハイブリドのみを二本鎖として残
す。フィルターを試験してどのプローブが標識されたサ
ンプルとハイブリダイズするかを決定する。

容疑者から得られたサンプルと比較されるべきサンプ
ルをDPタイプについて同じ方法により、すなわちPCR増
幅及び固定化されたSSOプローブとのハイブリダイゼー
ションにより試験する。容疑者からのサンプル及び比較
のサンプルのSSOプローブへの結合のパターンを試験し
てハイブリダイゼーションパターンの同量を決定する。

実施例９西洋ワサビオキシダーゼにより標識されたSSOプローブ
を使用してのHLA DPタイプ分け 39人の個体からの細胞のパネルをDPβ対立遺伝子につ
いてSSOプローブを用いて第二エクソンの変異に関して
タイプ分けした。プローブを西洋ワサビパーオキシダー
ゼ（HRP）により標識し、そしてハイブリドをドッロブ
ロット法により検出した。

分析された細胞は、14人のIDDM患者、５人の対照非−
IDDM患者、及びDPブランクとしてPLTによりタイプ分け
された19人のHTCからのものであった。IDDM患者は臨床
症状により同定された。実施例１に記載したようにして
細胞からDNAを単離した。標的領域、すなわちDPβ対立
遺伝子の第二エクソンをPCR法を用いて、50mM Tris−HC
l（pH8.3）、2.5mM MgCl₂、100μg/mlゼラチン、0.75mM
づつの４種のデオキシヌクレオシドトリホスフェート、
プライマーDB01及びDB02、並びにTagポリメラーゼを含
有する反応混合液200μ中で増幅した。増幅工程は次
の通りであった:30秒で94℃への加熱及びこの温度で30
秒間のインキュベーション:1分間で55℃への冷却及びこ
の温度での30秒間のインキュベーション:30秒で72℃へ
の加熱及びこの温度での45秒間のインキュベーション。
このサイクルを42サイクル反復した。増幅の後、反応混
合物をサンプリングし、そして３％Nusieve及び１％ア
ガロースを含有するゲル上でのゲル電気泳動によりモノ
ターし、すべてのDNA量が匹敵するか否かを決定した。

50μ／ドットの変性され増幅されたDNAをGenatran
ナイロン膜上にブロットしそしてサンプルを含有するフ
ィルターを５分間UV処理することにより、ドットブロッ
トされたサンプルを含有するフィルターを調製した。後
者の処理はサンプルを膜に固定するためのものである。
５μのPCR反応混合物を、0.4N NaOH及び25mM EDTAを
含有する150μの全容量中で５分間処理することによ
り、増幅されたDNAを変性させた。HRPで標識されたASO
プローブとのハイブリダイゼーションのために８枚のレ
プリカフィルターを調製した。

ハイブリダイゼーションに先立ち、サンプル含有フィ
ルターをプローブを含有しないプレ−ハイブリダイゼー
ション溶液（1x SSPE,5x Denhardt溶液、１％Triton x
−100）中で15分間インキュベーションした。プレ−ハ
イブリダイゼーションにおいてはSDSの代りにTriton x
−100が使用された。さらに1picomole/mlのプローブを
含有する同じ溶液中でハイブリダイゼーションを行っ
た。各フィルターを、HRP標識のプローブの１つを含有
するハイブリダイゼーション溶液2.5mlと共に45分間イ
ンキュベーションした。使用したプローブはDB27,DB28,
DB29,DB30,DB31,DB32,DB33及びDB25であった。プローブ
及びハイブリダイゼーション条件は実施例３において表
に示す。ハイブリダイゼーションの後、実施例３に記載
したようにして、適当なストリンジエント条件下で、す
なわち0.1x SSPE,0.1％Triton x−100中で42℃にて５分
間洗浄した。HRP標識SSOプローブはPCT公開89/02931及
び89/02932に記載されている方法と実質的に同様にして
調製した。これらの記載を引用によりこの明細書に組入
れる。

これらの方法は実質的に、一端にホスホラミダイト成
分を有しそして他端に保護されたスルヒドリル成分を有
する親水性ポリマー鎖（例えば、ポリオキシエチレン）
を含んで成る線状連結分子を用いて核酸プローブを誘導
体化することを含む。ホスホラミダイト成分は当業界に
おいてよく知られている反応（例えば、1988、Tetrahed
ron Lett.22:1859−1862）により核酸プローブにカップ
リングし、他方脱保護されたスルヒドリル基は蛋白質例
えばHRPとジスルフィド結合又は他の共有結合を形成す
ることができる。HRPはＮ−マレイミド−６−アミノカ
プロイル基を介して連結基に接合する。Ｎ−マレイミド
−６−アミノカプロン酸を４−ヒドロキシ−３−ニトロ
ベンゼンスルホン酸ナトリウムによりジメチルホルムア
ミド中１当量のジシクロヘキシルカルボジイミドの存在
下でエステル化することにより標識が調製される。精製
の後、生成物をHRP含有リン酸緩衝液にHRP:エステルの
重量比8:1で加えた。オリゴヌクレオチドプローブをDNA
合成機中で合成し、そして（C₆H₅）₃CS−（CH₂CH₂O）_４
−Ｐ（CH₂CH₂CN）〔Ｎ（ｉ−（PR）_２〕の構造をする連
結分子を、ホスホラミダイト合成条件を用いて接合させ
た。トリチル基を除去し、そしてHRP誘導体及びプロー
ブ誘導体を一緒に混合し、そして標識されたプローブを
形成するように反応せしめる。

ハイブリダイズしたプローブを含有するサンプルを、
Sheldonら、1986、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:9085−9
089に記載されているようにして、TMB/H₂O₂を用いる発
色反応により検出した。反応系を実施例10に後者する。
増幅されたDNAサンプルのHLA DP遺伝子型はフィルター
から容易に明らかであった。

実施例10 HRPで標識されたSSOプローブによるHLA POタイプ分け A.PCR増幅 DPBタイプ分けは14又はそれより多くのSSOプローブ
（配列特異的オリゴヌクレオチド）を用いることがで
き、DNAに制限がなければ増幅は0.5〜２μｇのDNAに対
して200μの反応容量中で行われる。より少量、すな
わち100ngの、DNAを増幅することができるが、この様な
サンプルによればより多くのサイクル、すなわち45サイ
クル、の増幅が行われるべきである。

PCR反応は下記のものを１〜２秒間渦動して混合する
ことにより開始される。

DNA 0.5〜２μｇ 10x Taq緩衝液 20μ 100mM dNTPs 1.5μ DPBプライマー［10μM UG19 or DB01］ 10μ DPBプライマー［10μM UG21 or DB03］ 10μ Taqポリメラーゼ5U/μ 1.2μ ガラス蒸留した水を添加して最終容量200μとす
る。10x Taq塩は500mM KCl、100mM Tris（pH8.3）、15m
M MgCl₂、及び1mg/mlゼラチンである。負対照（すなわ
ちDNAなし）を各PCR操作に含めるべきである。典型的に
は、Perkin−Elmer/Cetus Instruments DNA Thermal Cy
clerにおいて30〜35サイクルの増幅で十分である。サイ
クルは、96℃にて30秒間変性し、そして65℃にて30秒間
アニールしそして延長するように設計される。プライマ
ー対DB01/DB03が使用される場合、アニールは55℃にて3
0秒間であり、そして延長は72℃にて30秒間である。PCR
をチェックするため、及びドットブロットのために使用
されるべきDNAの量を決定するために分析ゲルを用いる
ことができる。

B.ドットブロット典型的には、５μの増幅されたDNAは、１回のドッ
トブロットのためには十分過ぎる約200ngを含有してい
る。しかしながら、14ドット以上が必要かも知れないこ
と、すなわちドットブロットを調製するために約70μ
の増幅反応混合物が使用されるかも知れないことを記憶
すべきである。５μの増幅反応混合物当り50μの0.
4N NaOH及び25mM EDTAがDNAに添加される。DNAの変性を
完了するのに５分間で十分である。Genatran膜をまず2x
SSPE中で湿し、そして次に150μの変性したDNAをド
ットブロット装置にかける。膜を2x SSPE中ですすぎ、
そして５分間にわたるUV光への暴露により、すなわちSt
rategeneから市販されているStratalinker 1800（商
標）UVボックス中55mJ/cm²の暴露によりDNAを膜に固定
する。

C.ハイブリダイゼーション膜を再び2x SSPE中で湿し、そして8x 12cmの膜（ドッ
トブロット装置のサイズ）当り約5mlのハイブリダイゼ
ーション溶液を加える。ハイブリダイゼーション溶液ml
当り約１〜1.5picomoleのHRPプローブを加え、そしてこ
のプローブを少なくとも１時間ハイブリダイズせしめ
る。ハイブリダイゼーション溶液は、SSPE（前記）、5x
Denhardt及び１％Triton x−100である。次に膜を0.1x
SSPE及び0.2％Triton x−100で10分間洗浄する。その
外は、ハイブリダイゼーション条件は実施例３に記載し
た通りであった。使用したプローブはDB27,DB29,DB30,D
B31,DB33,DB34,DB35,DB37,DB38,DB40,DB41,DB58,DB59,D
B62、及びDB63であった。

D.検出プローブの検出のための下記の段階を室温にて、穏や
かに撹拌しながら、膜を完全に覆うのに十分な溶液を用
いて、Bugawanら、1988、Bio/Technology,６:943−947
に記載されているようにして行う。膜を緩衝液Ｂと共に
５分間インキュベートし、緩衝液Ｃと共に５分間インキ
ュベートし、そして光を排除しながら緩衝液Ｂ及びTMB
（48mlの緩衝液Ｃ及び2.5mlの2mg/ml TMB）と共に10分
間インキュベートすることにより検出を行う。緩衝液Ｂ
は100mM NaCl、1M尿素、５％Triton x−100、及び１％
硫酸デキストランである。緩衝液Ｃは100mMクエン酸ナ
トリウム（pH5.0）である。TMBは3,3′,5,5′−テトメ
チルベンジジンである。約23μの３％H₂O₂を55.5mlの
緩衝液C/TMBに加え、得られる溶液を用いて、光排除条
件下で膜上に色を発生させる（色は１〜５分間以内に現
われる）。

少量の緩衝液Ｃを含有する水中での洗浄により発色を
停止させる。洗浄を30分間２回反復する。膜の写真を取
り、そして膜を緩衝液Ｃ中暗所に貯蔵する。

ここに記載する方法、並びにSSOプローブ及びプライ
マー及びこれらを含むキットは、個体のHLA DP遺伝子型
の正確な、比較的簡単な、そして経済的な決定のために
有用である。正確なDPタイプ分けは幾つかの医学的用途
において有用であることが証明されよう。例えば、提供
者と受理者その間の正確なHLA DPのマッチが同種移植片
の拒絶の回避及び宿主対移植片病の回避のための助けと
なろう。ある種のHLA DP遺伝子型が、例えば小児脂肪便
症、筋無力症、及びIDDMを含めてのある種の自己免疫疾
患と関連しているらしいので、HLA PP DNAタイプ分けは
完全な臨床症状の出現に先立つ患者の早期診断のために
有用である。

正確なHLA DPタイプ分けは法医学において有用であ
る。例えば、これは、ゲノム核酸を含有するサンプル、
例えば血液、毛、又は精液が容疑者個人に由来するか否
かの証拠を提供する。これはまた、個体の父系又は母系
を決定するのに有用である。後者は歴史的サンプルを分
析するのに特に有用である。

実施例11 TMACLにおけるプローブハイブリダイゼーションテトラメチルアンモニウムクロリド（TMACL）がハイ
ブリダイゼーション溶液中に存在する場合、プロブの区
別はプローブの長さに基き、プロブのC,C,A又はＴの組
成に基くものではない。ハイブリダイゼーション溶液中
にTMACLを用いることにより、単一の温度において多く
の異るプローブをハイブリダイズさせそして洗浄するこ
とができる。

この目的のための適当なハイブリダイゼーション溶液
は3M TMACL、0.5％SDS、10mM Tris−HCl（pH7.5）、及
び0.1mM EDTAを含有する。ハイブリダイゼーションは、
19−merプローブDB27,DB28,DB29,DB35,DB34,DB37,DB38
及びDB62のためには55℃にて30〜60分間;17−mer DB30,
DB31,DB33及びDB59のためには50℃にて；そしてDB40及
びDB41のためには60℃で行われる。洗浄溶液は3M TMAC
L、50mM Tris−HCl（pH8）及び2mM EDTAである。洗浄は
まず37℃にて20分間行われ、そして高ストレンジエンシ
ー温度（ハイブリダイゼーション温度）にて10分間行わ
れる。ハイブリダイゼーションの検出は実施例10に記載
したようにして行われる。

このために有用なプローブ、又は本発明の目的のため
の任意の他のハイブリダイゼーション方式のために有用
なプローブが下に示される（ｘはHRPである）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号３４７，５０６ (32)優先日平成１年５月４日(1989．5．4) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (72)発明者ブガワン，テオドリカエル. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94579，サンレアンドロ，ファリスストリート 15524 (56)参考文献特開昭62−214355（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12Q 1/68 ZNA C12N 15/09 G01N 33/53 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】個体から得られる核酸含有サンプルから該
個体のHLA DPβ遺伝子型を決定する方法であって、（ａ）前記サンプル中の核酸の標的領域を増幅せしめ、
ここで該標的領域はHLA DPβ遺伝子の第２エクソンの変
形体セグメントからの核酸配列であり、（ｂ）前記の増幅された核酸配列を配列特異的オリゴヌ
クレオチド（SSO）プローブのパネルと混合し、ここで
各プローブは、第２エクソンのコドン８〜10,33〜36,55
〜57,65〜69,76及び84〜87に位置する可変領域から成る
群から選択されたHLA DPβ遺伝子配列の可変領域を含む
ヌクレオチド配列を有する核酸から本質上成り且つDPB
1,DPB2.2,DPB4.2,DPB5,DPB6,DPB8,DPB9,DPB10,DPB11,DP
B13,DPB14,DPB15,DPB16,DPB17,DPB18,DPB19及びDPB20か
ら成る対立遺伝子の群から選択されたHLA DPβ対立遺伝
子に配列特異的にハイブリダイズすることができるもの
であり、前記混合は、上記の配列特異的オリゴヌクレオ
チドプローブが、前記HLA DPβ対立遺伝子のヌクレオチ
ド配列に対して正確に相補的である場合に限り前記増幅
された核酸配列に結合して安定なハイブリド２本鎖を形
成する条件下で行い；（ｃ）前記増幅された核酸配列と前記配列特異的オリゴ
ヌクレオチドプローブとの間に形成されたハイブリドを
検出し；そして（ｄ）前記ハイブリドの存在又は不存在から前記個体の
HLA DPβ遺伝子型を決定する；ことを含んで成る方法。
【請求項２】前記増幅が、前記サンプルをポリメラーゼ
連鎖反応の実施に適する条件下で行われる、請求項１に
記載の方法。
【請求項３】前記ポリメラーゼ連鎖反応を、プライマ
ー：の存在下で行う、請求項２に記載の方法。
【請求項４】前記配列特異的プローブの相補的配列の長
さが15〜30ヌクレオチドである、請求項１〜３のいずれ
か１項に記載の方法。
【請求項５】前記配列特異的プローブの相補的配列の長
さが17〜23ヌクレオチドである、請求項１〜４のいずれ
か１項に記載の方法。
【請求項６】前記配列特異的プローブの相補的配列の長
さが17〜19ヌクレオチドである、請求項１〜５のいずれ
か１項に記載の方法。
【請求項７】前記配列特異的プローブの相補的配列が、から成る群から選択される、請求項１〜６のいずれか１
項に記載の方法。
【請求項８】さらに、（ａ）個体の遺伝子型が自己免疫
疾患に関連するものであるか否かを決定すること；ある
いは（ｂ）請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法に
従って未知サンプルのHLA DPβ遺伝子型を決定し、そし
て個体及びサンプルのHLA DPβゲノタイプ及び場合によ
ってはHLA DPαゲノタイプを比較する、ことを含んで成
る、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】前記自己免疫疾患が小児性関節リウマチで
あり、そして個体のHLA DPβ遺伝子型がDPB2.1対立遺伝
子を含んで成り；あるいは前記自己免疫疾患がインシュ
リン依存性真性糖尿病（IDDM）であり、そして遺伝子型
がDPB2.1,DPBB1,DPB4.1及びDPB13から成る群から選択さ
れた対立遺伝子について陽性であり；あるいは前記自己
免疫疾患が小児脂肪便症（CD）であり、そして遺伝子型
がDPB1,DPB3及びDPB4.2から成る群から選択された対立
遺伝子について陽性である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】個体から得られる核酸含有サンプルから
該個体のHLA DPβ遺伝子型を決定するための複数の配列
特異的オリゴヌクレオチドプローブのパネルであって、
ここで各プローブは、第２エクソンのコドン８〜10,33
〜36,55〜57,65〜69,76及び84〜87に位置する可変領域
から成る群から選択されたHLA DPβ遺伝子配列の可変領
域を含むヌクレオチド配列を有する核酸から本質上成り
且つDPB1,DPB2.2,DPB4.2,DPB5,DPB6,DPB8,DPB9,DPB10,D
PB11,DPB13,DPB14,DPB15,DPB16,DPB17,DPB18,DPB19及び
DPB20から成る対立遺伝子の群から選択されたHLA DPβ
対立遺伝子に配列特異的にハイブリダイズすることがで
きるものであることを特徴とするパネル。
【請求項１１】HLA DPβ遺伝子配列の可変領域を含む核
酸配列が次の配列：から選択される、請求項10に記載の配列特異的オリゴヌ
クレオチドプローブのパネル。
【請求項１２】個体から得られた核酸含有サンプルから
該個体のHLA BPβ遺伝子を決定するための配列特異的オ
リゴヌクレオチドプローブであって、次のヌクレオチド
配列：から選択されたヌクレオチド配列を有するプローブ。
【請求項１３】個体から得られる核酸含有サンプルから
該個体のHLA DPβ遺伝子型を決定するために標的配列を
増幅するためのプライマーであって、次のヌクレオチド
配列：を有するプライマー。
【請求項１４】個体から得られる核酸含有サンプルから
該個体のHLA DPβ遺伝子型を決定するためのキットであ
って、（ａ）請求項10又は11に記載の配列特異的オリゴヌクレ
オチドプローブのパネル；及び（ｂ）キットの要素を用いて個体の遺伝子型を決定する
ための指示書、を含んで成るキット。
【請求項１５】HLA DPβ遺伝子の標的の増幅のために有
用なオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含んで成
る、請求項14に記載のキット。
【請求項１６】さらに、個体のHLA DPα遺伝子型を決定
するための配列特異的オリゴヌクレオチドプローブを含
んで成り、ここで各プローブは、HLA DPα遺伝子配列の
変形体領域を含むヌクレオチド配列を有する核酸から本
質上成り、そしてHLA DPα遺伝子の可変領域の変形体配
列に対して配列特異的にハイブリダイズすることができ
るものである、請求項14又は15に記載のキット。
【請求項１７】前記ヌクレオチド配列の長さが15〜30ヌ
クレオチドである、請求項16に記載のキット。
【請求項１８】前記ヌクレオチド配列の長さが17〜23ヌ
クレオチドである、請求項16又は17に記載のキット。
【請求項１９】前記ヌクレオチド配列の長さが17〜19で
ある、請求項16〜18のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２０】前記核酸の配列が次の配列：から選択される、請求項16〜19のいずれか１項に記載の
キット。
【請求項２１】HLA DPα遺伝子の標的領域の増幅のため
のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含んで成る、
請求項16〜20のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２２】前記プライマーが次のヌクレオチド配
列：を有する、請求項21に記載のキット。