JPH0690757A - Hla−drタイピング用塩基配列群とそれを用いた hla−drタイピング法 - Google Patents

Hla−drタイピング用塩基配列群とそれを用いた hla−drタイピング法

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JPH0690757A
JPH0690757A JP4224432A JP22443292A JPH0690757A JP H0690757 A JPH0690757 A JP H0690757A JP 4224432 A JP4224432 A JP 4224432A JP 22443292 A JP22443292 A JP 22443292A JP H0690757 A JPH0690757 A JP H0690757A
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JP
Japan
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seq
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nucleic acid
dna
nucleobase
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Application number
JP4224432A
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English (en)
Inventor
Bunya Obata
文弥 小幡
Noboru Kashiwagi
登 柏木
Akio Abe
章夫 阿部
Teruichi Miyakoshi
照一 宮越
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kitasato Institute
Mitsui Petrochemical Industries Ltd
Original Assignee
Kitasato Institute
Mitsui Petrochemical Industries Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 HLA−DR抗原分子のサブタイプの識別を
も精密に実施することを可能とする特定の配列を有する
オリゴヌクレオチドプローブ群、およびオリゴヌクレオ
チドプローブ群を含む検査試薬および器具を含む遺伝子
タイピングキット、さらに該試薬を用いる新規なタイピ
ング法 【効果】 本発明により提供されるオリゴヌクレオチド
プローブ群は、HLA−DR抗原をコードする遺伝子の
遺伝子型を明確に型分けすることが可能であり、該オリ
ゴヌクレオチドプローブを使用することにより、従来は
型分け不可能であった遺伝子型を型分け可能とした。ま
た公知のオリゴヌクレオチドプローブを併せて使用する
ことにより、日本人の場合には、その97%と高率でH
LA−DR抗原の遺伝子型を型分け可能とした。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト白血球抗原の内D
R抗原をコードする塩基配列を対象として行なわれる遺
伝子タイピングを目的としたオリゴヌクレオチドプロー
ブおよびこのオリゴヌクレオチドプローブを含む遺伝子
タイピング用の試薬キットおよび使用する器具を含む遺
伝子タイピングキット、さらにこれらを用いるヒト白血
球抗原のDR抗原のタイピングの方法に関する。
【0002】
【従来の技術】ヒト白血球抗原(HLAと省略する)の
タイピング(型分け)は、臓器移植時の適合性の判定の
みならず、疾病に対する個人の感受性の判定などにおい
てその重要性が注目されている。わが国で頻度が高い腎
移植の場合、血縁者がドナーとなる生体腎移植と、非血
縁者からの死体腎移植とでは適合度が異なり、生体腎移
植の方が良好な成績を納めている。このことは、従来の
血清学的タイピングでは同定できないサブタイプの存在
か、あるいは連鎖する他の遺伝子座が移植臓器の生着に
影響している可能性を示唆するものである(代謝ハイラ
イト、代謝25巻、臨時増刊号、山村雄一・吉利和監
修、373−380頁、東京、中山書店発行)。
【0003】血清学的なタイピングは、特異性の明らか
な抗血清を補体とともに検索対象のリンパ球に加えて、
その細胞が傷害されるか否かを調べることによって行な
われている。この方法は簡便ではあるもののHLA抗原
分子の抗原決定基の微妙な違いを識別できないため、サ
ブタイプの存在を見落とす場合がある。また血清学的タ
イピングのもう一つの欠点は、血清学的タイピングでは
未検出のHLAも存在していることである。この割合は
日本人集団においては11%の比率を占めていると言わ
れており(Baur M.P., Neugebaue
r M., Deppe Sigmund M., L
uton T., Mayer W.R., Albe
rt E.D.ら、 Histocompatibil
itytesting 1984.Berlin,Sp
ringer−Verlag、333頁 1984
年)、これは決して少なくない数である。
【0004】しかしながら、非血縁者からの死体腎移植
は多くなる一方で、従来の血清学的タイピングのみでは
組織適合度を詳細に検討できないのが実状である。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】HLA抗原はクラスI
抗原とクラスII抗原に大別される。腎移植を例にあげる
とクラスII抗原の一致が生着に重要であることが示唆さ
れている。クラスII抗原はDR、DQ、DPの3種の抗
原から構成されており、この中でも細胞膜表面上に最も
多く発現されているDR抗原の適合性が重要とされてい
る〔雨宮浩、佐田正晴:相沢班腎移植と適合性の集計、
昭和58年度科学研究費補助金〔総合研究(A)〕研究
成果報告書:HLA−D領域の構成と機能、67頁、1
984年〕。
【0006】HLA−DR分子はヒトのクラスII分子の
中で最も広く遺伝的な相違点を有している。即ち、18
種のHLA−DR(DR1からDRw18まで)および
2種のHLA−DRw(DRw52とDRw53)の
血清学的な特異性がリンパ球テスト(CDL)の結果に
よって定義されており、また、26種のHLA−D(D
w1からDw26まで)の細胞特異性が混合リンパ球試
験(MLR)の結果によって定義されている。(Bod
mer W.F., Alberet E.,Bodm
er J.G.ら、 Histocompatibil
ity Testing 1987年. New Yo
rk、 Springer−Verlag、72頁 1
989年) HLA−DRAと−DRB遺伝子の塩基配列分析により
DRとほとんどのD特異性がDRβ鎖の第1ドメインを
コードしているDRB遺伝子(B1、B3、B4、およ
びB5)の第2エクソン部によって決定されていること
が判ってきた(Flomenbereg, N., H
istocompatibilityTesting
1987. New York、Spriger−Ve
rlag、532頁 1989年. Bodmer
J.G., Marsh S.G.E.ら、 Tiss
sue Antigens 35巻 1頁 1990
年)。さらに、塩基分析の結果からDRBアレルの5〜
6個の帰属不明な変異物の存在が明らかにされている。
(Bodmer J.G., Marsh S.G.
E., Parham P.ら、 Tisssue A
ntigens 35巻 1頁 1990年. Abe
A., Ito I., Ohkubo M.ら、
Immunogenetics 30巻 422頁 1
989年. Obata F., Abe A., O
hkubo M.ら、 Hum Immunol 27
巻 269頁 1990年. Petersdorf
E.W., Griffith R.L., Erli
chi H.A.ら、Immunogenetics
32巻 96頁 1990年. Obata F.,
Ito I., Ito K.ら Immunogen
etics 32巻 313頁 1990年) これらの経緯を経て、免疫学的な手段によって検出され
る数以上のDRBアレルが知られるようになった。この
ような例としては、38種のDRB1アレル、4種のD
RB3アレル、1種のDRB4アレル、および4種のD
RB5アレルを挙げることができる。(Bodmer
J.G., Marsh S.G.E., Parha
m P.ら、 Tisssue Antigens 3
5巻 1頁 1990年) 従って、HLA−DR抗
原を精密に分類できるタイピング法が重要であることは
言うまでもない。しかし、血清学的方法による従来法に
よっては、必ずしも満足されるタイピング結果が得られ
ず、臓器移植など臨床的な観点からは従来の血清学的タ
イピングでは不十分と言わざるを得ない。
【0007】本発明は、血清学的タイピングでは識別困
難なHLA−DR抗原分子を含めて、ほぼ全ての型を判
別するための遺伝子タイピング用検査試薬を提供するこ
とを目的としている。さらに詳しくは、特にHLA−D
R抗原分子のサブタイプの識別をも精密に実施すること
を可能とするオリゴヌクレオチドプローブ群、およびオ
リゴヌクレオチドプローブ群を含む検査試薬および器具
を含む遺伝子タイピングキット、さらに該試薬を用いる
新規なタイピング法を提供することを目的としている。
【0008】
【課題を解決するための手段】本発明は、血清学的タイ
ピングでは分けることができないHLA−DR抗原分子
のサブタイプや血清学的にブランクと呼ばれるものも含
めて、これらの抗原分子の各々のDNA塩基配列に特異
的なオリゴヌクレオチドプローブ群に関するものであ
る。
【0009】本発明者らはHLA−DR抗原、中でもブ
ランクあるいはサブタイプを遺伝子レベルでタイピング
することができれば、現状以上に詳細なタイピングが可
能であり、血清学的なタイピングの欠点をも解消できる
と考えるに至った。具体的には、DR抗原の遺伝的多型
に富む領域に存在する個々の抗原決定部位に相当する特
異的な塩基配列に特異的に交雑し得るオリゴヌクレオチ
ドプローブを作製し、それに対して検体の遺伝子が交雑
するか否かでDR抗原のタイプを決定する方法である。
【0010】そこで、このような考え方に従って、種々
のDRBタイプの塩基配列を比較検討し、各々のタイプ
に固有の塩基配列を検索した。その結果、サブタイプお
よび血清学的には判別困難な型を含めて塩基配列の違い
が認められた。これらの塩基配列を基に、新規なオリゴ
ヌクレオチドプローブを含めて、それぞれのDR抗原遺
伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを作製し
た。また、さらにこれらのプローブを用いて遺伝子タイ
ピングを行なった結果、ほぼ全てのDRBの型を判別す
ることができた。
【0011】すなわち本発明は、下記の配列番号1乃至
配列番号8で表わされる核酸塩基配列の1種または2種
以上を検出するためのHLA−DR抗原の遺伝子タイピ
ング用のオリゴヌクレオチドプローブである。 OA3:配列番号1記載の核酸塩基配列 OF10:配列番号2記載の核酸塩基配列 OA1416:配列番号3記載の核酸塩基配列 OK1406:配列番号68記載の核酸塩基配列 OF30:配列番号4記載の核酸塩基配列 OF44:配列番号5記載の核酸塩基配列 OF45:配列番号6記載の核酸塩基配列 OF863:配列番号7記載の核酸塩基配列 OF851:配列番号8記載の核酸塩基配列 また、本発明は下記の配列番号9乃至配列番号16で表
される核酸塩基配列の1種または2種以上を含むHLA
−DR抗原の遺伝子タイピング用のオリゴヌクレオチド
プローブである。 A3:配列番号9記載の核酸塩基配列 F10:配列番号10記載の核酸塩基配列 A1416:配列番号11記載の核酸塩基配列 K1406:配列番号69記載の核酸塩基配列 F30:配列番号12記載の核酸塩基配列 F44:配列番号13記載の核酸塩基配列 F45:配列番号14記載の核酸塩基配列 F863:配列番号15記載の核酸塩基配列 F851:配列番号16記載の核酸塩基配列 また、本発明は配列番号1乃至配列番号8の核酸塩基配
列の1種または2種以上に加えて下記の配列番号17乃
至配列番号40で表わされる核酸塩基配列の1種または
2種以上をも検出することを特徴とするHLA−DR抗
原の遺伝子タイピング用のオリゴヌクレオチドプローブ
である。 OF1:配列番号17記載の核酸塩基配列 OF2:配列番号18記載の核酸塩基配列 OF3:配列番号19記載の核酸塩基配列 OF4:配列番号20記載の核酸塩基配列 OF7:配列番号21記載の核酸塩基配列 OF8:配列番号22記載の核酸塩基配列 OF9:配列番号23記載の核酸塩基配列 OF11:配列番号24記載の核酸塩基配列 OF13:配列番号25記載の核酸塩基配列 OF52:配列番号26記載の核酸塩基配列 OF52c:配列番号27記載の核酸塩基配列 OF53:配列番号28記載の核酸塩基配列 OF120:配列番号29記載の核酸塩基配列 OF121:配列番号30記載の核酸塩基配列 OF122:配列番号31記載の核酸塩基配列 OF123:配列番号32記載の核酸塩基配列 OF142:配列番号33記載の核酸塩基配列 OF143:配列番号34記載の核酸塩基配列 OF22:配列番号35記載の核酸塩基配列 OF29:配列番号36記載の核酸塩基配列 OF42:配列番号37記載の核酸塩基配列 OF46:配列番号38記載の核酸塩基配列 OF141:配列番号39記載の核酸塩基配列 OF158:配列番号40記載の核酸塩基配列 また、本発明は配列番号9乃至配列番号16の1種また
は2種以上のオリゴヌクレオチドプローブに加えて下記
の配列番号41乃至配列番号64の核酸塩基配列で表さ
れるオリゴヌクレオチドプローブの1種または2種以上
をも含むHLA−DR抗原の遺伝子タイピング用のオリ
ゴヌクレオチドプローブである。 F1:配列番号41記載の核酸塩基配列 F2:配列番号42記載の核酸塩基配列 F3:配列番号43記載の核酸塩基配列 F4:配列番号44記載の核酸塩基配列 F7:配列番号45記載の核酸塩基配列 F8:配列番号46記載の核酸塩基配列 F9:配列番号47記載の核酸塩基配列 F11:配列番号48記載の核酸塩基配列 F13:配列番号49記載の核酸塩基配列 F52:配列番号50記載の核酸塩基配列 F52c:配列番号51記載の核酸塩基配列 F53:配列番号52記載の核酸塩基配列 F120:配列番号53記載の核酸塩基配列 F121:配列番号54記載の核酸塩基配列 F122:配列番号55記載の核酸塩基配列 F123:配列番号56記載の核酸塩基配列 F142:配列番号57記載の核酸塩基配列 F143:配列番号58記載の核酸塩基配列 F22:配列番号59記載の核酸塩基配列 F29:配列番号60記載の核酸塩基配列 F42:配列番号61記載の核酸塩基配列 F46:配列番号62記載の核酸塩基配列 F141:配列番号63記載の核酸塩基配列 F158:配列番号64記載の核酸塩基配列 また、本発明は上記に記載のオリゴヌクレオチドプロー
ブにおいて、少なくとも連続した10塩基の塩基配列を
含むことを特徴とするHLA−DR抗原の遺伝子タイピ
ング用のオリゴヌクレオチドプローブである。
【0012】また、本発明は上記に記載のオリゴヌクレ
オチドプローブがHLA−DRをコードする以外の染色
体遺伝子、あるいは相補DNAの塩基配列に交雑しない
ことを特徴とする上記いずれかに記載のオリゴヌクレオ
チドプローブである。また、本発明は上記に記載のオリ
ゴヌクレオチドプローブがラジオアイソトープあるいは
/および蛍光、発光、発色のいずれかの現象を起こし得
る物質で標識されている、あるいは該物質により標識さ
れ得るように修飾されていることを特徴とする、上記い
ずれかのオリゴヌクレオチドプローブである。
【0013】また、本発明は上記に記載のオリゴヌクレ
オチドプローブの少なくとも連続した10塩基の塩基配列
を含むオリゴヌクレオチドが膜などに固定されているこ
とを特徴とする、上記いずれかのオリゴヌクレオチドプ
ローブである。また、本発明は上記に記載のオリゴヌク
レオチドプローブを、人の血液あるいは/および口腔粘
膜あるいは/および髪の毛あるいは/および爪を検体と
した検出に用いることを特徴とするHLA−DR抗原の
遺伝子タイピングの方法である。
【0014】また、本発明はHLA−DR抗原の遺伝子
タイピングを行なうための検体からDNAを得る際に使
用されるものであって、塩化カリウム、塩化マグネシウ
ム、ゼラチン、界面活性剤、プロテナーゼKを含むこと
を特徴とするトリス塩酸緩衝液である。また、本発明は
前記検体から得られるHLA−DR抗原をコードするD
NAの内、少なくとも前記オリゴヌクレオチドプローブ
の塩基配列を含む領域であり、且つ少なくともその一部
がラジオアイソトープあるいは/および蛍光、発光、発
色のいずれかの現象を起こし得る物質で標識されてい
る、あるいは該物質により標識され得るように修飾され
ていることを特徴とする検体DNAおよび該DNAを含
む溶液である。
【0015】また、本発明はHLA−DR抗原をコード
する塩基配列の内、上記いずれかのオリゴヌクレオチド
の塩基配列を含む部分領域を下記の方法で増幅するHL
A−DR抗原をコードする塩基配列の増幅方法である。 (1) 耐熱性DNAポリメラーゼ存在下に、オリゴヌクレ
オチドプライマーと加熱処理によってデネイチャーした
HLA−DRをコードする染色体DNAをアニールし、
(2) アニールしたDNAを加熱処理してプライマーイク
ステンションさせ、(3) (1) および(2) のステップを繰
り返す。
【0016】また、本発明は増幅反応をラジオアイソト
ープおよび/あるいは蛍光、発光、発色のいずれかの現
象を起こし得る物質で標識されている、あるいは該物質
により標識され得るように修飾されているオリゴヌクレ
オチドプライマーを用いて行うことを特徴とする上記増
幅方法である。また、本発明は該増幅反応をラジオアイ
ソトープおよび/あるいは蛍光、発色、発光のいずれか
の現象を起こし得る物質で標識されている、あるいは該
物質により標識され得るように修飾されている核酸を用
いて行ない上記いずれかに記載のオリゴヌクレオチドと
ハイブリダイゼーションさせることを特徴とする上記増
幅方法である。
【0017】また、本発明は上記に記載のオリゴヌクレ
オチドプライマーの塩基配列が配列番号65または配列
番号66で表わされるオリゴヌクレオチドプライマーで
ある。 FPR1:配列番号65に記載の核酸塩基配列 DRβAMP1:配列番号66に記載の核酸塩基配列 また、本発明はHLA−DR抗原の遺伝子タイピングを
行なうためにDNA増幅反応を行なう際に使用するもの
であって、塩化カリウム、塩化マグネシウム、ゼラチ
ン、dGTP、dCTP、dTTP、dATPおよび上
記のオリゴヌクレオチドプライマーを含むことを特徴と
するトリス・塩酸緩衝液である。
【0018】また、本発明は上記記載のオリゴヌクレオ
チドプローブに前記DNAをハイブリダイゼーションさ
せる際に使用するものであって、テトラメチルアンモニ
ウム、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム、デンハルト
液、ドデシル硫酸ナトリウム、キャリヤーDNAを含む
ことを特徴とするトリス塩酸緩衝液である。また、本発
明は上記記載のオリゴヌクレオチドプローブに検体のD
NAをハイブリダイゼーションさせた後の洗浄に使用す
るものであって、テトラメチルアンモニウム、エチレン
ジアミン四酢酸ナトリウム、デンハルト液、ドデシル硫
酸ナトリウム、を含むことを特徴とするトリス塩酸緩衝
液である。
【0019】また、本発明は上記記載のオリゴヌクレオ
チドプローブ、上記記載オリゴヌクレオチドプライマ
ー、上記記載の緩衝液の内、該オリゴヌクレオチドプロ
ーブを含む少なくとも2種類以上の構成物からなること
を特徴とするHLA−DR抗原の遺伝子タイピング用の
試薬キットである。また、本発明は上記記載の試薬キッ
トに、遺伝子採取処理用、DNA増幅反応用、ハイブリ
ダイゼーション用、ハイブリダイゼーション後の洗浄
用、検出反応用チューブなどの必要な器具のすべてある
いは一部を加えて構成されることを特徴とするHLA−
DR抗原の遺伝子タイピング用の検査キットである。
【0020】また、本発明はHLA−DR抗原の遺伝子
タイピングを行なうに際し、上記に記載の塩基配列群で
表わされるオリゴヌクレオチドプローブおよび上記記載
の試薬キットあるいは検査キットを使用することを特徴
とするHLA−DR抗原の遺伝子タイピングの方法であ
る。次に本発明に係るHLA−DR分子をコードする遺
伝子配列の内、各タイプに特異的な検出部位に相当する
DNA塩基配列およびタイピング方法について具体的に
説明する。
【0021】本発明に係るHLA−DRをコードする遺
伝子の検出部位に相当するDNA塩基配列は、超可変領
域と呼ばれる領域の塩基配列である。HLA関連の遺伝
子構成を図1に示すが、この中のDRB領域にある超可
変領域を含む塩基配列の中から特異的な配列を選びだ
し、新規なオリゴヌクレオチドプローブを開発し、さら
にそれらを組み合わせることにより各タイプを精密にタ
イピングする事を可能としたのである。
【0022】プローブに関して 従来の技術では検出することが不可能な遺伝子型、ある
いは既にオリゴヌクレオチドプローブは発表されてはい
るが、該プローブでは他の遺伝子型との交雑反応が高頻
度に起こるため検出時に判断が困難であったものについ
て、既に報告されているDRB遺伝子の種々のDRBア
レルの核酸塩基配列を基礎にして、その塩基配列から特
異的な配列を検索し、8種類からなる塩基配列を検出可
能とした。
【0023】これらのオリゴヌクレオチドプローブの標
的配列は、なるべく少ない数のオリゴヌクレオチドを使
用し、なるべく多くのDR型を同定できるように、また
オリゴヌクレオチドプローブと非標的DRB型との間で
間違ったペアを生じさせる主要な原因であるGTミスマ
ッチのチャンスを減らすようにコーディングストランド
および非コーディングストランド双方を対象として特異
的な配列を選択した。このようにして選択したオリゴヌ
クレオチドプローブの標的配列群を以下に列挙する。 OA3:配列番号1記載の核酸塩基配列 OF10:配列番号2記載の核酸塩基配列 OA1416:配列番号3記載の核酸塩基配列 OK1406:配列番号68記載の核酸塩基配列 OF30:配列番号4記載の核酸塩基配列 OF44:配列番号5記載の核酸塩基配列 OF45:配列番号6記載の核酸塩基配列 OF863:配列番号7記載の核酸塩基配列 OF851:配列番号8記載の核酸塩基配列 上記の塩基配列を検出するためのオリゴヌクレオチドプ
ローブは下記のとおりである。 A3:配列番号9記載の核酸塩基配列 F10:配列番号10記載の核酸塩基配列 A1416:配列番号11記載の核酸塩基配列 K1406:配列番号69記載の核酸塩基配列 F30:配列番号12記載の核酸塩基配列 F44:配列番号13記載の核酸塩基配列 F45:配列番号14記載の核酸塩基配列 F863:配列番号15記載の核酸塩基配列 F851:配列番号16記載の核酸塩基配列 これらのオリゴヌクレオチドプローブを使用することに
より、下記の遺伝子型の判定が容易に行えるようになっ
た。 A3 :配列番号9に記載の核酸塩基配列 :B1*0
301, B1*0302 F10 :配列番号10に記載の核酸塩基配列:B1*1
001 A1416:配列番号11に記載の核酸塩基配列:B1*0
302, B1*1402, B1-JX6,B3*0301 K1406:配列番号69に記載の核酸塩基配列:B1*0
302, B1*1402, B1-JX6,B3*0301 F30 :配列番号12に記載の核酸塩基配列:B1*1
103 F44 :配列番号13に記載の核酸塩基配列:B1*0
401 F45 :配列番号14に記載の核酸塩基配列:B1*0
403, B1*0406, B1*0407 F863 :配列番号15に記載の核酸塩基配列:B1*0
102, B1*1201, B1-12b,B5*0201, B5*0202 F851 :配列番号16に記載の核酸塩基配列:B1*0
101, B1*0102, B1*0103,B1*0301, B1*0302, B1*0401,B1
*0402, B1*0403, B1*0404,B1*0406, B1*0407, B1*0408,
B1*0802, B1*1001, B1*1301,B1*1302, B1*1402, B1-JX
6,B1-PEV, B3*0201, B3*0202 これら新規なオリゴヌクレオチドプローブを含めて、日
本人のHLA−DR抗原の遺伝子タイピングの為に32
種の異なったオリゴヌクレオチドプローブを合成し、D
R型およびDRB型を識別することが可能でなった。 OF1:配列番号17記載の核酸塩基配列 OF2:配列番号18記載の核酸塩基配列 OF3:配列番号19記載の核酸塩基配列 OA3:配列番号1記載の核酸塩基配列 OF4:配列番号20記載の核酸塩基配列 OF7:配列番号21記載の核酸塩基配列 OF8:配列番号22記載の核酸塩基配列 OF9:配列番号23記載の核酸塩基配列 OF10:配列番号2記載の核酸塩基配列 OF11:配列番号24記載の核酸塩基配列 OF13:配列番号25記載の核酸塩基配列 OF52:配列番号26記載の核酸塩基配列 OF52c:配列番号27記載の核酸塩基配列 OA1416:配列番号3記載の核酸塩基配列 OF53:配列番号28記載の核酸塩基配列 OF120:配列番号29記載の核酸塩基配列 OF121:配列番号30記載の核酸塩基配列 OF122:配列番号31記載の核酸塩基配列 OF123:配列番号32記載の核酸塩基配列 OF142:配列番号33記載の核酸塩基配列 OF143:配列番号34記載の核酸塩基配列 OF22:配列番号35記載の核酸塩基配列 OF29:配列番号36記載の核酸塩基配列 OF30:配列番号4記載の核酸塩基配列 OF42:配列番号37記載の核酸塩基配列 OF44:配列番号5記載の核酸塩基配列 OF45:配列番号6記載の核酸塩基配列 OF46:配列番号38記載の核酸塩基配列 OF141:配列番号39記載の核酸塩基配列 OF158:配列番号40記載の核酸塩基配列 OF863:配列番号7記載の核酸塩基配列 OF851:配列番号8記載の核酸塩基配列 ……………[A] F1:配列番号41記載の核酸塩基配列 F2:配列番号42記載の核酸塩基配列 F3:配列番号43記載の核酸塩基配列 A3:配列番号9記載の核酸塩基配列 F4:配列番号44記載の核酸塩基配列 F7:配列番号45記載の核酸塩基配列 F8:配列番号46記載の核酸塩基配列 F9:配列番号47記載の核酸塩基配列 F10:配列番号10記載の核酸塩基配列 F11:配列番号48記載の核酸塩基配列 F13:配列番号49記載の核酸塩基配列 F52:配列番号50記載の核酸塩基配列 F52c:配列番号51記載の核酸塩基配列 A1416:配列番号11記載の核酸塩基配列 F53:配列番号52記載の核酸塩基配列 F120:配列番号53記載の核酸塩基配列 F121:配列番号54記載の核酸塩基配列 F122:配列番号55記載の核酸塩基配列 F123:配列番号56記載の核酸塩基配列 F142:配列番号57記載の核酸塩基配列 F143:配列番号58記載の核酸塩基配列 F22:配列番号59記載の核酸塩基配列 F29:配列番号60記載の核酸塩基配列 F30:配列番号12記載の核酸塩基配列 F42:配列番号61記載の核酸塩基配列 F44:配列番号13記載の核酸塩基配列 F45:配列番号14記載の核酸塩基配列 F46:配列番号62記載の核酸塩基配列 F141:配列番号63記載の核酸塩基配列 F158:配列番号64記載の核酸塩基配列 F863:配列番号15記載の核酸塩基配列 F851:配列番号16記載の核酸塩基配列 ………[B] 上記配列番号1乃至配列番号8に示した核酸塩基配列お
よび配列番号9乃至配列番号16に示した新規なオリゴ
ヌクレオチドDNAプローブを含む上記式[A]に記載
した塩基配列群を検出する核酸プローブ群および上記式
[B]に記載したオリゴヌクレオチドであるDNAプロ
ーブ群において、交雑反応を起こすために必要な連続し
た少なくとも10塩基の核酸塩基配列を含むことを特徴
とするHLAのDRタイピング用の核酸プローブが使用
され得るのである。
【0024】これらのプローブ群を使用すると、血清学
的に決定されたDR型は、上記32種のオリゴヌクレオ
チドの内少なくとも一つで陽性として判定される。ま
た、特殊な細胞D特異性に伴うDRB型のほとんどは一
種のオリゴヌクレオチドあるいはオリゴヌクレオチドの
組合せで同定可能である。また更に、例えばDRB1−
12b、DRB1−14c、DRB1−JX6などいく
つかのDRB型は現時点で容易に入手できる免疫学的試
薬では同定困難であるが、これらも含めて我々のオリゴ
ヌクレオチドタイピングによって同定可能となる。以下
に本発明において使用されるオリゴヌクレオチドである
DNAプローブが同定できるDR型を纏めて記載した。
【0025】F1:配列番号41記載の核酸塩基配列:
DR1、B1*0101、B1*0102、B1*01
03 F2:配列番号42記載の核酸塩基配列:DR2、B5
*0101、B5*0102、B5*0201、B5*
0202、(Obata F., Abe A., O
hkubo M.ら、 Hum Immunol 27
巻 269頁−284頁 1990年) A3:配列番号9記載の核酸塩基配列(F3:配列番号
43記載の核酸塩基配列):DR3、B1*0301、
B1*0302 F4:配列番号44記載の核酸塩基配列:DR4、B1
*0401、B1*0402、B1*0403、B1*
0404、B1*0405、B1*0406、B1*0
407、B1*0408、(Obata F., Ab
e A., Ohkubo M.ら、 Hum Imm
unol 27巻 269頁−284頁1990年) F7:配列番号45記載の核酸塩基配列:DR7、B1
*0701、B1*0702、 F8:配列番号46記載の核酸塩基配列:DRw8、J
X6、B1*0801、B1*0802、B1*080
3、B1−JX6、(Abe A., ItoI.,
Ohkubo M.ら、 Immunogenetic
s 30巻422頁−426頁 1989年) F9:配列番号47記載の核酸塩基配列:DR9、B1
*0901 F10:配列番号10記載の核酸塩基配列:DRw1
0、B1*1001 F11:配列番号48記載の核酸塩基配列:DRw1
1、B1*1101、B1*1102、B1*110
3、B1*1104 F13:配列番号49記載の核酸塩基配列:DRw1
3、DR4−Dw10、B1*0103、B1*040
2、B1*1102、B1*1302 F52:配列番号50記載の核酸塩基配列:DRw1
1、DRw12、DRw13、DRw14、JX6、D
R3−Dw3、B3*0101、B3*0201、B3
*0202、B3*0301、(Obata F.,
Abe A.,Ohkubo M.ら、 Hum Im
munol 27巻 269頁−284頁 1990
年) A1416:配列番号11記載の核酸塩基配列および/
あるいはK1406:配列番号69記載の核酸塩基配列
(F52c:配列番号51記載の核酸塩基配列):DR
w14−Dw16、DR3、JX6、DRw13、B1
*0302、B1*1402、B1−JX6、B3*0
301、(Obata F., ItoI., Ito
K.ら、 Immunogenetics 32巻
313頁−320頁 1990年)) F53:配列番号52記載の核酸塩基配列:DR4、D
R7、DR9、(Obata F., Abe A.,
Ohkubo M., Ito I., Kanek
o T., Otani F., Watanabe
K., Kashiwagi N.ら、 Hum Im
munol 27巻 269頁−284頁 1990
年) F120:配列番号53記載の核酸塩基配列:DRw1
2a、DRw12b、B1*1201、B1−12b、
(Abe A., Ito I., Ohkubo
M.ら、 Immunogenetics 30巻 4
22頁−426頁1989年) F121:配列番号54記載の核酸塩基配列:DRw1
2a、B1*0803、B1*1201、(Abe
A., Ito I.ら、 Ohkubo M.ら、I
mmunogenetics 30巻 422頁−42
6頁 1989年) F122:配列番号55記載の核酸塩基配列:DRw1
2b、B1*0801、B1*0802、B1*110
1、B1*1104、B1*12b、B1−PEV,
B1*1601, B5*0101, B5*010
2、(AbeA., Ito I., Ohkubo
M.ら、 Immunogenetics 30巻 4
22頁−426頁 1989年) F123:配列番号56記載の核酸塩基配列:JX6、
DR2−Dw22、B1*1602、B1−JX6、
(Obata F., Abe A., Ohkubo
M.ら、 Hum Immunol 27巻 269
頁−284頁 1990年) F142:配列番号57記載の核酸塩基配列:DRw1
4c、B1−14c、(Obata F., Ito
I., Ito K.ら、 Immunogeneti
cs 32巻 313頁−320頁 1990年) F143:配列番号58記載の核酸塩基配列:DRw1
4−Dw9、B1*1401、( Obata F.,
Ito I., Ito K.ら、 Immunog
enetics 32巻 313頁−320頁 199
0年) F22:配列番号59記載の核酸塩基配列:B5*01
01、(ObataF., Ito I., Kane
ko T.ら Tissue Antigens 33
巻 550頁−558頁 1989年) F29:配列番号60記載の核酸塩基配列:B1*09
01、B5*0102、B5*0201、B5*020
2、(Obata F., Ito I.,Kanek
o T.ら、 Tissue Antigens 33
巻 550頁−558頁 1989年) F30:配列番号12記載の核酸塩基配列:B1*11
03、 F42:配列番号61記載の核酸塩基配列:B1*04
06、(ObataF., Ito I., Kane
ko T.ら、 Tissue Antigens 3
3巻 550頁−558頁 1989年) F44:配列番号13記載の核酸塩基配列:B1*04
01、 F45:配列番号14記載の核酸塩基配列:B1*04
03、B1*0406、B1*0407、 F46:配列番号62記載の核酸塩基配列:B1*01
01、B1*0102、B1*0404、B1*040
5、B1*0408、B1*1402、(Obata
F., Ito I., Ito K.ら、 Immu
nogenetics 32巻 313頁−320頁
1990年) F141:配列番号63記載の核酸塩基配列:B1*0
701、B1*0702、B1*1401、B1−14
c、B3*0301、(Obata F.,Ito
I., Ito K.ら、 Immunogeneti
cs 32巻313頁−320頁 1990年) F158:配列番号64記載の核酸塩基配列:B1*0
405、B1*0801、B1*0803、B1*13
03、(Obata F., Ito I.,Kane
ko T.ら、 Tissue Antigens 3
3巻 550頁−558頁 1989年) F863:配列番号15記載の核酸塩基配列:B1*0
102、B1*1201、B1−12b、B5*020
1、B5*0202、 F851:配列番号16記載の核酸塩基配列:B1*0
101、B1*0102、B1*0103、B1*03
01、B1*0302、B1*0401、B1*040
2、B1*0403、B1*0404、B1*040
6、B1*0407、B1*0408、B1*080
2、B1*1001、B1*1301、B1*130
2、B1*1402、B1−JX6、B1−PEV、B
3*0201、B3*0202 これらのプローブによって得られるタイピング結果につ
いて、表1に遺伝子型および判明しているDRおよびD
フェノタイプを記載した。
【0026】
【表1】
【0027】なお、DRB1アレルのペアがDRB1*
0403−DRB1*0407、DRB1*0404−
DRB1*0408、DRB1*1101−DR B1
*1104、およびDRB1*1301−DRB1*1
302の間で分別するにはオリゴヌクレオチドは使用で
きない。これらのDRB1ドメインの配列は互いにアミ
ノ酸#86(グリシンあるいはバリン)のみが異なって
おり、この部位の配列が実に多くのDRBアレルに共有
され過ぎているため、特殊なDRBの型を同定する事は
本発明に記載ののオリゴヌクレオチドによるタイピング
では不可能だからである。
【0028】また、DRB1*0701とDRB1*0
702は同一のDRB1ドメイン配列を持っており、区
別することは不可能である。本特許においてはこれらの
DRB1型のペアを任意の単独なDR型として記載す
る。即ちDRB1*0403およびDRB1*0407
はDRB1*04(03/07)、DRB1*0404
およびDRB1*0408はDRB1*04(04/0
8)、DRB1*0701およびDRB1*0702は
DR B1*07(01/02)、DRB1*1101
およびDRB1*1104は DRB1*11(01/
04)、DRB1*1301およびDRB1*1302
はDRB1*13(01/02)と表わす。
【0029】DRw15関連のDRB型の同定にはDR
B5アレル、DRB5*0101とDRB5*0102
をオリゴヌクレオチドの標的に選んだ。この場合にはD
RB5ローカスはDRB1ローカスよりもより多型性に
富むからである。(Wu S., Saunders
T.L., Bach F.H.ら、Nature32
4巻 676頁−679頁 1986年. Lee
B.S.M., Rust N.A., McMich
ael A.J., McDvitt H.O.ら、P
roc Natl Acad Sci USA 84巻
4591頁−4595頁 1987年) 一方、DR
w16関連のDRB型の場合にはDRB1とDRB5を
遺伝子タイピングの情報ローサイとして選択した。
【0030】これらの事情および特殊なDRB1アレル
と特殊なDRB5アレルの間の強い連鎖不平衡のため
(Bodmer J.G., Marsh S.G.
E.,Parham P.ら、 Tissue Ant
igens 35巻 1頁−8頁 1990年. Wu
S., Saunders T.L., Bach
F.H.ら、 Nature 324巻 676頁−6
79頁 1986年.Lee B.S.M., Rus
t N.A., McMichael A.J., M
cDvitt H.O.ら、Natl Acad Sc
i USA84巻 4591頁−4595頁 1987
年. Liu C−P, BachF.H., Wu
S.ら、J Immunol 140巻 3631頁−
3639頁 1988年. Knowles R.
W.、 Histocompatibility Te
sting 1987年 New York, Spr
inger−Verlag, 44頁−46頁 198
9年)、DRB1とDRB5型あるいはハプロタイプを
DRB1型と同等のDRB型の一つと考えて、DRB1
*1501−B5*0101、DRB1*1502−B
5*0102、DRB1*1601−B5*0201、
およびDRB1*1602−B5*0202と表現して
いる。(表2)
【0031】
【表2】
【0032】4種のDRB1−B5型のペア、あるいは
DRw15およびDRw16特異的に結合しているハプ
ロタイプを含む、33種の異なったDRB型が我々のオ
リゴヌクレオチドタイピングにより同定可能であるの
で、検体で現われる2種のDRB型の可能な組合せは全
部で561通りになる。コンピュータ検索によれば、こ
れらの内、28ケースでオリゴヌクレオチドタイピング
によってはDRB型の2つの組合せのどれに相当するか
は判別不能である。この内、7ケースではDRB型の判
定は、DRw11、DRw12、DRw13、DRw1
4、DRw17、およびDRw18からなるDRw52
ファミリーのDRB1アレルが常に4種のDRB3アレ
ル(*0101、*0201、*0202、および*0
301)にリンクしており(Bodmer J.G.,
Marsh S.G.E., Parham P.ら、
Tissue Antigens 35巻 1頁
−8頁 1990年. Abe A., ItoI.,
Ohkubo M.ら、Immunogenetic
s 30巻422頁−426頁 1989年. Ob
ata F. Abe A. Ohkubo M.ら、
Hum Immunol 27巻 269頁−28
4頁1990年. Petersdorf E.W.,
Griffith R.L., Erlich H.
A.ら、 Immunogentics 32巻96
頁−103頁 1990年. Obata F.,
Ito I., Ito K.ら、Immunogen
etics 32巻 313頁−320頁1990年.
Knowles R.W., Dupont B.
ら、 Histocompatibility Tes
ting 1987年. New York、 Spr
inger−Verlag、 44頁−6頁 1989
年.Tiercy J−M, Gorski J.,
Jeannet M., Mach B.ら、 Pro
c Natl Acad Sci USA 85巻19
8頁−202頁 1988年. Fernandez−
Vina M.,Shumway W., Stast
ny P.ら、 Hum Immunol28巻 51
頁−64頁 1990年)、これら全てがDRB3アレ
ルの一定の配列に対して作られている一種のオリゴヌク
レオチドであるF52によって検出されるのでタイピン
グ可能となる。
【0033】その結果、表2に示された21ケースが我
々のオリゴヌクレオチドタイピングでは同定不能として
残される。 検出対象物質 本特許において提案しているオリゴヌクレオチドプロー
ブ群は細胞表面に表現されている膜タンパク質を形成す
るDNA塩基配列の一部に相当している。従って、染色
体DNAを検出対象とすることはもちろん、メッセンジ
ャーRNA、C−DNAに対しても有効である。これら
3種類の核酸類の採取には既知の方法が用いられる。こ
れらの検出対象の内いづれを選択するかは、検査が行わ
れる環境により変化する。
【0034】また、本発明において使用される検体DN
Aは、ヒトの種々の部分から採取することが可能であ
る。その例としては、末梢血、口腔粘膜、髪の毛など体
毛および毛根、爪などを挙げることができる。これらの
内末梢血、口腔粘膜、体毛および毛根から染色体DNA
を採取する場合には、塩化カリウム、塩化マグネシウ
ム、ゼラチン、界面活性剤、プロテナーゼKを含むこと
を特徴とするトリス塩酸緩衝液が好んで使用される。ま
た、爪から染色体DNAを採取する場合には、塩化ナト
リウム、EDTA、ドデシル硫酸ナトリウム、ジチオス
レイトール、およびプロテナーゼKを含むトリス塩酸緩
衝液が好んで用いられる。この溶液において界面活性剤
の例としてはイオン性のドデシル硫酸ナトリウム、非イ
オン性のツイーン20あるいはノニデートP40を挙げ
ることができるが、中でもツイーン20が好んで使用さ
れる。この溶液を使用することによって37℃〜60℃
の温度で0.1時間〜1時間加熱処理し、その後さらに
90℃以上の温度で1分〜10分間加熱処理した後、氷
冷してフェノール抽出、クロロホルム洗浄を経て染色体
DNAの水溶液を得ることができる。本操作によって得
られたDNAは、その染色体DNA量が多い場合にはそ
のままハイブリダイゼーションに使用することができ
る。
【0035】また、本発明に用いられる上記の核酸は必
要に応じて、特にその量が少ない場合にはPCR(ポリ
メラーゼチェインリアクション)にかけて特定領域を増
幅した後にハイブリダイゼーションに使用することがで
きる。この場合には検体量が増加するので検出が容易に
なるとの利点がある。染色体DNAの特定領域をPCR
に掛ける場合には上記の操作中、加熱処理後のフェノー
ル抽出、クロロホルム洗浄を行なわずに単に遠心分離し
た後に、その上清液を使用することも行なわれる。
【0036】PCR PCRの方法をDRB型のタイピングに適用するには、
可能な全てのDRB型の全ての遺伝子を一揃いのプライ
マーを使用して一段階で増幅する一般的な方法と、一種
のDRB型あるいは一種のDRB遺伝子のみを増幅する
グループ特異的増幅法が考えられる。
【0037】この2方法の内、グループ特異的増幅法は
グループ特異的な増幅法であるが故に、先ず標的DRB
型を同定しておくことが必要であること、また一段階で
グループ特異的増幅を行なうためには、分離した個別の
チューブ中で可能性がある全てのプライマーを使用し増
幅を行なわねばならないとの問題がある。グループ特異
的増幅法を採用するか、あるいは一般的増幅法を採用す
るかは、どの程度精密な遺伝子タイピングが必要かに掛
かっている。即ち、グループ特異的増幅法は全ての知ら
れているDRB型を同定するのに有用であり、一方、一
般的増幅法は多くの検体について、プローブの選択しだ
いで一気にタイピングを行える得られる点で有用であ
る。 従って、本特許の目的であるDRB型のタイピン
グの為には、これらの方法の内、おもに一般的な方法が
使用される。
【0038】なお、本特許が提供するオリゴヌクレオチ
ドプローブ群は、グループ特異的増幅法を使用してタイ
ピングを行なう際にも有用であることは言うまでもな
い。 PCR用オリゴヌクレオチドプライマー 本発明において適宜使用されるPCRに用いられるオリ
ゴヌクレオチドプライマーの塩基配列は以下の通りであ
る。 FPR1:配列番号65記載の核酸塩基配列:(Oba
ta F., ItoI., Kaneko T.,
Ohkubo M., Ishimoto A.L.,
Abe A., Kashiwagi N.ら、 T
issue Antigens 33巻 550−55
8頁 1989年) GH46:配列番号67記載の核酸塩基配列:(Sch
arf S.J., Long C.M., Erli
ch H.A.ら、 Hum Immunol22巻
61−69頁 1988年) DRβAMP1:配列番号66記載の核酸塩基配列:
(Todd J.A.,Bell J.I., McD
evitt H.O.ら、 Nature 329巻
599−604頁 1987年) これらの内、オリゴヌクレオチドプライマー、FPR1
−DRβAMP1の組み合せによればDRB遺伝子の第
2エクソン部の第2および第3の超可変領域(238b
p)を増幅することができる(Obata F., A
be A.,Ohkubo M., Ito I.,
Kaneko T., OtaniF., Watan
abe K., Kashiwagi N.ら、Hum
Immunol 27巻 269−284頁 199
0年)ので最も好ましい。
【0039】増幅反応の条件 オリゴヌクレオチドプローブを膜、粒、板状の物質に固
定した状態で使用し、不均一系での交雑反応を行なうの
であれば、この増幅反応を行なう際には、該オリゴヌク
レオチドプライマーがラジオアイソトープおよび/また
は蛍光、発色、発光のいずれかの現象をおこし得る物質
で標識されている、あるいは該物質により標識され得る
ように修飾されていること、および/またはオリゴヌク
レオチドプライマーを使用して検体遺伝子のDNA増幅
反応を行うに際し、その反応の少なくとも一部にラジオ
アイソトープおよび/または蛍光、発色、発光のいずれ
かの現象をおこし得る物質で標識されている、あるいは
該物質により標識され得るように修飾されている核酸を
使用することが必要である。
【0040】一方、検体DNAを膜、粒、棒状の物質に
固定した後に標識したオリゴヌクレオチドプローブを用
いてハイブリダイゼーションさせるのであれば、増幅反
応において検体DNAを標識することは不用であり、標
識したあるいは標識可能な状態に修飾した反応基質を用
いる必要はなくなる。上記の増幅反応を円滑に起こすた
めには酵素に耐熱性DNAポリメラーゼを用い、塩化カ
リウム、塩化マグネシウム、ゼラチン、dGTP、dC
TP、dTTP、dATPおよびオリゴヌクレオチドプ
ライマーを含むトリス・塩酸緩衝液中で反応させること
が好ましい。なおオリゴヌクレオチドプローブを固定し
た膜等を使用してハイブリダイゼーションさせるのであ
れば検体となるDNAを標識しておくことが必要であ
り、ラジオアイソトープを含む核酸、あるいはビオチン
化など非放射性物質で修飾したdATP、dUTPなど
の核酸、あるいはラジオアイソトープあるいはビオチン
化など非放射性物質で修飾したオリゴヌクレオチドプラ
イマーを添加する方法を採用することになる。この中で
は、ラジオアイソトープを使用するよりもビオチン化な
ど非放射性物質で修飾した物質を使用する方法が検査の
安全対策上好んで用いられる。ビオチン化した核酸の中
ではハイブリダイゼーションを円滑に行なわせるために
ビオチン化−14−dATPが好んで用いられる。例え
ばビオチン化−14−dATPの代わりにビオチン化−
21−dUTPを使用するとハイブリダイゼーション強
度にばらつきが認められることがある。
【0041】この際に、検体となる組織の量、血液の量
などにより異なるが、PCR反応は20回以上の降温お
よび昇温のサイクルを繰り返し行われ、検体DNAはほ
ぼ1μg程度に増幅されることが、引き続く検査を円滑
に行なうためには好ましい。なお、検体量が少ない場合
には30回のPCRを行なった後、その反応液に酵素を
添加し、さらにPCRを繰り返し行なうことも有効であ
る。
【0042】具体的には、髪の毛などの体毛から採取し
たDNA溶液を使用する場合には、1回目の反応を先ず
94℃で3分間加熱し、引続き58℃で2分間、更に7
2℃で2分間行い、2回目以降のPCRは94℃で1分
間、58℃で1分間、72℃で2分間、最後が72℃で
2分間という条件で行なうことが好ましい。また口腔粘
膜細胞ほぼ3万個から採取したDNA溶液を使用する場
合には、1回目の反応を先ず94℃で3分間加熱し、引
続き58℃で2分間、更に72℃で2分間行い、2回目
以降のPCRは94℃で10秒間、58℃で30秒間、
72℃で1分間、最後が72℃で2分間という条件で行
なうことが好ましい。
【0043】オリゴヌクレオチドプローブの使用形態 オリゴヌクレオチドプローブは該プローブを適当な基材
に化学的に結合させ、該基材に固定するか、あるいは物
理的に吸着させ固定するかのいづれかの形態、あるいは
溶液中において溶解あるいは懸濁した状態で使用するこ
とが可能であり、これらのいづれの形態をとってもよ
い。しかし、ハイブリダイゼーション時には一般には大
過剰量のオリゴヌクレオチドプローブを使用するため、
オリゴヌクレオチドプローブを溶液中に溶解した状態あ
るいは懸濁状態でハイブリダイゼーションする場合に
は、通常未交雑のオリゴヌクレオチドプローブを除去し
ハイブリダイゼーションの有無を検知しなければならな
いので、検体となる遺伝子あるいは遺伝子の断片を核酸
固定用の膜などの基材に予め固定しておき、該基材を使
用してハイブリダイゼーションさせる方法、あるいは、
逆にオリゴヌクレオチドプローブを固定しておき検体D
NAあるいはその断片を溶解あるいは鹸濁した液を使用
してハイブリダイゼーションさせる方法、また後者の方
法の変法として該オリゴヌクレオチドプローブに加え、
検体中の該オリゴヌクレオチドプローブに相当するDN
A塩基配列以外の部分の塩基配列に相当する少なくとも
もう1種類のオリゴヌクレオチドプローブを用い、この
プローブを核酸固定用の膜に固定しておき、ハイブリダ
イゼーションを行う方法、オリゴヌクレオチドの3’末
端あるいは5’末端に特定の配列を連結しておき、この
塩基配列に相補な配列を予め膜などの固定用該基材に固
定しておきハイブリダイゼーションを行う方法などが採
用される。
【0044】これらの方法の中では、オリゴヌクレオチ
ドプローブを不均一相においてより容易に検体DNAと
交雑反応を行えるよう、該プローブを化学的に結合した
状態で、あるいは物理的に吸着した状態でのいづれかの
状態で固定した形状で使用する方法が好んで使用され
る。この方法において、交雑反応に支障が無い形式で化
学的に結合した状態で使用することが好ましいことは言
うまでもない。この際にプローブを結合させる物質とし
ては膜状の物質、粒状の物質、板状の物質があり、これ
らのいづれかから選択されることになる。交雑反応時の
操作性を良好にするために、これらの中では膜状あるい
は板状の物質が好んで用いられ、なかでも膜状の物質が
最も好んで用いられる。
【0045】プローブをこれらの物質に固定するには、
固定量を増加させるために、また該基材上での交雑反応
の阻害を抑制するために、固定する前に一般的には核酸
のホモポリマーでテーリングしておき、このテーリング
したプローブを固定することが好ましい。そのために
は、一般的には、酵素にターミナルデオキシヌクレオチ
ジルトランスフェラーゼを、反応基質としてdTTP、
あるいはdATP、あるいはdCTP、あるいはdGT
Pを使用して行なうプローブの3’末端のテーリング処
理が採用される。
【0046】この処理においては、カコジル酸ナトリウ
ム、塩化コバルト、ジチオスレイトール、dTTP、あ
るいはdATP、あるいはdCTP、あるいはdGTP
およびプローブを含むトリス塩酸緩衝液が用いられる。
この際にホモポリマーとしてはdTTPを反応基質に用
いるポリdTが好んで形成され、その長さは50塩基長
以上2000塩基以下、好ましくは100塩基長以上1
000塩基以下、より好ましくは200塩基長以上50
0塩基以下の塩基長で形成される。
【0047】このようにして得られるテーリングしたオ
リゴヌクレオチドプローブはセルロースあるいはナイロ
ンを成分として含有する膜に加熱法あるいは紫外線照射
法あるいは他の方法で化学結合を形成させて固定する。
これらの膜の具体例としては、HybondTM−C、H
ybondTM−C extra、HybondTM −E
CL、HybondTM−N、HybondTM−N+(Amer
sham社) 、Whatman541filter(Whatman
社) 、DuralonTMUV、Duralose−UV
TM(Stratagene 社) 、PhotoGene Nylon
Membrane(BRL社) などを挙げることができる
が、これら以外を使用しても遺伝子あるいはオリゴヌク
レオチドプローブを結合させ得るものであれば差し支え
ない。これらの膜に遺伝子あるいはオリゴヌクレオチド
プローブを固定する際には加熱処理、あるいはUV照射
処理などの方法によるが、このいづれかあるいは別の方
法によるかについては、使用する膜の性質によって適宜
変更することになる。例えば、Duralon UV、
Hybond−N+ を使用する場合にはUV照射法によ
り固定し、Hybond−C extraを使用する場
合には真空中80℃に加熱する方法が好んで採用され
る。
【0048】一方、検体遺伝子を固定するためには、検
体DNAをそのまま加熱処理あるいは紫外線照射する方
法などが採用される。また検出に必要となる塩基配列以
外の部位に、例えば5’末端あるいは3’末端をポリd
T等で修飾することが好ましい場合があり、これらの場
合には検体遺伝子を修飾することも行われる。これらの
ための方法として、3’末端の修飾には核酸とターミナ
ルデオキシヌクレオチディルトランスフェラーゼによる
伸長反応あるいは修飾に必要な塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチドとリガーゼを用いる伸長反応がある。ま
た、5’末端の修飾にはPCRに用いるプライマーの
5’末端部分に予め適当な塩基配列を結合させておく方
法などが採用される。
【0049】交雑の有無を調べるには、ハイブリダイゼ
ーションの方法によって異なるが、オリゴヌクレオチド
プローブあるいは検体DNAをラジオアイソトープおよ
び/または蛍光、発色、発光のいずれかの現象をおこし
得る物質で標識しておく、あるいは該物質により標識さ
れ得るように修飾しておくことにより、該標識物質を検
出することで行なわれる。
【0050】ここで用いられる標識物質としては、32
P、35S、125 Iのようなラジオアイソトープ、あるい
はフルオレッセインイソチオシネート(FITC)のよ
うな蛍光色素あるいはビオチン、ジゴキシゲニンなどの
ようなを非ラジオアイソトープを挙げることができる。
検出に当たっては、ラジオアイソトープはX線フィルム
に感光させるなど公知の方法が、蛍光物質の場合には蛍
光光度計による測定が、ビオチン、ジゴキシゲニンの場
合には各々ストレプトアビジンあるいは抗ジコギシゲニ
ン抗体に結合した酵素などにより発光現象あるいは呈色
現象などを起こし、これらを光度計により測定する方
法、X線フィルムに感光させる方法が採用される。ここ
で使用される酵素としては例えばアルカリフォスファタ
ーゼ、ワサビ過酸化酵素を挙げることができる。
【0051】これらの標識物質は、オリゴヌクレオチド
の合成時に、あるいは検体遺伝子の調製時あるいは増幅
時に、これらの目的に合った修飾を施した核酸を使用す
ることによりこれらの塩基配列中に挿入することも、ま
た、5’末端部あるいは3’末端部に付加することも可
能である。このようにして得られた標識化オリゴヌクレ
オチドあるいは標識化検体遺伝子はいづれもHLA−D
Rのタイピングに使用することができる。
【0052】ハイブリダイゼーション 本発明では、ハイブリダイゼーションを必要な種類のプ
ローブを固定した膜状物質あるいは粒状物質あるいは板
状物質、および検体から増幅したDNA断片をアルカリ
変性した検体DNAを使用して行うことを推奨する。こ
の交雑反応には、3M 塩化テトラメチルアンモニウ
ム、2mM EDTA、5×デンハルト溶液、0.1重
量% SDS(ドデシルスルホン酸ナトリウム)、更に
100μg/mlの濃度の変性DNAを含む50mM
トリス塩酸緩衝液(pH8.0)が好んで用いられる。
しかし、この他の組成の液も使用されることは言うまで
もなく、その例としては、6×SSC(0.9M 塩化
ナトリウム、0.09M クエン酸ナトリウム)、0.
5%SDS、100μg/mlの濃度の変性DNAを含
む液などが挙げられる。
【0053】上記の溶液中で42℃の温度で30分乃至
10時間ハイブリダイゼーションを行なう。ハイブリダ
イゼーション後は通常、プローブを固定し、ハイブリダ
イゼーションにかけた膜を室温下、組成が6×SSCお
よび0.1% SDSである洗浄溶液の中で5分間づつ
2回乃至5回洗浄し、引続きハイブリダイゼーション時
の温度である40℃乃至65℃の温度で5分乃至30分
間洗浄する。その後、2×SSC溶液中で1回室温下洗
浄する。ここで洗浄液に組成が6×SSCおよび0.1
% SDSの溶液の代わりに2×SSPE(0.3M
塩化ナトリウム、0.02M 燐酸1ナトリウム、2m
M EDTA)および0.1%SDSの溶液、あるいは
塩化テトラメチルアンモニウム溶液を使用することもで
きる。
【0054】上記したように、本発明ではハイブリダイ
ゼーションを必要な種類のオリゴヌクレオチドプローブ
を固定した膜状物質あるいは粒状物質あるいは板状物
質、および検体から増幅したDNA断片をアルカリ変性
した検体DNAを使用して行うことを推奨するが、検体
から増幅したDNA断片を前記の方法で固定した膜状物
質あるいは粒状物質あるいは板状物質および溶液中に溶
解したオリゴヌクレオチドプローブを用いて行なうこと
も可能である。
【0055】この時のハイブリダイゼーションは、例え
ば以下のように行なわれる。先ず、膜を一片に1個のド
ットがあるようにして12片に切取り、各片をまず12
種の32Pラベルしたオリゴヌクレオチドプローブ(F
1、F2、F4、F7、F8、F9、 F11、F12
0、F13、F123、F142、F143、各2ng
/ml) で6×SSC(塩化ナトリウム、クエン酸ナ
トリウム)、0.5%SDS、5×デンハルト液の混合
液中、37℃で2〜3時間ハイブリダイズさせ、膜は下
記の条件で洗浄する。ここで先ずこれらのオリゴヌクレ
オチドプローブに対する結果を調べる。
【0056】この結果が得られた後に、膜を0.4MN
aOH中、15分間37℃で処理し、続いて0.1×S
SC(15mM塩化ナトリウム、1.9mMクエン酸ナ
トリウム、pH7.0)0.01%SDSからなる水溶
液中、更に15分間37℃で処理してオリゴヌクレオチ
ドプローブを除き、他の異なった14種のオリゴヌクレ
オチドプローブ(F3、F10、F22、F29、F4
2、F44、F45、F46、F121、F122、F
158、F52c、A1416、K1406)と上記の
方法でハイブリダイズさせる。また、上記のハイブリダ
イズでは完全に決めれないものには、上記のオリゴヌク
レオチドプローブに加えてF30、F52、F141、
F851、F863を使用する。
【0057】ハイブリダイズ後の洗浄溶液組成および洗
浄温度は以下の通りである。 F1、F2、F7、F9、F29、F143、F15
8:6×SSC(塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウ
ム)、0.1%SDS、54℃ F4、F8、F10、
F22、F52、F52c、A1416、K1406、
F121、F851、F863:6×SSC(塩化ナト
リウム、クエン酸ナトリウム)、0.1%SDS、57
℃: F11、F13、F30、F42、F120、F
122、F123、F141、F142:6×SSC
(塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、)0.1%S
DS、62℃: F45、F46:3M塩化テトラメチルアンモニウム、
57℃: F3、F44:3M塩化テトラメチルアンモニウム、6
2℃ 上記洗浄の全ての場合に、膜の断片を上記の温度で洗浄
する前に、洗浄液をもちいて室温下で5分間洗浄する。
【0058】この場合のハイブリダイゼーションはハイ
ブリダイズさせようとするオリゴヌクレオチドプローブ
ごとに個別の容器で実施することが必要となり、使用す
るオリゴヌクレオチドプローブの数だけの反応容器、お
よび検体DNAを固定した膜状物質あるいは粒状物質あ
るいは板状物質を用いねばならないこと、従って検査実
施者の操作が煩雑になることは言うまでもない。
【0059】このような操作により得られるハイブリダ
イゼーションの結果の例を図2、図3および図4に示し
た。 検査結果 上記のオリゴヌクレオチドプローブおよびオリゴヌクレ
オチドプライマーを使用して血清学的なDR型あるいは
細胞学的なD型が不明な健康な日本人375人のDRB
遺伝子タイピングを行なった。
【0060】既に記した通り、本特許に記載のオリゴヌ
クレオチドプローブ群によっても、理論的には21種の
同定不可能なケースがある。しかし、これらの21種の
同定不能なケースの内、15ケースは日本人では滅多に
見られないDRB型であり、例えば、DRB1*010
2、DRB1*0103、DRB1*0301、DRB
1*0302、DRB−PEVおよびDRB1*160
1、DRB5*0201は今回調べた375人の日本人
では認められなかった。従って、最終的に6ケース11
人(ケース5、6、9、16、17、18)が同定不能
であったにすぎない。即ち375人中364人(97
%)の型判定が行えたことになる。
【0061】表3には、上記の結果から得られた遺伝子
頻度を、表4には血清学的なタイピングから得られた遺
伝子頻度との比較を、また表5には細胞学的なタイピン
グから得られた遺伝子頻度との比較を示した。この値か
ら、本特許により提供されるプローブ群およびこのプロ
ーブ群を使用するタイピング法では、従来のタイピング
法によるよりも帰属不可能な型を示すブランクの値が小
さくなり、型分け精度が向上していることが明らかであ
る。
【0062】
【表3】
【0063】
【表4】
【0064】
【表5】
【0065】検査試薬キットの内容 上記したように、HLA−DRのオリゴヌクレオチドプ
ローブを用いるタイピングにおいて良好な結果を得るた
めには、該プローブあるいは該プローブを固定した膜状
物質、あるいは粒状物質あるいは板状物質が必須であ
り、さらに該プローブを使用して行なう交雑反応、さら
に洗浄を行うために必要な試薬、更に検体からDNAを
採取する試薬を含むことが望ましい。また該タイピング
を円滑に実施するためにはPCRに使用されるオリゴヌ
クレオチドプライマーが含まれることが望ましい。
【0066】従って、該タイピングに供される試薬キッ
トには検査に必要となる試薬類および器具類が含まれる
ことが望ましく、具体的にはオリゴヌクレオチドプロー
ブ群あるいはこれらをテーリング処理したオリゴヌクレ
オチドプローブ群あるいはテーリング処理したオリゴヌ
クレオチドプローブ群を固定処理した膜、粒、板、標識
用の試薬、検体DNAの遺伝子増幅反応用の試薬、ハイ
ブリダイゼーション用の試薬、ハイブリダイゼーション
後に行う洗浄用の試薬、ハイブリダイゼーション操作用
および洗浄操作用の器具、交雑の有無を判定するための
ポジティブコントロールおよびネガティブコントロール
の標準試薬、判定結果の表現例、検査の各操作に必要な
器具類などが含まれ、これらの全てあるいはオリゴヌク
レオチドプローブを必須として他の物品の一部から構成
される。
【0067】標識用の試薬としては、PhotoGeneTM Nucl
eic Acid Detection System (BRL,Life Technologi-es
Inc.)、Southern Light Kit(Boheringermamhaim )
あるいはDIG systemTM(Boehringer Mannheim )を例に
挙げることができる。また器具としては、BIO-BIK サン
プリングチューブ(BioPlastic Co,Ltd.)などのプラス
チック製チューブ、ボロシリケート処理したガラス製試
験管(Corning GlassWorks )などの試験管、PipetmanT
M(Gilson)などの容量可変デジタル式ピペットおよび
それ用のチップ、加熱シール可能なプラスチックバッグ
(コスモバイオ製など)、検査時に生じる発光、蛍光、
色を検出する光度計、X線フィルム、露光用カセット、
フィルムハンガー(富士メディカルシステム)および恒
温槽、水浴槽を挙げることができる。
【0068】各種の試薬類は必要に応じて濃度を制御で
きるように使用濃度よりも濃厚な溶液として提供される
のが一般的であるが、検査時の必要濃度に調製しておい
ても差し支えない。
【0069】
【発明の効果】本発明により提供されるオリゴヌクレオ
チドプローブ群は、HLA−DR抗原をコードする遺伝
子の遺伝子型を明確に型分けすることが可能であり、該
オリゴヌクレオチドプローブを使用することにより、従
来は型分け不可能であった遺伝子型を型分け可能とし
た。また公知のオリゴヌクレオチドプローブを併せて使
用することにより、日本人の場合には、その97%と高
率でHLA−DR抗原の遺伝子型を型分け可能とした。
このように本発明により提供されるオリゴヌクレオチド
プローブならびにそれを使用する遺伝子型分けの方法に
よれば、従来の型分けによるよりも高精度な型分けが可
能となる。特に抗血清によるタイピングが不能なDRの
型を含めて判定する為には本発明のオリゴヌクレオチド
プローブの使用が必須の要件である。
【0070】上記のように、本発明により提供されるオ
リゴヌクレオチドプローブならびにそれを使用する遺伝
子型分けの方法により、更に新たな診断手法の開発ある
いはその他の医学上の研究の進展も期待できるものであ
る。
【0071】
【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。ただし、これら実施例は本発明の技術的範囲を限定
するものではない。
【0072】
【実施例1】 オリゴヌクレオチドの合成 オリゴヌクレオチドは、Applied Biosystem 社(Foster
City )製の自動DNA合成機を使用して合成し、変性
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。
【0073】PCRプライマーの塩基配列は既に報告さ
れている下記の2種類である。 FPR1、DRβAMP1 また、オリゴヌクレオチドプローブの内、以下の分は既
に報告されている配列を用いている。 F22、F29、F42、F158 F8、F120、F121、F122 F2、F4、F123、F52 F46、F52c、F141、F142、F143 他のオリゴヌクレオチドプローブは既に報告されている
DRBアレルの塩基配列に従って合成した。
【0074】
【実施例2】 検体からの染色体DNAの採取−1 15μlのヒト抹消血あるいは口腔粘膜(約28000
個の細胞を含む)を500μlのTE緩衝液(10mM
トリス塩酸(pH7.4)、1mMEDTA)に鹸濁
し、10秒間、エッペンドルフ社製卓上遠心分離機を用
いて13000rpmで遠心分離した。遠心分離後、上
清液を取り去り、固体物質を残した。ここに500μl
のTE緩衝液を加えてよく攪拌し、固体物質を鹸濁さ
せ、再度遠心分離した。遠心分離後、上清液を取り去
り、固体物質を残した。この操作を引続き2回行い、得
た固体物質に、50mM塩化カリウム、10mMトリス
塩酸(pH8.3)、1.5mM塩化マグネシウム、
0.001%ゼラチン、0.05%ツイーン20、10
μgプロテナーゼKからなる溶液100μlを加えて鹸
濁させ、56℃で45分反応させ、さらに5分間沸騰条
件下で加熱処理した後、氷浴中で急冷した。その後、先
と同様に遠心分離して染色体DNAを含む上清液を得
た。この上清液から5μlを採り、染色体DNA溶液と
してPCRに供した。
【0075】
【実施例3】 検体からの染色体DNAの採取−2 10mMトリス塩酸(pH7.4)、100mM塩化ナ
トリウム、1mMEDTAからなる溶液100μlにジ
チオスレイトール1.5mg、10%SDS25μlを
加えて、ヒトの爪を鹸濁させ、更に100mgのプロテ
ナーゼKを含む溶液10μlを添加して、56℃で5分
〜45分反応させ、さらに95℃で10分間加熱処理し
た後、氷浴中で急冷した。その後、実施例1におけると
同様に遠心分離して染色体DNAを含む上清液を得た。
この上清液から5μl採り、染色体DNA溶液としてP
CRに供した。
【0076】〔比較例1〕50μlの血液を5%EDT
A溶液50μlに鹸濁し、5秒間実施例1におけると同
様に遠心分離した後、上清液を取り除いた。残った固体
物質に水200μlを添加して溶解し、5分間沸騰条件
下で加熱処理した。得られた溶液を上記と同様に遠心分
離して、上清液を採取した。この上清液から40μlを
採り、染色体DNA溶液としてPCRに供した。
【0077】〔比較例2〕50μlのヒト血液を5%E
DTA溶液50μlに鹸濁し、この鹸濁液を注射筒と注
射針(22ゲージ)を用いて、注射筒への出し入れを5
分間行なった。この後、5分間沸騰条件下で加熱処理し
た。得られた溶液を実施例1と同様に遠心分離して、上
清液を採取した。この上清液から40μlを採り、染色
体DNA溶液としてPCRに供した。
【0078】〔比較例3〕100μlの血液を、水10
0μl及び5%EDTA50μlからなる溶液に鹸濁
し、実施例1におけると同様に遠心分離した後、残った
固体物質を0.05%のノニデートP40の水溶液20
0μlに鹸濁し、5分間沸騰条件下で加熱処理した。得
られた溶液を上記と同様に遠心分離して、上清液を採取
した。この上清液から40μlを採り、染色体DNA溶
液としてPCRに供した。
【0079】
【実施例4】ビオチン化−21−dUTPを使用するポ
リメラーゼチェインリアクション(PCR)によるビオ
チン化 10×PCR緩衝液(200mMトリス塩酸、
15mMMgCl、250mMKCl、0. 5%Twe
en20、100μg/mlBSA)を5μl、2. 5
mMdATP、2. 5mMdCTP、2. 5mMdGT
Pを各々1μl、1. 5mMdTTPを1μl、0. 5
mMビオチン化−21−dUTPを1. 25μl、10
μMプライマー液(FPR1プライマーとDRβAMP
1プライマーの等量混合溶液)を1μl、実施例2にお
いて得たDNA溶液を5μl、さらに水を混合し全容量
を49μlとした。この液を混合し、95℃にて5分間
加熱し、室温に放置冷却した。この液に2. 5ユニット
/μlのTaq.DNA ポリメラーゼ溶液1μlを加
え攪拌した後、40μlのミネラルオイルを重層した。
この液をASTEC製PC−500を使用し、PCRを
30回行った。
【0080】PCRにおける最初の反応は55℃で2分
間、72℃で3分間の条件で、2回目以降29回までは
94℃で50秒、55℃で1分間、72℃で2分間の条
件で、30回目は72℃3分間の条件で行った。反応液
を50μlとり、そこへグリコーゲン(10mg/μ
l)1μl、3M酢酸ナトリウム(pH5. 5)を5μ
l、エタノールを165μl混合し、攪拌した後に−2
0℃で30分間冷却した。冷却後5分間12000rp
mの条件で遠心し、固形沈澱物を得た。得た沈澱物に7
0%エタノールを加え、固形沈澱物を洗浄しその後、減
圧下にて乾燥した。このようにして得られたUがビオチ
ン化されたDNAからなる固形物を108μlの水に溶
解し、DNA濃度が0. 01μg/μlの溶液を調製し
た。PCRによる生成DNAの長さはDNA溶液8μl
を1. 0%アガロースゲルにかけて確認した。
【0081】〔比較例4〕実施例4において実施例2に
おいて得られたDNA溶液の代わりに比較例1において
得られたDNA溶液を使用した以外は実施例4と同様に
操作した。その結果、アガロースゲルでは明確なバンド
が認められず、比較例1において得られたDNA溶液は
使用できないことが明らかとなった。
【0082】〔比較例5〕実施例4において実施例2に
おいて得られたDNA溶液の代わりに比較例2において
得られたDNA溶液を使用した以外は実施例4と同様に
操作した。その結果、アガロースゲルでは明確なバンド
が認められず、比較例1において得られたDNA溶液は
使用できないことが明らかとなった。
【0083】〔比較例6〕実施例4において実施例2に
おいて得られたDNA溶液の代わりに比較例3において
得られたDNA溶液を使用した以外は実施例4と同様に
操作した。その結果、アガロースゲルでは明確なバンド
が認められず、比較例1において得られたDNA溶液は
使用できないことが明らかとなった。
【0084】
【実施例5】 ビオチン化−14−dATPを使用するPCRによるビ
オチン化 容量が50μl、実施例2において得られたDNA溶液
を5μlを含み、さらに塩化カリウム、トリス塩酸緩衝
液(pH8.3)、塩化マグネシウム、ゼラチン、dG
TP、dCTP、dTTP、dATP、ビオチン−14
−dATP、プライマー、ベントDNAポリメラーゼ
(NEB社製)の濃度を各々50mM、10mM、1.
5mM、0.001%、50μM、50μM、50μ
M、30μM、12μM、20μM、0.02u/μl
とした水溶液を調製した。この溶液を、95℃にて5分
間加熱し、室温に放置冷却した。この液に2. 5ユニッ
ト/μlのTaq.DNA ポリメラーゼ溶液1μlを
加え攪拌した後、40μlのミネラルオイルを重層し
た。この液をASTEC製PC−500を使用し、PC
Rを30回行った。
【0085】PCRにおける最初の反応は55℃で2分
間、72℃で3分間の条件で、2回目以降29回までは
94℃で50秒、55℃で1分間、72℃で2分間の条
件で、30回目は72℃3分間の条件で行った。反応液
を50μlとり、そこへグリコーゲン(10mg/μ
l)1μl、3M酢酸ナトリウム(pH5.5)を5μ
l、エタノールを165μl混合し、攪拌した後に−2
0℃で30分間冷却した。冷却後5分間12000rp
mの条件で遠心し、固形沈澱物を得た。得た沈澱物に7
0%エタノールを加え、固形沈澱物を洗浄しその後、減
圧下にて乾燥した。このようにして得られたUがビオチ
ン化されたDNAからなる固形物を108μlの水に溶
解し、DNA濃度が0. 01μg/μlの溶液を調製し
た。PCRによる生成DNAの長さはDNA溶液8μl
を1. 0%アガロースゲルにかけて確認した。
【0086】
【実施例6】 オリゴヌクレオチドプローブのテーリングと膜への固定 10×テーリング緩衝液(1Mカコジル酸ナトリウム
(pH7.6)、250mMTris−HCl(pH
7.6)、2mMジチオスレイトール)を10μl、1
00mMdTTPを4μl、プローブを200pmol
混合し、そこへ10mMCoCl2を10μl添加し、
混合した。さらにそこへ25ユニット/μlのターミナ
ルデオキシヌクレオチジイルトランスフェラーゼ(TO
YOBO製)を2μl添加し、全容量を100μlとし
た。この液を37℃にて2時間反応させた後、フェノー
ルとクロロホルムの1/1混合液100μlにより2回
抽出した。抽出残液に3M酢酸ナトリウム溶液を10μ
l、エタノールを330μlを添加し攪拌混合し、−2
0℃にて30分放置した。その後、遠心し、得られた固
形沈澱物を70%エタノールで洗浄した。得られた固形
沈澱物を減圧下で乾燥した。
【0087】このようにして得られた固形物を水50μ
lに溶解し、内42μlの溶液を65℃にて5分加熱
し、直ちに氷中で冷却した。この溶液に1158μlの
10×SSC溶液(1.5M塩化ナトリウム、0.19
Mクエン酸ナトリウム、pH7.0)を加え、攪拌し
た。この溶液を100μlづつミリポア製MilliB
lot−Dを使用してナイロン膜Dularon UV
(Stratagene社製)にブロットした。さらに
MilliBlot−Dのウエルを10×SSC(塩化
ナトリウム、クエン酸ナトリウム溶液で洗浄し、ストラ
リンカーを使用し、紫外線を120000マイクロジュ
ール照射した。
【0088】得られた膜を5×SSPE(0.9M 塩
化ナトリウム、50mM 燐酸二水素ナトリウム(pH
7.4))、5mM EDTA(pH7.4))溶液、
0.5%SDSからなる水溶液中、37℃で15分間洗
浄した。その後、純水中で5分間洗浄した。このように
して得た膜を室温下で風乾した。
【0089】
【実施例7】 ビオチン化−21−dUTPを使用しないPCRによる
遺伝子増幅 実施例3において0.5mMビオチン化−21−dUT
Pを使用せず、さらに添加するdTTPの濃度を2.5
mMとした以外は、実施例3と同様に操作してAがビオ
チン化されたDNAを得た。
【0090】
【実施例8】 DNAプローブのハイブリダイゼーション 健康な日本人ドナーから採取した染色体DNA1μgを
FPR1およびDRβAMP1をプライマーに用いて3
0サイクルのPCRにかけ増幅した。増幅したDRB遺
伝子の第2エクソン部の第2および第3超可変領域を含
む238塩基対のフラグメントをアルカリ変性し、ナイ
ロン膜に12ドット固定した。
【0091】膜を一片に1個のドットがあるようにして
12片に切取り、各片をまず12種の32Pラベルしたオ
リゴヌクレオチドプローブ(F1、F2、F4、F7、
F8、F9、 F11、F120、F13、F123、
F142、F143、各2ng/ml) で6×SSC
(塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム)、0.5%S
DS、5×デンハルト液中、37℃で2〜3時間ハイブ
リダイズさせ、膜は下記の条件で洗浄し、オートラジオ
グラフィーにかけた。
【0092】この結果が得られた後に、膜を0.4MN
aOH中、15分間37℃で処理し、続いて0.1×S
SC(15mM塩化ナトリウム、1.9mMクエン酸ナ
トリウム、pH7.0)、0.01%SDSからなる水
溶液中、更に15分間37℃で処理してオリゴヌクレオ
チドプローブを除き、他の異なった12種のオリゴヌク
レオチドプローブ(F3、F10、F22、F29、F
42、F44、F45、F46、F121、F122、
F158、F52c)と上記の方法でハイブリダイズさ
せた。また、上記のハイブリダイズでは完全に決めれな
いものには、上記のオリゴヌクレオチドプローブに加え
てF3 0、F52、F141、F851、F863を
使用した。
【0093】ハイブリダイズ後の洗浄溶液組成および洗
浄温度は以下の通りである。 F1、F2、F7、F9、F29、F143、F15
8:6×SSC(塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウ
ム)、0.1%SDS、54℃ F4、F8、F10、
F22、F52、F52c、F121、F851、F8
63:6×SSC(塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウ
ム)、0.1%SDS、57℃: F11、F13、F30、F42、F120、F12
2、F123、F141、F142:6×SSC(塩化
ナトリウム、クエン酸ナトリウム、)0.1%SDS、
62℃: F45、F46:3M塩化テトラメチルアンモニウム、
57℃: F3、F44:3M塩化テトラメチルアンモニウム、6
2℃ 上記洗浄の全ての場合に、膜の断片を上記の温度で洗浄
する前に、洗浄液をもちいて室温下で5分間洗浄した。
結果を図2に示す。
【0094】
【実施例9】 プローブ固定膜を使用するハイブリダイゼーション プローブを固定した膜をハイブリダイゼーション用プラ
スチックバッグに入れ、そこへ2mlのハイブリダイゼ
ーション用液(50mMトリス塩酸(pH8.0)、3
Mテトラメチルアンモニウムクロライド、2mMEDT
A(pH8.0)、5×デンハルト液、0.1%SDS、
100μg変性鮭精子DNA)2mlを加え、42℃で
50分間加熱した。その後、増幅し、さらに並行してビ
オチン化−21−dUTPあるいはビオチン化−14−
dATPにより標識したDNAを100ng(100μ
l)添加し、42℃で振盪しながら3時間加熱を続け
た。
【0095】ハイブリダイゼーション後に緩衝液を捨
て、バッグから膜を取り出し、洗浄液I(2×SSP
E、0. 1%SDS)中室温下、5分間の間隔で2回洗
浄した。次に膜を洗浄液II(50mMトリス塩酸(pH
8. 0)、3Mテトラメチルアンモニウムクロライド、
2mMEDTA、5×デンハルト液、0. 1%SDS)
中室温下、5分間洗浄し、さらに洗浄液II中58℃で2
0分間洗浄し、引続き2×SSC(塩化ナトリウム、ク
エン酸ナトリウム)溶液中室温下で5分間洗浄した。
【0096】
【実施例10】 プローブ固定膜を使用するハイブリダイゼーション プローブを固定した膜をハイブリダイゼーション用プラ
スチックバッグに入れ、そこへ2mlのハイブリダイゼ
ーション緩衝液(成分および濃度は以下の通り、50m
Mトリス塩酸(pH8. 0)、3M塩化テトラメチルア
ンモニウム、2mMEDTA(pH8. 0)、5×デン
ハルト(0.1%フィコール、0.21%ポリビニルピ
ロリドン、0.1%BSA)、0. 1%SDS、100
μg/ml変性鮭精子DNA)2mlを加え、42℃で
50分間加熱した。その後、そこへ増幅したDNAを1
00ng(100μl)添加し、42℃で振盪しながら
3時間加熱を続け、ハイブリダイゼーションさせた。
【0097】ハイブリダイゼーション後にハイブリダイ
ゼーション液を捨て、バッグから膜を取り出し、洗浄液
I(2×SSPE(0.36M塩化ナトリウム、20m
M隣酸水素ナトリウム、(pH7.4))、EDTA
(pH7.4))、0. 1%SDS)中室温下、5分間
の間隔で2回洗浄した。次に膜を洗浄液II(50mMト
リス塩酸(pH8.0)、3Mテトラメチルアンモニウ
ムクロライド、2mMEDTA、5×デンハルト溶液、
0. 1%SDS)中室温下、5分間洗浄し、さらに洗浄
液II中58℃で20分間洗浄し、引続き2×SSC(塩
化ナトリウム、クエン酸ナトリウム溶液中室温下で5分
間洗浄した。
【0098】
【実施例11】 検出 (BRL社製 PhotoGeneTM Nucleic Acid Detection Sy
stemを使用)ハイブリダイゼーションおよび洗浄後の膜
をTBSーTween20(100mMトリス塩酸、1
50mMNaCl、0. 05%Tween20)中で室
温下で1分間洗浄した。続いて、膜1cm2 当り0. 7
5mlのブロッキング溶液(3%BSA、TBSーTw
een20)中で室温下50分間処理した。
【0099】ストレプトアビジン−アルカリフォスファ
ターゼ結合体の溶液をTBS−Tween20を用いて
3000倍に希釈した液中で膜を室温下10分間処理し
た。その後、膜1cm2あたり1mlのTBS−Twe
en20溶液中室温下15分間づつ2回洗浄した。さら
に最終緩衝液の10倍希釈液中、室温下1時間洗浄し
た。膜をワットマン3MM濾紙上に置き過剰の緩衝液を
除いた後、膜を現像ホルダー中に置いた。ホルダー中の
膜に検出試薬を滴下し、膜をホルダーで覆った。そのま
ま2時間反応させ、X線フィルムあるいはHyper
Film(アマシャム社)を挟み、15分間露光させ、
現像し、第3図および第4図に示される結果を得た。
【0100】型分け結果 血清学的に明らかにされたDRの型とプローブによって
決定されたDRの型を比較して図2乃至図4ならびに表
4および表5に示した。この結果から、検体DNAを固
定した膜にプローブをハイブリダイズさせた場合、およ
びプローブを固定した膜に検体DNAをバイブリダイズ
させた場合のいづれの場合においても血清学的に決定さ
れたDRの型およびサブタイプを示す結果が得られた。
また、血清学的には決定できない型の場合においても、
その型を決定できた。
【0101】
【配列表】
配列番号:1 (1)配列の長さ:18 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:genomic DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではOA3と記載される。X
は核酸がRNAの場合はU、核酸がDNAの場合はTを
表わす。 (8)配列 AGXAGXXGXC CACCCGGC 18 配列番号:2 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:genomic DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではOF10と記載される。
X は核酸がRNAの場合はU、核酸がDNAの場合はT
を表わす。 (8)配列 XGGAAAGACG CGXCCAXAA 19 配列番号:3 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:genomic DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではOA1416と記載され
る。X は核酸がRNAの場合はU、核酸がDNAの場合
はTを表わす。 (8)配列 CAGGAGGAGA ACGXGCGCX 19 配列番号:4 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:genomic DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではOF30と記載される。
X は核酸がRNAの場合はU、核酸がDNAの場合はT
を表わす。 (8)配列 GACXXCCXGG AAGACGAGC 19 配列番号:5 (1)配列の長さ:18 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:genomic DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではOF44と記載される。
X は核酸がRNAの場合はU、核酸がDNAの場合はT
を表わす。 (8)配列 CGCGGCCCGC XXCXGCXC 18 配列番号:6 (1)配列の長さ:18 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:genomic DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではOF45と記載される。
X は核酸がRNAの場合はU、核酸がDNAの場合はT
を表わす。 (8)配列 CCXCGGCCCG CCXCXGCX 18 配列番号:7 (1)配列の長さ:18 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:genomic DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではOF863と記載され
る。X は核酸がRNAの場合はU、核酸がDNAの場合
はTを表わす。 (8)配列 GCXCXCCACA GCCCCGXA 18 配列番号:8 (1)配列の長さ:18 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:genomic DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではOF851と記載され
る。X は核酸がRNAの場合はU、核酸がDNAの場合
はTを表わす。 (8)配列 GCGGCCXGAX GCCGAGXA 18 配列番号:9 (1)配列の長さ:18 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではA3と記載される。 (8)配列 GCCGGGTGGA CAACTACT 18 配列番号:10 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではF10と記載される。 (8)配列 TTATGGACGC GTCTTTCCA 19 配列番号:11 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではA1416と記載され
る。 (8)配列 AGCGCACGTT CTCCTCCTG 19 配列番号:12 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではF30と記載される。 (8)配列 GCTCGTCTTC CAGGAAGTC 19 配列番号:13 (1)配列の長さ:18 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではF44と記載される。 (8)配列 GAGCAGAAGC GGGCCGCG 18 配列番号:14 (1)配列の長さ:18 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではF45と記載される。 (8)配列 AGCAGAGGCG GGCCGAGG 18 配列番号:15 (1)配列の長さ:18 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではF863と記載される。 (8)配列 TACGGGGCTG TGGAGAGC 18 配列番号:16 (1)配列の長さ:18 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではF851と記載される。 (8)配列 TACTCGGCAT CAGGCCGC 18 配列番号:17 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:genomic DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではOF1と記載される。X
は核酸がRNAの場合はU、核酸がDNAの場合はTを
表わす。 (8)配列 GCXGGAAAGA XGCAXCXAX 19 配列番号:18 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:genomic DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではOF2と記載される。X
は核酸がRNAの場合はU、核酸がDNAの場合はTを
表わす。 (8)配列 CXCXGXGCAG GAACCGCAC 19 配列番号:19 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:genomic DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではOF3と記載される。X
は核酸がRNAの場合はU、核酸がDNAの場合はTを
表わす。 (8)配列 GXCXGCAGXA GXXGXCCAC 19 配列番号:20 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:genomic DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではOF4と記載される。X
は核酸がRNAの場合はU、核酸がDNAの場合はTを
表わす。 (8)配列 CCXCXXGGXG AXAGAAGXA 19 配列番号:21 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:genomic DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではOF7と記載される。X
は核酸がRNAの場合はU、核酸がDNAの場合はTを
表わす。 (8)配列 CCXGGAAAGA CXCXXCXAX 19 配列番号:22 (1)配列の長さ:18 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:genomic DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではOF8と記載される。X
は核酸がRNAの場合はU、核酸がDNAの場合はTを
表わす。 (8)配列 GGCCCXGGXG GACACCXA 18 配列番号:23 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:genomic DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではOF9と記載される。X
は核酸がRNAの場合はU、核酸がDNAの場合はTを
表わす。 (8)配列 GGXGCGGXAX CXGCACAGA 19 配列番号:24 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:genomic DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではOF11と記載される。
X は核酸がRNAの場合はU、核酸がDNAの場合はT
を表わす。 (8)配列 CCAGXACXCC XCAXCAGGC 19 配列番号:25 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:genomic DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではOF13と記載される。
X は核酸がRNAの場合はU、核酸がDNAの場合はT
を表わす。 (8)配列 CGCXCGXCXX CCAGGAXGX 19 配列番号:26 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではOF52と記載される。
X は核酸がRNAの場合はU、核酸がDNAの場合はT
を表わす。 (8)配列 XGGACAAXXA CXGCAGACA 19 配列番号:27 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではOF52cと記載され
る。X は核酸がRNAの場合はU、核酸がDNAの場合
はTを表わす。 (8)配列 GAAGXAXCXC XCCAGGAAC 19 配列番号:28 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではOF53と記載される。
X は核酸がRNAの場合はU、核酸がDNAの場合はT
を表わす。 (8)配列 CXGAXCAGGX XCCACACXC 19 配列番号:29 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではOF120と記載され
る。X は核酸がRNAの場合はU、核酸がDNAの場合
はTを表わす。 (8)配列 AAGCGCAGGA GCXCCXCCX 19 配列番号:30 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではOF121と記載され
る。X は核酸がRNAの場合はU、核酸がDNAの場合
はTを表わす。 (8)配列 GCCXGXCXXC CAGGAXGXC 19 配列番号:31 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b)株名: (7)配列の特徴:本文中ではOF122と記載され
る。X は核酸がRNAの場合はU、核酸がDNAの場合
はTを表わす。 (8)配列 CGCCXGXCXX CCAGGAAGX 19 配列番号:32 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではOF123と記載され
る。X は核酸がRNAの場合はU、核酸がDNAの場合
はTを表わす。 (8)配列 GCCXGXCXXC CAGGAGGXC 19 配列番号:33 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではOF142と記載され
る。X は核酸がRNAの場合はU、核酸がDNAの場合
はTを表わす。 (8)配列 CGGCCXGAXG CXGAGXACX 19 配列番号:34 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではOF143と記載され
る。X は核酸がRNAの場合はU、核酸がDNAの場合
はTを表わす。 (8)配列 GXXCCAGXGC XCCGCAGCA 19 配列番号:35 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではOF22と記載される。
X は核酸がRNAの場合はU、核酸がDNAの場合はT
を表わす。 (8)配列 CAACAGGAGG ACXXGCGCX 19 配列番号:36 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではOF29と記載される。
X は核酸がRNAの場合はU、核酸がDNAの場合はT
を表わす。 (8)配列 XGCACAGAGG CAXCXAXAA 19 配列番号:37 (1)配列の長さ:20 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではOF42と記載される。
X は核酸がRNAの場合はU、核酸がDNAの場合はT
を表わす。 (8)配列 ACGGACXCCX CXXGGXGAXA 20 配列番号:38 (1)配列の長さ:18 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではOF46と記載される。
X は核酸がRNAの場合はU、核酸がDNAの場合はT
を表わす。 (8)配列 ACCGCGGCCC GCCXCXGC 18 配列番号:39 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:genomic DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではOF141と記載され
る。X は核酸がRNAの場合はU、核酸がDNAの場合
はTを表わす。 (8)配列 CAGGAGGAGX XCGXGCGCX 19 配列番号:40 (1)配列の長さ:18 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:genomic DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではOF158と記載され
る。X は核酸がRNAの場合はU、核酸がDNAの場合
はTを表わす。 (8)配列 AGXACXCGGC GCXAGGCC 18 配列番号:41 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではF1と記載される。 (8)配列 ATAGATGCAT CTTTCCAGC 19 配列番号:42 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではF2と記載される。 (8)配列 GTGCGGTTCC TGCACAGAG 19 配列番号:43 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではF3と記載される。 (8)配列 GTGGACAACT ACTGCAGAC 19 配列番号:44 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではF4と記載される。 (8)配列 TACTTCTATC ACCAAGAGG 19 配列番号:45 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではF7と記載される。 (8)配列 ATAGAAGAGT CTTTCCAGG 19 配列番号:46 (1)配列の長さ:18 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではF8と記載される。 (8)配列 TAGGTGTCCA CCAGGGCC 18 配列番号:47 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではF9と記載される。 (8)配列 TCTGTGCAGA TACCGCACC 19 配列番号:48 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではF11と記載される。 (8)配列 GCCTGATGAG GAGTACTGG 19 配列番号:49 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではF13と記載される。 (8)配列 ACATCCTGGA AGACGAGCG 19 配列番号:50 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではF52と記載される。 (8)配列 TGTCTGCAGT AATTGTCCA 19 配列番号:51 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではF52cと記載される。 (8)配列 GTTCCTGGAG AGATACTTC 19 配列番号:52 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではF53と記載される。 (8)配列 GAGTGTGGAA CCTGATCAG 19 配列番号:53 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではF120と記載される。 (8)配列 AGGAGGAGCT CCTGCGCTT 19 配列番号:54 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではF121と記載される。 (8)配列 GACATCCTGG AAGACAGGC 19 配列番号:55 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではF122と記載される。 (8)配列 ACTTCCTGGA AGACAGGCG 19 配列番号:56 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではF123と記載される。 (8)配列 GACCTCCTGG AAGACAGGC 19 配列番号:57 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではF142と記載される。 (8)配列 AGTACTCAGC ATCAGGCCG 19 配列番号:58 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではF143と記載される。 (8)配列 TGCTGCGGAG CACTGGAAC 19 配列番号:59 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではF22と記載される。 (8)配列 AGCGCAAGTC CTCCTGTTG 19 配列番号:60 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではF29と記載される。 (8)配列 TTATAGATGC CTCTGTGCA 19 配列番号:61 (1)配列の長さ:20 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではF42と記載される。 (8)配列 TATCACCAAG AGGAGTCCGT 20 配列番号:62 (1)配列の長さ:18 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではF46と記載される。 (8)配列 GCAGAGGCGG GCCGCGGT 18 配列番号:63 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではF141と記載される。 (8)配列 AGCGCACGAA CTCCTCCTG 19 配列番号:64 (1)配列の長さ:18 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではF158と記載される。 (8)配列 GGCCTAGCGC CGAGTACT 18 配列番号:65 (1)配列の長さ:25 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖(4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではFPR1と記載される。
【0102】配列中、T(C)はTとCの混合物を意味する。 (8)配列 AGTGTCATTT CTTCAAT(C)GGG ACCCA 25 配列番号:66 (1)配列の長さ:20 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではDRβAMP1と記載さ
れる。 (8)配列 CGCTGCACTG TCAAGCTCTC 20 配列番号:67 (1)配列の長さ:27 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源 (a) 生物名:ヒト (b) 株名: (7)配列の特徴:本文中ではGH46と記載される。 (8)配列 CCGGATCCTT CGTGTCCCCA CAGCACG 27 配列番号:68 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:genomic DNA (6)起源 (a)生物名:ヒト (b)株名: (7)配列の特徴:本文中ではOK1406と記載され
る。Xは核酸がRNAの場合はU、核酸がDNAの場合
にはTを表わす。 (8)配列 AACCAGGAGG AGAACGXGC 19 配列番号:69 (1)配列の長さ:19 (2)配列の型:核酸 (3)鎖の数:一本鎖 (4)トポロジー:直鎖状 (5)配列の種類:合成オリゴヌクレオチド DNA (6)起源(a)生物名:ヒト (b)株名: (7)配列の特徴:本文中ではK1406と記載され
る。 (8)配列: GCACGTTCTC CTCCTGGTT 19
【図面の簡単な説明】
【図1】オリゴヌクレオチドプローブでHLA抗原遺伝
子の構造を示す図。
【図2】オリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリ
ダイゼーションによるタイピングの結果を示す図。
【図3】オリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリ
ダイゼーションによるタイピングの結果を示す図。
【図4】オリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリ
ダイゼーションによるタイピングの結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 G01N 33/53 D 8310−2J K 8310−2J (72)発明者 宮越 照一 千葉県袖ヶ浦市長浦字拓二号580番32

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 下記の配列番号1乃至配列番号8で表わ
    される核酸塩基配列の1種または2種以上を検出するた
    めのHLA−DR抗原の遺伝子タイピング用のオリゴヌ
    クレオチドプローブ。 OA3:配列番号1記載の核酸塩基配列 OF10:配列番号2記載の核酸塩基配列 OA1416:配列番号3記載の核酸塩基配列 OK1406:配列番号68記載の核酸塩基配列 OF30:配列番号4記載の核酸塩基配列 OF44:配列番号5記載の核酸塩基配列 OF45:配列番号6記載の核酸塩基配列 OF863:配列番号7記載の核酸塩基配列 OF851:配列番号8記載の核酸塩基配列
  2. 【請求項2】 下記の配列番号9乃至配列番号16で表
    される核酸塩基配列の1種または2種以上を含むHLA
    −DR抗原の遺伝子タイピング用のオリゴヌクレオチド
    プローブ。 A3:配列番号9記載の核酸塩基配列 F10:配列番号10記載の核酸塩基配列 A1416:配列番号11記載の核酸塩基配列 K1406:配列番号69記載の核酸塩基配列 F30:配列番号12記載の核酸塩基配列 F44:配列番号13記載の核酸塩基配列 F45:配列番号14記載の核酸塩基配列 F863:配列番号15記載の核酸塩基配列 F851:配列番号16記載の核酸塩基配列
  3. 【請求項3】 請求項1記載の核酸塩基配列に加えて下
    記の配列番号17乃至配列番号40で表わされる核酸塩
    基配列の1種または2種以上をも検出することを特徴と
    するHLA−DR抗原の遺伝子タイピング用のオリゴヌ
    クレオチドプローブ。 OF1:配列番号17記載の核酸塩基配列 OF2:配列番号18記載の核酸塩基配列 OF3:配列番号19記載の核酸塩基配列 OF4:配列番号20記載の核酸塩基配列 OF7:配列番号21記載の核酸塩基配列 OF8:配列番号22記載の核酸塩基配列 OF9:配列番号23記載の核酸塩基配列 OF11:配列番号24記載の核酸塩基配列 OF13:配列番号25記載の核酸塩基配列 OF52:配列番号26記載の核酸塩基配列 OF52c:配列番号27記載の核酸塩基配列 OF53:配列番号28記載の核酸塩基配列 OF120:配列番号29記載の核酸塩基配列 OF121:配列番号30記載の核酸塩基配列 OF122:配列番号31記載の核酸塩基配列 OF123:配列番号32記載の核酸塩基配列 OF142:配列番号33記載の核酸塩基配列 OF143:配列番号34記載の核酸塩基配列 OF22:配列番号35記載の核酸塩基配列 OF29:配列番号36記載の核酸塩基配列 OF42:配列番号37記載の核酸塩基配列 OF46:配列番号38記載の核酸塩基配列 OF141:配列番号39記載の核酸塩基配列 OF158:配列番号40記載の核酸塩基配列
  4. 【請求項4】 請求項2記載のオリゴヌクレオチドプロ
    ーブに加えて下記の配列番号41乃至配列番号64の核
    酸塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドプローブの1
    種または2種以上をも含むHLA−DR抗原の遺伝子タ
    イピング用のオリゴヌクレオチドプローブ。 F1:配列番号41記載の核酸塩基配列 F2:配列番号42記載の核酸塩基配列 F3:配列番号43記載の核酸塩基配列 F4:配列番号44記載の核酸塩基配列 F7:配列番号45記載の核酸塩基配列 F8:配列番号46記載の核酸塩基配列 F9:配列番号47記載の核酸塩基配列 F11:配列番号48記載の核酸塩基配列 F13:配列番号49記載の核酸塩基配列 F52:配列番号50記載の核酸塩基配列 F52c:配列番号51記載の核酸塩基配列 F53:配列番号52記載の核酸塩基配列 F120:配列番号53記載の核酸塩基配列 F121:配列番号54記載の核酸塩基配列 F122:配列番号55記載の核酸塩基配列 F123:配列番号56記載の核酸塩基配列 F142:配列番号57記載の核酸塩基配列 F143:配列番号58記載の核酸塩基配列 F22:配列番号59記載の核酸塩基配列 F29:配列番号60記載の核酸塩基配列 F42:配列番号61記載の核酸塩基配列 F46:配列番号62記載の核酸塩基配列 F141:配列番号63記載の核酸塩基配列 F158:配列番号64記載の核酸塩基配列
  5. 【請求項5】 請求項1乃至4のいずれかに記載のオリ
    ゴヌクレオチドプローブにおいて、少なくとも連続した
    10塩基の塩基配列を含むことを特徴とするHLA−D
    R抗原の遺伝子タイピング用のオリゴヌクレオチドプロ
    ーブ。
  6. 【請求項6】 該オリゴヌクレオチドプローブがHLA
    −DRをコードする以外の染色体遺伝子、あるいは相補
    DNAの塩基配列に交雑しないことを特徴とする請求項
    2、4、5のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプロ
    ーブ。
  7. 【請求項7】 該オリゴヌクレオチドプローブがラジオ
    アイソトープあるいは/および蛍光、発光、発色のいず
    れかの現象を起こし得る物質で標識されている、あるい
    は該物質により標識され得るように修飾されていること
    を特徴とする請求項2、4、5、6のいずれかに記載の
    オリゴヌクレオチドプローブ。
  8. 【請求項8】 該オリゴヌクレオチドプローブの少なく
    とも連続した10塩基の塩基配列を含むオリゴヌクレオチ
    ドが膜などに固定されていることを特徴とする請求項
    2、4、5、6、7のいずれかに記載のオリゴヌクレオ
    チドプローブ。
  9. 【請求項9】 該オリゴヌクレオチドプローブを、人の
    血液あるいは/および口腔粘膜あるいは/および髪の毛
    あるいは/および爪を検体とした検出に用いることを特
    徴とするHLA−DR抗原の遺伝子タイピングの方法。
  10. 【請求項10】 HLA−DR抗原の遺伝子タイピングを
    行なうための検体からDNAを得る際に使用するもので
    あって、塩化カリウム、塩化マグネシウム、ゼラチン、
    界面活性剤、プロテナーゼKを含むことを特徴とするト
    リス塩酸緩衝液。
  11. 【請求項11】 請求項9に記載の検体から得られるHL
    A−DR抗原をコードするDNAの内、少なくとも請求
    項1乃至6に記載のいずれかのオリゴヌクレオチドプロ
    ーブの塩基配列を含む領域であり、且つ少なくともその
    一部がラジオアイソトープあるいは/および蛍光、発
    光、発色のいずれかの現象を起こし得る物質で標識され
    ている、あるいは該物質により標識され得るように修飾
    されていることを特徴とする検体DNAおよび該DNA
    を含む溶液。
  12. 【請求項12】 HLA−DR抗原をコードするDNAの
    内、請求項1乃至6項のいずれかに記載のオリゴヌクレ
    オチドの塩基配列を含む部分領域を下記の方法で増幅す
    るHLA−DR抗原をコードするDNAの増幅方法。 (1) 耐熱性DNAポリメラーゼ存在下に、オリゴヌクレ
    オチドプライマーと加熱処理によってデネイチャーした
    HLA−DRをコードする染色体DNAをアニールし、
    (2) アニールしたDNAを加熱処理してプライマーイク
    ステンションさせ、(3) (1) および(2) のステップを繰
    り返す。
  13. 【請求項13】 増幅反応をラジオアイソトープおよび/
    あるいは蛍光、発光、発色のいずれかの現象を起こし得
    る物質で標識されている、あるいは該物質により標識さ
    れ得るように修飾されているオリゴヌクレオチドプライ
    マーを用いて行うことを特徴とする請求項12に記載の
    増幅方法。
  14. 【請求項14】 該増幅反応をラジオアイソトープおよび
    /あるいは蛍光、発色、発光のいずれかの現象を起こし
    得る物質で標識されている、あるいは該物質により標識
    され得るように修飾されている核酸を用いて行ない請求
    項2、4、5、6、8のいずれかに記載のオリゴヌクレ
    オチドとハイブリダイゼーションさせることを特徴とす
    る請求項12または13に記載の増幅方法。
  15. 【請求項15】 該オリゴヌクレオチドプライマーの塩基
    配列が配列番号65または配列番号66で表わされる請
    求項12または13に記載のオリゴヌクレオチドプライ
    マー。 FPR1:配列番号65に記載の核酸塩基配列 DRβAMP1:配列番号66に記載の核酸塩基配列
  16. 【請求項16】 HLA−DR抗原の遺伝子タイピングを
    行なうためにDNA増幅反応を行なう際に使用するもの
    であって、塩化カリウム、塩化マグネシウム、ゼラチ
    ン、dGTP、dCTP、dTTP、dATPおよび請
    求項15記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含むこ
    とを特徴とするトリス・塩酸緩衝液。
  17. 【請求項17】 請求項8に記載のオリゴヌクレオチドプ
    ローブに請求項11に記載のDNAをハイブリダイゼーシ
    ョンさせる際に使用するものであって、テトラメチルア
    ンモニウム、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム、デン
    ハルト液、ドデシル硫酸ナトリウム、キャリヤーDNA
    を含むことを特徴とするトリス塩酸緩衝液。
  18. 【請求項18】 請求項8に記載の物質に請求項11に記
    載のDNAをハイブリダイゼーションさせた後の洗浄に
    使用するものであって、テトラメチルアンモニウム、エ
    チレンジアミン四酢酸ナトリウム、デンハルト液、ドデ
    シル硫酸ナトリウムを含むことを特徴とするトリス塩酸
    緩衝液。
  19. 【請求項19】 請求項1乃至8のいずれかに記載のオリ
    ゴヌクレオチドプローブ、および請求項15に記載のオ
    リゴヌクレオチドプライマー、請求項10、16、1
    7、18のいずれかに記載の緩衝液の内、該オリゴヌク
    レオチドロープを含む少なくとも2種類以上の構成物か
    らなることを特徴とするHLA−DR抗原の遺伝子タイ
    ピング用の試薬キット。
  20. 【請求項20】 請求項19に記載の試薬キットに、遺伝子
    採取処理用、DNA増幅反応用、ハイブリダイゼーショ
    ン用、ハイブリダイゼーション後の洗浄用、検出反応用
    チューブなどの必要な器具のすべてあるいは一部を加え
    て構成されることを特徴とするHLA−DR抗原の遺伝
    子タイピング用の検査キット。
  21. 【請求項21】 HLA−DR抗原の遺伝子タイピングを
    行なうに際し、請求項1乃至8のいずれかに記載の塩基
    配列で表わされるオリゴヌクレオチドプローブ群あるい
    は請求項19または20に記載の試薬キットあるいは検
    査キットを使用することを特徴とするHLA−DR抗原
    の遺伝子タイピングの方法。
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JP4224432A Pending JPH0690757A (ja) 1991-08-23 1992-08-24 Hla−drタイピング用塩基配列群とそれを用いた hla−drタイピング法

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