JPH05276954A - 新規なｄｎａ塩基配列およびその用途 - Google Patents
新規なｄｎａ塩基配列およびその用途Info
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- JPH05276954A JPH05276954A JP3207060A JP20706091A JPH05276954A JP H05276954 A JPH05276954 A JP H05276954A JP 3207060 A JP3207060 A JP 3207060A JP 20706091 A JP20706091 A JP 20706091A JP H05276954 A JPH05276954 A JP H05276954A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 特定のアミノ酸配列をコードするＨＬＡ−Ｄ
Ｒｗ14ｃの遺伝子ＤＮＡ、遺伝子ＤＮＡの増幅方法、該
遺伝子ＤＮＡに相補なＤＮＡ配列を含むＤＲタイピング
用ＤＮＡプローブ、該ＤＮＡプローブを含むヒト白血球
抗原のタイピング試薬およびタイピング試薬のキット。 【効果】 ＤＲＢ１−14ｃ特異的なオリゴヌクレオチド
プローブであるＦ14２とＦ14４を他のオリゴヌクレオチ
ドプローブとをともに使用することによってＤＲｗ14関
連の遺伝子をタイピングすることが可能となった。ま
た、本発明のＤＲｗ14ｃのＤＮＡは本発明により初めて
得られ、かつその塩基配列が決定がされたものであり、
このＤＮＡにより更に新たな診断手法の開発あるいはそ
の他の医学上の研究の進展も期待でき、産業上きわめて
有用である。
Ｒｗ14ｃの遺伝子ＤＮＡ、遺伝子ＤＮＡの増幅方法、該
遺伝子ＤＮＡに相補なＤＮＡ配列を含むＤＲタイピング
用ＤＮＡプローブ、該ＤＮＡプローブを含むヒト白血球
抗原のタイピング試薬およびタイピング試薬のキット。 【効果】 ＤＲＢ１−14ｃ特異的なオリゴヌクレオチド
プローブであるＦ14２とＦ14４を他のオリゴヌクレオチ
ドプローブとをともに使用することによってＤＲｗ14関
連の遺伝子をタイピングすることが可能となった。ま
た、本発明のＤＲｗ14ｃのＤＮＡは本発明により初めて
得られ、かつその塩基配列が決定がされたものであり、
このＤＮＡにより更に新たな診断手法の開発あるいはそ
の他の医学上の研究の進展も期待でき、産業上きわめて
有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はヒト白血球抗原の内ＤＲ
抗原のＤＮＡ塩基配列およびそのＤＮＡタイピングを目
的としたオリゴヌクレオチドＤＮＡプローブおよびＤＮ
Ａプローブを用いるヒト白血球抗原のＤＲ抗原のタイピ
ングの方法さらにタイピング用の試薬に関する。
抗原のＤＮＡ塩基配列およびそのＤＮＡタイピングを目
的としたオリゴヌクレオチドＤＮＡプローブおよびＤＮ
Ａプローブを用いるヒト白血球抗原のＤＲ抗原のタイピ
ングの方法さらにタイピング用の試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒト白血球抗原（ＨＬＡと省略する）の
タイピング（型分け）は、臓器移植時の適合性の判定の
みならず、疾病に対する個人の感受性の判定などにおい
てその重要性が注目されている。わが国で頻度が高い腎
移植の場合、血縁者がドナーとなる生体腎移植と、非血
縁者からの死体腎移植とでは適合度が異なり、サイクロ
スポリンＡなどの免疫抑制剤の使用によりその差は小さ
くなるものの、生体腎移植の方が良好な成績を納めてい
る。このことは、従来の血清学的タイピングでは同定で
きないサブタイプの存在か、あるいは連鎖する他の遺伝
子座が移植臓器の生着に影響している可能性を示唆する
ものである。（代謝ハイライト、代謝25巻、臨時増刊
号、山村雄一・吉利和監修、373〜380頁、東京、中山書
店発行）。
タイピング（型分け）は、臓器移植時の適合性の判定の
みならず、疾病に対する個人の感受性の判定などにおい
てその重要性が注目されている。わが国で頻度が高い腎
移植の場合、血縁者がドナーとなる生体腎移植と、非血
縁者からの死体腎移植とでは適合度が異なり、サイクロ
スポリンＡなどの免疫抑制剤の使用によりその差は小さ
くなるものの、生体腎移植の方が良好な成績を納めてい
る。このことは、従来の血清学的タイピングでは同定で
きないサブタイプの存在か、あるいは連鎖する他の遺伝
子座が移植臓器の生着に影響している可能性を示唆する
ものである。（代謝ハイライト、代謝25巻、臨時増刊
号、山村雄一・吉利和監修、373〜380頁、東京、中山書
店発行）。
【０００３】血清学的なタイピングは、特異性の明らか
な抗血清を補体とともに検索対象のリンパ球に加えて、
その細胞が傷害されるか否かを調べることによって行な
われている。この方法は簡便ではあるもののＨＬＡ抗原
分子の抗原決定基の微妙な違いを識別できないため、サ
ブタイプの存在を見落とす場合がある。しかしながら、
非血縁者からの死体腎移植は多くなる一方で、血清学的
タイピングのみでは組織適合度を詳細に検討できないの
が実状である。
な抗血清を補体とともに検索対象のリンパ球に加えて、
その細胞が傷害されるか否かを調べることによって行な
われている。この方法は簡便ではあるもののＨＬＡ抗原
分子の抗原決定基の微妙な違いを識別できないため、サ
ブタイプの存在を見落とす場合がある。しかしながら、
非血縁者からの死体腎移植は多くなる一方で、血清学的
タイピングのみでは組織適合度を詳細に検討できないの
が実状である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】ＨＬＡ抗原はクラスＩ
抗原とクラスII抗原に大別される。腎移植を例にあげる
とクラスII抗原の一致が生着に重要であることが示唆さ
れている。クラスII抗原はＤＲ、ＤＱ、ＤＰの３種の抗
原から構成されており、この中でも細胞膜表面上に最も
多く発現されているＤＲ抗原の適合性が重要とされてい
る〔雨宮浩、佐田正晴：相沢班腎移植と適合性の集計ｉ
ｎ昭和５８年度科学研究費補助金〔総合研究（Ａ）〕研
究成果報告書：ＨＬＡ−Ｄ領域の構成と機能67頁、1984
年〕。
抗原とクラスII抗原に大別される。腎移植を例にあげる
とクラスII抗原の一致が生着に重要であることが示唆さ
れている。クラスII抗原はＤＲ、ＤＱ、ＤＰの３種の抗
原から構成されており、この中でも細胞膜表面上に最も
多く発現されているＤＲ抗原の適合性が重要とされてい
る〔雨宮浩、佐田正晴：相沢班腎移植と適合性の集計ｉ
ｎ昭和５８年度科学研究費補助金〔総合研究（Ａ）〕研
究成果報告書：ＨＬＡ−Ｄ領域の構成と機能67頁、1984
年〕。
【０００５】既知のＨＬＡ−ＤＲハプロタイプの中でＤ
Ｒｗ14は特異的な抗血清を入手するのが困難であるた
め、血清学的には完全に分類するのが難しい型の一つで
ある。塩基配列分析では細胞学的なＤタイピングと同様
にＤＲｗ14にはＤＲＢ１* 1401（ＤＲｗ14−Ｄｗ９）と
ＤＲＢ１* 1402（ＤＲｗ14−Ｄｗ16）の２つのＤＲＢ１
対立遺伝子があることを示している（Bodmer, W.F., Al
bert, E., Bodmer, J.G., Dausset, J., Kissmeyer-Nie
lsen, F., Mayr, W., Payne, R., Rood, J.J. van, Trn
ka, Z., and Walford, R.L. Histocompatibility Testi
ng 1984 4〜8頁 Springer-Verlag Berlin 1984年、Tier
cy, J-M., Gorski, J., Betuel, H., Freidel, A.C., G
ebuhrer, L., Jeannet, H., and Mach, B.Hum Immunol
24巻 1〜14頁 1989年、Gorski, J. Hum Immunol 24巻
145〜149頁 1989年、Kao, H.T., Gregersen P.K., Tan
g, J.C., Takahashi, T., Wang, C.Y., and Silver, J.
J Immunol 142巻 1743頁 1989年)。
Ｒｗ14は特異的な抗血清を入手するのが困難であるた
め、血清学的には完全に分類するのが難しい型の一つで
ある。塩基配列分析では細胞学的なＤタイピングと同様
にＤＲｗ14にはＤＲＢ１* 1401（ＤＲｗ14−Ｄｗ９）と
ＤＲＢ１* 1402（ＤＲｗ14−Ｄｗ16）の２つのＤＲＢ１
対立遺伝子があることを示している（Bodmer, W.F., Al
bert, E., Bodmer, J.G., Dausset, J., Kissmeyer-Nie
lsen, F., Mayr, W., Payne, R., Rood, J.J. van, Trn
ka, Z., and Walford, R.L. Histocompatibility Testi
ng 1984 4〜8頁 Springer-Verlag Berlin 1984年、Tier
cy, J-M., Gorski, J., Betuel, H., Freidel, A.C., G
ebuhrer, L., Jeannet, H., and Mach, B.Hum Immunol
24巻 1〜14頁 1989年、Gorski, J. Hum Immunol 24巻
145〜149頁 1989年、Kao, H.T., Gregersen P.K., Tan
g, J.C., Takahashi, T., Wang, C.Y., and Silver, J.
J Immunol 142巻 1743頁 1989年)。
【０００６】血清学的には同型ではあるがＤＲ抗原のサ
ブタイプが異なるドナーとレシーピエントの間での臓器
移植においては拒絶反応を引き起こす可能性があるとの
問題がある。このように、臓器移植など臨床的な観点か
らは従来の血清学的タイピングでは不十分と言わざるを
得ない。本発明の課題は、このような血清学的タイピン
グの欠点を解消することにある。すなわち本発明は、血
清学的タイピングでは識別困難なＨＬＡ−ＤＲ抗原分子
の型を判別するための試薬を提供することをその課題と
するものであり、さらに詳しくは、特にＨＬＡ−ＤＲ抗
原分子のサブタイプの識別を精密に実施することを可能
とするオリゴヌクレオチドプローブ、および該オリゴヌ
クレオチドプローブを含む検査試薬を提供することを課
題とするものである。
ブタイプが異なるドナーとレシーピエントの間での臓器
移植においては拒絶反応を引き起こす可能性があるとの
問題がある。このように、臓器移植など臨床的な観点か
らは従来の血清学的タイピングでは不十分と言わざるを
得ない。本発明の課題は、このような血清学的タイピン
グの欠点を解消することにある。すなわち本発明は、血
清学的タイピングでは識別困難なＨＬＡ−ＤＲ抗原分子
の型を判別するための試薬を提供することをその課題と
するものであり、さらに詳しくは、特にＨＬＡ−ＤＲ抗
原分子のサブタイプの識別を精密に実施することを可能
とするオリゴヌクレオチドプローブ、および該オリゴヌ
クレオチドプローブを含む検査試薬を提供することを課
題とするものである。
【０００７】また、本発明は、このような新規なＨＬＡ
−ＤＲ抗原分子のタイピングの方法をも提供することも
その課題とするものである。
−ＤＲ抗原分子のタイピングの方法をも提供することも
その課題とするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らはＨＬＡ−Ｄ
Ｒ抗原、中でもサブタイプをＤＮＡレベルでタイピング
することができればさらに詳細な型分けが可能であり、
血清学的なタイピングの欠点を解消できると考えるに至
った。具体的には、ＤＲ抗原の遺伝的多型に富む領域に
存在する個々の抗原に特異的な塩基配列に交雑し得るオ
リゴヌクレオチドプローブを作製し、それに対して検体
の遺伝子が交雑するか否かでＤＲ抗原のタイプを決定す
る手法である。
Ｒ抗原、中でもサブタイプをＤＮＡレベルでタイピング
することができればさらに詳細な型分けが可能であり、
血清学的なタイピングの欠点を解消できると考えるに至
った。具体的には、ＤＲ抗原の遺伝的多型に富む領域に
存在する個々の抗原に特異的な塩基配列に交雑し得るオ
リゴヌクレオチドプローブを作製し、それに対して検体
の遺伝子が交雑するか否かでＤＲ抗原のタイプを決定す
る手法である。
【０００９】そこで、このような考え方に従って、ＤＲ
ｗ14のＤＮＡ塩基配列の決定を行うべく種々の研究を行
った。その結果、ＤＲｗ14は既知の２つのサブタイプに
加え、更に新規な１つのサブタイプに分かれることが明
らかとなり、本発明者らはこのサブタイプをＤＲｗ14ｃ
と命名した〔なお、ＤＲｗ14ｃはＤＲ遺伝子の命名法(B
odmer JG, Marsh SGE, Parham P. et al., "Nomenclatu
re for factors of the HLA system, 1989" Tissue Ant
igens 35巻、１〜８頁、1990）によるとＤＲＢ１−14ｃ
と称せられるので、以下、ＤＲＢ１−14ｃはＤＲＢ１−
14ｃと言う〕。そしてこれらの遺伝子ＤＮＡを調製する
とともにその塩基配列を決定し、さらに決定された塩基
配列を元にしてこのＤＲ抗原遺伝子に特異的なオリゴヌ
クレオチドプローブを作製した。これらのプローブでＤ
ＮＡタイピングを行ったところ他のＤＲ抗原遺伝子とＤ
ＲＢ１−14ｃの遺伝子ＤＮＡを容易に判別することがで
きることを見い出し、本発明を完成するに至った。
ｗ14のＤＮＡ塩基配列の決定を行うべく種々の研究を行
った。その結果、ＤＲｗ14は既知の２つのサブタイプに
加え、更に新規な１つのサブタイプに分かれることが明
らかとなり、本発明者らはこのサブタイプをＤＲｗ14ｃ
と命名した〔なお、ＤＲｗ14ｃはＤＲ遺伝子の命名法(B
odmer JG, Marsh SGE, Parham P. et al., "Nomenclatu
re for factors of the HLA system, 1989" Tissue Ant
igens 35巻、１〜８頁、1990）によるとＤＲＢ１−14ｃ
と称せられるので、以下、ＤＲＢ１−14ｃはＤＲＢ１−
14ｃと言う〕。そしてこれらの遺伝子ＤＮＡを調製する
とともにその塩基配列を決定し、さらに決定された塩基
配列を元にしてこのＤＲ抗原遺伝子に特異的なオリゴヌ
クレオチドプローブを作製した。これらのプローブでＤ
ＮＡタイピングを行ったところ他のＤＲ抗原遺伝子とＤ
ＲＢ１−14ｃの遺伝子ＤＮＡを容易に判別することがで
きることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】すなわち本発明は、以下の式 Ｉ で表さ
れるアミノ酸配列をコードするＤＲＢ１−14ｃの遺伝子
ＤＮＡにある。 式 Ｉ ＦＬＥＹＳＴＳＥＣＱＦＦＮＧＴＥＲＶＲＦＬＤ ＲＹＦＨＮＱＥＥＦＶＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲＡＶ ＴＥＬＧＲＰＤＡＥＹＷＮＳＱＫＤＬＬＥＲＲＲ ＡＥＶＤＴＹＣＲＨＮＹＧＶＶ （式中、Ａはアラニン、Ｒはアルギニン、Ｎはアスパラ
ギン、Ｄはアスパラギン酸、Ｃはシスティン、Ｑはグル
タミン、Ｅはグルタミン酸、Ｇはグリシン、Ｈはヒスチ
ジン、Ｌはロイシン、Ｋはリジン、Ｆはフェニルアラニ
ン、Ｐはプロリン、Ｓはセリン、Ｔはトレオニン、Ｙは
チロシン、Ｖはバリンを示す） 以下の式［II］で表わされることを特徴とするＤＲＢ１
−14ｃのＤＮＡにある。 ５’− ＴＴＴＣＴＴＧＧＡＧＴＡＣＴＣＴＡＣ ＧＴＣＴＧＡＧＴＧＴＣＡＡＴＴＣＴＴＣＡＡＴ ＧＧＧＡＣＧＧＡＧＣＧＧＧＴＧＣＧＧＴＴＣＣ ＴＧＧＡＣＡＧＡＴＡＣＴＴＣＣＡＴＡＡＣＣＡ ＧＧＡＧＧＡＧＴＴＣＧＴＧＣＧＣＴＴＣＧＡＣ ＡＧＣＧＡＣＧＴＧＧＧＧＧＡＧＴＡＣＣＧＧＧ ＣＧＧＴＧＡＣＧＧＡＧＣＴＧＧＧＧＣＧＧＣＣ ＴＧＡＴＧＣＴＧＡＧＴＡＣＴＧＧＡＡＣＡＧＣ ＣＡＧＡＡＧＧＡＣＣＴＣＣＴＧＧＡＧＣＧＧＡ ＧＧＣＧＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＧＡＣＡＣＣＴＡ ＴＴＧＣＡＧＡＣＡＣＡＡＣＴＡＣＧＧＧＧＴＴ ＧＴＧ−３’ （式中、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、
Ｔはチミンを示す） また本発明は、前記式［Ｉ］又は式［II］で表わされる
ＤＲＢ１−14ｃのＤＮＡ塩基配列であることを特徴とす
るヒト白血球抗原のＤＲタイピング用のＤＮＡプローブ
にある。
れるアミノ酸配列をコードするＤＲＢ１−14ｃの遺伝子
ＤＮＡにある。 式 Ｉ ＦＬＥＹＳＴＳＥＣＱＦＦＮＧＴＥＲＶＲＦＬＤ ＲＹＦＨＮＱＥＥＦＶＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲＡＶ ＴＥＬＧＲＰＤＡＥＹＷＮＳＱＫＤＬＬＥＲＲＲ ＡＥＶＤＴＹＣＲＨＮＹＧＶＶ （式中、Ａはアラニン、Ｒはアルギニン、Ｎはアスパラ
ギン、Ｄはアスパラギン酸、Ｃはシスティン、Ｑはグル
タミン、Ｅはグルタミン酸、Ｇはグリシン、Ｈはヒスチ
ジン、Ｌはロイシン、Ｋはリジン、Ｆはフェニルアラニ
ン、Ｐはプロリン、Ｓはセリン、Ｔはトレオニン、Ｙは
チロシン、Ｖはバリンを示す） 以下の式［II］で表わされることを特徴とするＤＲＢ１
−14ｃのＤＮＡにある。 ５’− ＴＴＴＣＴＴＧＧＡＧＴＡＣＴＣＴＡＣ ＧＴＣＴＧＡＧＴＧＴＣＡＡＴＴＣＴＴＣＡＡＴ ＧＧＧＡＣＧＧＡＧＣＧＧＧＴＧＣＧＧＴＴＣＣ ＴＧＧＡＣＡＧＡＴＡＣＴＴＣＣＡＴＡＡＣＣＡ ＧＧＡＧＧＡＧＴＴＣＧＴＧＣＧＣＴＴＣＧＡＣ ＡＧＣＧＡＣＧＴＧＧＧＧＧＡＧＴＡＣＣＧＧＧ ＣＧＧＴＧＡＣＧＧＡＧＣＴＧＧＧＧＣＧＧＣＣ ＴＧＡＴＧＣＴＧＡＧＴＡＣＴＧＧＡＡＣＡＧＣ ＣＡＧＡＡＧＧＡＣＣＴＣＣＴＧＧＡＧＣＧＧＡ ＧＧＣＧＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＧＡＣＡＣＣＴＡ ＴＴＧＣＡＧＡＣＡＣＡＡＣＴＡＣＧＧＧＧＴＴ ＧＴＧ−３’ （式中、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、
Ｔはチミンを示す） また本発明は、前記式［Ｉ］又は式［II］で表わされる
ＤＲＢ１−14ｃのＤＮＡ塩基配列であることを特徴とす
るヒト白血球抗原のＤＲタイピング用のＤＮＡプローブ
にある。
【００１１】また本発明は、式［Ｉ］又は式［II］で表
わされるＤＲＢ１−14ｃのＤＮＡ塩基配列に相補な配列
であることを特徴とするヒト白血球抗原のＤＲタイピン
グ用のＤＮＡプローブにある。また本発明は、式［Ｉ］
又は式［II］で表わされるＤＲＢ１−14ｃのＤＮＡ配列
の内、少なくとも連続した10塩基の塩基配列を含むオリ
ゴヌクレオチドであることを特徴とするヒト白血球抗原
のＤＲタイピング用のＤＮＡプローブにある。
わされるＤＲＢ１−14ｃのＤＮＡ塩基配列に相補な配列
であることを特徴とするヒト白血球抗原のＤＲタイピン
グ用のＤＮＡプローブにある。また本発明は、式［Ｉ］
又は式［II］で表わされるＤＲＢ１−14ｃのＤＮＡ配列
の内、少なくとも連続した10塩基の塩基配列を含むオリ
ゴヌクレオチドであることを特徴とするヒト白血球抗原
のＤＲタイピング用のＤＮＡプローブにある。
【００１２】また本発明は、式［Ｉ］又は式［II］で表
わされるＤＲＢ１−14ｃのＤＮＡ配列に相補なＤＮＡ配
列の内、少なくとも連続した５塩基の塩基配列を含むオ
リゴヌクレオチドであることを特徴とするヒト白血球抗
原のＤＲタイピング用のＤＮＡプローブにある。また本
発明は、前記オリゴヌクレオチドがＤＲＢ１−14ｃ以外
の染色体遺伝子、あるいは相補ＤＮＡのＤＮＡ配列に交
雑しないことを特徴とする前記のＤＮＡプローブにあ
る。
わされるＤＲＢ１−14ｃのＤＮＡ配列に相補なＤＮＡ配
列の内、少なくとも連続した５塩基の塩基配列を含むオ
リゴヌクレオチドであることを特徴とするヒト白血球抗
原のＤＲタイピング用のＤＮＡプローブにある。また本
発明は、前記オリゴヌクレオチドがＤＲＢ１−14ｃ以外
の染色体遺伝子、あるいは相補ＤＮＡのＤＮＡ配列に交
雑しないことを特徴とする前記のＤＮＡプローブにあ
る。
【００１３】また本発明は、前記オリゴヌクレオチドの
ＤＮＡ塩基配列が５’−ＡＧＴＧＴＣＡＡＴＴＣＴＴＣ
ＡＡＴＧＧ−３’である前記のＤＮＡプローブにある。
また本発明は、前記オリゴヌクレオチドのＤＮＡ塩基配
列が５’−ＡＧＴＡＣＴＣＡＧＣＡＴＣＡＧＧＣＣＧ−
３’である前記のＤＮＡプローブにある。なお、上記塩
基配列はＤＲＢ１−14ｃの塩基配列と相補の塩基配列で
ある。
ＤＮＡ塩基配列が５’−ＡＧＴＧＴＣＡＡＴＴＣＴＴＣ
ＡＡＴＧＧ−３’である前記のＤＮＡプローブにある。
また本発明は、前記オリゴヌクレオチドのＤＮＡ塩基配
列が５’−ＡＧＴＡＣＴＣＡＧＣＡＴＣＡＧＧＣＣＧ−
３’である前記のＤＮＡプローブにある。なお、上記塩
基配列はＤＲＢ１−14ｃの塩基配列と相補の塩基配列で
ある。
【００１４】また本発明は、前記ＤＮＡプローブが放射
性同位体あるいは／および蛍光色素、発色色素、発光色
素で標識されているあるいは該物質により標識され得る
ように修飾されていることを特徴とする前記のＤＮＡプ
ローブにある。また本発明は、前記オリゴヌクレオチド
の少なくとも連続した10塩基配列を含むオリゴヌクレオ
チドが膜などに固定化（結合）されていることを特徴と
する前記のＤＮＡプローブにある。
性同位体あるいは／および蛍光色素、発色色素、発光色
素で標識されているあるいは該物質により標識され得る
ように修飾されていることを特徴とする前記のＤＮＡプ
ローブにある。また本発明は、前記オリゴヌクレオチド
の少なくとも連続した10塩基配列を含むオリゴヌクレオ
チドが膜などに固定化（結合）されていることを特徴と
する前記のＤＮＡプローブにある。
【００１５】また本発明は、前記式［Ｉ］で表わされる
アミノ酸配列をコードする塩基配列又は式［II］で表わ
されるＤＲＢ１−14ｃの塩基配列の全部あるいは部分領
域を下記の方法で増幅するＤＲＢ１−14ｃの塩基配列の
増幅方法である。 (1) Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ存在下にオリゴヌクレ
オチドプライマーと加熱処理によってデネイチャーした
ＤＲＢ１−14ｃのＤＲ型を有するヒトの末梢血から採取
した染色体ＤＮＡをアニールし、(2) アニールしたＤＮ
Ａを加熱処理してプライマーイクステンションさせ、
(3) (1)および(2)のステップを繰り返す。
アミノ酸配列をコードする塩基配列又は式［II］で表わ
されるＤＲＢ１−14ｃの塩基配列の全部あるいは部分領
域を下記の方法で増幅するＤＲＢ１−14ｃの塩基配列の
増幅方法である。 (1) Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ存在下にオリゴヌクレ
オチドプライマーと加熱処理によってデネイチャーした
ＤＲＢ１−14ｃのＤＲ型を有するヒトの末梢血から採取
した染色体ＤＮＡをアニールし、(2) アニールしたＤＮ
Ａを加熱処理してプライマーイクステンションさせ、
(3) (1)および(2)のステップを繰り返す。
【００１６】また本発明は、前記オリゴヌクレオチドプ
ライマーが放射性同位体あるいは／および蛍光色素、発
色色素、発光色素などで標識されているあるいは該物質
により標識され得るように修飾されているものであるこ
とを特徴とする前記のＤＲＢ１−14ｃの塩基配列の増幅
方法である。また本発明は、前記増幅反応を放射性同位
体あるいは／および色素などで標識されたあるいは該物
質により標識され得るように修飾された核酸を用いて行
い、得られる標識されたＤＮＡを交雑させることを特徴
とする前記のＨＬＡ−ＤＲｗ14ｃの塩基配列の増幅方法
である。
ライマーが放射性同位体あるいは／および蛍光色素、発
色色素、発光色素などで標識されているあるいは該物質
により標識され得るように修飾されているものであるこ
とを特徴とする前記のＤＲＢ１−14ｃの塩基配列の増幅
方法である。また本発明は、前記増幅反応を放射性同位
体あるいは／および色素などで標識されたあるいは該物
質により標識され得るように修飾された核酸を用いて行
い、得られる標識されたＤＮＡを交雑させることを特徴
とする前記のＨＬＡ−ＤＲｗ14ｃの塩基配列の増幅方法
である。
【００１７】また本発明は、前記オリゴヌクレオチドの
ＤＮＡ配列が５’−ＡＧＴＧＴＣＡＴＴＴＣＴＴＣＡＡ
（およびＣ）ＧＧＧＡＣＧＧＡ−３’、５’−ＣＧＣＴ
ＧＣＡＣＴＧＴＧＡＡＧＣＴＣＴＣ−３’および５’−
ＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＣＧＴＧＴＣＣＣＣＡＣＡＧＣＡ
ＣＧ−３’から選ばれたものである前記プライマーにあ
る。
ＤＮＡ配列が５’−ＡＧＴＧＴＣＡＴＴＴＣＴＴＣＡＡ
（およびＣ）ＧＧＧＡＣＧＧＡ−３’、５’−ＣＧＣＴ
ＧＣＡＣＴＧＴＧＡＡＧＣＴＣＴＣ−３’および５’−
ＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＣＧＴＧＴＣＣＣＣＡＣＡＧＣＡ
ＣＧ−３’から選ばれたものである前記プライマーにあ
る。
【００１８】また本発明は、前記ＤＮＡプローブの内少
なくとも１種類のＤＮＡプローブを含むことを特徴とす
るヒト白血球抗原のＤＲタイピング用試薬である。また
本発明は、前記ＤＮＡプローブに加えて、ヒト白血球抗
原の内、他の型を識別し得るＤＮＡプローブをも含み構
成されることを特徴とするヒト白血球抗原のタイピング
試薬にある。
なくとも１種類のＤＮＡプローブを含むことを特徴とす
るヒト白血球抗原のＤＲタイピング用試薬である。また
本発明は、前記ＤＮＡプローブに加えて、ヒト白血球抗
原の内、他の型を識別し得るＤＮＡプローブをも含み構
成されることを特徴とするヒト白血球抗原のタイピング
試薬にある。
【００１９】また本発明は、前記ＤＮＡプローブに加え
て、ヒト白血球抗原の内、他の型を識別し得るＤＮＡプ
ローブと、交雑反応、続いて行なう洗浄用の試薬をも含
むことを特徴とするヒト白血球抗原のタイピング試薬の
キットにある。また本発明は、前記ＤＮＡプローブに加
えて、ヒト白血球抗原の内、他の型を識別し得るＤＮＡ
プローブ、交雑反応、続いて行なう洗浄用の試薬と、こ
れらの操作に必要な器具、機器を含むことを特徴とする
ヒト白血球抗原のタイピング用のキットにある。
て、ヒト白血球抗原の内、他の型を識別し得るＤＮＡプ
ローブと、交雑反応、続いて行なう洗浄用の試薬をも含
むことを特徴とするヒト白血球抗原のタイピング試薬の
キットにある。また本発明は、前記ＤＮＡプローブに加
えて、ヒト白血球抗原の内、他の型を識別し得るＤＮＡ
プローブ、交雑反応、続いて行なう洗浄用の試薬と、こ
れらの操作に必要な器具、機器を含むことを特徴とする
ヒト白血球抗原のタイピング用のキットにある。
【００２０】また本発明は、前記ＤＮＡプローブおよび
前記プライマーを含むことを特徴とするヒト白血球抗原
のＤＲタイピング試薬にある。また本発明は、前記ＤＮ
Ａプローブおよびプライマーに加えて、ヒト白血球抗原
の内、他の型を識別し得るＤＮＡプローブをも含み構成
されることを特徴とするヒト白血球抗原のタイピング試
薬に関するものである。
前記プライマーを含むことを特徴とするヒト白血球抗原
のＤＲタイピング試薬にある。また本発明は、前記ＤＮ
Ａプローブおよびプライマーに加えて、ヒト白血球抗原
の内、他の型を識別し得るＤＮＡプローブをも含み構成
されることを特徴とするヒト白血球抗原のタイピング試
薬に関するものである。
【００２１】また本発明は、前記ＤＮＡプローブおよび
前記プライマーに加えて、ヒト白血球抗原の内、他の型
を識別し得るＤＮＡプローブと、増幅反応、交雑反応、
続いて行なう洗浄用の試薬をも含むことを特徴とするヒ
ト白血球抗原のタイピング試薬のキットにある。また本
発明は、前記ＤＮＡプローブおよび前記プライマーに加
えて、ヒト白血球抗原の内、他の型を識別し得るＤＮＡ
プローブ、増幅反応、交雑反応、続いて行なう洗浄用の
試薬と、これらの操作に必要な器具、機器を含むことを
特徴とするヒト白血球抗原のタイピング用のキットにあ
る。
前記プライマーに加えて、ヒト白血球抗原の内、他の型
を識別し得るＤＮＡプローブと、増幅反応、交雑反応、
続いて行なう洗浄用の試薬をも含むことを特徴とするヒ
ト白血球抗原のタイピング試薬のキットにある。また本
発明は、前記ＤＮＡプローブおよび前記プライマーに加
えて、ヒト白血球抗原の内、他の型を識別し得るＤＮＡ
プローブ、増幅反応、交雑反応、続いて行なう洗浄用の
試薬と、これらの操作に必要な器具、機器を含むことを
特徴とするヒト白血球抗原のタイピング用のキットにあ
る。
【００２２】また本発明は、前記ＤＮＡプローブおよび
前記プライマーに加えて、ヒト白血球抗原の内、他の型
を識別し得るＤＮＡプローブおよび他の型のＤＮＡを増
幅させるための少なくとも１種類の異なるプライマーを
も含み構成されることを特徴とするヒト白血球抗原のタ
イピング試薬にある。また本発明は、前記ＤＮＡプロー
ブおよび前記プライマーおよび他の型のＤＮＡを増幅さ
せるための少なくとも１種類の異なるプライマーに加え
て、ヒト白血球抗原の内、他の型を識別し得るＤＮＡプ
ローブと、増幅反応、交雑反応、続いて行なう洗浄用の
試薬をも含むことを特徴とするヒト白血球抗原のタイピ
ング試薬のキットにある。
前記プライマーに加えて、ヒト白血球抗原の内、他の型
を識別し得るＤＮＡプローブおよび他の型のＤＮＡを増
幅させるための少なくとも１種類の異なるプライマーを
も含み構成されることを特徴とするヒト白血球抗原のタ
イピング試薬にある。また本発明は、前記ＤＮＡプロー
ブおよび前記プライマーおよび他の型のＤＮＡを増幅さ
せるための少なくとも１種類の異なるプライマーに加え
て、ヒト白血球抗原の内、他の型を識別し得るＤＮＡプ
ローブと、増幅反応、交雑反応、続いて行なう洗浄用の
試薬をも含むことを特徴とするヒト白血球抗原のタイピ
ング試薬のキットにある。
【００２３】また本発明は、前記ＤＮＡプローブおよび
前記プライマーに加えて、ヒト白血球抗原の内、他の型
を識別し得るＤＮＡプローブ、および他の型のＤＮＡを
増幅させるための少なくとも１種類の異なるプライマ
ー、増幅反応、交雑反応、続いて行なう洗浄用の試薬
と、これらの操作に必要な器具、機器を含むことを特徴
とするヒト白血球抗原のタイピング用のキットにある。
前記プライマーに加えて、ヒト白血球抗原の内、他の型
を識別し得るＤＮＡプローブ、および他の型のＤＮＡを
増幅させるための少なくとも１種類の異なるプライマ
ー、増幅反応、交雑反応、続いて行なう洗浄用の試薬
と、これらの操作に必要な器具、機器を含むことを特徴
とするヒト白血球抗原のタイピング用のキットにある。
【００２４】また本発明は、前記ＤＮＡプローブを用い
ることを特徴とするヒト白血球抗原のタイピング方法に
ある。次に本発明に係る新規なＤＮＡ塩基配列およびそ
の用途およびタイピング方法について具体的に説明す
る。まず本発明に係る新規なＤＮＡ塩基配列、すなわち
ＤＲＢ１−14ｃの塩基配列について説明する。本発明に
係るＤＲＢ１−14ｃの塩基配列及び対応するアミノ酸配
列を図１に示す。
ることを特徴とするヒト白血球抗原のタイピング方法に
ある。次に本発明に係る新規なＤＮＡ塩基配列およびそ
の用途およびタイピング方法について具体的に説明す
る。まず本発明に係る新規なＤＮＡ塩基配列、すなわち
ＤＲＢ１−14ｃの塩基配列について説明する。本発明に
係るＤＲＢ１−14ｃの塩基配列及び対応するアミノ酸配
列を図１に示す。
【００２５】なお、図１において、オリゴヌクレオチド
プローブの位置は塩基配列下部に記した矢印部分に相当
する。そして、オリゴヌクレオチドプローブの位置を示
す矢印の向きは５'→３'に相当し、右向きの矢印は記載
の塩基配列であり、左向きの矢印は記載の塩基配列と相
補の塩基配列となる。本発明に係るＤＲＢ１−14ｃの塩
基配列は以下のようにして得た。
プローブの位置は塩基配列下部に記した矢印部分に相当
する。そして、オリゴヌクレオチドプローブの位置を示
す矢印の向きは５'→３'に相当し、右向きの矢印は記載
の塩基配列であり、左向きの矢印は記載の塩基配列と相
補の塩基配列となる。本発明に係るＤＲＢ１−14ｃの塩
基配列は以下のようにして得た。
【００２６】先ず、日本人のＨＬＡ−ＤＲのタイプを第
10回国際組織適合抗原ワークショップの血清を用いて調
べ、３種の抗ＤＲｗ14血清（ワークショップナンバー90
60、9061、1111）の内、少なくとも２種、および抗ＤＲ
１／２／ｗ６血清（ワークショップナンバー1197ｃ）と
反応するが、抗ＤＲｗ13血清（ワークショップナンバー
9058、9062）とは反応しないものをＤＲｗ14とした。
10回国際組織適合抗原ワークショップの血清を用いて調
べ、３種の抗ＤＲｗ14血清（ワークショップナンバー90
60、9061、1111）の内、少なくとも２種、および抗ＤＲ
１／２／ｗ６血清（ワークショップナンバー1197ｃ）と
反応するが、抗ＤＲｗ13血清（ワークショップナンバー
9058、9062）とは反応しないものをＤＲｗ14とした。
【００２７】このようにして血清学的にＤＲｗ14とタイ
プされた日本人から分離した染色体ＤＮＡを、オリゴヌ
クレオチドプライマーとして例えば下記のＧＨ46、ＦＲ
Ｐ１あるいはＤＲβＡＭＰ１を組み合せて使用してＰＣ
Ｒに掛け、引続きＦ143、Ｆ６ｂ、Ｆ46、Ｆ141あるいは
Ｆ52ｃ等のオリゴヌクレオチドプローブによるハイブリ
ダイゼーションを行った。
プされた日本人から分離した染色体ＤＮＡを、オリゴヌ
クレオチドプライマーとして例えば下記のＧＨ46、ＦＲ
Ｐ１あるいはＤＲβＡＭＰ１を組み合せて使用してＰＣ
Ｒに掛け、引続きＦ143、Ｆ６ｂ、Ｆ46、Ｆ141あるいは
Ｆ52ｃ等のオリゴヌクレオチドプローブによるハイブリ
ダイゼーションを行った。
【００２８】これらのプライマー及びプローブ塩基配列
は以下の通りである。 ＦＰＲ１：５’−ＡＧＴＧＴＣＡＴＴＴＣＴＴＣＡＡ
（およびＣ）ＧＧＧＡＣＧＧＡ−３’(Obata,F.,Ito,
I., Kaneko, T., Ohkubo, M., Ishimoto, A. L., Abe,
A., and Kashiwagi, N. Tissue Antigens 33巻 550〜
558頁 1989年） ＤＲβＡＭＰ１：５’−ＣＧＣＴＧＣＡＣＴＧＴＧＡＡ
ＧＣＴＣＴＣ−３’（Todd, J.A., Bell, J.I., and Mc
Devitt, H.O.Nature 329巻 599〜604頁 1987年） ＧＨ４６：５’−ＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＣＧＴＧＴＣＣ
ＣＣＡＣＡＧＣＡＣＧ−３’（Scharf, S.J., Long, C.
M., and Erlich, H.A. Hum Immunol 22巻 61〜69頁
1988年） オリゴヌクレオチドプライマーＧＨ46−ＤＲβＡＭＰ１
の組み合せによればＤＲＢ遺伝子の第２エクソン部の殆
ど全ての領域 (288bp)を、ＦＰＲ１−ＤＲβＡＭＰ１の
組み合せによればＤＲＢ遺伝子の第２エクソン部の第２
および第３の超可変領域(238bp) を増幅することができ
る（Obata, F., Abe, A., Ohkubo, M.,Ito, I., Kanek
o, T., Otani, F., Watanabe, K., and Kashiwagi, N.
ら Hum Immunol 27巻 269〜284頁 1990年）。
は以下の通りである。 ＦＰＲ１：５’−ＡＧＴＧＴＣＡＴＴＴＣＴＴＣＡＡ
（およびＣ）ＧＧＧＡＣＧＧＡ−３’(Obata,F.,Ito,
I., Kaneko, T., Ohkubo, M., Ishimoto, A. L., Abe,
A., and Kashiwagi, N. Tissue Antigens 33巻 550〜
558頁 1989年） ＤＲβＡＭＰ１：５’−ＣＧＣＴＧＣＡＣＴＧＴＧＡＡ
ＧＣＴＣＴＣ−３’（Todd, J.A., Bell, J.I., and Mc
Devitt, H.O.Nature 329巻 599〜604頁 1987年） ＧＨ４６：５’−ＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＣＧＴＧＴＣＣ
ＣＣＡＣＡＧＣＡＣＧ−３’（Scharf, S.J., Long, C.
M., and Erlich, H.A. Hum Immunol 22巻 61〜69頁
1988年） オリゴヌクレオチドプライマーＧＨ46−ＤＲβＡＭＰ１
の組み合せによればＤＲＢ遺伝子の第２エクソン部の殆
ど全ての領域 (288bp)を、ＦＰＲ１−ＤＲβＡＭＰ１の
組み合せによればＤＲＢ遺伝子の第２エクソン部の第２
および第３の超可変領域(238bp) を増幅することができ
る（Obata, F., Abe, A., Ohkubo, M.,Ito, I., Kanek
o, T., Otani, F., Watanabe, K., and Kashiwagi, N.
ら Hum Immunol 27巻 269〜284頁 1990年）。
【００２９】増幅したＤＮＡ断片をアルカリ変性した
後、ナイロン膜上にブロットし、32Ｐラベルしたオリゴ
ヌクレオチドプローブによりハイブリダイズした。ハイ
ブリダイゼーション後、ナイロン膜を室温下、洗浄溶液
（組成： (６×SSC) 0.9Ｍ NaCl 、0.09Ｍ Na-Citrate
、 0.1％ SDS) 中で５分間洗浄し、引続きオリゴヌク
レオチドＦ14３を使用した場合には54℃で15分間、オリ
ゴヌクレオチドＦ14４（後述のＤＲｗ14のタイピングの
項参照）あるいはＦ52ｃを使用した場合には58℃で15分
間、オリゴヌクレオチドＦ６ｂあるいはＦ14１あるいは
Ｆ14２（後述のＤＲｗ14のタイピングの項参照）あるい
はＦ46を使用した場合には62℃で15分間洗浄した。
後、ナイロン膜上にブロットし、32Ｐラベルしたオリゴ
ヌクレオチドプローブによりハイブリダイズした。ハイ
ブリダイゼーション後、ナイロン膜を室温下、洗浄溶液
（組成： (６×SSC) 0.9Ｍ NaCl 、0.09Ｍ Na-Citrate
、 0.1％ SDS) 中で５分間洗浄し、引続きオリゴヌク
レオチドＦ14３を使用した場合には54℃で15分間、オリ
ゴヌクレオチドＦ14４（後述のＤＲｗ14のタイピングの
項参照）あるいはＦ52ｃを使用した場合には58℃で15分
間、オリゴヌクレオチドＦ６ｂあるいはＦ14１あるいは
Ｆ14２（後述のＤＲｗ14のタイピングの項参照）あるい
はＦ46を使用した場合には62℃で15分間洗浄した。
【００３０】ＨＬＡ−ＤＲｗ14関連のタイピング用には
既知のＤＲＢ１* 1401（ＤＲｗ14−Ｄｗ９）とＤＲＢ１
* 1042（ＤＲｗ14−Ｄｗ16）（Tiercy, J-M., Gorski,
J.,Betuel, H., Freidel, A.C., Gebu-hrer, L., Jeann
et, H., and Mach, B. ら Hum Immunol 24巻 １〜14
頁 1989年、Gorski, J. Hum Immunol 24巻 145〜149
頁 1989年、Kao, H.T., Gregersen, P.K., Tang, J.
C., Takahashi,T., Wang, C.Y., and Silver, J.らJ Im
munol 142巻 1743頁 1989年）の塩基配列に基づいて
オリゴヌクレオチドプローブを合成した。これらのオリ
ゴヌクレオチドプローブの塩基配列は以下の通りであ
る。 Ｆ14３：５’−ＴＧＣＴＧＣＧＧＡＧＣＡＣＴＧＧＡＡ
Ｃ−３'(Tiercy, J.-M.,Gorski, J., Betuel, H., Frei
del A.C., Gebuhrer L., Jeannet M., and Mach,B., Hu
m Immunol 24巻 1〜14頁 1989年) Ｆ６ｂ：５’−ＧＴＧＴＣＴＧＣＡＡＴＡＧＧＴＧＴＣ
Ｃ−３'(Abe, A., Ito,I., Ohkubo M., Kaneko, T., It
o K., Kato H., Kashiwagi, N., and Obata F.らImmuno
genetics, 30巻 422〜426頁 1989年） Ｆ４６：５’−ＧＣＡＧＡＧＧＣＧＧＧＣＣＧＣＧＧＴ
−３'(Scharf, S.J., Friedman, A., Brautbar, C., Sz
afer, F., Steiman, L., Horn, G., Gyllensten,U., an
d Erlich, H.A., Proc Natl Acad Sci USA, 85巻 3504
〜3508頁、1988年） Ｆ14１：５’−ＡＧＣＧＣＡＣＧＡＡＣＴＣＣＴＣＣＴ
Ｇ−３’ Ｆ５２ｃ：５’−ＧＴＴＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡＴＡＣＴ
ＴＣ−３'(Tiercy, J.-M., Gorski, J., Jeannet, M.,
and Mach, B., Proc Natl Acad Sci USA, 85巻 198〜20
2頁、1988年） Ｆ６ｂ、Ｆ141、Ｆ143はＤＲＢ１（ＤＲＢ１* 1401）の
塩基配列に相補であり、Ｆ46、Ｆ52ｃはＤＲＢ１（ＤＲ
Ｂ１* 1402）の塩基配列に相補である。また、これらの
オリゴヌクレオチドプローブのいくつかはＤＲＢ１* 14
01およびＤＲＢ１* 1402以外のＤＲＢ１とＤＲＢ３の塩
基配列にも相補である。（表１) これらの関係を表１に示す。
既知のＤＲＢ１* 1401（ＤＲｗ14−Ｄｗ９）とＤＲＢ１
* 1042（ＤＲｗ14−Ｄｗ16）（Tiercy, J-M., Gorski,
J.,Betuel, H., Freidel, A.C., Gebu-hrer, L., Jeann
et, H., and Mach, B. ら Hum Immunol 24巻 １〜14
頁 1989年、Gorski, J. Hum Immunol 24巻 145〜149
頁 1989年、Kao, H.T., Gregersen, P.K., Tang, J.
C., Takahashi,T., Wang, C.Y., and Silver, J.らJ Im
munol 142巻 1743頁 1989年）の塩基配列に基づいて
オリゴヌクレオチドプローブを合成した。これらのオリ
ゴヌクレオチドプローブの塩基配列は以下の通りであ
る。 Ｆ14３：５’−ＴＧＣＴＧＣＧＧＡＧＣＡＣＴＧＧＡＡ
Ｃ−３'(Tiercy, J.-M.,Gorski, J., Betuel, H., Frei
del A.C., Gebuhrer L., Jeannet M., and Mach,B., Hu
m Immunol 24巻 1〜14頁 1989年) Ｆ６ｂ：５’−ＧＴＧＴＣＴＧＣＡＡＴＡＧＧＴＧＴＣ
Ｃ−３'(Abe, A., Ito,I., Ohkubo M., Kaneko, T., It
o K., Kato H., Kashiwagi, N., and Obata F.らImmuno
genetics, 30巻 422〜426頁 1989年） Ｆ４６：５’−ＧＣＡＧＡＧＧＣＧＧＧＣＣＧＣＧＧＴ
−３'(Scharf, S.J., Friedman, A., Brautbar, C., Sz
afer, F., Steiman, L., Horn, G., Gyllensten,U., an
d Erlich, H.A., Proc Natl Acad Sci USA, 85巻 3504
〜3508頁、1988年） Ｆ14１：５’−ＡＧＣＧＣＡＣＧＡＡＣＴＣＣＴＣＣＴ
Ｇ−３’ Ｆ５２ｃ：５’−ＧＴＴＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡＴＡＣＴ
ＴＣ−３'(Tiercy, J.-M., Gorski, J., Jeannet, M.,
and Mach, B., Proc Natl Acad Sci USA, 85巻 198〜20
2頁、1988年） Ｆ６ｂ、Ｆ141、Ｆ143はＤＲＢ１（ＤＲＢ１* 1401）の
塩基配列に相補であり、Ｆ46、Ｆ52ｃはＤＲＢ１（ＤＲ
Ｂ１* 1402）の塩基配列に相補である。また、これらの
オリゴヌクレオチドプローブのいくつかはＤＲＢ１* 14
01およびＤＲＢ１* 1402以外のＤＲＢ１とＤＲＢ３の塩
基配列にも相補である。（表１) これらの関係を表１に示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】なお、これらオリゴヌクレオチドプローブ
の特異性は、ＤＲ／Ｄの表現型およびＤＲＢ１／Ｂ３／
Ｂ４の遺伝子型が判っているＢ細胞樹立株のＰＣＲ法を
用いるタイピングによって確認した。（表２） またＢ細胞樹立株のＨＬＡ−ＤＲとＤ型のオリゴヌクレ
オチドによるタイピングには、第９回および第10回の国
際組織適合抗原ワークショップに報告されている（Schr
euder, G.M.T., Doxiadis,I., Parlevliet, J., and Gr
osse-Wilde, H.Histo-compatibility Testing 1984 243
〜248頁 Spriger-Verlag Berlin 1984年、Jaraquemada,
D., Rein-smoen, N.L., Ollier, W., Oloye, R., Bac
h, F.H.,and Festenstein, H. Histocompatibility Tes
ting 1984 270〜174 頁 Springer-Verlag Berlin 198
4年、Yang, S.Y., Milford,E., Hmmer-ling, U., and D
upont,B.Immunobiology of HLA １巻 11〜19頁 Spring
-Verlag New York 1989年)ものを用いた。
の特異性は、ＤＲ／Ｄの表現型およびＤＲＢ１／Ｂ３／
Ｂ４の遺伝子型が判っているＢ細胞樹立株のＰＣＲ法を
用いるタイピングによって確認した。（表２） またＢ細胞樹立株のＨＬＡ−ＤＲとＤ型のオリゴヌクレ
オチドによるタイピングには、第９回および第10回の国
際組織適合抗原ワークショップに報告されている（Schr
euder, G.M.T., Doxiadis,I., Parlevliet, J., and Gr
osse-Wilde, H.Histo-compatibility Testing 1984 243
〜248頁 Spriger-Verlag Berlin 1984年、Jaraquemada,
D., Rein-smoen, N.L., Ollier, W., Oloye, R., Bac
h, F.H.,and Festenstein, H. Histocompatibility Tes
ting 1984 270〜174 頁 Springer-Verlag Berlin 198
4年、Yang, S.Y., Milford,E., Hmmer-ling, U., and D
upont,B.Immunobiology of HLA １巻 11〜19頁 Spring
-Verlag New York 1989年)ものを用いた。
【００３３】オリゴヌクレオチドプローブＦ６ｂ、Ｆ14
１、Ｆ14３、Ｆ46、Ｆ52ｃの各々にハイブリダイズさせ
た時の結果を表２に示す。
１、Ｆ14３、Ｆ46、Ｆ52ｃの各々にハイブリダイズさせ
た時の結果を表２に示す。
【００３４】
【表２】
【００３５】表２に示した結果のように、ＫＷ（ＤＲｗ
14／９）、24Ｆ（ＤＲｗ14／ｗ８）および38Ｆ（ＤＲｗ
14／ｗ１１）はＦ６ｂ、Ｆ14１およびＦ14３と交雑し
た。この交雑様式はＤＲＢ１* 1401であるＢ細胞株ＴＥ
Ｍおよび 31227ＡＢＯの場合と同じであった。従って、
これら３種はＤＲＢ１* 1401を持っていると結論され
る。
14／９）、24Ｆ（ＤＲｗ14／ｗ８）および38Ｆ（ＤＲｗ
14／ｗ１１）はＦ６ｂ、Ｆ14１およびＦ14３と交雑し
た。この交雑様式はＤＲＢ１* 1401であるＢ細胞株ＴＥ
Ｍおよび 31227ＡＢＯの場合と同じであった。従って、
これら３種はＤＲＢ１* 1401を持っていると結論され
る。
【００３６】一方、59Ｍ（ＤＲｗ14／９）および75Ｍ
（ＤＲｗ14／ｗ８）はＦ46およびＦ52ｃと交雑し、その
交雑様式はＤＲＢ１* 1402を持っているＢ細胞株ＡＭＡ
ＬＡおよびＬＺＬの場合と同じであった。従って、この
２種はＤＲＢ１* 1402を持っていると結論される。38Ｍ
（ＤＲｗ14／４）、36Ｍ（ＤＲｗ14／ｗ15）および26Ｆ
（ＤＲｗ14／９）の場合には、既知のＤＲｗ14関連の場
合の上記の結果とは対照的に、特異的な結果が得られ
た。すなわち、ＤＲＢ１* 1401に特異的なＦ14３とは交
雑しないが、同じくＤＲＢ１* 1401に特異的なＦ６ｂお
よびＦ14１と交雑する。この結果からＤＲＢ１* 1401と
は少なくともＦ14３の部位が異なっているＤＲｗ14の異
なったサブタイプであることが判る。また、36Ｍおよび
26Ｆの場合にはＦ46およびＦ52ｃとは、38Ｍの場合には
Ｆ52ｃとは交雑しないとの結果が得られた。この結果か
らこれら３種はＤＲＢ１＊1402とも異なっていることが
判る。
（ＤＲｗ14／ｗ８）はＦ46およびＦ52ｃと交雑し、その
交雑様式はＤＲＢ１* 1402を持っているＢ細胞株ＡＭＡ
ＬＡおよびＬＺＬの場合と同じであった。従って、この
２種はＤＲＢ１* 1402を持っていると結論される。38Ｍ
（ＤＲｗ14／４）、36Ｍ（ＤＲｗ14／ｗ15）および26Ｆ
（ＤＲｗ14／９）の場合には、既知のＤＲｗ14関連の場
合の上記の結果とは対照的に、特異的な結果が得られ
た。すなわち、ＤＲＢ１* 1401に特異的なＦ14３とは交
雑しないが、同じくＤＲＢ１* 1401に特異的なＦ６ｂお
よびＦ14１と交雑する。この結果からＤＲＢ１* 1401と
は少なくともＦ14３の部位が異なっているＤＲｗ14の異
なったサブタイプであることが判る。また、36Ｍおよび
26Ｆの場合にはＦ46およびＦ52ｃとは、38Ｍの場合には
Ｆ52ｃとは交雑しないとの結果が得られた。この結果か
らこれら３種はＤＲＢ１＊1402とも異なっていることが
判る。
【００３７】これらの結果は、ＤＲｗ14関連の型には既
知のＤＲＢ１* 1401、ＤＲＢ１* 1402の２種の他に第３
番目の型があることを示唆する。この３番目の型をＤＲ
Ｂ１−14ｃと命名する。ＤＲＢ１−14ｃ塩基配列の決定 染色体ＤＮＡを36Ｍ（ＤＲｗ14／ｗ15）と38Ｍ（ＤＲｗ
14／４）の二人の日本人から分離し、プライマーにＧＨ
４６とＤＲβＡＭＰ１を用いて30回のポリメラーゼチェ
インリアクション（ＰＣＲ）を行った。このように増幅
したＤＲＢ遺伝子の第２エクソンの殆ど全ての領域を含
む 288bpのＤＮＡ断片を、ＧＨ46内にあるBamHＩ部位で
切断し、アガロースゲル電気泳動法により精製した。次
に、この断片を Bluescript Vector (Stratagene、San
Diego)のBamHＩ−EcoRＶ部位に挿入した。このようにし
て得たプラスミドを大腸菌ＪＭ10９にトランスフェクト
し、32ＰでラベルしたＦ６ｂのオリゴヌクレオチドプロ
ーブを用いたコロニーハイブリダイゼーションによりＤ
ＲＢ１−14ｃのＤＲＢ１第２エクソン部の遺伝子を含む
クローンを取り出した。塩基配列のデータの信頼性を最
大にするために、２つのサンプルからオリゴヌクレオチ
ドプローブＦ６ｂに交雑する各々３つのクローンを取
り、さらにＤＮＡの両鎖についてジデオキシ法により塩
基配列を調べた。その結果、36Ｍおよび38Ｍから得られ
た各々の３種のクローンは同一であった。
知のＤＲＢ１* 1401、ＤＲＢ１* 1402の２種の他に第３
番目の型があることを示唆する。この３番目の型をＤＲ
Ｂ１−14ｃと命名する。ＤＲＢ１−14ｃ塩基配列の決定 染色体ＤＮＡを36Ｍ（ＤＲｗ14／ｗ15）と38Ｍ（ＤＲｗ
14／４）の二人の日本人から分離し、プライマーにＧＨ
４６とＤＲβＡＭＰ１を用いて30回のポリメラーゼチェ
インリアクション（ＰＣＲ）を行った。このように増幅
したＤＲＢ遺伝子の第２エクソンの殆ど全ての領域を含
む 288bpのＤＮＡ断片を、ＧＨ46内にあるBamHＩ部位で
切断し、アガロースゲル電気泳動法により精製した。次
に、この断片を Bluescript Vector (Stratagene、San
Diego)のBamHＩ−EcoRＶ部位に挿入した。このようにし
て得たプラスミドを大腸菌ＪＭ10９にトランスフェクト
し、32ＰでラベルしたＦ６ｂのオリゴヌクレオチドプロ
ーブを用いたコロニーハイブリダイゼーションによりＤ
ＲＢ１−14ｃのＤＲＢ１第２エクソン部の遺伝子を含む
クローンを取り出した。塩基配列のデータの信頼性を最
大にするために、２つのサンプルからオリゴヌクレオチ
ドプローブＦ６ｂに交雑する各々３つのクローンを取
り、さらにＤＮＡの両鎖についてジデオキシ法により塩
基配列を調べた。その結果、36Ｍおよび38Ｍから得られ
た各々の３種のクローンは同一であった。
【００３８】得られた塩基配列を図１に示した。ＤＲＢ１−14ｃの塩基配列の特徴 このクローンはＦ６ｂ、Ｆ14１の塩基配列を含むもの
の、Ｆ14３、Ｆ46、Ｆ52ｃの塩基配列は含まないことが
判った。また、ＤＲＢ１−14ｃには他には見られない塩
基置換が起こり、48番目の塩基がアデニンであった。
の、Ｆ14３、Ｆ46、Ｆ52ｃの塩基配列は含まないことが
判った。また、ＤＲＢ１−14ｃには他には見られない塩
基置換が起こり、48番目の塩基がアデニンであった。
【００３９】なお、このクローンがＤＲＢ１−14ｃに随
伴するＤＲＢ３に由来するものではないことは、38Ｍ
（ＤＲＢ１−14ｃ／４）由来でＦ６ｂに交雑しないクロ
ーンのＤＲＢ３の塩基配列がＤＲＢ３* 0201（ＤＲｗ52
ｂ)の塩基配列(Gorski, J. andMack, B. Nature 322 巻
67〜70頁 1986年）と同じであり、ここで示した塩基配
列とは異なっていることから確認した。また、偽遺伝子
のＤＲＢ２に由来しているとの可能性は、ＤＲｗ11、Ｄ
Ｒｗ12、ＤＲｗ13、ＤＲｄｗ14、ＤＲｗ17およびＤＲｗ
18などのＤＲｗ52族に属するＤＲＢ２遺伝子は第２エク
ソンが欠落している(Rollini, P., Mach, B., and Gors
ki, J. Immunogenetics 25巻 336〜342頁 1987年）こと
から否定できる。従って、ここで示した塩基配列はＤＲ
Ｂ１−14ｃに随伴するＤＲＢ１遺伝子に由来するもので
あり、ＤＲＢ２あるいはＤＲＢ３に由来するものではな
いと考えられる。
伴するＤＲＢ３に由来するものではないことは、38Ｍ
（ＤＲＢ１−14ｃ／４）由来でＦ６ｂに交雑しないクロ
ーンのＤＲＢ３の塩基配列がＤＲＢ３* 0201（ＤＲｗ52
ｂ)の塩基配列(Gorski, J. andMack, B. Nature 322 巻
67〜70頁 1986年）と同じであり、ここで示した塩基配
列とは異なっていることから確認した。また、偽遺伝子
のＤＲＢ２に由来しているとの可能性は、ＤＲｗ11、Ｄ
Ｒｗ12、ＤＲｗ13、ＤＲｄｗ14、ＤＲｗ17およびＤＲｗ
18などのＤＲｗ52族に属するＤＲＢ２遺伝子は第２エク
ソンが欠落している(Rollini, P., Mach, B., and Gors
ki, J. Immunogenetics 25巻 336〜342頁 1987年）こと
から否定できる。従って、ここで示した塩基配列はＤＲ
Ｂ１−14ｃに随伴するＤＲＢ１遺伝子に由来するもので
あり、ＤＲＢ２あるいはＤＲＢ３に由来するものではな
いと考えられる。
【００４０】ＤＲＢ１−14ｃのＤＲβ１鎖の第１ドメイ
ンの塩基配列から決定されるアミノ酸配列はＤＲＢ１*
1401 (Tiercy, J-M., Gorski, J., Betuel, H., Freide
l, A.C., Gebuhrer, L., Jeannet, M., and Mach, B. H
um Immunol 24巻 1〜14頁 1989年、Gorski, J. Hum Imm
unol 24巻 145〜１49頁 1989年）のアミノ酸配列と16、
57、60番目の位置で異なっている。16番目のグルタミン
はＤＲＢ１−14ｃに特有なアミノ酸であり、他のＤＲの
型では見られない。57番目および60番目はオリゴヌクレ
オチドプローブＦ14３に相当する部分であり、ＤＲＢ１
* 1401とＤＲＢ１−14ｃとを区別する箇所である。一
方、ＤＲＢ１−14ｃとＤＲＢ１* 1402(Kao, H.T., Greg
ersen, P.K., Tang, J.C., Takahashi, T., Wang, C.
Y., and Silver, J. J Immunol 142巻 1743頁 1989年、
Gorski, J. Hum Immunol 24巻 145〜149頁 1989年）と
のアミノ酸配列は16、28、37、70、74および86番目の位
置で異なっている。28番目の位置はＦ52ｃに、70および
74番目はＦ46に相当する部分である。ＤＲｗ14関連の３
種のＤＲβ１鎖の配列を比較するとＤＲＢ１* 1301（Ｄ
Ｒｗ13−Ｄｗ18、Tiercy, J-M., Gorski, J., Betuel,
H., Freidel, A.C., Gebuhrer, L., Jeannet, H., and
Mach, B.Hum Immunol 24巻 １〜14頁 1989年、Kao,
H.T., Gregersen, P.K., Tang, J.C., Takahashi, T.,
Wang, C.Y., and Silver, J.J Immunol 142 巻 1743頁
1989年)、ＤＲＢ１* 1302 (ＤＲｗ13−Ｄｗ19、Tierc
y, J-M., Gorski, J., Betuel, H., Freidel, A.C., Ge
buhrer, L.,Jeannet, H., and Mach, B.Hum Immunol 24
巻 １〜14頁 1989年）およびＤＲＢ１−ＪＸ６ (Obat
a, F., Abe, A., Ohkubo, M., Ito, I., Kaneko, T., O
tani, F., Watanabe, K., and Kashiwagi, N.Hum Immun
ol 27巻 269〜284頁 1990年）など他のＤＲＢ１のＤ
Ｒβ１配列との比較と同様に血清学的にＤＲｗ14の特異
性を説明できるようなアミノ酸残基を特定できない。す
なわち、３種のＤＲｗ14関連のアレルにのみ一般的な多
型的なアミノ酸残基は無い。
ンの塩基配列から決定されるアミノ酸配列はＤＲＢ１*
1401 (Tiercy, J-M., Gorski, J., Betuel, H., Freide
l, A.C., Gebuhrer, L., Jeannet, M., and Mach, B. H
um Immunol 24巻 1〜14頁 1989年、Gorski, J. Hum Imm
unol 24巻 145〜１49頁 1989年）のアミノ酸配列と16、
57、60番目の位置で異なっている。16番目のグルタミン
はＤＲＢ１−14ｃに特有なアミノ酸であり、他のＤＲの
型では見られない。57番目および60番目はオリゴヌクレ
オチドプローブＦ14３に相当する部分であり、ＤＲＢ１
* 1401とＤＲＢ１−14ｃとを区別する箇所である。一
方、ＤＲＢ１−14ｃとＤＲＢ１* 1402(Kao, H.T., Greg
ersen, P.K., Tang, J.C., Takahashi, T., Wang, C.
Y., and Silver, J. J Immunol 142巻 1743頁 1989年、
Gorski, J. Hum Immunol 24巻 145〜149頁 1989年）と
のアミノ酸配列は16、28、37、70、74および86番目の位
置で異なっている。28番目の位置はＦ52ｃに、70および
74番目はＦ46に相当する部分である。ＤＲｗ14関連の３
種のＤＲβ１鎖の配列を比較するとＤＲＢ１* 1301（Ｄ
Ｒｗ13−Ｄｗ18、Tiercy, J-M., Gorski, J., Betuel,
H., Freidel, A.C., Gebuhrer, L., Jeannet, H., and
Mach, B.Hum Immunol 24巻 １〜14頁 1989年、Kao,
H.T., Gregersen, P.K., Tang, J.C., Takahashi, T.,
Wang, C.Y., and Silver, J.J Immunol 142 巻 1743頁
1989年)、ＤＲＢ１* 1302 (ＤＲｗ13−Ｄｗ19、Tierc
y, J-M., Gorski, J., Betuel, H., Freidel, A.C., Ge
buhrer, L.,Jeannet, H., and Mach, B.Hum Immunol 24
巻 １〜14頁 1989年）およびＤＲＢ１−ＪＸ６ (Obat
a, F., Abe, A., Ohkubo, M., Ito, I., Kaneko, T., O
tani, F., Watanabe, K., and Kashiwagi, N.Hum Immun
ol 27巻 269〜284頁 1990年）など他のＤＲＢ１のＤ
Ｒβ１配列との比較と同様に血清学的にＤＲｗ14の特異
性を説明できるようなアミノ酸残基を特定できない。す
なわち、３種のＤＲｗ14関連のアレルにのみ一般的な多
型的なアミノ酸残基は無い。
【００４１】ＤＲｗ14のタイピング ＤＲＢ１−14ｃはＤＲＢ１* 1401からはＦ14３が交雑し
ないことで区別される。より積極的にＤＲＢ１−14ｃを
同定するためにＤＲＢ１−14ｃに特異的に交雑するオリ
ゴヌクレオチドプローブとしてＦ144およびＦ142を合成
した（図１参照）。Ｆ14４はＤＲＢ１−14ｃの16番目の
アミノ酸のグルタミン酸を含む領域に相当する。Ｆ14２
はＤＲＢ１* 1402、ＤＲＢ１* 1301、ＤＲＢ１* 1302、
ＤＲＢ１−ＪＸ６を含めた他の多くのＤＲＢ１遺伝子に
共通な57番目のアスパラギン酸と60番目のチロシンを含
む領域に相当し、アミノ酸配列での置換はないが、ＤＲ
Ｂ１−14ｃに特異的な塩基配列の174番目のチミンを含
む。
ないことで区別される。より積極的にＤＲＢ１−14ｃを
同定するためにＤＲＢ１−14ｃに特異的に交雑するオリ
ゴヌクレオチドプローブとしてＦ144およびＦ142を合成
した（図１参照）。Ｆ14４はＤＲＢ１−14ｃの16番目の
アミノ酸のグルタミン酸を含む領域に相当する。Ｆ14２
はＤＲＢ１* 1402、ＤＲＢ１* 1301、ＤＲＢ１* 1302、
ＤＲＢ１−ＪＸ６を含めた他の多くのＤＲＢ１遺伝子に
共通な57番目のアスパラギン酸と60番目のチロシンを含
む領域に相当し、アミノ酸配列での置換はないが、ＤＲ
Ｂ１−14ｃに特異的な塩基配列の174番目のチミンを含
む。
【００４２】血清学的にＤＲｗ14とタイプされた日本人
および他の型の日本人から染色体ＤＮＡを分離し、ＧＨ
46−ＤＲβＡＭＰ１の組み合せのプライマーを用いてＰ
ＣＲに掛け、第１超可変領域を含むＤＲＢ第２エクソン
の大部分を増幅した。増幅したＤＮＡ断片をナイロン膜
にブロットし、ＤＲＢ１−14ｃ特異的なＦ14２、Ｆ14４
および他のＦ６ｂ、Ｆ14１、Ｆ14３、Ｆ46、およびＦ52
ｃとハイブリダイズさせた。その結果を図２および表３
に示す。これから明らかなように血清学的にＤＲｗ14特
異的な検体の中のいくつかはＦ14２、Ｆ14４とＦ６ｂ、
Ｆ14１に交雑し、他のＤＲＢ１* 1401あるいはＤＲＢ１
* 1402とは区別可能であり、従って、ＤＲＢ１−14ｃに
属することを断定できることが判った。ＤＲｗ14関連以
外のＤＲＢ１およびＤＲＢ３遺伝子に特異的なオリゴヌ
クレオチドプローブでの交雑様式から他の検体のＤＲｗ
14関連の遺伝子はＤＲＢ１* 1401あるいはＤＲＢ１* 14
02と判定される。
および他の型の日本人から染色体ＤＮＡを分離し、ＧＨ
46−ＤＲβＡＭＰ１の組み合せのプライマーを用いてＰ
ＣＲに掛け、第１超可変領域を含むＤＲＢ第２エクソン
の大部分を増幅した。増幅したＤＮＡ断片をナイロン膜
にブロットし、ＤＲＢ１−14ｃ特異的なＦ14２、Ｆ14４
および他のＦ６ｂ、Ｆ14１、Ｆ14３、Ｆ46、およびＦ52
ｃとハイブリダイズさせた。その結果を図２および表３
に示す。これから明らかなように血清学的にＤＲｗ14特
異的な検体の中のいくつかはＦ14２、Ｆ14４とＦ６ｂ、
Ｆ14１に交雑し、他のＤＲＢ１* 1401あるいはＤＲＢ１
* 1402とは区別可能であり、従って、ＤＲＢ１−14ｃに
属することを断定できることが判った。ＤＲｗ14関連以
外のＤＲＢ１およびＤＲＢ３遺伝子に特異的なオリゴヌ
クレオチドプローブでの交雑様式から他の検体のＤＲｗ
14関連の遺伝子はＤＲＢ１* 1401あるいはＤＲＢ１* 14
02と判定される。
【００４３】
【表３】
【００４４】検出対象物質 本特許において提案しているオリゴヌクレオチドプロー
ブは細胞表面に表現されている膜タンパク質が形成する
ＤＮＡ塩基配列の一部に相当している。従って、染色体
ＤＮＡを検出対象とすることはもちろん、メッセンジャ
ーＲＮＡ、Ｃ−ＤＮＡに対しても有効である。これら３
種類の核酸類の採取には既知の方法が用いられる。これ
らの検出対象の内いづれを選択するかは、検査が行われ
る環境により変化する。
ブは細胞表面に表現されている膜タンパク質が形成する
ＤＮＡ塩基配列の一部に相当している。従って、染色体
ＤＮＡを検出対象とすることはもちろん、メッセンジャ
ーＲＮＡ、Ｃ−ＤＮＡに対しても有効である。これら３
種類の核酸類の採取には既知の方法が用いられる。これ
らの検出対象の内いづれを選択するかは、検査が行われ
る環境により変化する。
【００４５】また、本発明に用いられる上記の核酸は必
要に応じてＰＣＲに掛けて、増幅して使用してもよく：
この場合には検体量が増加するので検出が容易になると
の利点がある。ＰＣＲ用のプライマーには上記のプロー
ブに使用するオリゴヌクレオチドとは別の塩基配列のオ
リゴヌクレオチドを使用しても、また上記のプローブオ
リゴヌクレオチドを使用してもよいが、一般には別の塩
基配列のオリゴヌクレオチドを使用する。
要に応じてＰＣＲに掛けて、増幅して使用してもよく：
この場合には検体量が増加するので検出が容易になると
の利点がある。ＰＣＲ用のプライマーには上記のプロー
ブに使用するオリゴヌクレオチドとは別の塩基配列のオ
リゴヌクレオチドを使用しても、また上記のプローブオ
リゴヌクレオチドを使用してもよいが、一般には別の塩
基配列のオリゴヌクレオチドを使用する。
【００４６】更に、１種類あるいは複数以上の制限酵素
により消化し、さらにそれをゲル電気泳動法により分別
し、そこで得られる遺伝子断片を検出対象とするいわゆ
るＲＦＬＰ法によるタイピングに対しても本発明のオリ
ゴヌクレオチドを使用することができる。オリゴヌクレオチドプローブの使用形態 オリゴヌクレオチドプローブは該プローブが化学的に結
合し固定されるか、あるいは物理的に吸着し固定される
かのいづれかの形態、あるいは溶液中において溶解ある
いは懸濁した状態で使用することが可能であり、これら
のいづれの形態をとってもよい。ハイブリダイゼーショ
ン時には一般には大過剰量のオリゴヌクレオチドプロー
ブを使用するため、溶液中に溶解した状態あるいは懸濁
状態でハイブリダイゼーションする場合には未交雑のオ
リゴヌクレオチドを除去し検知しなければならないの
で、検体となる遺伝子あるいは遺伝子の断片を核酸固定
用の膜に予め固定しておき、該膜を使用してハイブリダ
イゼーションさせる方法：あるいは該オリゴヌクレオチ
ドプローブに加え、検体中の該オリゴヌクレオチドプロ
ーブに相当するＤＮＡ塩基配列以外の部分の塩基配列に
相当する少なくとももう１種類のオリゴヌクレオチドプ
ローブを用い、このプローブを核酸固定用の膜に固定し
ておき、ハイブリダイゼーションを行う方法、オリゴヌ
クレオチドの３’末端あるいは５’末端に特定の配列を
連結しておき、この塩基配列に相補な配列を予め膜に固
定しておきハイブリダイゼーションを行う方法などが採
用される。
により消化し、さらにそれをゲル電気泳動法により分別
し、そこで得られる遺伝子断片を検出対象とするいわゆ
るＲＦＬＰ法によるタイピングに対しても本発明のオリ
ゴヌクレオチドを使用することができる。オリゴヌクレオチドプローブの使用形態 オリゴヌクレオチドプローブは該プローブが化学的に結
合し固定されるか、あるいは物理的に吸着し固定される
かのいづれかの形態、あるいは溶液中において溶解ある
いは懸濁した状態で使用することが可能であり、これら
のいづれの形態をとってもよい。ハイブリダイゼーショ
ン時には一般には大過剰量のオリゴヌクレオチドプロー
ブを使用するため、溶液中に溶解した状態あるいは懸濁
状態でハイブリダイゼーションする場合には未交雑のオ
リゴヌクレオチドを除去し検知しなければならないの
で、検体となる遺伝子あるいは遺伝子の断片を核酸固定
用の膜に予め固定しておき、該膜を使用してハイブリダ
イゼーションさせる方法：あるいは該オリゴヌクレオチ
ドプローブに加え、検体中の該オリゴヌクレオチドプロ
ーブに相当するＤＮＡ塩基配列以外の部分の塩基配列に
相当する少なくとももう１種類のオリゴヌクレオチドプ
ローブを用い、このプローブを核酸固定用の膜に固定し
ておき、ハイブリダイゼーションを行う方法、オリゴヌ
クレオチドの３’末端あるいは５’末端に特定の配列を
連結しておき、この塩基配列に相補な配列を予め膜に固
定しておきハイブリダイゼーションを行う方法などが採
用される。
【００４７】オリゴヌクレオチドプローブあるいは検体
遺伝子を固定する場合に使用される物としては核酸が固
定される物であれば特に制限は加えられないが：その形
態としては膜上、板上、棒状の物が使用される。これら
の中では膜が好ましく使用される。ここで使用される膜
としては、セルロースを成分にする膜、ナイロン膜など
の市販の核酸固定用膜をあげることができる。HybondTM
-C、HybondTM-C extra、HybondTM-ECL、HybondTM-N、Hy
bond-NTM+（Amersham社）、Whatman541filter(Whatman
社）、DuralonTMUV 、Duralose-UVTM(Stratagene社）、
PhotoGene Nylon Membrane(BRL社）などを具体例として
挙げることができるが、これら以外を使用しても遺伝子
あるいはオリゴヌクレオチドプローブを結合させ得るも
のであれば差し支えない。これらの膜に遺伝子あるいは
オリゴヌクレオチドプローブを固定する際には加熱処
理、あるいはＵＶ照射処理などの方法によるが、このい
づれかあるいは別の方法によるかについては、使用する
膜の性質によって適宜変更することになる。例えば、Hy
bondTM-N+を使用する場合にはＵＶ照射法により固定
し、HybondTM-C extraを使用する場合には真空中80℃に
加熱する方法が採用される。
遺伝子を固定する場合に使用される物としては核酸が固
定される物であれば特に制限は加えられないが：その形
態としては膜上、板上、棒状の物が使用される。これら
の中では膜が好ましく使用される。ここで使用される膜
としては、セルロースを成分にする膜、ナイロン膜など
の市販の核酸固定用膜をあげることができる。HybondTM
-C、HybondTM-C extra、HybondTM-ECL、HybondTM-N、Hy
bond-NTM+（Amersham社）、Whatman541filter(Whatman
社）、DuralonTMUV 、Duralose-UVTM(Stratagene社）、
PhotoGene Nylon Membrane(BRL社）などを具体例として
挙げることができるが、これら以外を使用しても遺伝子
あるいはオリゴヌクレオチドプローブを結合させ得るも
のであれば差し支えない。これらの膜に遺伝子あるいは
オリゴヌクレオチドプローブを固定する際には加熱処
理、あるいはＵＶ照射処理などの方法によるが、このい
づれかあるいは別の方法によるかについては、使用する
膜の性質によって適宜変更することになる。例えば、Hy
bondTM-N+を使用する場合にはＵＶ照射法により固定
し、HybondTM-C extraを使用する場合には真空中80℃に
加熱する方法が採用される。
【００４８】これらの膜にオリゴヌクレオチドあるいは
検体遺伝子を固定するためには検出に必要となる塩基配
列以外に５’末端あるいは３’末端をポリｄＴ等で修飾
することが好ましい場合があり、これらの場合にはオリ
ゴヌクレオチドあるいは検体遺伝子を修飾することも行
われる。これらのための方法として、３’末端の修飾に
は核酸とターミナルデオキシヌクレオチディルトランス
フェラーゼによる伸長反応あるいは修飾に必要な塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドとリガーゼを用いる伸長
反応がある。また、５’末端の修飾にはＰＣＲに用いる
プライマーの５’末端部分に予め必要な塩基配列を結合
させておく方法が採用される。
検体遺伝子を固定するためには検出に必要となる塩基配
列以外に５’末端あるいは３’末端をポリｄＴ等で修飾
することが好ましい場合があり、これらの場合にはオリ
ゴヌクレオチドあるいは検体遺伝子を修飾することも行
われる。これらのための方法として、３’末端の修飾に
は核酸とターミナルデオキシヌクレオチディルトランス
フェラーゼによる伸長反応あるいは修飾に必要な塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドとリガーゼを用いる伸長
反応がある。また、５’末端の修飾にはＰＣＲに用いる
プライマーの５’末端部分に予め必要な塩基配列を結合
させておく方法が採用される。
【００４９】交雑の有無を調べるためには、オリゴヌク
レオチドプローブあるいは検体遺伝子をラジオアイソト
ープあるいは蛍光物質で標識しておく、あるいは標識さ
れ得るように修飾されている系を使用し、該標識物質を
検出することで行なわれる。ここで用いられる標識物質
としては、32Ｐ、35Ｓ、125Ｉのようなラジオアイソト
ープ、あるいはフルオレッセインイソチオシネート（Ｆ
ＩＴＣ）のような蛍光色素あるいはビオチン、ジオキシ
ゲニンなどのような非ラジオアイソトープ物質を挙げる
ことができる。
レオチドプローブあるいは検体遺伝子をラジオアイソト
ープあるいは蛍光物質で標識しておく、あるいは標識さ
れ得るように修飾されている系を使用し、該標識物質を
検出することで行なわれる。ここで用いられる標識物質
としては、32Ｐ、35Ｓ、125Ｉのようなラジオアイソト
ープ、あるいはフルオレッセインイソチオシネート（Ｆ
ＩＴＣ）のような蛍光色素あるいはビオチン、ジオキシ
ゲニンなどのような非ラジオアイソトープ物質を挙げる
ことができる。
【００５０】検出に当たっては、ラジオアイソトープは
Ｘ線フイルムに感光させるなど公知の方法が、蛍光物質
の場合には蛍光光度計による測定が、ビオチン、ジゴキ
シゲニンの場合には各々ストレプトアビジンあるいは抗
ジコギシゲニン抗体に結合した酵素などにより発光現象
あるいは呈色現象などを起こし、これらを光度計により
測定する方法、Ｘ線フイルムに感光させる方法が採用さ
れる。ここで使用される酵素としては例えばアルカリフ
ォスファターゼ、ワサビ過酸化酵素を挙げることができ
る。これらの標識は、オリゴヌクレオチドの合成時にあ
るいは検体遺伝子の増幅時にこれらの目的に合った修飾
を施した核酸を使用することによりこれらの塩基配列中
に挿入することも、またオリゴヌクレオチドあるいは検
体遺伝子の修飾によりこれらの５’末端あるいは３’末
端に付加することあるいは塩基配列の内部に挿入するこ
とも可能である。このようにして得られた標識化オリゴ
ヌクレオチドあるいは標識化検体遺伝子はいづれもＨＬ
Ａ−ＤＲのタイピングに使用することができる。
Ｘ線フイルムに感光させるなど公知の方法が、蛍光物質
の場合には蛍光光度計による測定が、ビオチン、ジゴキ
シゲニンの場合には各々ストレプトアビジンあるいは抗
ジコギシゲニン抗体に結合した酵素などにより発光現象
あるいは呈色現象などを起こし、これらを光度計により
測定する方法、Ｘ線フイルムに感光させる方法が採用さ
れる。ここで使用される酵素としては例えばアルカリフ
ォスファターゼ、ワサビ過酸化酵素を挙げることができ
る。これらの標識は、オリゴヌクレオチドの合成時にあ
るいは検体遺伝子の増幅時にこれらの目的に合った修飾
を施した核酸を使用することによりこれらの塩基配列中
に挿入することも、またオリゴヌクレオチドあるいは検
体遺伝子の修飾によりこれらの５’末端あるいは３’末
端に付加することあるいは塩基配列の内部に挿入するこ
とも可能である。このようにして得られた標識化オリゴ
ヌクレオチドあるいは標識化検体遺伝子はいづれもＨＬ
Ａ−ＤＲのタイピングに使用することができる。
【００５１】検査試薬キットの内容 ＨＬＡ−ＤＲのタイピングを行うための検査に供される
試薬キットには検査に必要となる試薬類および器具類が
含まれる。具体的にはオリゴヌクレオチドプローブある
いはオリゴヌクレオチドプローブを固定した膜、標識用
の試薬、オリゴヌクレオチドあるいは検体遺伝子固定用
の膜、ハイブリダイゼーション用の試薬、ハイブリダイ
ゼーション後に行う洗浄用の試薬、ハイブリダイゼーシ
ョン操作用および洗浄操作用の器具、交雑の有無を判定
するためのポジティブコントロールおよびネガティブコ
ントロールの標準試薬、判定結果の表現例、検査の各操
作に必要な器具類などが含まれ、これらの全てあるいは
オリゴヌクレオチドプローブを必須として他の物品の一
部からなる。標識用の試薬としては、PhotoGeneTMNucle
ic Acid Detection System (BRL, Life Technologies I
nc.)あるいはDIG systemTM (Boehringer Mannheim)を例
に挙げることができる。また器具としては、BIO-BIK サ
ンプリングチューブ(BioPlastic Co., Ltd.)などのプラ
スチック製チューブ、ボロシリケート処理したガラス製
試験管(Corning Glass Works) などの試験管、Pipetman
TMなどの(Gilson 社) 容量可変デジタル式ピペットおよ
びそれ用のチップ、加熱シール可能なプラスチックバッ
グ（コスモバイオ）、検査時に生じる発光、蛍光、色を
検出する光度計、Ｘ線フイルム、露光用カセット、フイ
ルムハンガー（富士メディカルシステム社）および恒温
槽、水浴槽を挙げることができる。各種の試薬類は必要
に応じて濃度を制御できるように使用濃度よりも濃厚な
溶液として提供されるのが一般的であるが、検査時の必
要濃度に調製しておいても差し支えない。
試薬キットには検査に必要となる試薬類および器具類が
含まれる。具体的にはオリゴヌクレオチドプローブある
いはオリゴヌクレオチドプローブを固定した膜、標識用
の試薬、オリゴヌクレオチドあるいは検体遺伝子固定用
の膜、ハイブリダイゼーション用の試薬、ハイブリダイ
ゼーション後に行う洗浄用の試薬、ハイブリダイゼーシ
ョン操作用および洗浄操作用の器具、交雑の有無を判定
するためのポジティブコントロールおよびネガティブコ
ントロールの標準試薬、判定結果の表現例、検査の各操
作に必要な器具類などが含まれ、これらの全てあるいは
オリゴヌクレオチドプローブを必須として他の物品の一
部からなる。標識用の試薬としては、PhotoGeneTMNucle
ic Acid Detection System (BRL, Life Technologies I
nc.)あるいはDIG systemTM (Boehringer Mannheim)を例
に挙げることができる。また器具としては、BIO-BIK サ
ンプリングチューブ(BioPlastic Co., Ltd.)などのプラ
スチック製チューブ、ボロシリケート処理したガラス製
試験管(Corning Glass Works) などの試験管、Pipetman
TMなどの(Gilson 社) 容量可変デジタル式ピペットおよ
びそれ用のチップ、加熱シール可能なプラスチックバッ
グ（コスモバイオ）、検査時に生じる発光、蛍光、色を
検出する光度計、Ｘ線フイルム、露光用カセット、フイ
ルムハンガー（富士メディカルシステム社）および恒温
槽、水浴槽を挙げることができる。各種の試薬類は必要
に応じて濃度を制御できるように使用濃度よりも濃厚な
溶液として提供されるのが一般的であるが、検査時の必
要濃度に調製しておいても差し支えない。
【００５２】ＨＬＡ−ＤＲのタイピングを行うために
は、各種の型を検出する為の種々のオリゴヌクレオチド
プローブが必要であり、本発明は従来検出不可能な型を
検出するものであるから、既知のオリゴヌクレオチドプ
ローブを検査試薬の中に含ませることは検査の精密性お
よび簡便性を高める上で好ましい。
は、各種の型を検出する為の種々のオリゴヌクレオチド
プローブが必要であり、本発明は従来検出不可能な型を
検出するものであるから、既知のオリゴヌクレオチドプ
ローブを検査試薬の中に含ませることは検査の精密性お
よび簡便性を高める上で好ましい。
【００５３】
【発明の効果】ＤＲＢ１−14ｃ特異的なオリゴヌクレオ
チドプローブであるＦ14２とＦ14４を他のオリゴヌクレ
オチドプローブとをともに使用することによってＤＲｗ
14関連の遺伝子をタイピングすることが可能である。日
本人３６１人でのＤＲＢ１−14ｃ、ＤＲＢ１* 1401、Ｄ
ＲＢ１* 1402のジーンフレンキュエンシーは各々0.01
8、0.038 、0.017 である。このことはＤＲｗ14関連の
遺伝子の全頻度の４分の１はＤＲＢ−14ｃであることを
示唆しているので本発明によるオリゴヌクレオチドプロ
ーブおよびこれを使用する検査法は、完全なＤＲ抗原の
タイピングには必須の要件となるものであり、極めて有
用なものである。また、本発明のＤＲｗ14ｃのＤＮＡは
本発明により初めて得られ、かつその塩基配列が決定が
されたものであり、このＤＮＡにより更に新たな診断手
法の開発あるいはその他の医学上の研究の進展も期待で
きるものである。
チドプローブであるＦ14２とＦ14４を他のオリゴヌクレ
オチドプローブとをともに使用することによってＤＲｗ
14関連の遺伝子をタイピングすることが可能である。日
本人３６１人でのＤＲＢ１−14ｃ、ＤＲＢ１* 1401、Ｄ
ＲＢ１* 1402のジーンフレンキュエンシーは各々0.01
8、0.038 、0.017 である。このことはＤＲｗ14関連の
遺伝子の全頻度の４分の１はＤＲＢ−14ｃであることを
示唆しているので本発明によるオリゴヌクレオチドプロ
ーブおよびこれを使用する検査法は、完全なＤＲ抗原の
タイピングには必須の要件となるものであり、極めて有
用なものである。また、本発明のＤＲｗ14ｃのＤＮＡは
本発明により初めて得られ、かつその塩基配列が決定が
されたものであり、このＤＮＡにより更に新たな診断手
法の開発あるいはその他の医学上の研究の進展も期待で
きるものである。
【００５４】
【実施例】以下に本発明を実施例により説明するが、本
発明はこの実施例のみに限定されるものではない。ＤＲＢ１−14ｃの第２エクソンのＤＮＡ塩基配列の決定 血清学的タイピングでＤＲｗ14と判定された日本人３
人、ＫＷ（ＤＲｗ14／９）、24Ｆ（ＤＲｗ14／ｗ８）、
38Ｆ（ＤＲｗ14／ｗ11）の末梢血から公知の方法（Mani
atis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. ら Molecular
Cloning:A Labora-tory Manual 280〜281頁、1987年、
Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New Y
ork.）により染色体ＤＮＡを調製した。この染色体ＤＮ
Ａを用いて、前述の、プライマーＧＨ４６と５’末端を
リン酸化したＤＲβＡＭＰ１を用いてＰＣＲ法によるＤ
ＮＡ増幅を30回行い、ＤＲβ１遺伝子の第２エクソンの
ほぼ全領域 288bpを選択的に増幅した。
発明はこの実施例のみに限定されるものではない。ＤＲＢ１−14ｃの第２エクソンのＤＮＡ塩基配列の決定 血清学的タイピングでＤＲｗ14と判定された日本人３
人、ＫＷ（ＤＲｗ14／９）、24Ｆ（ＤＲｗ14／ｗ８）、
38Ｆ（ＤＲｗ14／ｗ11）の末梢血から公知の方法（Mani
atis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. ら Molecular
Cloning:A Labora-tory Manual 280〜281頁、1987年、
Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New Y
ork.）により染色体ＤＮＡを調製した。この染色体ＤＮ
Ａを用いて、前述の、プライマーＧＨ４６と５’末端を
リン酸化したＤＲβＡＭＰ１を用いてＰＣＲ法によるＤ
ＮＡ増幅を30回行い、ＤＲβ１遺伝子の第２エクソンの
ほぼ全領域 288bpを選択的に増幅した。
【００５５】次にＰＣＲ法について説明する。染色体Ｄ
ＮＡ１μｇ、各 0.5μＭのプライマー、各 200μＭのｄ
ＮＴＰ（dATP、dCTP、dGTP、dTTP) 、10ｍＭ Tris-HCl
(pＨ8.0)、３ｍＭ MgCl2 、0.05％ Tween20、0.05％Ｎ
Ｐ40溶液を40μｌ用意する。98℃、５分の加熱でＤＮＡ
を変性後、２μｌ（2.5 ユニット／μｌ）のＴａｑＩ
ＤＮＡポリメラーゼを加える。これに48μｌのミネラル
オイルを重層する。この溶液を55℃で２分のアニーリン
グを行った後、72℃で２分、最初のプライマーの伸長を
行う。残りの29サイクルのＰＣＲは以下の条件で行っ
た。すなわち、95℃１分のＤＮＡの変性、55℃１分のア
ニーリング、72℃３分の伸長である。
ＮＡ１μｇ、各 0.5μＭのプライマー、各 200μＭのｄ
ＮＴＰ（dATP、dCTP、dGTP、dTTP) 、10ｍＭ Tris-HCl
(pＨ8.0)、３ｍＭ MgCl2 、0.05％ Tween20、0.05％Ｎ
Ｐ40溶液を40μｌ用意する。98℃、５分の加熱でＤＮＡ
を変性後、２μｌ（2.5 ユニット／μｌ）のＴａｑＩ
ＤＮＡポリメラーゼを加える。これに48μｌのミネラル
オイルを重層する。この溶液を55℃で２分のアニーリン
グを行った後、72℃で２分、最初のプライマーの伸長を
行う。残りの29サイクルのＰＣＲは以下の条件で行っ
た。すなわち、95℃１分のＤＮＡの変性、55℃１分のア
ニーリング、72℃３分の伸長である。
【００５６】増幅したＤＮＡ断片をアルカリ変性した
後、ナイロン膜上にブロットし、32Ｐラベルしたオリゴ
ヌクレオチドプローブによりハイブリダイズした。な
お、ハイブリダイゼーションは Obataらの方法（Obata,
F., Ito,I., Kaneko, T., Ohkubo, M., Ishimoto, A.
L., Abe,A., and Kashiwagi, N. Tissue Antigens 33
巻 550〜558頁 1989年）に従って行った。ここでは、
既知のＤＲＢ１* 1401（ＤＲｗ14−Ｄｗ９）とＤＲＢ１
* 1042（ＤＲｗ14−Ｄｗ16）の塩基配列に基づいてオリ
ゴヌクレオチドプローブを合成し、電気泳動法により精
製し用いた。Ｆ６ｂ、Ｆ14１、Ｆ14３はＤＲＢ１* 1401
の塩基配列に相補であり、Ｆ46、Ｆ52ｃはＤＲＢ１* 14
02の塩基配列に相補である。
後、ナイロン膜上にブロットし、32Ｐラベルしたオリゴ
ヌクレオチドプローブによりハイブリダイズした。な
お、ハイブリダイゼーションは Obataらの方法（Obata,
F., Ito,I., Kaneko, T., Ohkubo, M., Ishimoto, A.
L., Abe,A., and Kashiwagi, N. Tissue Antigens 33
巻 550〜558頁 1989年）に従って行った。ここでは、
既知のＤＲＢ１* 1401（ＤＲｗ14−Ｄｗ９）とＤＲＢ１
* 1042（ＤＲｗ14−Ｄｗ16）の塩基配列に基づいてオリ
ゴヌクレオチドプローブを合成し、電気泳動法により精
製し用いた。Ｆ６ｂ、Ｆ14１、Ｆ14３はＤＲＢ１* 1401
の塩基配列に相補であり、Ｆ46、Ｆ52ｃはＤＲＢ１* 14
02の塩基配列に相補である。
【００５７】ハイブリダイゼーション後、ナイロン膜を
室温下、洗浄溶液（組成： (６×SSC) 0.9Ｍ NaCl、0.
09Ｍ Na-Citrate、 0.1％ SDS）中で５分間洗浄し、引
続きオリゴヌクレオチドＦ14３を使用した場合には54℃
で15分間、オリゴヌクレオチドＦ14４あるいはＦ52ｃを
使用した場合には58℃で15分間、オリゴヌクレオチドＦ
６ｂあるいはＦ14１あるいはＦ14２あるいはＦ46を使用
した場合には62℃で15分間、同洗浄液で洗浄した。
室温下、洗浄溶液（組成： (６×SSC) 0.9Ｍ NaCl、0.
09Ｍ Na-Citrate、 0.1％ SDS）中で５分間洗浄し、引
続きオリゴヌクレオチドＦ14３を使用した場合には54℃
で15分間、オリゴヌクレオチドＦ14４あるいはＦ52ｃを
使用した場合には58℃で15分間、オリゴヌクレオチドＦ
６ｂあるいはＦ14１あるいはＦ14２あるいはＦ46を使用
した場合には62℃で15分間、同洗浄液で洗浄した。
【００５８】これらのオリゴヌクレオチドプローブＦ６
ｂ、Ｆ14１、Ｆ14３、Ｆ46、Ｆ52ｃの各々にハイブリダ
イズさせた時の結果を表２に示す。次に、ＤＲＢ１−14
ｃのＤＲβ１遺伝子のクローニング法を説明する。ＰＣ
Ｒ法によって増幅した 288bpのＤＮＡ断片を、プライマ
ーＧＨ46内に存在するBamHＩ部位で消化後、 1.5％アガ
ロースゲル電気泳動により分画し、公知の方法でＤＮＡ
断片を精製した。これを Bluescript(STRATAGENE) のBa
mHI−EcoRV部位に挿入した。この組み換え体を用い、公
知の方法で大腸菌ＪＭ10９株〔recA1 supE44endAl hsdR
17 gyrA96 relA1 thi △(lac-proAB) F'［traD36 proAB
+ laclq lacZ△M15］〕を形質転換し、５−ブロモ−４
−クロロ−３−インドール−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド（Ｘｇａｌ）とイソプロピル−β−Ｄ（−）チオガラ
クトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含むＬＢ培地（１％ Bac
to triptone、0.5％Yeast extract 、１％ NaCl)で生育
させた。白色のコロニーを楊子で拾いニトロセルロース
フィルターに移し、コロニーハイブリダイゼーション法
を行った。フィルターにＤＮＡを固着させるにはGruns-
tein, M., Wallis, J.らの方法（Meth.Enzymology 63
巻、379〜389頁、1979年、Academic Press、New York）
に従った。
ｂ、Ｆ14１、Ｆ14３、Ｆ46、Ｆ52ｃの各々にハイブリダ
イズさせた時の結果を表２に示す。次に、ＤＲＢ１−14
ｃのＤＲβ１遺伝子のクローニング法を説明する。ＰＣ
Ｒ法によって増幅した 288bpのＤＮＡ断片を、プライマ
ーＧＨ46内に存在するBamHＩ部位で消化後、 1.5％アガ
ロースゲル電気泳動により分画し、公知の方法でＤＮＡ
断片を精製した。これを Bluescript(STRATAGENE) のBa
mHI−EcoRV部位に挿入した。この組み換え体を用い、公
知の方法で大腸菌ＪＭ10９株〔recA1 supE44endAl hsdR
17 gyrA96 relA1 thi △(lac-proAB) F'［traD36 proAB
+ laclq lacZ△M15］〕を形質転換し、５−ブロモ−４
−クロロ−３−インドール−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド（Ｘｇａｌ）とイソプロピル−β−Ｄ（−）チオガラ
クトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含むＬＢ培地（１％ Bac
to triptone、0.5％Yeast extract 、１％ NaCl)で生育
させた。白色のコロニーを楊子で拾いニトロセルロース
フィルターに移し、コロニーハイブリダイゼーション法
を行った。フィルターにＤＮＡを固着させるにはGruns-
tein, M., Wallis, J.らの方法（Meth.Enzymology 63
巻、379〜389頁、1979年、Academic Press、New York）
に従った。
【００５９】ハイブリダイゼーションについては Obat
a、F., Ito, I., Kaneko, T., Ohkubo, M., Ishimoto,
A.L., Abe, A., kashiwagi, N.らの方法（Tissue Antig
ens 33巻、550〜558頁、1989年）に従った。ＤＲｗ14の
ハプロタイプのＤＲβ遺伝子を持つクローンは32Ｐで標
識したＦ６ｂプローブを用いて検出した。このプローブ
は既に Abeら（Abe, A., Ito, I., Ohkubo M., Kaneko,
T., ItoK., Kato H., Kashiwagi, N., and Obata F.Im
munogenetics, 30巻 422〜426頁 1989年）によって発
表されている。また、ＤＲＢ１−14／ｂ（Tiercy, J-
M., Gorski, J., Betuel, H., Freidel, A.C., Gebuhre
r, L., Jeannet, H., andMach, B.Hum Immunol 24巻
１〜14頁 1989年）に報告されているものと本質的に同
じである。
a、F., Ito, I., Kaneko, T., Ohkubo, M., Ishimoto,
A.L., Abe, A., kashiwagi, N.らの方法（Tissue Antig
ens 33巻、550〜558頁、1989年）に従った。ＤＲｗ14の
ハプロタイプのＤＲβ遺伝子を持つクローンは32Ｐで標
識したＦ６ｂプローブを用いて検出した。このプローブ
は既に Abeら（Abe, A., Ito, I., Ohkubo M., Kaneko,
T., ItoK., Kato H., Kashiwagi, N., and Obata F.Im
munogenetics, 30巻 422〜426頁 1989年）によって発
表されている。また、ＤＲＢ１−14／ｂ（Tiercy, J-
M., Gorski, J., Betuel, H., Freidel, A.C., Gebuhre
r, L., Jeannet, H., andMach, B.Hum Immunol 24巻
１〜14頁 1989年）に報告されているものと本質的に同
じである。
【００６０】Ｆ６ｂ陽性のクローンについて Sanger,
F., Nicklen, S., Coulson, A.R. らのジデオキシチェ
インターミネーション法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA
74 巻、5463〜5467頁、1977年）によって塩基配列の決
定を行った。なお、このＦ６ｂ陽性でかつＤＲＢ１−14
ｃのＤＮＡを有する形質転換大腸菌はｐＤＲ14ｃ（38M-
103F) として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託さ
れている。そして、その寄託番号は微工研条寄第3496号
である。
F., Nicklen, S., Coulson, A.R. らのジデオキシチェ
インターミネーション法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA
74 巻、5463〜5467頁、1977年）によって塩基配列の決
定を行った。なお、このＦ６ｂ陽性でかつＤＲＢ１−14
ｃのＤＮＡを有する形質転換大腸菌はｐＤＲ14ｃ（38M-
103F) として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託さ
れている。そして、その寄託番号は微工研条寄第3496号
である。
【００６１】図１にＤＲＢ１遺伝子の第２エクソンのＤ
ＮＡ塩基配列及び対応するアミノ酸配列を示した。ＤＲ
ｗ14には、ＤＲＢ１*1401とＤＲＢ１*1402の２種が既知
である。(Bodmer,W.F., Albert, E.,Bodmer, J.G., Dau
sset, J., Kissmeyer-Nielsen, F., Mayr, W., Payne,
R., Rood, J.J.van, Trnka,Z., and Walford, R.L.Hist
ocompatibility Testing 1984 ４〜８頁 Springer-V
erlag Berlin 1984年、Tiercy, J-M., Gorski, J., Bet
uel, H., Freidel, A.C., Gebuhrer, L., Jeannet, H.,
and Mach, B.Hum Immunol 24巻 １〜14頁 1989年、G
orski, J.Hum Immunol 24巻145〜149頁 1989年、Kao,
H.T., Gregersen, P.K., Tang, J.C., Takahashi,T., W
ang, C.Y., and Silver, J. J Immunol 142 巻 1743頁
1989年）。
ＮＡ塩基配列及び対応するアミノ酸配列を示した。ＤＲ
ｗ14には、ＤＲＢ１*1401とＤＲＢ１*1402の２種が既知
である。(Bodmer,W.F., Albert, E.,Bodmer, J.G., Dau
sset, J., Kissmeyer-Nielsen, F., Mayr, W., Payne,
R., Rood, J.J.van, Trnka,Z., and Walford, R.L.Hist
ocompatibility Testing 1984 ４〜８頁 Springer-V
erlag Berlin 1984年、Tiercy, J-M., Gorski, J., Bet
uel, H., Freidel, A.C., Gebuhrer, L., Jeannet, H.,
and Mach, B.Hum Immunol 24巻 １〜14頁 1989年、G
orski, J.Hum Immunol 24巻145〜149頁 1989年、Kao,
H.T., Gregersen, P.K., Tang, J.C., Takahashi,T., W
ang, C.Y., and Silver, J. J Immunol 142 巻 1743頁
1989年）。
【００６２】これらによってそれぞれ報告されたＤＮＡ
塩基配列を合わせて引用した。波線部分は、塩基配列が
同一であることを示す。これらの塩基配列から作製した
オリゴヌクレオチドプローブを矢印で示し、右向きのオ
リゴヌクレオチドプローブはアミノ酸配列にコードされ
るＤＮＡ塩基配列に対応し、左向きのオリゴヌクレオチ
ドプローブはアミノ酸配列にコードされない配列に対応
している。
塩基配列を合わせて引用した。波線部分は、塩基配列が
同一であることを示す。これらの塩基配列から作製した
オリゴヌクレオチドプローブを矢印で示し、右向きのオ
リゴヌクレオチドプローブはアミノ酸配列にコードされ
るＤＮＡ塩基配列に対応し、左向きのオリゴヌクレオチ
ドプローブはアミノ酸配列にコードされない配列に対応
している。
【００６３】このＤＲＢ１−14ｃのＤＲβ１鎖の第１ド
メインの塩基配列から決定されるアミノ酸配列はＤＲＢ
１* 14０１のアミノ酸配列と16、57、60番目の位置で異
なっている。16番目のグルタミンはＤＲＢ１−14ｃに特
有なアミノ酸であり、他のＤＲの型では見られない。57
番目および60番目はオリゴヌクレオチドプローブＦ14３
に相当する部分であり、ＤＲＢ１* 1401とＤＲＢ１−14
ｃとを区別する箇所である。一方、ＤＲＢ１−14ｃとＤ
ＲＢ１* 1402とのアミノ酸配列は16、28、37、70、74、
および86番目の位置で異なっている。28番目の位置はＦ
52ｃに、70および74番目はＦ46に相当する部分である。
メインの塩基配列から決定されるアミノ酸配列はＤＲＢ
１* 14０１のアミノ酸配列と16、57、60番目の位置で異
なっている。16番目のグルタミンはＤＲＢ１−14ｃに特
有なアミノ酸であり、他のＤＲの型では見られない。57
番目および60番目はオリゴヌクレオチドプローブＦ14３
に相当する部分であり、ＤＲＢ１* 1401とＤＲＢ１−14
ｃとを区別する箇所である。一方、ＤＲＢ１−14ｃとＤ
ＲＢ１* 1402とのアミノ酸配列は16、28、37、70、74、
および86番目の位置で異なっている。28番目の位置はＦ
52ｃに、70および74番目はＦ46に相当する部分である。
【００６４】ＤＲ１−14ｃのＤＮＡ塩基配列を元にして
作製した各々のオリゴヌクレオチドがＤＲ抗原のＤＮＡ
タイピングに使用できることの証明 ＤＲＢ１−14ｃに特異的に交雑するオリゴヌクレオチド
プローブとしてＦ14４およびＦ14２を合成した。Ｆ14４
はＤＲＢ１−14ｃの16番目のアミノ酸の部位グルタミン
酸に相当する。Ｆ14２はＤＲＢ１* 1402、ＤＲＢ１* 13
01、ＤＲＢ１*1302、ＤＲＢ１ＪＸ６を含めた他の多く
のＤＲＢ１遺伝子に共通な57番目アスパラギン酸と60番
目のアミノ酸チロシンの部位に相当するが、ＤＲＢ１−
14ｃに特異的な塩基配列の１７４番目のチミンを含む。
作製した各々のオリゴヌクレオチドがＤＲ抗原のＤＮＡ
タイピングに使用できることの証明 ＤＲＢ１−14ｃに特異的に交雑するオリゴヌクレオチド
プローブとしてＦ14４およびＦ14２を合成した。Ｆ14４
はＤＲＢ１−14ｃの16番目のアミノ酸の部位グルタミン
酸に相当する。Ｆ14２はＤＲＢ１* 1402、ＤＲＢ１* 13
01、ＤＲＢ１*1302、ＤＲＢ１ＪＸ６を含めた他の多く
のＤＲＢ１遺伝子に共通な57番目アスパラギン酸と60番
目のアミノ酸チロシンの部位に相当するが、ＤＲＢ１−
14ｃに特異的な塩基配列の１７４番目のチミンを含む。
【００６５】図２はこれらのオリゴヌクレオチドプロー
ブによりＤＲ抗原遺伝子のＤＮＡタイピングをドットハ
イブリダイゼーション法を用いて行った結果である。縦
軸にはドナーと血清学的な方法で調べられた各々のＤＲ
抗原のタイプを示している。横軸にはオリゴヌクレオチ
ドプローブを示した。ドナーＤＮＡがオリゴヌクレオチ
ドプローブと交雑したところが黒いスポットで示され
る。
ブによりＤＲ抗原遺伝子のＤＮＡタイピングをドットハ
イブリダイゼーション法を用いて行った結果である。縦
軸にはドナーと血清学的な方法で調べられた各々のＤＲ
抗原のタイプを示している。横軸にはオリゴヌクレオチ
ドプローブを示した。ドナーＤＮＡがオリゴヌクレオチ
ドプローブと交雑したところが黒いスポットで示され
る。
【００６６】遺伝的多型性を見るための試料は日本人ド
ナーと第10回International HLA Workshop（Yang, S.
Y., Milfold, E., Hammerling, U., Dupont, B. Tenth
International Histocompatibility Work-shop Newslet
ter 、２巻、１号、７頁、1987年、New York、Central
Science Office of Histocom-patibility Workshop)に
よって提供されたＢ細胞樹立株を使用した。
ナーと第10回International HLA Workshop（Yang, S.
Y., Milfold, E., Hammerling, U., Dupont, B. Tenth
International Histocompatibility Work-shop Newslet
ter 、２巻、１号、７頁、1987年、New York、Central
Science Office of Histocom-patibility Workshop)に
よって提供されたＢ細胞樹立株を使用した。
【００６７】公知の方法に従い染色体ＤＮＡを調製し、
その１μｇをＧＨ46とＤＲβＡＭＰ１プライマーを用い
て30サイクルのＰＣＲを行った。増幅した 288bpのＤＮ
Ａ断片は 0.2Ｎの水酸化ナトリウム溶液で室温下10分処
理して変性した後、終濃度が１Ｍとなるように酢酸アン
モニウムを加え中和した。このＤＮＡ溶液を直ちにナイ
ロンメンブレンのHybond-N上にスポットし、風乾後、80
℃に２時間放置した。このナイロンメンブレンを６×SS
C 、 0.5％ SDS、５×Denhardt's solution、20μg／ml
熱変性ニシン精子ＤＮＡの溶液中に移し、37℃で30分の
前処理を行った。ただし、１×Denhardt's solution は
0.02％ウシ血清アルブミン、0.02％フィコール、0.02％
ポリビニルピロリドンからなる溶液である。前処理後、
同じ溶液に５’末端を32Ｐで標識したオリゴヌクレオチ
ドを１ｎｇ／mlとなるように加え、37℃で３時間ハイブ
リダイゼーションを行った。ナイロンメンブレンを６×
SSC、0.1％ SDS溶液に移し、室温に５分間放置する。次
にナイロンメンブレンを表１に示した洗浄液の温度で15
分間洗浄した。ナイロンメンブレンを風乾後、３時間か
ら一晩のオートラジオグラフィーを行った。
その１μｇをＧＨ46とＤＲβＡＭＰ１プライマーを用い
て30サイクルのＰＣＲを行った。増幅した 288bpのＤＮ
Ａ断片は 0.2Ｎの水酸化ナトリウム溶液で室温下10分処
理して変性した後、終濃度が１Ｍとなるように酢酸アン
モニウムを加え中和した。このＤＮＡ溶液を直ちにナイ
ロンメンブレンのHybond-N上にスポットし、風乾後、80
℃に２時間放置した。このナイロンメンブレンを６×SS
C 、 0.5％ SDS、５×Denhardt's solution、20μg／ml
熱変性ニシン精子ＤＮＡの溶液中に移し、37℃で30分の
前処理を行った。ただし、１×Denhardt's solution は
0.02％ウシ血清アルブミン、0.02％フィコール、0.02％
ポリビニルピロリドンからなる溶液である。前処理後、
同じ溶液に５’末端を32Ｐで標識したオリゴヌクレオチ
ドを１ｎｇ／mlとなるように加え、37℃で３時間ハイブ
リダイゼーションを行った。ナイロンメンブレンを６×
SSC、0.1％ SDS溶液に移し、室温に５分間放置する。次
にナイロンメンブレンを表１に示した洗浄液の温度で15
分間洗浄した。ナイロンメンブレンを風乾後、３時間か
ら一晩のオートラジオグラフィーを行った。
【００６８】ＤＲＢ１−14ｃに特異的なＦ14２、Ｆ14４
および非特異的なＦ６ｂ、Ｆ14１、Ｆ14３、Ｆ46、およ
びＦ52ｃとハイブリダイズした。その結果、図２および
表３に示すように血清学的にＤＲｗ14特異的な検体の中
の36Ｍ、38Ｍ、82Ｆ、26Ｆ、ＭＳ、ＧＯＴなどがＦ14
２、Ｆ14４、Ｆ６ｂ、Ｆ14１に交雑し、一方、他のＤＲ
Ｂ１* 1401あるいはＤＲＢ１* 1402たとえば７Ｍ、ＩＩ
Ｔ、ＫＷ、24Ｆ、59Ｍ、75Ｍ、57ＦがＦ14２およびＦ14
４とは交雑しないことが判った。したがって、ＤＲ１−
14ｃを他のＤＲｗ14関連の型から区別可能であり、ＤＲ
Ｂ１−14ｃに属することを断定できることが判った。
および非特異的なＦ６ｂ、Ｆ14１、Ｆ14３、Ｆ46、およ
びＦ52ｃとハイブリダイズした。その結果、図２および
表３に示すように血清学的にＤＲｗ14特異的な検体の中
の36Ｍ、38Ｍ、82Ｆ、26Ｆ、ＭＳ、ＧＯＴなどがＦ14
２、Ｆ14４、Ｆ６ｂ、Ｆ14１に交雑し、一方、他のＤＲ
Ｂ１* 1401あるいはＤＲＢ１* 1402たとえば７Ｍ、ＩＩ
Ｔ、ＫＷ、24Ｆ、59Ｍ、75Ｍ、57ＦがＦ14２およびＦ14
４とは交雑しないことが判った。したがって、ＤＲ１−
14ｃを他のＤＲｗ14関連の型から区別可能であり、ＤＲ
Ｂ１−14ｃに属することを断定できることが判った。
【００６９】プローブのテーリングと膜への固定 Ｆ１44を除くオリゴヌクレオチドプローブを以下のよう
に処理した。10×テーリング緩衝液（１Ｍカコジル酸ナ
トリウム（ｐＨ7.6)、 250ｍＭ Tris-HCl(ｐＨ7.6)、２
ｍＭジチオスレイトール）を10μｌ、10０ｍＭdTTPを４
μｌ、プローブを 200pmol混合し、そこへ10ｍＭ CoCl2
を10μｌ添加し、混合した。さらにそこへ25ユニット／
μｌのターミナルデオキシヌクレオチジイルトランスフ
ェラーゼを２μｌ添加し、全容量を 100μｌとした。こ
の液を３７℃にて１.５時間反応させた後、フェノール
とクロロホルムの１／１混合液 100μｌにより２回抽出
した。抽出残液に３Ｍ酢酸ナトリウム溶液を10μｌ、エ
タノールを 330μｌを添加し攪拌混合し、−20℃にて30
分放置した。その後、遠心し、得られた固形沈澱物を70
％エタノールで洗浄した。得られた固形沈澱物を減圧下
で乾燥した。
に処理した。10×テーリング緩衝液（１Ｍカコジル酸ナ
トリウム（ｐＨ7.6)、 250ｍＭ Tris-HCl(ｐＨ7.6)、２
ｍＭジチオスレイトール）を10μｌ、10０ｍＭdTTPを４
μｌ、プローブを 200pmol混合し、そこへ10ｍＭ CoCl2
を10μｌ添加し、混合した。さらにそこへ25ユニット／
μｌのターミナルデオキシヌクレオチジイルトランスフ
ェラーゼを２μｌ添加し、全容量を 100μｌとした。こ
の液を３７℃にて１.５時間反応させた後、フェノール
とクロロホルムの１／１混合液 100μｌにより２回抽出
した。抽出残液に３Ｍ酢酸ナトリウム溶液を10μｌ、エ
タノールを 330μｌを添加し攪拌混合し、−20℃にて30
分放置した。その後、遠心し、得られた固形沈澱物を70
％エタノールで洗浄した。得られた固形沈澱物を減圧下
で乾燥した。
【００７０】このようにして得られた固形物を水50μｌ
に溶解し、内42μｌの溶液を65℃にて５分加熱し、直ち
に氷中で冷却した。この溶液に1158μｌの10×SSC 溶液
を加え、攪拌した。この溶液を 200μｌづつミリポア製
MilliBlot−Ｄを使用してナイロン膜にブロットした。
さらにMilliBlot −Ｄのウエルを10×SSC 溶液で洗浄
し、ストラリンカーを使用し、紫外線を120000マイクロ
ジュール照射した。
に溶解し、内42μｌの溶液を65℃にて５分加熱し、直ち
に氷中で冷却した。この溶液に1158μｌの10×SSC 溶液
を加え、攪拌した。この溶液を 200μｌづつミリポア製
MilliBlot−Ｄを使用してナイロン膜にブロットした。
さらにMilliBlot −Ｄのウエルを10×SSC 溶液で洗浄
し、ストラリンカーを使用し、紫外線を120000マイクロ
ジュール照射した。
【００７１】得られた膜を５×SSC、0.5％ SDSからなる
溶液中、37℃で15分間洗浄した。その後、水中で５分間
洗浄した。このようにして得た膜を室温下で風乾した。ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）によるビ
オチン化 10×ＰＣＲ緩衝液（200ｍＭ Tris・HCl、15ｍＭ MgCl 、
250ｍＭ KCl、0.5％ Tween 20、100μｇ／ml BSA) を５
μｌ、2.5ｍＭ dATP、2.5ｍＭ dCTP、2.5ｍＭdGTPを各
々１μｌ、1.5ｍＭ dTTPを１μｌ、0.5ｍＭ Bio-21-dUT
Pを 1.25μｌ、10μＭプライマー液（ＦＰＲ１プライマ
ーとＤＲβＡＭＰ１プライマーの等量混合溶液）を１μ
ｌ、ＤＮＡを１μｇ、さらに水を混合し全容量を49μｌ
とした。この液を混合し、95℃にて５分間加熱し、室温
に放置冷却した。この液に 2.5ユニット／μｌのTaq.Ｄ
ＮＡ ポリメラーゼ溶液１μｌを加え攪拌した後、40μ
ｌのミネラルオイルを重層した。この液をＡＳＴＥＣ製
PC-500を使用し、ＰＣＲを30回行った。
溶液中、37℃で15分間洗浄した。その後、水中で５分間
洗浄した。このようにして得た膜を室温下で風乾した。ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）によるビ
オチン化 10×ＰＣＲ緩衝液（200ｍＭ Tris・HCl、15ｍＭ MgCl 、
250ｍＭ KCl、0.5％ Tween 20、100μｇ／ml BSA) を５
μｌ、2.5ｍＭ dATP、2.5ｍＭ dCTP、2.5ｍＭdGTPを各
々１μｌ、1.5ｍＭ dTTPを１μｌ、0.5ｍＭ Bio-21-dUT
Pを 1.25μｌ、10μＭプライマー液（ＦＰＲ１プライマ
ーとＤＲβＡＭＰ１プライマーの等量混合溶液）を１μ
ｌ、ＤＮＡを１μｇ、さらに水を混合し全容量を49μｌ
とした。この液を混合し、95℃にて５分間加熱し、室温
に放置冷却した。この液に 2.5ユニット／μｌのTaq.Ｄ
ＮＡ ポリメラーゼ溶液１μｌを加え攪拌した後、40μ
ｌのミネラルオイルを重層した。この液をＡＳＴＥＣ製
PC-500を使用し、ＰＣＲを30回行った。
【００７２】ＰＣＲにおける最初の反応は55℃で２分
間、72℃で３分間の条件で、２回目以降29回までは94℃
で50秒、55℃で１分間、72℃で２分間の条件で、30回目
は72℃３分間の条件で行った。反応液を50μｌとり、そ
こへグリコーゲン（10ｍｇ／μｌ）１μｌ、３Ｍ酢酸ナ
トリウム(pＨ5.5)を５μｌ、エタノールを 165μｌ混合
し、攪拌した後−20℃で30分間冷却した。冷却後５分間
12000 rpm の条件で遠心し、固形沈澱物を得た。得た沈
澱物に70％エタノールを加え、固形沈澱物を洗浄しその
後、減圧下にて乾燥した。得られた固形物を 108μｌの
水に溶解し、ＤＮＡ0.01μｇ／μｌの溶液を調製した。
ＰＣＲによる生成ＤＮＡの長さはＤＮＡ溶液８μｌを
1.0％アガロースゲルにかけて確認した。ハイブリダイゼーション プローブを固定した膜をハイブリダイゼーション用プラ
スチックバッグに入れ、そこへ２mlのハイブリダイゼー
ション緩衝液（50ｍＭ Tris・HCl (pＨ8.0)、３Ｍテトラ
メチルアンモニウムクロライド、２ｍＭ EDTA (pＨ8.
0)、５×Denhardt's溶液、0.1％ SDS、100μｇ変性ＤＮ
Ａ）２mlを加え、42℃で50分間加熱した。その後、プロ
ーブを100ng (100μｌ）添加し、42℃で振盪しながら12
時間加熱を続けた。
間、72℃で３分間の条件で、２回目以降29回までは94℃
で50秒、55℃で１分間、72℃で２分間の条件で、30回目
は72℃３分間の条件で行った。反応液を50μｌとり、そ
こへグリコーゲン（10ｍｇ／μｌ）１μｌ、３Ｍ酢酸ナ
トリウム(pＨ5.5)を５μｌ、エタノールを 165μｌ混合
し、攪拌した後−20℃で30分間冷却した。冷却後５分間
12000 rpm の条件で遠心し、固形沈澱物を得た。得た沈
澱物に70％エタノールを加え、固形沈澱物を洗浄しその
後、減圧下にて乾燥した。得られた固形物を 108μｌの
水に溶解し、ＤＮＡ0.01μｇ／μｌの溶液を調製した。
ＰＣＲによる生成ＤＮＡの長さはＤＮＡ溶液８μｌを
1.0％アガロースゲルにかけて確認した。ハイブリダイゼーション プローブを固定した膜をハイブリダイゼーション用プラ
スチックバッグに入れ、そこへ２mlのハイブリダイゼー
ション緩衝液（50ｍＭ Tris・HCl (pＨ8.0)、３Ｍテトラ
メチルアンモニウムクロライド、２ｍＭ EDTA (pＨ8.
0)、５×Denhardt's溶液、0.1％ SDS、100μｇ変性ＤＮ
Ａ）２mlを加え、42℃で50分間加熱した。その後、プロ
ーブを100ng (100μｌ）添加し、42℃で振盪しながら12
時間加熱を続けた。
【００７３】ハイブリダイゼーション緩衝液を捨て、バ
ッグから膜を取り出し、洗浄液Ｉ（２×SSPE、 0.1％SD
S)中室温下、５分間の間隔で２回洗浄した。次に膜を洗
浄液II（50ｍＭ Tris・HCl（ｐＨ8.0)、３Ｍテトラメチ
ルアンモニウムクロライド、２ｍＭEDTA、５×Denhard
t's溶液、 0.1％ SDS) 中室温下、５分間１回洗浄し、
さらに洗浄液II中58℃で20分間１回洗浄し、引続き２×
SSC 溶液中室温下で５分間１回洗浄した。
ッグから膜を取り出し、洗浄液Ｉ（２×SSPE、 0.1％SD
S)中室温下、５分間の間隔で２回洗浄した。次に膜を洗
浄液II（50ｍＭ Tris・HCl（ｐＨ8.0)、３Ｍテトラメチ
ルアンモニウムクロライド、２ｍＭEDTA、５×Denhard
t's溶液、 0.1％ SDS) 中室温下、５分間１回洗浄し、
さらに洗浄液II中58℃で20分間１回洗浄し、引続き２×
SSC 溶液中室温下で５分間１回洗浄した。
【００７４】検 出 （ＢＲＬ社のPhotoGeneTM Nucleic Acid Detection Sys
tem (BR) 社、Life Technologies 社を使用）ハイブリ
ダイゼーションおよび洗浄後の膜をTBS-Tween 20 (100
ｍＭ Tris・HCl、150ｍＭ NaCl、0.05％ Tween20）中で
室温下１分間洗浄した。続いて、膜１cm 2当り0.75mlの
ブロッキング溶液（３％ BSA、TBS-Tween20)中で室温下
50分間処理した。
tem (BR) 社、Life Technologies 社を使用）ハイブリ
ダイゼーションおよび洗浄後の膜をTBS-Tween 20 (100
ｍＭ Tris・HCl、150ｍＭ NaCl、0.05％ Tween20）中で
室温下１分間洗浄した。続いて、膜１cm 2当り0.75mlの
ブロッキング溶液（３％ BSA、TBS-Tween20)中で室温下
50分間処理した。
【００７５】ストレプトアビジン−アルカリフォスファ
ターゼ結合体の溶液を TBS-Tween20を用いて3000倍に希
釈した液中で膜を室温下10分間処理した。その後、膜１
cm2あたり１mlの TBS-Tween20溶液中室温下15分間づつ
２回洗浄した。さらに最終緩衝液の10倍希釈液中、室温
下１時間洗浄した。膜をワットマン３ＭＭ濾紙上に置き
過剰の緩衝液を除いた後、膜を現像ホルダー中に置い
た。そこへ、ホルダー中の膜に検出試薬を滴下し、膜を
ホルダーで覆った。そのまま２時間反応させ、Ｘ線フイ
ルムあるいはHyper Film（アマシャム社）を挟み、１５
分間露光させ、現像し、図２と同様の結果を得た。
ターゼ結合体の溶液を TBS-Tween20を用いて3000倍に希
釈した液中で膜を室温下10分間処理した。その後、膜１
cm2あたり１mlの TBS-Tween20溶液中室温下15分間づつ
２回洗浄した。さらに最終緩衝液の10倍希釈液中、室温
下１時間洗浄した。膜をワットマン３ＭＭ濾紙上に置き
過剰の緩衝液を除いた後、膜を現像ホルダー中に置い
た。そこへ、ホルダー中の膜に検出試薬を滴下し、膜を
ホルダーで覆った。そのまま２時間反応させ、Ｘ線フイ
ルムあるいはHyper Film（アマシャム社）を挟み、１５
分間露光させ、現像し、図２と同様の結果を得た。
【図１】 ＤＲＢ１−14ｃ遺伝子の第２エクソンのＤＮ
Ａ塩基配列及び対応するアミノ酸配列を示す。
Ａ塩基配列及び対応するアミノ酸配列を示す。
【図２】 オリゴヌクレオチドプローブでＤＲ抗原遺伝
子のＤＮＡタイピングを行った結果を示す。
子のＤＮＡタイピングを行った結果を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年３月４日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３】
【図１】
【図２】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＤＲＢ１−14ｃ遺伝子の第２エクソンのＤＮ
Ａ塩基配列及び対応するアミノ酸配列を示す。
Ａ塩基配列及び対応するアミノ酸配列を示す。
【図２】 ＤＲＢ１−14ｃ遺伝子の第２エクソンのＤＮ
Ａ塩基配列及び対応するアミノ酸配列を示す（図１のつ
づき）。
Ａ塩基配列及び対応するアミノ酸配列を示す（図１のつ
づき）。
【図３】 オリゴヌクレオチドプローブでＤＲ抗原遺伝
子のＤＮＡタイピングを行った結果を示す。 ─────────────────────────────────────────────────────
子のＤＮＡタイピングを行った結果を示す。 ─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年３月１８日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００９】そこで、このような考え方に従って、ＤＲ
ｗ14のＤＮＡ塩基配列の決定を行うべく種々の研究を行
った。その結果、ＤＲｗ14は既知の２つのサブタイプに
加え、更に新規な１つのサブタイプに分かれることが明
らかとなり、本発明者らはこのサブタイプをＤＲｗ14ｃ
と命名した〔なお、ＤＲｗ14ｃはＤＲ遺伝子の命名法(B
odmer JG, Marsh SGE, Parham P. et al., "Nomenclatu
re for factors of the HLA system, 1989" Tissue Ant
igens 35巻、１〜８頁、1990）によるとＤＲＢ１−14ｃ
と称せられるので、以下、ＤＲｗ14ｃはＤＲＢ１−14ｃ
と言う〕。そしてこれらの遺伝子ＤＮＡを調製するとと
もにその塩基配列を決定し、さらに決定された塩基配列
を元にしてこのＤＲ抗原遺伝子に特異的なオリゴヌクレ
オチドプローブを作製した。これらのプローブでＤＮＡ
タイピングを行ったところ他のＤＲ抗原遺伝子とＤＲＢ
１−14ｃの遺伝子ＤＮＡを容易に判別することができる
ことを見い出し、本発明を完成するに至った。
ｗ14のＤＮＡ塩基配列の決定を行うべく種々の研究を行
った。その結果、ＤＲｗ14は既知の２つのサブタイプに
加え、更に新規な１つのサブタイプに分かれることが明
らかとなり、本発明者らはこのサブタイプをＤＲｗ14ｃ
と命名した〔なお、ＤＲｗ14ｃはＤＲ遺伝子の命名法(B
odmer JG, Marsh SGE, Parham P. et al., "Nomenclatu
re for factors of the HLA system, 1989" Tissue Ant
igens 35巻、１〜８頁、1990）によるとＤＲＢ１−14ｃ
と称せられるので、以下、ＤＲｗ14ｃはＤＲＢ１−14ｃ
と言う〕。そしてこれらの遺伝子ＤＮＡを調製するとと
もにその塩基配列を決定し、さらに決定された塩基配列
を元にしてこのＤＲ抗原遺伝子に特異的なオリゴヌクレ
オチドプローブを作製した。これらのプローブでＤＮＡ
タイピングを行ったところ他のＤＲ抗原遺伝子とＤＲＢ
１−14ｃの遺伝子ＤＮＡを容易に判別することができる
ことを見い出し、本発明を完成するに至った。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１０】すなわち本発明は、配列番号１記載のアミ
ノ酸配列をコードするＤＲＢ１−14ｃの遺伝子ＤＮＡに
ある。また本発明は、配列番号２記載の塩基配列を有す
るＤＲＢ１−14ｃのＤＮＡにある。また本発明は、配列
番号１又は配列番号２で表わされるＤＲＢ１−14ｃのＤ
ＮＡ塩基配列であることを特徴とするヒト白血球抗原の
ＤＲタイピング用のＤＮＡプローブにある。
ノ酸配列をコードするＤＲＢ１−14ｃの遺伝子ＤＮＡに
ある。また本発明は、配列番号２記載の塩基配列を有す
るＤＲＢ１−14ｃのＤＮＡにある。また本発明は、配列
番号１又は配列番号２で表わされるＤＲＢ１−14ｃのＤ
ＮＡ塩基配列であることを特徴とするヒト白血球抗原の
ＤＲタイピング用のＤＮＡプローブにある。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１１】また本発明は、配列番号１又は配列番号２
で表わされるＤＲＢ１−14ｃのＤＮＡ塩基配列に相補な
配列であることを特徴とするヒト白血球抗原のＤＲタイ
ピング用のＤＮＡプローブにある。また本発明は、配列
番号１又は配列番号２で表わされるＤＲＢ１−14ｃのＤ
ＮＡ配列の内、少なくとも連続した10塩基の塩基配列を
含むオリゴヌクレオチドであることを特徴とするヒト白
血球抗原のＤＲタイピング用のＤＮＡプローブにある。
で表わされるＤＲＢ１−14ｃのＤＮＡ塩基配列に相補な
配列であることを特徴とするヒト白血球抗原のＤＲタイ
ピング用のＤＮＡプローブにある。また本発明は、配列
番号１又は配列番号２で表わされるＤＲＢ１−14ｃのＤ
ＮＡ配列の内、少なくとも連続した10塩基の塩基配列を
含むオリゴヌクレオチドであることを特徴とするヒト白
血球抗原のＤＲタイピング用のＤＮＡプローブにある。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１２】また本発明は、配列番号１又は配列番号２
で表わされるＤＲＢ１−14ｃのＤＮＡ配列に相補なＤＮ
Ａ配列の内、少なくとも連続した10塩基の塩基配列を含
むオリゴヌクレオチドであることを特徴とするヒト白血
球抗原のＤＲタイピング用のＤＮＡプローブにある。ま
た本発明は、前記オリゴヌクレオチドがＤＲＢ１−14ｃ
以外の染色体遺伝子、あるいは相補ＤＮＡのＤＮＡ配列
に交雑しないことを特徴とする前記のＤＮＡプローブに
ある。
で表わされるＤＲＢ１−14ｃのＤＮＡ配列に相補なＤＮ
Ａ配列の内、少なくとも連続した10塩基の塩基配列を含
むオリゴヌクレオチドであることを特徴とするヒト白血
球抗原のＤＲタイピング用のＤＮＡプローブにある。ま
た本発明は、前記オリゴヌクレオチドがＤＲＢ１−14ｃ
以外の染色体遺伝子、あるいは相補ＤＮＡのＤＮＡ配列
に交雑しないことを特徴とする前記のＤＮＡプローブに
ある。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１３】また本発明は、前記オリゴヌクレオチドの
ＤＮＡ塩基配列が配列番号３である前記のＤＮＡプロー
ブにある。また本発明は、前記オリゴヌクレオチドのＤ
ＮＡ塩基配列が配列番号４である前記のＤＮＡプローブ
にある。なお、上記塩基配列はＤＲＢ１−14ｃの塩基配
列と相補の塩基配列である。
ＤＮＡ塩基配列が配列番号３である前記のＤＮＡプロー
ブにある。また本発明は、前記オリゴヌクレオチドのＤ
ＮＡ塩基配列が配列番号４である前記のＤＮＡプローブ
にある。なお、上記塩基配列はＤＲＢ１−14ｃの塩基配
列と相補の塩基配列である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１５】また本発明は、配列番号１記載のアミノ酸
配列をコードする塩基配列又は配列番号２記載のＤＲＢ
１−14ｃの塩基配列の全部あるいは部分領域を下記の方
法で増幅するＤＲＢ１−14ｃの塩基配列の増幅方法であ
る。 (1) Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ存在下にオリゴヌクレ
オチドプライマーと加熱処理によってデネイチャーした
ＤＲＢ１−14ｃのＤＲ型を有するヒトの末梢血から採取
した染色体ＤＮＡをアニールし、(2) アニールしたＤＮ
Ａを加熱処理してプライマーイクステンションさせ、
(3) (1)および(2)のステップを繰り返す。
配列をコードする塩基配列又は配列番号２記載のＤＲＢ
１−14ｃの塩基配列の全部あるいは部分領域を下記の方
法で増幅するＤＲＢ１−14ｃの塩基配列の増幅方法であ
る。 (1) Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ存在下にオリゴヌクレ
オチドプライマーと加熱処理によってデネイチャーした
ＤＲＢ１−14ｃのＤＲ型を有するヒトの末梢血から採取
した染色体ＤＮＡをアニールし、(2) アニールしたＤＮ
Ａを加熱処理してプライマーイクステンションさせ、
(3) (1)および(2)のステップを繰り返す。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１７】また本発明は、前記オリゴヌクレオチドの
ＤＮＡ配列が配列番号５、配列番号６および配列番号７
の中から選ばれたものである前記プライマーにある。
ＤＮＡ配列が配列番号５、配列番号６および配列番号７
の中から選ばれたものである前記プライマーにある。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２４】また本発明は、前記ＤＮＡプローブを用い
ることを特徴とするヒト白血球抗原のタイピング方法に
ある。次に本発明に係る新規なＤＮＡ塩基配列およびそ
の用途およびタイピング方法について具体的に説明す
る。まず本発明に係る新規なＤＮＡ塩基配列、すなわち
ＤＲＢ１−14ｃの塩基配列について説明する。本発明に
係るＤＲＢ１−14ｃの塩基配列及び対応するアミノ酸配
列を図１及び図２に示す。
ることを特徴とするヒト白血球抗原のタイピング方法に
ある。次に本発明に係る新規なＤＮＡ塩基配列およびそ
の用途およびタイピング方法について具体的に説明す
る。まず本発明に係る新規なＤＮＡ塩基配列、すなわち
ＤＲＢ１−14ｃの塩基配列について説明する。本発明に
係るＤＲＢ１−14ｃの塩基配列及び対応するアミノ酸配
列を図１及び図２に示す。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２５】なお、図１及び図２において、オリゴヌク
レオチドプローブの位置は塩基配列下部に記した矢印部
分に相当する。そして、オリゴヌクレオチドプローブの
位置を示す矢印の向きは5'→3'に相当し、右向きの矢印
は記載の塩基配列であり、左向きの矢印は記載の塩基配
列と相補の塩基配列となる。本発明に係るＤＲＢ１−14
ｃの塩基配列は以下のようにして得た。
レオチドプローブの位置は塩基配列下部に記した矢印部
分に相当する。そして、オリゴヌクレオチドプローブの
位置を示す矢印の向きは5'→3'に相当し、右向きの矢印
は記載の塩基配列であり、左向きの矢印は記載の塩基配
列と相補の塩基配列となる。本発明に係るＤＲＢ１−14
ｃの塩基配列は以下のようにして得た。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２８】これらのプライマー及びプローブ塩基配列
は、ＦＰＲ１は配列番号５ (Obata,F.,Ito, I., Kanek
o, T., Ohkubo, M., Ishimoto, A. L., Abe, A., and K
ashiwagi, N. Tissue Antigens 33巻 550〜558頁 19
89年）に、ＤＲβＡＭＰ１は配列番号６（Todd, J.A.,
Bell, J.I., and McDevitt, H.O.Nature 329巻 599〜60
4頁 1987年）に、ＧＨ46は配列番号７（Scharf, S.J.,
Long, C.M., and Erlich, H.A. Hum Immunol 22巻 6
1〜69頁 1988年）に記載された通りである。オリゴヌ
クレオチドプライマーＧＨ46−ＤＲβＡＭＰ１の組み合
せによればＤＲＢ遺伝子の第２エクソン部の殆ど全ての
領域 (288bp)を、ＦＰＲ１−ＤＲβＡＭＰ１の組み合せ
によればＤＲＢ遺伝子の第２エクソン部の第２および第
３の超可変領域(238bp) を増幅することができる（Obat
a, F., Abe, A., Ohkubo, M.,Ito, I., Kaneko, T., Ot
ani, F., Watanabe, K., and Kashiwagi, N.ら Hum Imm
unol 27巻 269〜284頁 1990年）。
は、ＦＰＲ１は配列番号５ (Obata,F.,Ito, I., Kanek
o, T., Ohkubo, M., Ishimoto, A. L., Abe, A., and K
ashiwagi, N. Tissue Antigens 33巻 550〜558頁 19
89年）に、ＤＲβＡＭＰ１は配列番号６（Todd, J.A.,
Bell, J.I., and McDevitt, H.O.Nature 329巻 599〜60
4頁 1987年）に、ＧＨ46は配列番号７（Scharf, S.J.,
Long, C.M., and Erlich, H.A. Hum Immunol 22巻 6
1〜69頁 1988年）に記載された通りである。オリゴヌ
クレオチドプライマーＧＨ46−ＤＲβＡＭＰ１の組み合
せによればＤＲＢ遺伝子の第２エクソン部の殆ど全ての
領域 (288bp)を、ＦＰＲ１−ＤＲβＡＭＰ１の組み合せ
によればＤＲＢ遺伝子の第２エクソン部の第２および第
３の超可変領域(238bp) を増幅することができる（Obat
a, F., Abe, A., Ohkubo, M.,Ito, I., Kaneko, T., Ot
ani, F., Watanabe, K., and Kashiwagi, N.ら Hum Imm
unol 27巻 269〜284頁 1990年）。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３０】ＨＬＡ−ＤＲｗ14関連のタイピング用には
既知のＤＲＢ１* 1401（ＤＲｗ14−Ｄｗ９）とＤＲＢ１
* 1042（ＤＲｗ14−Ｄｗ16）（Tiercy, J-M., Gorski,
J.,Betuel, H., Freidel, A.C., Gebu-hrer, L., Jeann
et, H., and Mach, B. ら Hum Immunol 24巻 １〜14
頁 1989年、Gorski, J. Hum Immunol 24巻 145〜149
頁 1989年、Kao, H.T., Gregersen, P.K., Tang, J.
C., Takahashi,T., Wang, C.Y., and Silver, J.らJ Im
munol 142巻 1743頁 1989年）の塩基配列に基づいて
オリゴヌクレオチドプローブを合成した。これらのオリ
ゴヌクレオチドプローブの塩基配列は、Ｆ143 は配列番
号８（Tiercy, J.-M.,Gorski, J., Betuel, H., Freide
l A.C., Gebuhrer L., Jeannet M., and Mach, B., Hum
Immunol 24巻 1〜14頁 1989年) に、Ｆ６ｂは配列番号
９（Abe, A., Ito,I., Ohkubo M.,Kaneko, T., Ito K.,
Kato H., Kashiwagi, N., and Obata F.ら Immunogene
tics, 30巻 422〜426頁 1989年）に、Ｆ46は配列番
号10（Scharf, S.J., Friedman, A., Brautbar, C., Sz
afer, F., Steiman, L., Horn, G., Gyllensten, U.,an
d Erlich, H.A., Proc Natl Acad Sci USA, 85巻 3504
〜3508頁、1988年）に、Ｆ141 は配列番号11に、Ｆ52ｃ
は配列番号12（Tiercy, J.-M., Gorski, J., Jeannet,
M., and Mach, B., Proc Natl Acad Sci USA, 85巻 198
〜202頁、1988年）に記載された通りである。Ｆ６ｂ、
Ｆ141、Ｆ143はＤＲＢ１（ＤＲＢ１* 1401）の塩基配列
に相補であり、Ｆ46、Ｆ52ｃはＤＲＢ１（ＤＲＢ１* 14
02）の塩基配列に相補である。また、これらのオリゴヌ
クレオチドプローブのいくつかはＤＲＢ１* 1401および
ＤＲＢ１* 1402以外のＤＲＢ１とＤＲＢ３の塩基配列に
も相補である。（表１) これらの関係を表１に示す。
既知のＤＲＢ１* 1401（ＤＲｗ14−Ｄｗ９）とＤＲＢ１
* 1042（ＤＲｗ14−Ｄｗ16）（Tiercy, J-M., Gorski,
J.,Betuel, H., Freidel, A.C., Gebu-hrer, L., Jeann
et, H., and Mach, B. ら Hum Immunol 24巻 １〜14
頁 1989年、Gorski, J. Hum Immunol 24巻 145〜149
頁 1989年、Kao, H.T., Gregersen, P.K., Tang, J.
C., Takahashi,T., Wang, C.Y., and Silver, J.らJ Im
munol 142巻 1743頁 1989年）の塩基配列に基づいて
オリゴヌクレオチドプローブを合成した。これらのオリ
ゴヌクレオチドプローブの塩基配列は、Ｆ143 は配列番
号８（Tiercy, J.-M.,Gorski, J., Betuel, H., Freide
l A.C., Gebuhrer L., Jeannet M., and Mach, B., Hum
Immunol 24巻 1〜14頁 1989年) に、Ｆ６ｂは配列番号
９（Abe, A., Ito,I., Ohkubo M.,Kaneko, T., Ito K.,
Kato H., Kashiwagi, N., and Obata F.ら Immunogene
tics, 30巻 422〜426頁 1989年）に、Ｆ46は配列番
号10（Scharf, S.J., Friedman, A., Brautbar, C., Sz
afer, F., Steiman, L., Horn, G., Gyllensten, U.,an
d Erlich, H.A., Proc Natl Acad Sci USA, 85巻 3504
〜3508頁、1988年）に、Ｆ141 は配列番号11に、Ｆ52ｃ
は配列番号12（Tiercy, J.-M., Gorski, J., Jeannet,
M., and Mach, B., Proc Natl Acad Sci USA, 85巻 198
〜202頁、1988年）に記載された通りである。Ｆ６ｂ、
Ｆ141、Ｆ143はＤＲＢ１（ＤＲＢ１* 1401）の塩基配列
に相補であり、Ｆ46、Ｆ52ｃはＤＲＢ１（ＤＲＢ１* 14
02）の塩基配列に相補である。また、これらのオリゴヌ
クレオチドプローブのいくつかはＤＲＢ１* 1401および
ＤＲＢ１* 1402以外のＤＲＢ１とＤＲＢ３の塩基配列に
も相補である。（表１) これらの関係を表１に示す。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３７】これらの結果は、ＤＲｗ14関連の型には既
知のＤＲＢ１* 1401、ＤＲＢ１* 1402の２種の他に第３
番目の型があることを示唆する。この３番目の型をＤＲ
Ｂ１−14ｃと命名する。ＤＲＢ１−14ｃ塩基配列の決定 染色体ＤＮＡを36Ｍ（ＤＲｗ14／ｗ15）と38Ｍ（ＤＲｗ
14／４）の二人の日本人から分離し、プライマーにＧＨ
４６とＤＲβＡＭＰ１を用いて30回のポリメラーゼチェ
インリアクション（ＰＣＲ）を行った。このように増幅
したＤＲＢ遺伝子の第２エクソンの殆ど全ての領域を含
む 288bpのＤＮＡ断片を、ＧＨ46内にあるBamHＩ部位で
切断し、アガロースゲル電気泳動法により精製した。次
に、この断片を Bluescript Vector (Stratagene、San
Diego)のBamHＩ−EcoRＶ部位に挿入した。このようにし
て得たプラスミドを大腸菌ＪＭ10９にトランスフェクト
し、32ＰでラベルしたＦ６ｂのオリゴヌクレオチドプロ
ーブを用いたコロニーハイブリダイゼーションによりＤ
ＲＢ１−14ｃのＤＲＢ１第２エクソン部の遺伝子を含む
クローンを取り出した。塩基配列のデータの信頼性を最
大にするために、２つのサンプルからオリゴヌクレオチ
ドプローブＦ６ｂに交雑する各々３つのクローンを取
り、さらにＤＮＡの両鎖についてジデオキシ法により塩
基配列を調べた。その結果、36Ｍおよび38Ｍから得られ
た各々の３種のクローンは同一であった。
知のＤＲＢ１* 1401、ＤＲＢ１* 1402の２種の他に第３
番目の型があることを示唆する。この３番目の型をＤＲ
Ｂ１−14ｃと命名する。ＤＲＢ１−14ｃ塩基配列の決定 染色体ＤＮＡを36Ｍ（ＤＲｗ14／ｗ15）と38Ｍ（ＤＲｗ
14／４）の二人の日本人から分離し、プライマーにＧＨ
４６とＤＲβＡＭＰ１を用いて30回のポリメラーゼチェ
インリアクション（ＰＣＲ）を行った。このように増幅
したＤＲＢ遺伝子の第２エクソンの殆ど全ての領域を含
む 288bpのＤＮＡ断片を、ＧＨ46内にあるBamHＩ部位で
切断し、アガロースゲル電気泳動法により精製した。次
に、この断片を Bluescript Vector (Stratagene、San
Diego)のBamHＩ−EcoRＶ部位に挿入した。このようにし
て得たプラスミドを大腸菌ＪＭ10９にトランスフェクト
し、32ＰでラベルしたＦ６ｂのオリゴヌクレオチドプロ
ーブを用いたコロニーハイブリダイゼーションによりＤ
ＲＢ１−14ｃのＤＲＢ１第２エクソン部の遺伝子を含む
クローンを取り出した。塩基配列のデータの信頼性を最
大にするために、２つのサンプルからオリゴヌクレオチ
ドプローブＦ６ｂに交雑する各々３つのクローンを取
り、さらにＤＮＡの両鎖についてジデオキシ法により塩
基配列を調べた。その結果、36Ｍおよび38Ｍから得られ
た各々の３種のクローンは同一であった。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４５】また、本発明に用いられる上記の核酸は必
要に応じてＰＣＲに掛けて、増幅して使用してもよく、
この場合には検体量が増加するので検出が容易になると
の利点がある。ＰＣＲ用のプライマーには上記のプロー
ブに使用するオリゴヌクレオチドとは別の塩基配列のオ
リゴヌクレオチドを使用しても、また上記のプローブオ
リゴヌクレオチドを使用してもよいが、一般には別の塩
基配列のオリゴヌクレオチドを使用する。
要に応じてＰＣＲに掛けて、増幅して使用してもよく、
この場合には検体量が増加するので検出が容易になると
の利点がある。ＰＣＲ用のプライマーには上記のプロー
ブに使用するオリゴヌクレオチドとは別の塩基配列のオ
リゴヌクレオチドを使用しても、また上記のプローブオ
リゴヌクレオチドを使用してもよいが、一般には別の塩
基配列のオリゴヌクレオチドを使用する。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４６】更に、１種類あるいは複数以上の制限酵素
により消化し、さらにそれをゲル電気泳動法により分別
し、そこで得られる遺伝子断片を検出対象とするいわゆ
るＲＦＬＰ法によるタイピングに対しても本発明のオリ
ゴヌクレオチドを使用することができる。オリゴヌクレオチドプローブの使用形態 オリゴヌクレオチドプローブは該プローブが化学的に結
合し固定されるか、あるいは物理的に吸着し固定される
かのいづれかの形態、あるいは溶液中において溶解ある
いは懸濁した状態で使用することが可能であり、これら
のいづれの形態をとってもよい。ハイブリダイゼーショ
ン時には一般には大過剰量のオリゴヌクレオチドプロー
ブを使用するため、溶液中に溶解した状態あるいは懸濁
状態でハイブリダイゼーションする場合には未交雑のオ
リゴヌクレオチドを除去し検知しなければならないの
で、検体となる遺伝子あるいは遺伝子の断片を核酸固定
用の膜に予め固定しておき、該膜を使用してハイブリダ
イゼーションさせる方法、あるいは該オリゴヌクレオチ
ドプローブに加え、検体中の該オリゴヌクレオチドプロ
ーブに相当するＤＮＡ塩基配列以外の部分の塩基配列に
相当する少なくとももう１種類のオリゴヌクレオチドプ
ローブを用い、このプローブを核酸固定用の膜に固定し
ておき、ハイブリダイゼーションを行う方法、オリゴヌ
クレオチドの３’末端あるいは５’末端に特定の配列を
連結しておき、この塩基配列に相補な配列を予め膜に固
定しておきハイブリダイゼーションを行う方法などが採
用される。
により消化し、さらにそれをゲル電気泳動法により分別
し、そこで得られる遺伝子断片を検出対象とするいわゆ
るＲＦＬＰ法によるタイピングに対しても本発明のオリ
ゴヌクレオチドを使用することができる。オリゴヌクレオチドプローブの使用形態 オリゴヌクレオチドプローブは該プローブが化学的に結
合し固定されるか、あるいは物理的に吸着し固定される
かのいづれかの形態、あるいは溶液中において溶解ある
いは懸濁した状態で使用することが可能であり、これら
のいづれの形態をとってもよい。ハイブリダイゼーショ
ン時には一般には大過剰量のオリゴヌクレオチドプロー
ブを使用するため、溶液中に溶解した状態あるいは懸濁
状態でハイブリダイゼーションする場合には未交雑のオ
リゴヌクレオチドを除去し検知しなければならないの
で、検体となる遺伝子あるいは遺伝子の断片を核酸固定
用の膜に予め固定しておき、該膜を使用してハイブリダ
イゼーションさせる方法、あるいは該オリゴヌクレオチ
ドプローブに加え、検体中の該オリゴヌクレオチドプロ
ーブに相当するＤＮＡ塩基配列以外の部分の塩基配列に
相当する少なくとももう１種類のオリゴヌクレオチドプ
ローブを用い、このプローブを核酸固定用の膜に固定し
ておき、ハイブリダイゼーションを行う方法、オリゴヌ
クレオチドの３’末端あるいは５’末端に特定の配列を
連結しておき、この塩基配列に相補な配列を予め膜に固
定しておきハイブリダイゼーションを行う方法などが採
用される。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４７】オリゴヌクレオチドプローブあるいは検体
遺伝子を固定する場合に使用される物としては核酸が固
定される物であれば特に制限は加えられないが、その形
態としては膜上、板上、棒状の物が使用される。これら
の中では膜が好ましく使用される。ここで使用される膜
としては、セルロースを成分にする膜、ナイロン膜など
の市販の核酸固定用膜をあげることができる。HybondTM
-C、HybondTM-C extra、HybondTM-ECL、HybondTM-N、Hy
bond-NTM+（Amersham社）、Whatman541filter(Whatman
社）、DuralonTMUV 、Duralose-UVTM(Stratagene社）、
PhotoGene Nylon Membrane(BRL社）などを具体例として
挙げることができるが、これら以外を使用しても遺伝子
あるいはオリゴヌクレオチドプローブを結合させ得るも
のであれば差し支えない。これらの膜に遺伝子あるいは
オリゴヌクレオチドプローブを固定する際には加熱処
理、あるいはＵＶ照射処理などの方法によるが、このい
づれかあるいは別の方法によるかについては、使用する
膜の性質によって適宜変更することになる。例えば、Hy
bondTM-N+を使用する場合にはＵＶ照射法により固定
し、HybondTM-C extraを使用する場合には真空中80℃に
加熱する方法が採用される。
遺伝子を固定する場合に使用される物としては核酸が固
定される物であれば特に制限は加えられないが、その形
態としては膜上、板上、棒状の物が使用される。これら
の中では膜が好ましく使用される。ここで使用される膜
としては、セルロースを成分にする膜、ナイロン膜など
の市販の核酸固定用膜をあげることができる。HybondTM
-C、HybondTM-C extra、HybondTM-ECL、HybondTM-N、Hy
bond-NTM+（Amersham社）、Whatman541filter(Whatman
社）、DuralonTMUV 、Duralose-UVTM(Stratagene社）、
PhotoGene Nylon Membrane(BRL社）などを具体例として
挙げることができるが、これら以外を使用しても遺伝子
あるいはオリゴヌクレオチドプローブを結合させ得るも
のであれば差し支えない。これらの膜に遺伝子あるいは
オリゴヌクレオチドプローブを固定する際には加熱処
理、あるいはＵＶ照射処理などの方法によるが、このい
づれかあるいは別の方法によるかについては、使用する
膜の性質によって適宜変更することになる。例えば、Hy
bondTM-N+を使用する場合にはＵＶ照射法により固定
し、HybondTM-C extraを使用する場合には真空中80℃に
加熱する方法が採用される。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６１】図１及び図２にＤＲＢ１遺伝子の第２エク
ソンのＤＮＡ塩基配列及び対応するアミノ酸配列を示し
た。ＤＲｗ14には、ＤＲＢ１＊1401とＤＲＢ１＊1402の
２種が既知である。（Bodmer, W.F., Albert, E.,Bodme
r, J.G., Dausset, J., Kissmeyer-Nielsen, F., Mayr,
W., Payne, R., Rood, J.J.van, Trnka,Z., and Walfo
rd, R.L. Histocompatibility Testing 1984 ４〜８頁
Springer-Verlag Berlin 1984年、Tiercy,J-M., Gors
ki, J., Betuel, H., Freidel, A.C., Gebuhrer, L., J
eannet, H.,and Mach, B.Hum Immunol 24巻 １〜14頁
1989年、Gorski, J.Hum Immunol24巻 145〜149頁 1
989年、Kao, H.T., Gregersen, P.K., Tang, J.C., Tak
ahashi, T., Wang, C.Y., and Silver, J. J Immunol
142巻 1743頁 1989年）。
ソンのＤＮＡ塩基配列及び対応するアミノ酸配列を示し
た。ＤＲｗ14には、ＤＲＢ１＊1401とＤＲＢ１＊1402の
２種が既知である。（Bodmer, W.F., Albert, E.,Bodme
r, J.G., Dausset, J., Kissmeyer-Nielsen, F., Mayr,
W., Payne, R., Rood, J.J.van, Trnka,Z., and Walfo
rd, R.L. Histocompatibility Testing 1984 ４〜８頁
Springer-Verlag Berlin 1984年、Tiercy,J-M., Gors
ki, J., Betuel, H., Freidel, A.C., Gebuhrer, L., J
eannet, H.,and Mach, B.Hum Immunol 24巻 １〜14頁
1989年、Gorski, J.Hum Immunol24巻 145〜149頁 1
989年、Kao, H.T., Gregersen, P.K., Tang, J.C., Tak
ahashi, T., Wang, C.Y., and Silver, J. J Immunol
142巻 1743頁 1989年）。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６５】図３はこれらのオリゴヌクレオチドプロー
ブによりＤＲ抗原遺伝子のＤＮＡタイピングをドットハ
イブリダイゼーション法を用いて行った結果である。縦
軸にはドナーと血清学的な方法で調べられた各々のＤＲ
抗原のタイプを示している。横軸にはオリゴヌクレオチ
ドプローブを示した。ドナーＤＮＡがオリゴヌクレオチ
ドプローブと交雑したところが黒いスポットで示され
る。
ブによりＤＲ抗原遺伝子のＤＮＡタイピングをドットハ
イブリダイゼーション法を用いて行った結果である。縦
軸にはドナーと血清学的な方法で調べられた各々のＤＲ
抗原のタイプを示している。横軸にはオリゴヌクレオチ
ドプローブを示した。ドナーＤＮＡがオリゴヌクレオチ
ドプローブと交雑したところが黒いスポットで示され
る。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７５】ストレプトアビジン−アルカリフォスファ
ターゼ結合体の溶液をTBS-Tween20を用いて3000倍に希
釈した液中で膜を室温下10分間処理した。その後、膜１
cm2あたり１mlのTBS-Tween20 溶液中室温下15分間づつ
２回洗浄した。さらに最終緩衝液の10倍希釈液中、室温
下１時間洗浄した。膜をワットマン３ＭＭ濾紙上に置き
過剰の緩衝液を除いた後、膜を現像ホルダー中に置い
た。そこへ、ホルダー中の膜に検出試薬を滴下し、膜を
ホルダーで覆った。そのまま２時間反応させ、Ｘ線フイ
ルムあるいはHyper Film（アマシャム社）を挟み、15分
間露光させ、現像し、図３と同様の結果を得た。
ターゼ結合体の溶液をTBS-Tween20を用いて3000倍に希
釈した液中で膜を室温下10分間処理した。その後、膜１
cm2あたり１mlのTBS-Tween20 溶液中室温下15分間づつ
２回洗浄した。さらに最終緩衝液の10倍希釈液中、室温
下１時間洗浄した。膜をワットマン３ＭＭ濾紙上に置き
過剰の緩衝液を除いた後、膜を現像ホルダー中に置い
た。そこへ、ホルダー中の膜に検出試薬を滴下し、膜を
ホルダーで覆った。そのまま２時間反応させ、Ｘ線フイ
ルムあるいはHyper Film（アマシャム社）を挟み、15分
間露光させ、現像し、図３と同様の結果を得た。
【配列表】 配列番号：１ （１）配列の長さ：８７ （２）配列の型：タンパク質 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：アミノ酸 （６）起源 (a)生物名：ヒト (b)株名： （７）配列の特徴：アミノ酸番号８から８７の配列。 （８）配列 Phe Leu Glu Tyr Ser Thr Ser Glu Cys Gln Phe Phe Asn Gly Thr Glu Arg 24 Val Arg Phe Leu Asp Arg Tyr Phe His Asn Gln Glu Glu Phe Val Arg Phe 41 Asp Ser Asp Val Gly Glu Tyr Arg Ala Val Thr Glu Leu Gly Arg Pro Asp 58 Ala Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Leu Leu Glu Arg Arg Arg Ala Glu 75 Val Asp Thr Tyr Cys Arg His Asn Tyr Gly Val Val 87 配列番号：２ （１）配列の長さ：２４１ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a)生物名：ヒト (b)株名： （７）配列の特徴：塩基配列番号１９から２５９の配列 （８）配列 TTTCTTGGAG TACTCTACGT CTGAGTGTCA ATTCTTCAAT GGGACGGAGC GGGTGCGGTT 78 CCTGGACAGA TACTTCCATA ACCAGGAGGA GTTCGTGCGC TTCGACAGCG ACGTGGGGGA 138 GTACCGGGCG GTGACGGAGC TGGGGCGGCC TGATGCTGAG TACTGGAACA GCCAGAAGGA 198 CCTCCTGGAG CGGAGGCGGG CCGAGGTGGA CACCTATTGC AGACACAACT ACGGGGTTGT 258 G 259 配列番号：３ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a)生物名：ヒト (b)株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ１４４と記載される （８）配列 AGTGTCAATT CTTCAATGG 19 配列番号：４ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a)生物名：ヒト (b)株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ１４２と記載される （８）配列 AGTACTCAGC ATCAGGCCG 19 配列番号：５ （１）配列の長さ：２５ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a)生物名：ヒト (b)株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦＰＲ１と記載される （８）配列 AGTGTCATTT CTTCAATGGG ACGGA 25 AGTGTCATTT CTTCAACGGG ACGGA 25 配列番号：６ （１）配列の長さ：２０ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a)生物名：ヒト (b)株名： （７）配列の特徴：本文中ではＤＲβＡＭＰ１と記載さ
れる （８）配列 CGCTGCACTG TGAAGCTCTC 20 配列番号：７ （１）配列の長さ：２７ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a)生物名：ヒト (b)株名： （７）配列の特徴：本文中ではＧＨ４６と記載される （８）配列 CCGGATCCTT CGTGTCCCCA CAGCACG 27 配列番号：８ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a)生物名：ヒト (b)株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ１４３と記載される （８）配列 TGCTGCGGAG CACTGGAAC 19 配列番号：９ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a)生物名：ヒト (b)株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ６ｂと記載される （８）配列 GTGTCTGCAA TAGGTGTCC 19 配列番号：１０ （１）配列の長さ：１８ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a)生物名：ヒト (b)株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ４６と記載される （８）配列 GCAGAGGCGG GCCGCGGT 18 配列番号：１１ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a)生物名：ヒト (b)株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ１４１と記載される （８）配列 AGCGCACGAA CTCCTCCTG 19 配列番号：１２ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a)生物名：ヒト (b)株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ５２ｃと記載される （８）配列 GTTCCTGGAG AGATACTTC 19
れる （８）配列 CGCTGCACTG TGAAGCTCTC 20 配列番号：７ （１）配列の長さ：２７ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a)生物名：ヒト (b)株名： （７）配列の特徴：本文中ではＧＨ４６と記載される （８）配列 CCGGATCCTT CGTGTCCCCA CAGCACG 27 配列番号：８ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a)生物名：ヒト (b)株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ１４３と記載される （８）配列 TGCTGCGGAG CACTGGAAC 19 配列番号：９ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a)生物名：ヒト (b)株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ６ｂと記載される （８）配列 GTGTCTGCAA TAGGTGTCC 19 配列番号：１０ （１）配列の長さ：１８ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a)生物名：ヒト (b)株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ４６と記載される （８）配列 GCAGAGGCGG GCCGCGGT 18 配列番号：１１ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a)生物名：ヒト (b)株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ１４１と記載される （８）配列 AGCGCACGAA CTCCTCCTG 19 配列番号：１２ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a)生物名：ヒト (b)株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ５２ｃと記載される （８）配列 GTTCCTGGAG AGATACTTC 19
Claims (27)
- 【請求項１】 以下の式 Ｉ で表されるアミノ酸配列
をコードするＨＬＡ−ＤＲｗ14ｃの遺伝子ＤＮＡ。 式 Ｉ ＦＬＥＹＳＴＳＥＣＱＦＦＮＧＴＥＲＶＲＦＬ ＤＲＹＦＨＮＱＥＥＦＶＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ ＡＶＴＥＬＧＲＰＤＡＥＹＷＮＳＱＫＤＬＬＥ ＲＲＲＡＥＶＤＴＹＣＲＨＮＹＧＶＶ - 【請求項２】 以下の式［II］で表わされる塩基配列を
有する請求項１記載のＤＮＡ。 式 II ５’− ＴＴＴＣＴＴＧＧＡＧＴＡＣＴＣＴＡ ＣＧＴＣＴＧＡＧＴＧＴＣＡＡＴＴＣＴＴＣＡ ＡＴＧＧＧＡＣＧＧＡＧＣＧＧＧＴＧＣＧＧＴ ＴＣＣＴＧＧＡＣＡＧＡＴＡＣＴＴＣＣＡＴＡ ＡＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＴＴＣＧＴＧＣＧＣＴ ＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＴＧＧＧＧＧＡＧＴ ＡＣＣＧＧＧＣＧＧＴＧＡＣＧＧＡＧＣＴＧＧ ＧＧＣＧＧＣＣＴＧＡＴＧＣＴＧＡＧＴＡＣＴ ＧＧＡＡＣＡＧＣＣＡＧＡＡＧＧＡＣＣＴＣＣ ＴＧＧＡＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＧＣＣＧＡＧＧ ＴＧＧＡＣＡＣＣＴＡＴＴＧＣＡＧＡＣＡＣＡ ＡＣＴＡＣＧＧＧＧＴＴＧＴＧ−３’ - 【請求項３】 式［Ｉ］又は式［II］で表わされるＨＬ
Ａ−ＤＲｗ14ｃのＤＮＡ塩基配列であることを特徴とす
るヒト白血球抗原のＤＲタイピング用のＤＮＡプロー
ブ。 - 【請求項４】 式［Ｉ］又は式［II］で表わされるＨＬ
Ａ−ＤＲ14ｃのＤＮＡ塩基配列に相補な配列であること
を特徴とするヒト白血球抗原のＤＲタイピング用のＤＮ
Ａプローブ。 - 【請求項５】 式［Ｉ］又は式［II］で表わされるＨＬ
Ａ−ＤＲｗ14ｃのＤＮＡ配列の内、少なくとも連続した
10塩基の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであること
を特徴とするヒト白血球抗原のＤＲタイピング用のＤＮ
Ａプローブ。 - 【請求項６】 式［Ｉ］又は式［II］で表わされるＨＬ
Ａ−ＤＲｗ14ｃのＤＮＡ配列に相補なＤＮＡ配列の内、
少なくとも連続した10塩基の塩基配列を含むオリゴヌク
レオチドであることを特徴とするヒト白血球抗原のＤＲ
タイピング用のＤＮＡプローブ。 - 【請求項７】 オリゴヌクレオチドがＨＬＡ−ＤＲｗ14
ｃ以外の染色体遺伝子、あるいは相補ＤＮＡのＤＮＡ配
列に交雑しないことを特徴とする請求項５又は６記載の
ＤＮＡプローブ。 - 【請求項８】 オリゴヌクレオチドのＤＮＡ塩基配列が
５’−ＡＧＴＧＴＣＡＡＴＴＣＴＴＣＡＡＴＧＧ−３’
である請求項５乃至７いずれか記載のＤＮＡプローブ。 - 【請求項９】 該オリゴヌクレオチドのＤＮＡ塩基配列
が５’−ＡＧＴＡＣＴＣＡＧＣＡＴＣＡＧＧＣＣＧ−
３’である請求項５乃至７いずれか記載のＤＮＡプロー
ブ。 - 【請求項10】 該ＤＮＡプローブが放射性同位体あるい
は／および蛍光色素、発色色素、発光色素で標識されて
いるあるいは該物質により標識され得るように修飾され
ていることを特徴とする請求項３乃至９いずれか記載の
ＤＮＡプローブ。 - 【請求項11】 該オリゴヌクレオチドの少なくとも連続
した10塩基の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが膜な
どに固定されていることを特徴とする請求項１乃至９い
ずれかに記載のＤＮＡプローブ。 - 【請求項12】 前記式［Ｉ］で表わされるアミノ酸配列
をコードする塩基配列又は式［II］で表わされるＨＬＡ
−ＤＲｗ14ｃの塩基配列の全部あるいは部分領域を下記
の方法で増幅するＨＬＡ−ＤＲｗ14ｃの塩基配列の増幅
方法。 (1) ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ存在下にオリゴヌクレオ
チドプライマーと加熱処理によってデネイチャーしたＨ
ＬＡ−ＤＲｗ14ｃのＤＲ型を有するヒトの末梢血から採
取した染色体ＤＮＡをアニールし、(2) アニールしたＤ
ＮＡを加熱処理してプライマーイクステンションさせ、
(3) (1)および(2)のステップを繰り返す。 - 【請求項13】 該オリゴヌクレオチドプライマーが放射
性同位体あるいは／および蛍光色素、発色色素、発光色
素などで標識されているあるいは該物質により標識され
得るように修飾されているものであることを特徴とする
請求項12記載の増幅方法。 - 【請求項14】 該ＤＮＡ増幅反応を放射性同位体あるい
は／および色素などで標識されたあるいは該物質により
標識され得るように修飾された核酸を用いて行い、得ら
れる標識されたＤＮＡを交雑させることを特徴とする請
求項12又は13記載の増幅方法。 - 【請求項15】 該オリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列がＦ
ＰＲ１：５’−ＡＧＴＧＴＣＡＴＴＴＣＴＴＣＡＡＴ
（およびＣ）ＧＧＧＡＣＧＧＡ−３’ ＤＲβＡＭＰ１：５’−ＣＧＣＴＧＣＡＣＴＧＴＧＡＡ
ＧＣＴＣＴＣ−３’ およびＧＨ４６：５’−ＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＣＧＴＧ
ＴＣＣＣＣＡＣＡＧＣＡＣＧ−３’ から選ばれたものである請求項12乃至14いずれか記載の
プライマー。 - 【請求項16】 請求項３乃至11のいずれか記載のＤＮＡ
プローブの内少なくとも１種類のＤＮＡプローブを含む
ことを特徴とするヒト白血球抗原のＤＲタイピング用試
薬。 - 【請求項17】 請求項３乃至11のいずれか記載のＤＮＡ
プローブに加えて、ヒト白血球抗原の内、他の型を識別
し得るＤＮＡプローブをも含み構成されることを特徴と
するヒト白血球抗原のタイピング試薬。 - 【請求項18】 請求項３乃至11のいずれか記載のＤＮＡ
プローブに加えて、ヒト白血球抗原の内、他の型を識別
し得るＤＮＡプローブと、交雑反応、続いて行なう洗浄
用の試薬をも含むことを特徴とするヒト白血球抗原のタ
イピング試薬のキット。 - 【請求項19】 請求項３乃至11のいずれか記載のＤＮＡ
プローブに加えて、ヒト白血球抗原の内、他の型を識別
し得るＤＮＡプローブ、交雑反応、続いて行なう洗浄用
の試薬と、これらの操作に必要な器具、機器を含むこと
を特徴とするヒト白血球抗原のタイピング用のキット。 - 【請求項20】 請求項３乃至11のいずれか記載のＤＮＡ
プローブおよび請求項12乃至15のいずれか記載のプライ
マーを含むことを特徴とするヒト白血球抗原のＤＲタイ
ピング試薬。 - 【請求項21】 請求項３乃至11のいずれか記載のＤＮＡ
プローブおよび請求項12乃至15のいずれか記載のプライ
マーに加えて、ヒト白血球抗原の内、他の型を識別し得
るＤＮＡプローブをも含み構成されることを特徴とする
ヒト白血球抗原のタイピング試薬。 - 【請求項22】 請求項３乃至11のいずれか記載のＤＮＡ
プローブおよび請求項12乃至15のいずれか記載のプライ
マーに加えて、ヒト白血球抗原の内、他の型を識別し得
るＤＮＡプローブと、増幅反応、交雑反応、続いて行な
う洗浄用の試薬をも含むことを特徴とするヒト白血球抗
原のタイピング試薬のキット。 - 【請求項23】 請求項３乃至11のいずれか記載のＤＮＡ
プローブおよび請求項12乃至15のいずれか記載のプライ
マーに加えて、ヒト白血球抗原の内、他の型を識別し得
るＤＮＡプローブ、増幅反応、交雑反応、続いて行なう
洗浄用の試薬と、これらの操作に必要な器具、機器を含
むことを特徴とするヒト白血球抗原のタイピング用のキ
ット。 - 【請求項24】 請求項３乃至11のいずれか記載のＤＮＡ
プローブおよび請求項12乃至15いずれか記載のプライマ
ーに加えて、ヒト白血球抗原の内、他の型を識別し得る
ＤＮＡプローブおよび他の型のＤＮＡを増幅させるため
の少なくとも１種類の異なるプライマーをも含み構成さ
れることを特徴とするヒト白血球抗原のタイピング試
薬。 - 【請求項25】 請求項３乃至11のいずれか記載のＤＮＡ
プローブおよび請求項12乃至15のいずれか記載のプライ
マーおよび他の型のＤＮＡを増幅させるための少なくと
も１種類の異なるプライマーに加えて、ヒト白血球抗原
の内、他の型を識別し得るＤＮＡプローブと、増幅反
応、交雑反応、続いて行なう洗浄用の試薬をも含むこと
を特徴とするヒト白血球抗原のタイピング試薬のキッ
ト。 - 【請求項26】 請求項３乃至11のいずれか記載のＤＮＡ
プローブおよび請求項12乃至15のいずれか記載のプライ
マーに加えて、ヒト白血球抗原の内、他の型を識別し得
るＤＮＡプローブ、および他の型のＤＮＡを増幅させる
ための少なくとも１種類の異なるプライマー、増幅反
応、交雑反応、続いて行なう洗浄用の試薬と、これらの
操作に必要な器具、機器を含むことを特徴とするヒト白
血球抗原のタイピング用のキット。 - 【請求項27】 請求項３乃至11のいずれか記載のＤＮＡ
プローブを用いることを特徴とするヒト白血球抗原のタ
イピング方法。
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