JPH0690757A - Ｈｌａ−ｄｒタイピング用塩基配列群とそれを用いた ｈｌａ−ｄｒタイピング法 - Google Patents
Ｈｌａ−ｄｒタイピング用塩基配列群とそれを用いた ｈｌａ−ｄｒタイピング法Info
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- JPH0690757A JPH0690757A JP4224432A JP22443292A JPH0690757A JP H0690757 A JPH0690757 A JP H0690757A JP 4224432 A JP4224432 A JP 4224432A JP 22443292 A JP22443292 A JP 22443292A JP H0690757 A JPH0690757 A JP H0690757A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ＨＬＡ−ＤＲ抗原分子のサブタイプの識別を
も精密に実施することを可能とする特定の配列を有する
オリゴヌクレオチドプローブ群、およびオリゴヌクレオ
チドプローブ群を含む検査試薬および器具を含む遺伝子
タイピングキット、さらに該試薬を用いる新規なタイピ
ング法 【効果】 本発明により提供されるオリゴヌクレオチド
プローブ群は、ＨＬＡ−ＤＲ抗原をコードする遺伝子の
遺伝子型を明確に型分けすることが可能であり、該オリ
ゴヌクレオチドプローブを使用することにより、従来は
型分け不可能であった遺伝子型を型分け可能とした。ま
た公知のオリゴヌクレオチドプローブを併せて使用する
ことにより、日本人の場合には、その９７％と高率でＨ
ＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子型を型分け可能とした。
も精密に実施することを可能とする特定の配列を有する
オリゴヌクレオチドプローブ群、およびオリゴヌクレオ
チドプローブ群を含む検査試薬および器具を含む遺伝子
タイピングキット、さらに該試薬を用いる新規なタイピ
ング法 【効果】 本発明により提供されるオリゴヌクレオチド
プローブ群は、ＨＬＡ−ＤＲ抗原をコードする遺伝子の
遺伝子型を明確に型分けすることが可能であり、該オリ
ゴヌクレオチドプローブを使用することにより、従来は
型分け不可能であった遺伝子型を型分け可能とした。ま
た公知のオリゴヌクレオチドプローブを併せて使用する
ことにより、日本人の場合には、その９７％と高率でＨ
ＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子型を型分け可能とした。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト白血球抗原の内Ｄ
Ｒ抗原をコードする塩基配列を対象として行なわれる遺
伝子タイピングを目的としたオリゴヌクレオチドプロー
ブおよびこのオリゴヌクレオチドプローブを含む遺伝子
タイピング用の試薬キットおよび使用する器具を含む遺
伝子タイピングキット、さらにこれらを用いるヒト白血
球抗原のＤＲ抗原のタイピングの方法に関する。
Ｒ抗原をコードする塩基配列を対象として行なわれる遺
伝子タイピングを目的としたオリゴヌクレオチドプロー
ブおよびこのオリゴヌクレオチドプローブを含む遺伝子
タイピング用の試薬キットおよび使用する器具を含む遺
伝子タイピングキット、さらにこれらを用いるヒト白血
球抗原のＤＲ抗原のタイピングの方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒト白血球抗原（ＨＬＡと省略する）の
タイピング（型分け）は、臓器移植時の適合性の判定の
みならず、疾病に対する個人の感受性の判定などにおい
てその重要性が注目されている。わが国で頻度が高い腎
移植の場合、血縁者がドナーとなる生体腎移植と、非血
縁者からの死体腎移植とでは適合度が異なり、生体腎移
植の方が良好な成績を納めている。このことは、従来の
血清学的タイピングでは同定できないサブタイプの存在
か、あるいは連鎖する他の遺伝子座が移植臓器の生着に
影響している可能性を示唆するものである（代謝ハイラ
イト、代謝２５巻、臨時増刊号、山村雄一・吉利和監
修、３７３−３８０頁、東京、中山書店発行）。
タイピング（型分け）は、臓器移植時の適合性の判定の
みならず、疾病に対する個人の感受性の判定などにおい
てその重要性が注目されている。わが国で頻度が高い腎
移植の場合、血縁者がドナーとなる生体腎移植と、非血
縁者からの死体腎移植とでは適合度が異なり、生体腎移
植の方が良好な成績を納めている。このことは、従来の
血清学的タイピングでは同定できないサブタイプの存在
か、あるいは連鎖する他の遺伝子座が移植臓器の生着に
影響している可能性を示唆するものである（代謝ハイラ
イト、代謝２５巻、臨時増刊号、山村雄一・吉利和監
修、３７３−３８０頁、東京、中山書店発行）。
【０００３】血清学的なタイピングは、特異性の明らか
な抗血清を補体とともに検索対象のリンパ球に加えて、
その細胞が傷害されるか否かを調べることによって行な
われている。この方法は簡便ではあるもののＨＬＡ抗原
分子の抗原決定基の微妙な違いを識別できないため、サ
ブタイプの存在を見落とす場合がある。また血清学的タ
イピングのもう一つの欠点は、血清学的タイピングでは
未検出のＨＬＡも存在していることである。この割合は
日本人集団においては１１％の比率を占めていると言わ
れており（Ｂａｕｒ Ｍ．Ｐ．， Ｎｅｕｇｅｂａｕｅ
ｒ Ｍ．， Ｄｅｐｐｅ Ｓｉｇｍｕｎｄ Ｍ．， Ｌ
ｕｔｏｎ Ｔ．， Ｍａｙｅｒ Ｗ．Ｒ．， Ａｌｂｅ
ｒｔ Ｅ．Ｄ．ら、 Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌ
ｉｔｙｔｅｓｔｉｎｇ １９８４．Ｂｅｒｌｉｎ，Ｓｐ
ｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、３３３頁 １９８４
年）、これは決して少なくない数である。
な抗血清を補体とともに検索対象のリンパ球に加えて、
その細胞が傷害されるか否かを調べることによって行な
われている。この方法は簡便ではあるもののＨＬＡ抗原
分子の抗原決定基の微妙な違いを識別できないため、サ
ブタイプの存在を見落とす場合がある。また血清学的タ
イピングのもう一つの欠点は、血清学的タイピングでは
未検出のＨＬＡも存在していることである。この割合は
日本人集団においては１１％の比率を占めていると言わ
れており（Ｂａｕｒ Ｍ．Ｐ．， Ｎｅｕｇｅｂａｕｅ
ｒ Ｍ．， Ｄｅｐｐｅ Ｓｉｇｍｕｎｄ Ｍ．， Ｌ
ｕｔｏｎ Ｔ．， Ｍａｙｅｒ Ｗ．Ｒ．， Ａｌｂｅ
ｒｔ Ｅ．Ｄ．ら、 Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌ
ｉｔｙｔｅｓｔｉｎｇ １９８４．Ｂｅｒｌｉｎ，Ｓｐ
ｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、３３３頁 １９８４
年）、これは決して少なくない数である。
【０００４】しかしながら、非血縁者からの死体腎移植
は多くなる一方で、従来の血清学的タイピングのみでは
組織適合度を詳細に検討できないのが実状である。
は多くなる一方で、従来の血清学的タイピングのみでは
組織適合度を詳細に検討できないのが実状である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】ＨＬＡ抗原はクラスＩ
抗原とクラスII抗原に大別される。腎移植を例にあげる
とクラスII抗原の一致が生着に重要であることが示唆さ
れている。クラスII抗原はＤＲ、ＤＱ、ＤＰの３種の抗
原から構成されており、この中でも細胞膜表面上に最も
多く発現されているＤＲ抗原の適合性が重要とされてい
る〔雨宮浩、佐田正晴：相沢班腎移植と適合性の集計、
昭和５８年度科学研究費補助金〔総合研究（Ａ）〕研究
成果報告書：ＨＬＡ−Ｄ領域の構成と機能、６７頁、１
９８４年〕。
抗原とクラスII抗原に大別される。腎移植を例にあげる
とクラスII抗原の一致が生着に重要であることが示唆さ
れている。クラスII抗原はＤＲ、ＤＱ、ＤＰの３種の抗
原から構成されており、この中でも細胞膜表面上に最も
多く発現されているＤＲ抗原の適合性が重要とされてい
る〔雨宮浩、佐田正晴：相沢班腎移植と適合性の集計、
昭和５８年度科学研究費補助金〔総合研究（Ａ）〕研究
成果報告書：ＨＬＡ−Ｄ領域の構成と機能、６７頁、１
９８４年〕。
【０００６】ＨＬＡ−ＤＲ分子はヒトのクラスII分子の
中で最も広く遺伝的な相違点を有している。即ち、１８
種のＨＬＡ−ＤＲ（ＤＲ１からＤＲｗ１８まで）および
２種のＨＬＡ−ＤＲｗ（ＤＲｗ５２とＤＲｗ５３）の
血清学的な特異性がリンパ球テスト（ＣＤＬ）の結果に
よって定義されており、また、２６種のＨＬＡ−Ｄ（Ｄ
ｗ１からＤｗ２６まで）の細胞特異性が混合リンパ球試
験（ＭＬＲ）の結果によって定義されている。（Ｂｏｄ
ｍｅｒ Ｗ．Ｆ．， Ａｌｂｅｒｅｔ Ｅ．，Ｂｏｄｍ
ｅｒ Ｊ．Ｇ．ら、 Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌ
ｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ １９８７年． Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ、 Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、７２頁 １
９８９年） ＨＬＡ−ＤＲＡと−ＤＲＢ遺伝子の塩基配列分析により
ＤＲとほとんどのＤ特異性がＤＲβ鎖の第１ドメインを
コードしているＤＲＢ遺伝子（Ｂ１、Ｂ３、Ｂ４、およ
びＢ５）の第２エクソン部によって決定されていること
が判ってきた（Ｆｌｏｍｅｎｂｅｒｅｇ， Ｎ．， Ｈ
ｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙＴｅｓｔｉｎｇ
１９８７． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｓｐｒｉｇｅｒ−Ｖｅ
ｒｌａｇ、５３２頁 １９８９年． Ｂｏｄｍｅｒ
Ｊ．Ｇ．， Ｍａｒｓｈ Ｓ．Ｇ．Ｅ．ら、 Ｔｉｓｓ
ｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ３５巻 １頁 １９９０
年）。さらに、塩基分析の結果からＤＲＢアレルの５〜
６個の帰属不明な変異物の存在が明らかにされている。
（Ｂｏｄｍｅｒ Ｊ．Ｇ．， Ｍａｒｓｈ Ｓ．Ｇ．
Ｅ．， Ｐａｒｈａｍ Ｐ．ら、 Ｔｉｓｓｓｕｅ Ａ
ｎｔｉｇｅｎｓ ３５巻 １頁 １９９０年． Ａｂｅ
Ａ．， Ｉｔｏ Ｉ．， Ｏｈｋｕｂｏ Ｍ．ら、
Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３０巻 ４２２頁 １
９８９年． Ｏｂａｔａ Ｆ．， Ａｂｅ Ａ．， Ｏ
ｈｋｕｂｏ Ｍ．ら、 Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７
巻 ２６９頁 １９９０年． Ｐｅｔｅｒｓｄｏｒｆ
Ｅ．Ｗ．， Ｇｒｉｆｆｉｔｈ Ｒ．Ｌ．， Ｅｒｌｉ
ｃｈｉ Ｈ．Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ
３２巻 ９６頁 １９９０年． Ｏｂａｔａ Ｆ．，
Ｉｔｏ Ｉ．， Ｉｔｏ Ｋ．ら Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ ３２巻 ３１３頁 １９９０年） これらの経緯を経て、免疫学的な手段によって検出され
る数以上のＤＲＢアレルが知られるようになった。この
ような例としては、３８種のＤＲＢ１アレル、４種のＤ
ＲＢ３アレル、１種のＤＲＢ４アレル、および４種のＤ
ＲＢ５アレルを挙げることができる。（Ｂｏｄｍｅｒ
Ｊ．Ｇ．， Ｍａｒｓｈ Ｓ．Ｇ．Ｅ．， Ｐａｒｈａ
ｍ Ｐ．ら、 Ｔｉｓｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ３
５巻 １頁 １９９０年） 従って、ＨＬＡ−ＤＲ抗
原を精密に分類できるタイピング法が重要であることは
言うまでもない。しかし、血清学的方法による従来法に
よっては、必ずしも満足されるタイピング結果が得られ
ず、臓器移植など臨床的な観点からは従来の血清学的タ
イピングでは不十分と言わざるを得ない。
中で最も広く遺伝的な相違点を有している。即ち、１８
種のＨＬＡ−ＤＲ（ＤＲ１からＤＲｗ１８まで）および
２種のＨＬＡ−ＤＲｗ（ＤＲｗ５２とＤＲｗ５３）の
血清学的な特異性がリンパ球テスト（ＣＤＬ）の結果に
よって定義されており、また、２６種のＨＬＡ−Ｄ（Ｄ
ｗ１からＤｗ２６まで）の細胞特異性が混合リンパ球試
験（ＭＬＲ）の結果によって定義されている。（Ｂｏｄ
ｍｅｒ Ｗ．Ｆ．， Ａｌｂｅｒｅｔ Ｅ．，Ｂｏｄｍ
ｅｒ Ｊ．Ｇ．ら、 Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌ
ｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ １９８７年． Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ、 Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、７２頁 １
９８９年） ＨＬＡ−ＤＲＡと−ＤＲＢ遺伝子の塩基配列分析により
ＤＲとほとんどのＤ特異性がＤＲβ鎖の第１ドメインを
コードしているＤＲＢ遺伝子（Ｂ１、Ｂ３、Ｂ４、およ
びＢ５）の第２エクソン部によって決定されていること
が判ってきた（Ｆｌｏｍｅｎｂｅｒｅｇ， Ｎ．， Ｈ
ｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙＴｅｓｔｉｎｇ
１９８７． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｓｐｒｉｇｅｒ−Ｖｅ
ｒｌａｇ、５３２頁 １９８９年． Ｂｏｄｍｅｒ
Ｊ．Ｇ．， Ｍａｒｓｈ Ｓ．Ｇ．Ｅ．ら、 Ｔｉｓｓ
ｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ３５巻 １頁 １９９０
年）。さらに、塩基分析の結果からＤＲＢアレルの５〜
６個の帰属不明な変異物の存在が明らかにされている。
（Ｂｏｄｍｅｒ Ｊ．Ｇ．， Ｍａｒｓｈ Ｓ．Ｇ．
Ｅ．， Ｐａｒｈａｍ Ｐ．ら、 Ｔｉｓｓｓｕｅ Ａ
ｎｔｉｇｅｎｓ ３５巻 １頁 １９９０年． Ａｂｅ
Ａ．， Ｉｔｏ Ｉ．， Ｏｈｋｕｂｏ Ｍ．ら、
Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３０巻 ４２２頁 １
９８９年． Ｏｂａｔａ Ｆ．， Ａｂｅ Ａ．， Ｏ
ｈｋｕｂｏ Ｍ．ら、 Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７
巻 ２６９頁 １９９０年． Ｐｅｔｅｒｓｄｏｒｆ
Ｅ．Ｗ．， Ｇｒｉｆｆｉｔｈ Ｒ．Ｌ．， Ｅｒｌｉ
ｃｈｉ Ｈ．Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ
３２巻 ９６頁 １９９０年． Ｏｂａｔａ Ｆ．，
Ｉｔｏ Ｉ．， Ｉｔｏ Ｋ．ら Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ ３２巻 ３１３頁 １９９０年） これらの経緯を経て、免疫学的な手段によって検出され
る数以上のＤＲＢアレルが知られるようになった。この
ような例としては、３８種のＤＲＢ１アレル、４種のＤ
ＲＢ３アレル、１種のＤＲＢ４アレル、および４種のＤ
ＲＢ５アレルを挙げることができる。（Ｂｏｄｍｅｒ
Ｊ．Ｇ．， Ｍａｒｓｈ Ｓ．Ｇ．Ｅ．， Ｐａｒｈａ
ｍ Ｐ．ら、 Ｔｉｓｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ３
５巻 １頁 １９９０年） 従って、ＨＬＡ−ＤＲ抗
原を精密に分類できるタイピング法が重要であることは
言うまでもない。しかし、血清学的方法による従来法に
よっては、必ずしも満足されるタイピング結果が得られ
ず、臓器移植など臨床的な観点からは従来の血清学的タ
イピングでは不十分と言わざるを得ない。
【０００７】本発明は、血清学的タイピングでは識別困
難なＨＬＡ−ＤＲ抗原分子を含めて、ほぼ全ての型を判
別するための遺伝子タイピング用検査試薬を提供するこ
とを目的としている。さらに詳しくは、特にＨＬＡ−Ｄ
Ｒ抗原分子のサブタイプの識別をも精密に実施すること
を可能とするオリゴヌクレオチドプローブ群、およびオ
リゴヌクレオチドプローブ群を含む検査試薬および器具
を含む遺伝子タイピングキット、さらに該試薬を用いる
新規なタイピング法を提供することを目的としている。
難なＨＬＡ−ＤＲ抗原分子を含めて、ほぼ全ての型を判
別するための遺伝子タイピング用検査試薬を提供するこ
とを目的としている。さらに詳しくは、特にＨＬＡ−Ｄ
Ｒ抗原分子のサブタイプの識別をも精密に実施すること
を可能とするオリゴヌクレオチドプローブ群、およびオ
リゴヌクレオチドプローブ群を含む検査試薬および器具
を含む遺伝子タイピングキット、さらに該試薬を用いる
新規なタイピング法を提供することを目的としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、血清学的タイ
ピングでは分けることができないＨＬＡ−ＤＲ抗原分子
のサブタイプや血清学的にブランクと呼ばれるものも含
めて、これらの抗原分子の各々のＤＮＡ塩基配列に特異
的なオリゴヌクレオチドプローブ群に関するものであ
る。
ピングでは分けることができないＨＬＡ−ＤＲ抗原分子
のサブタイプや血清学的にブランクと呼ばれるものも含
めて、これらの抗原分子の各々のＤＮＡ塩基配列に特異
的なオリゴヌクレオチドプローブ群に関するものであ
る。
【０００９】本発明者らはＨＬＡ−ＤＲ抗原、中でもブ
ランクあるいはサブタイプを遺伝子レベルでタイピング
することができれば、現状以上に詳細なタイピングが可
能であり、血清学的なタイピングの欠点をも解消できる
と考えるに至った。具体的には、ＤＲ抗原の遺伝的多型
に富む領域に存在する個々の抗原決定部位に相当する特
異的な塩基配列に特異的に交雑し得るオリゴヌクレオチ
ドプローブを作製し、それに対して検体の遺伝子が交雑
するか否かでＤＲ抗原のタイプを決定する方法である。
ランクあるいはサブタイプを遺伝子レベルでタイピング
することができれば、現状以上に詳細なタイピングが可
能であり、血清学的なタイピングの欠点をも解消できる
と考えるに至った。具体的には、ＤＲ抗原の遺伝的多型
に富む領域に存在する個々の抗原決定部位に相当する特
異的な塩基配列に特異的に交雑し得るオリゴヌクレオチ
ドプローブを作製し、それに対して検体の遺伝子が交雑
するか否かでＤＲ抗原のタイプを決定する方法である。
【００１０】そこで、このような考え方に従って、種々
のＤＲＢタイプの塩基配列を比較検討し、各々のタイプ
に固有の塩基配列を検索した。その結果、サブタイプお
よび血清学的には判別困難な型を含めて塩基配列の違い
が認められた。これらの塩基配列を基に、新規なオリゴ
ヌクレオチドプローブを含めて、それぞれのＤＲ抗原遺
伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを作製し
た。また、さらにこれらのプローブを用いて遺伝子タイ
ピングを行なった結果、ほぼ全てのＤＲＢの型を判別す
ることができた。
のＤＲＢタイプの塩基配列を比較検討し、各々のタイプ
に固有の塩基配列を検索した。その結果、サブタイプお
よび血清学的には判別困難な型を含めて塩基配列の違い
が認められた。これらの塩基配列を基に、新規なオリゴ
ヌクレオチドプローブを含めて、それぞれのＤＲ抗原遺
伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを作製し
た。また、さらにこれらのプローブを用いて遺伝子タイ
ピングを行なった結果、ほぼ全てのＤＲＢの型を判別す
ることができた。
【００１１】すなわち本発明は、下記の配列番号１乃至
配列番号８で表わされる核酸塩基配列の１種または２種
以上を検出するためのＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子タイピ
ング用のオリゴヌクレオチドプローブである。 ＯＡ３：配列番号１記載の核酸塩基配列 ＯＦ１０：配列番号２記載の核酸塩基配列 ＯＡ１４１６：配列番号３記載の核酸塩基配列 ＯＫ１４０６：配列番号６８記載の核酸塩基配列 ＯＦ３０：配列番号４記載の核酸塩基配列 ＯＦ４４：配列番号５記載の核酸塩基配列 ＯＦ４５：配列番号６記載の核酸塩基配列 ＯＦ８６３：配列番号７記載の核酸塩基配列 ＯＦ８５１：配列番号８記載の核酸塩基配列 また、本発明は下記の配列番号９乃至配列番号１６で表
される核酸塩基配列の１種または２種以上を含むＨＬＡ
−ＤＲ抗原の遺伝子タイピング用のオリゴヌクレオチド
プローブである。 Ａ３：配列番号９記載の核酸塩基配列 Ｆ１０：配列番号１０記載の核酸塩基配列 Ａ１４１６：配列番号１１記載の核酸塩基配列 Ｋ１４０６：配列番号６９記載の核酸塩基配列 Ｆ３０：配列番号１２記載の核酸塩基配列 Ｆ４４：配列番号１３記載の核酸塩基配列 Ｆ４５：配列番号１４記載の核酸塩基配列 Ｆ８６３：配列番号１５記載の核酸塩基配列 Ｆ８５１：配列番号１６記載の核酸塩基配列 また、本発明は配列番号１乃至配列番号８の核酸塩基配
列の１種または２種以上に加えて下記の配列番号１７乃
至配列番号４０で表わされる核酸塩基配列の１種または
２種以上をも検出することを特徴とするＨＬＡ−ＤＲ抗
原の遺伝子タイピング用のオリゴヌクレオチドプローブ
である。 ＯＦ１：配列番号１７記載の核酸塩基配列 ＯＦ２：配列番号１８記載の核酸塩基配列 ＯＦ３：配列番号１９記載の核酸塩基配列 ＯＦ４：配列番号２０記載の核酸塩基配列 ＯＦ７：配列番号２１記載の核酸塩基配列 ＯＦ８：配列番号２２記載の核酸塩基配列 ＯＦ９：配列番号２３記載の核酸塩基配列 ＯＦ１１：配列番号２４記載の核酸塩基配列 ＯＦ１３：配列番号２５記載の核酸塩基配列 ＯＦ５２：配列番号２６記載の核酸塩基配列 ＯＦ５２ｃ：配列番号２７記載の核酸塩基配列 ＯＦ５３：配列番号２８記載の核酸塩基配列 ＯＦ１２０：配列番号２９記載の核酸塩基配列 ＯＦ１２１：配列番号３０記載の核酸塩基配列 ＯＦ１２２：配列番号３１記載の核酸塩基配列 ＯＦ１２３：配列番号３２記載の核酸塩基配列 ＯＦ１４２：配列番号３３記載の核酸塩基配列 ＯＦ１４３：配列番号３４記載の核酸塩基配列 ＯＦ２２：配列番号３５記載の核酸塩基配列 ＯＦ２９：配列番号３６記載の核酸塩基配列 ＯＦ４２：配列番号３７記載の核酸塩基配列 ＯＦ４６：配列番号３８記載の核酸塩基配列 ＯＦ１４１：配列番号３９記載の核酸塩基配列 ＯＦ１５８：配列番号４０記載の核酸塩基配列 また、本発明は配列番号９乃至配列番号１６の１種また
は２種以上のオリゴヌクレオチドプローブに加えて下記
の配列番号４１乃至配列番号６４の核酸塩基配列で表さ
れるオリゴヌクレオチドプローブの１種または２種以上
をも含むＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子タイピング用のオリ
ゴヌクレオチドプローブである。 Ｆ１：配列番号４１記載の核酸塩基配列 Ｆ２：配列番号４２記載の核酸塩基配列 Ｆ３：配列番号４３記載の核酸塩基配列 Ｆ４：配列番号４４記載の核酸塩基配列 Ｆ７：配列番号４５記載の核酸塩基配列 Ｆ８：配列番号４６記載の核酸塩基配列 Ｆ９：配列番号４７記載の核酸塩基配列 Ｆ１１：配列番号４８記載の核酸塩基配列 Ｆ１３：配列番号４９記載の核酸塩基配列 Ｆ５２：配列番号５０記載の核酸塩基配列 Ｆ５２ｃ：配列番号５１記載の核酸塩基配列 Ｆ５３：配列番号５２記載の核酸塩基配列 Ｆ１２０：配列番号５３記載の核酸塩基配列 Ｆ１２１：配列番号５４記載の核酸塩基配列 Ｆ１２２：配列番号５５記載の核酸塩基配列 Ｆ１２３：配列番号５６記載の核酸塩基配列 Ｆ１４２：配列番号５７記載の核酸塩基配列 Ｆ１４３：配列番号５８記載の核酸塩基配列 Ｆ２２：配列番号５９記載の核酸塩基配列 Ｆ２９：配列番号６０記載の核酸塩基配列 Ｆ４２：配列番号６１記載の核酸塩基配列 Ｆ４６：配列番号６２記載の核酸塩基配列 Ｆ１４１：配列番号６３記載の核酸塩基配列 Ｆ１５８：配列番号６４記載の核酸塩基配列 また、本発明は上記に記載のオリゴヌクレオチドプロー
ブにおいて、少なくとも連続した１０塩基の塩基配列を
含むことを特徴とするＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子タイピ
ング用のオリゴヌクレオチドプローブである。
配列番号８で表わされる核酸塩基配列の１種または２種
以上を検出するためのＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子タイピ
ング用のオリゴヌクレオチドプローブである。 ＯＡ３：配列番号１記載の核酸塩基配列 ＯＦ１０：配列番号２記載の核酸塩基配列 ＯＡ１４１６：配列番号３記載の核酸塩基配列 ＯＫ１４０６：配列番号６８記載の核酸塩基配列 ＯＦ３０：配列番号４記載の核酸塩基配列 ＯＦ４４：配列番号５記載の核酸塩基配列 ＯＦ４５：配列番号６記載の核酸塩基配列 ＯＦ８６３：配列番号７記載の核酸塩基配列 ＯＦ８５１：配列番号８記載の核酸塩基配列 また、本発明は下記の配列番号９乃至配列番号１６で表
される核酸塩基配列の１種または２種以上を含むＨＬＡ
−ＤＲ抗原の遺伝子タイピング用のオリゴヌクレオチド
プローブである。 Ａ３：配列番号９記載の核酸塩基配列 Ｆ１０：配列番号１０記載の核酸塩基配列 Ａ１４１６：配列番号１１記載の核酸塩基配列 Ｋ１４０６：配列番号６９記載の核酸塩基配列 Ｆ３０：配列番号１２記載の核酸塩基配列 Ｆ４４：配列番号１３記載の核酸塩基配列 Ｆ４５：配列番号１４記載の核酸塩基配列 Ｆ８６３：配列番号１５記載の核酸塩基配列 Ｆ８５１：配列番号１６記載の核酸塩基配列 また、本発明は配列番号１乃至配列番号８の核酸塩基配
列の１種または２種以上に加えて下記の配列番号１７乃
至配列番号４０で表わされる核酸塩基配列の１種または
２種以上をも検出することを特徴とするＨＬＡ−ＤＲ抗
原の遺伝子タイピング用のオリゴヌクレオチドプローブ
である。 ＯＦ１：配列番号１７記載の核酸塩基配列 ＯＦ２：配列番号１８記載の核酸塩基配列 ＯＦ３：配列番号１９記載の核酸塩基配列 ＯＦ４：配列番号２０記載の核酸塩基配列 ＯＦ７：配列番号２１記載の核酸塩基配列 ＯＦ８：配列番号２２記載の核酸塩基配列 ＯＦ９：配列番号２３記載の核酸塩基配列 ＯＦ１１：配列番号２４記載の核酸塩基配列 ＯＦ１３：配列番号２５記載の核酸塩基配列 ＯＦ５２：配列番号２６記載の核酸塩基配列 ＯＦ５２ｃ：配列番号２７記載の核酸塩基配列 ＯＦ５３：配列番号２８記載の核酸塩基配列 ＯＦ１２０：配列番号２９記載の核酸塩基配列 ＯＦ１２１：配列番号３０記載の核酸塩基配列 ＯＦ１２２：配列番号３１記載の核酸塩基配列 ＯＦ１２３：配列番号３２記載の核酸塩基配列 ＯＦ１４２：配列番号３３記載の核酸塩基配列 ＯＦ１４３：配列番号３４記載の核酸塩基配列 ＯＦ２２：配列番号３５記載の核酸塩基配列 ＯＦ２９：配列番号３６記載の核酸塩基配列 ＯＦ４２：配列番号３７記載の核酸塩基配列 ＯＦ４６：配列番号３８記載の核酸塩基配列 ＯＦ１４１：配列番号３９記載の核酸塩基配列 ＯＦ１５８：配列番号４０記載の核酸塩基配列 また、本発明は配列番号９乃至配列番号１６の１種また
は２種以上のオリゴヌクレオチドプローブに加えて下記
の配列番号４１乃至配列番号６４の核酸塩基配列で表さ
れるオリゴヌクレオチドプローブの１種または２種以上
をも含むＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子タイピング用のオリ
ゴヌクレオチドプローブである。 Ｆ１：配列番号４１記載の核酸塩基配列 Ｆ２：配列番号４２記載の核酸塩基配列 Ｆ３：配列番号４３記載の核酸塩基配列 Ｆ４：配列番号４４記載の核酸塩基配列 Ｆ７：配列番号４５記載の核酸塩基配列 Ｆ８：配列番号４６記載の核酸塩基配列 Ｆ９：配列番号４７記載の核酸塩基配列 Ｆ１１：配列番号４８記載の核酸塩基配列 Ｆ１３：配列番号４９記載の核酸塩基配列 Ｆ５２：配列番号５０記載の核酸塩基配列 Ｆ５２ｃ：配列番号５１記載の核酸塩基配列 Ｆ５３：配列番号５２記載の核酸塩基配列 Ｆ１２０：配列番号５３記載の核酸塩基配列 Ｆ１２１：配列番号５４記載の核酸塩基配列 Ｆ１２２：配列番号５５記載の核酸塩基配列 Ｆ１２３：配列番号５６記載の核酸塩基配列 Ｆ１４２：配列番号５７記載の核酸塩基配列 Ｆ１４３：配列番号５８記載の核酸塩基配列 Ｆ２２：配列番号５９記載の核酸塩基配列 Ｆ２９：配列番号６０記載の核酸塩基配列 Ｆ４２：配列番号６１記載の核酸塩基配列 Ｆ４６：配列番号６２記載の核酸塩基配列 Ｆ１４１：配列番号６３記載の核酸塩基配列 Ｆ１５８：配列番号６４記載の核酸塩基配列 また、本発明は上記に記載のオリゴヌクレオチドプロー
ブにおいて、少なくとも連続した１０塩基の塩基配列を
含むことを特徴とするＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子タイピ
ング用のオリゴヌクレオチドプローブである。
【００１２】また、本発明は上記に記載のオリゴヌクレ
オチドプローブがＨＬＡ−ＤＲをコードする以外の染色
体遺伝子、あるいは相補ＤＮＡの塩基配列に交雑しない
ことを特徴とする上記いずれかに記載のオリゴヌクレオ
チドプローブである。また、本発明は上記に記載のオリ
ゴヌクレオチドプローブがラジオアイソトープあるいは
／および蛍光、発光、発色のいずれかの現象を起こし得
る物質で標識されている、あるいは該物質により標識さ
れ得るように修飾されていることを特徴とする、上記い
ずれかのオリゴヌクレオチドプローブである。
オチドプローブがＨＬＡ−ＤＲをコードする以外の染色
体遺伝子、あるいは相補ＤＮＡの塩基配列に交雑しない
ことを特徴とする上記いずれかに記載のオリゴヌクレオ
チドプローブである。また、本発明は上記に記載のオリ
ゴヌクレオチドプローブがラジオアイソトープあるいは
／および蛍光、発光、発色のいずれかの現象を起こし得
る物質で標識されている、あるいは該物質により標識さ
れ得るように修飾されていることを特徴とする、上記い
ずれかのオリゴヌクレオチドプローブである。
【００１３】また、本発明は上記に記載のオリゴヌクレ
オチドプローブの少なくとも連続した10塩基の塩基配列
を含むオリゴヌクレオチドが膜などに固定されているこ
とを特徴とする、上記いずれかのオリゴヌクレオチドプ
ローブである。また、本発明は上記に記載のオリゴヌク
レオチドプローブを、人の血液あるいは／および口腔粘
膜あるいは／および髪の毛あるいは／および爪を検体と
した検出に用いることを特徴とするＨＬＡ−ＤＲ抗原の
遺伝子タイピングの方法である。
オチドプローブの少なくとも連続した10塩基の塩基配列
を含むオリゴヌクレオチドが膜などに固定されているこ
とを特徴とする、上記いずれかのオリゴヌクレオチドプ
ローブである。また、本発明は上記に記載のオリゴヌク
レオチドプローブを、人の血液あるいは／および口腔粘
膜あるいは／および髪の毛あるいは／および爪を検体と
した検出に用いることを特徴とするＨＬＡ−ＤＲ抗原の
遺伝子タイピングの方法である。
【００１４】また、本発明はＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子
タイピングを行なうための検体からＤＮＡを得る際に使
用されるものであって、塩化カリウム、塩化マグネシウ
ム、ゼラチン、界面活性剤、プロテナーゼＫを含むこと
を特徴とするトリス塩酸緩衝液である。また、本発明は
前記検体から得られるＨＬＡ−ＤＲ抗原をコードするＤ
ＮＡの内、少なくとも前記オリゴヌクレオチドプローブ
の塩基配列を含む領域であり、且つ少なくともその一部
がラジオアイソトープあるいは／および蛍光、発光、発
色のいずれかの現象を起こし得る物質で標識されてい
る、あるいは該物質により標識され得るように修飾され
ていることを特徴とする検体ＤＮＡおよび該ＤＮＡを含
む溶液である。
タイピングを行なうための検体からＤＮＡを得る際に使
用されるものであって、塩化カリウム、塩化マグネシウ
ム、ゼラチン、界面活性剤、プロテナーゼＫを含むこと
を特徴とするトリス塩酸緩衝液である。また、本発明は
前記検体から得られるＨＬＡ−ＤＲ抗原をコードするＤ
ＮＡの内、少なくとも前記オリゴヌクレオチドプローブ
の塩基配列を含む領域であり、且つ少なくともその一部
がラジオアイソトープあるいは／および蛍光、発光、発
色のいずれかの現象を起こし得る物質で標識されてい
る、あるいは該物質により標識され得るように修飾され
ていることを特徴とする検体ＤＮＡおよび該ＤＮＡを含
む溶液である。
【００１５】また、本発明はＨＬＡ−ＤＲ抗原をコード
する塩基配列の内、上記いずれかのオリゴヌクレオチド
の塩基配列を含む部分領域を下記の方法で増幅するＨＬ
Ａ−ＤＲ抗原をコードする塩基配列の増幅方法である。 (1) 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ存在下に、オリゴヌクレ
オチドプライマーと加熱処理によってデネイチャーした
ＨＬＡ−ＤＲをコードする染色体ＤＮＡをアニールし、
(2) アニールしたＤＮＡを加熱処理してプライマーイク
ステンションさせ、(3) (1) および(2) のステップを繰
り返す。
する塩基配列の内、上記いずれかのオリゴヌクレオチド
の塩基配列を含む部分領域を下記の方法で増幅するＨＬ
Ａ−ＤＲ抗原をコードする塩基配列の増幅方法である。 (1) 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ存在下に、オリゴヌクレ
オチドプライマーと加熱処理によってデネイチャーした
ＨＬＡ−ＤＲをコードする染色体ＤＮＡをアニールし、
(2) アニールしたＤＮＡを加熱処理してプライマーイク
ステンションさせ、(3) (1) および(2) のステップを繰
り返す。
【００１６】また、本発明は増幅反応をラジオアイソト
ープおよび／あるいは蛍光、発光、発色のいずれかの現
象を起こし得る物質で標識されている、あるいは該物質
により標識され得るように修飾されているオリゴヌクレ
オチドプライマーを用いて行うことを特徴とする上記増
幅方法である。また、本発明は該増幅反応をラジオアイ
ソトープおよび／あるいは蛍光、発色、発光のいずれか
の現象を起こし得る物質で標識されている、あるいは該
物質により標識され得るように修飾されている核酸を用
いて行ない上記いずれかに記載のオリゴヌクレオチドと
ハイブリダイゼーションさせることを特徴とする上記増
幅方法である。
ープおよび／あるいは蛍光、発光、発色のいずれかの現
象を起こし得る物質で標識されている、あるいは該物質
により標識され得るように修飾されているオリゴヌクレ
オチドプライマーを用いて行うことを特徴とする上記増
幅方法である。また、本発明は該増幅反応をラジオアイ
ソトープおよび／あるいは蛍光、発色、発光のいずれか
の現象を起こし得る物質で標識されている、あるいは該
物質により標識され得るように修飾されている核酸を用
いて行ない上記いずれかに記載のオリゴヌクレオチドと
ハイブリダイゼーションさせることを特徴とする上記増
幅方法である。
【００１７】また、本発明は上記に記載のオリゴヌクレ
オチドプライマーの塩基配列が配列番号６５または配列
番号６６で表わされるオリゴヌクレオチドプライマーで
ある。 ＦＰＲ１：配列番号６５に記載の核酸塩基配列 ＤＲβＡＭＰ１：配列番号６６に記載の核酸塩基配列 また、本発明はＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子タイピングを
行なうためにＤＮＡ増幅反応を行なう際に使用するもの
であって、塩化カリウム、塩化マグネシウム、ゼラチ
ン、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰおよび上
記のオリゴヌクレオチドプライマーを含むことを特徴と
するトリス・塩酸緩衝液である。
オチドプライマーの塩基配列が配列番号６５または配列
番号６６で表わされるオリゴヌクレオチドプライマーで
ある。 ＦＰＲ１：配列番号６５に記載の核酸塩基配列 ＤＲβＡＭＰ１：配列番号６６に記載の核酸塩基配列 また、本発明はＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子タイピングを
行なうためにＤＮＡ増幅反応を行なう際に使用するもの
であって、塩化カリウム、塩化マグネシウム、ゼラチ
ン、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰおよび上
記のオリゴヌクレオチドプライマーを含むことを特徴と
するトリス・塩酸緩衝液である。
【００１８】また、本発明は上記記載のオリゴヌクレオ
チドプローブに前記ＤＮＡをハイブリダイゼーションさ
せる際に使用するものであって、テトラメチルアンモニ
ウム、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム、デンハルト
液、ドデシル硫酸ナトリウム、キャリヤーＤＮＡを含む
ことを特徴とするトリス塩酸緩衝液である。また、本発
明は上記記載のオリゴヌクレオチドプローブに検体のＤ
ＮＡをハイブリダイゼーションさせた後の洗浄に使用す
るものであって、テトラメチルアンモニウム、エチレン
ジアミン四酢酸ナトリウム、デンハルト液、ドデシル硫
酸ナトリウム、を含むことを特徴とするトリス塩酸緩衝
液である。
チドプローブに前記ＤＮＡをハイブリダイゼーションさ
せる際に使用するものであって、テトラメチルアンモニ
ウム、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム、デンハルト
液、ドデシル硫酸ナトリウム、キャリヤーＤＮＡを含む
ことを特徴とするトリス塩酸緩衝液である。また、本発
明は上記記載のオリゴヌクレオチドプローブに検体のＤ
ＮＡをハイブリダイゼーションさせた後の洗浄に使用す
るものであって、テトラメチルアンモニウム、エチレン
ジアミン四酢酸ナトリウム、デンハルト液、ドデシル硫
酸ナトリウム、を含むことを特徴とするトリス塩酸緩衝
液である。
【００１９】また、本発明は上記記載のオリゴヌクレオ
チドプローブ、上記記載オリゴヌクレオチドプライマ
ー、上記記載の緩衝液の内、該オリゴヌクレオチドプロ
ーブを含む少なくとも２種類以上の構成物からなること
を特徴とするＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子タイピング用の
試薬キットである。また、本発明は上記記載の試薬キッ
トに、遺伝子採取処理用、ＤＮＡ増幅反応用、ハイブリ
ダイゼーション用、ハイブリダイゼーション後の洗浄
用、検出反応用チューブなどの必要な器具のすべてある
いは一部を加えて構成されることを特徴とするＨＬＡ−
ＤＲ抗原の遺伝子タイピング用の検査キットである。
チドプローブ、上記記載オリゴヌクレオチドプライマ
ー、上記記載の緩衝液の内、該オリゴヌクレオチドプロ
ーブを含む少なくとも２種類以上の構成物からなること
を特徴とするＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子タイピング用の
試薬キットである。また、本発明は上記記載の試薬キッ
トに、遺伝子採取処理用、ＤＮＡ増幅反応用、ハイブリ
ダイゼーション用、ハイブリダイゼーション後の洗浄
用、検出反応用チューブなどの必要な器具のすべてある
いは一部を加えて構成されることを特徴とするＨＬＡ−
ＤＲ抗原の遺伝子タイピング用の検査キットである。
【００２０】また、本発明はＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子
タイピングを行なうに際し、上記に記載の塩基配列群で
表わされるオリゴヌクレオチドプローブおよび上記記載
の試薬キットあるいは検査キットを使用することを特徴
とするＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子タイピングの方法であ
る。次に本発明に係るＨＬＡ−ＤＲ分子をコードする遺
伝子配列の内、各タイプに特異的な検出部位に相当する
ＤＮＡ塩基配列およびタイピング方法について具体的に
説明する。
タイピングを行なうに際し、上記に記載の塩基配列群で
表わされるオリゴヌクレオチドプローブおよび上記記載
の試薬キットあるいは検査キットを使用することを特徴
とするＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子タイピングの方法であ
る。次に本発明に係るＨＬＡ−ＤＲ分子をコードする遺
伝子配列の内、各タイプに特異的な検出部位に相当する
ＤＮＡ塩基配列およびタイピング方法について具体的に
説明する。
【００２１】本発明に係るＨＬＡ−ＤＲをコードする遺
伝子の検出部位に相当するＤＮＡ塩基配列は、超可変領
域と呼ばれる領域の塩基配列である。ＨＬＡ関連の遺伝
子構成を図１に示すが、この中のＤＲＢ領域にある超可
変領域を含む塩基配列の中から特異的な配列を選びだ
し、新規なオリゴヌクレオチドプローブを開発し、さら
にそれらを組み合わせることにより各タイプを精密にタ
イピングする事を可能としたのである。
伝子の検出部位に相当するＤＮＡ塩基配列は、超可変領
域と呼ばれる領域の塩基配列である。ＨＬＡ関連の遺伝
子構成を図１に示すが、この中のＤＲＢ領域にある超可
変領域を含む塩基配列の中から特異的な配列を選びだ
し、新規なオリゴヌクレオチドプローブを開発し、さら
にそれらを組み合わせることにより各タイプを精密にタ
イピングする事を可能としたのである。
【００２２】プローブに関して 従来の技術では検出することが不可能な遺伝子型、ある
いは既にオリゴヌクレオチドプローブは発表されてはい
るが、該プローブでは他の遺伝子型との交雑反応が高頻
度に起こるため検出時に判断が困難であったものについ
て、既に報告されているＤＲＢ遺伝子の種々のＤＲＢア
レルの核酸塩基配列を基礎にして、その塩基配列から特
異的な配列を検索し、８種類からなる塩基配列を検出可
能とした。
いは既にオリゴヌクレオチドプローブは発表されてはい
るが、該プローブでは他の遺伝子型との交雑反応が高頻
度に起こるため検出時に判断が困難であったものについ
て、既に報告されているＤＲＢ遺伝子の種々のＤＲＢア
レルの核酸塩基配列を基礎にして、その塩基配列から特
異的な配列を検索し、８種類からなる塩基配列を検出可
能とした。
【００２３】これらのオリゴヌクレオチドプローブの標
的配列は、なるべく少ない数のオリゴヌクレオチドを使
用し、なるべく多くのＤＲ型を同定できるように、また
オリゴヌクレオチドプローブと非標的ＤＲＢ型との間で
間違ったペアを生じさせる主要な原因であるＧＴミスマ
ッチのチャンスを減らすようにコーディングストランド
および非コーディングストランド双方を対象として特異
的な配列を選択した。このようにして選択したオリゴヌ
クレオチドプローブの標的配列群を以下に列挙する。 ＯＡ３：配列番号１記載の核酸塩基配列 ＯＦ１０：配列番号２記載の核酸塩基配列 ＯＡ１４１６：配列番号３記載の核酸塩基配列 ＯＫ１４０６：配列番号６８記載の核酸塩基配列 ＯＦ３０：配列番号４記載の核酸塩基配列 ＯＦ４４：配列番号５記載の核酸塩基配列 ＯＦ４５：配列番号６記載の核酸塩基配列 ＯＦ８６３：配列番号７記載の核酸塩基配列 ＯＦ８５１：配列番号８記載の核酸塩基配列 上記の塩基配列を検出するためのオリゴヌクレオチドプ
ローブは下記のとおりである。 Ａ３：配列番号９記載の核酸塩基配列 Ｆ１０：配列番号１０記載の核酸塩基配列 Ａ１４１６：配列番号１１記載の核酸塩基配列 Ｋ１４０６：配列番号６９記載の核酸塩基配列 Ｆ３０：配列番号１２記載の核酸塩基配列 Ｆ４４：配列番号１３記載の核酸塩基配列 Ｆ４５：配列番号１４記載の核酸塩基配列 Ｆ８６３：配列番号１５記載の核酸塩基配列 Ｆ８５１：配列番号１６記載の核酸塩基配列 これらのオリゴヌクレオチドプローブを使用することに
より、下記の遺伝子型の判定が容易に行えるようになっ
た。 Ａ３ ：配列番号９に記載の核酸塩基配列 ：B1*0
301, B1*0302 Ｆ１０ ：配列番号１０に記載の核酸塩基配列：B1*1
001 Ａ１４１６：配列番号１１に記載の核酸塩基配列：B1*0
302, B1*1402, B1-JX6,B3*0301 Ｋ１４０６：配列番号６９に記載の核酸塩基配列：B1*0
302, B1*1402, B1-JX6,B3*0301 Ｆ３０ ：配列番号１２に記載の核酸塩基配列：B1*1
103 Ｆ４４ ：配列番号１３に記載の核酸塩基配列：B1*0
401 Ｆ４５ ：配列番号１４に記載の核酸塩基配列：B1*0
403, B1*0406, B1*0407 Ｆ８６３ ：配列番号１５に記載の核酸塩基配列：B1*0
102, B1*1201, B1-12b,B5*0201, B5*0202 Ｆ８５１ ：配列番号１６に記載の核酸塩基配列：B1*0
101, B1*0102, B1*0103,B1*0301, B1*0302, B1*0401,B1
*0402, B1*0403, B1*0404,B1*0406, B1*0407, B1*0408,
B1*0802, B1*1001, B1*1301,B1*1302, B1*1402, B1-JX
6,B1-PEV, B3*0201, B3*0202 これら新規なオリゴヌクレオチドプローブを含めて、日
本人のＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子タイピングの為に３２
種の異なったオリゴヌクレオチドプローブを合成し、Ｄ
Ｒ型およびＤＲＢ型を識別することが可能でなった。 ＯＦ１：配列番号１７記載の核酸塩基配列 ＯＦ２：配列番号１８記載の核酸塩基配列 ＯＦ３：配列番号１９記載の核酸塩基配列 ＯＡ３：配列番号１記載の核酸塩基配列 ＯＦ４：配列番号２０記載の核酸塩基配列 ＯＦ７：配列番号２１記載の核酸塩基配列 ＯＦ８：配列番号２２記載の核酸塩基配列 ＯＦ９：配列番号２３記載の核酸塩基配列 ＯＦ１０：配列番号２記載の核酸塩基配列 ＯＦ１１：配列番号２４記載の核酸塩基配列 ＯＦ１３：配列番号２５記載の核酸塩基配列 ＯＦ５２：配列番号２６記載の核酸塩基配列 ＯＦ５２ｃ：配列番号２７記載の核酸塩基配列 ＯＡ１４１６：配列番号３記載の核酸塩基配列 ＯＦ５３：配列番号２８記載の核酸塩基配列 ＯＦ１２０：配列番号２９記載の核酸塩基配列 ＯＦ１２１：配列番号３０記載の核酸塩基配列 ＯＦ１２２：配列番号３１記載の核酸塩基配列 ＯＦ１２３：配列番号３２記載の核酸塩基配列 ＯＦ１４２：配列番号３３記載の核酸塩基配列 ＯＦ１４３：配列番号３４記載の核酸塩基配列 ＯＦ２２：配列番号３５記載の核酸塩基配列 ＯＦ２９：配列番号３６記載の核酸塩基配列 ＯＦ３０：配列番号４記載の核酸塩基配列 ＯＦ４２：配列番号３７記載の核酸塩基配列 ＯＦ４４：配列番号５記載の核酸塩基配列 ＯＦ４５：配列番号６記載の核酸塩基配列 ＯＦ４６：配列番号３８記載の核酸塩基配列 ＯＦ１４１：配列番号３９記載の核酸塩基配列 ＯＦ１５８：配列番号４０記載の核酸塩基配列 ＯＦ８６３：配列番号７記載の核酸塩基配列 ＯＦ８５１：配列番号８記載の核酸塩基配列 ……………［Ａ］ Ｆ１：配列番号４１記載の核酸塩基配列 Ｆ２：配列番号４２記載の核酸塩基配列 Ｆ３：配列番号４３記載の核酸塩基配列 Ａ３：配列番号９記載の核酸塩基配列 Ｆ４：配列番号４４記載の核酸塩基配列 Ｆ７：配列番号４５記載の核酸塩基配列 Ｆ８：配列番号４６記載の核酸塩基配列 Ｆ９：配列番号４７記載の核酸塩基配列 Ｆ１０：配列番号１０記載の核酸塩基配列 Ｆ１１：配列番号４８記載の核酸塩基配列 Ｆ１３：配列番号４９記載の核酸塩基配列 Ｆ５２：配列番号５０記載の核酸塩基配列 Ｆ５２ｃ：配列番号５１記載の核酸塩基配列 Ａ１４１６：配列番号１１記載の核酸塩基配列 Ｆ５３：配列番号５２記載の核酸塩基配列 Ｆ１２０：配列番号５３記載の核酸塩基配列 Ｆ１２１：配列番号５４記載の核酸塩基配列 Ｆ１２２：配列番号５５記載の核酸塩基配列 Ｆ１２３：配列番号５６記載の核酸塩基配列 Ｆ１４２：配列番号５７記載の核酸塩基配列 Ｆ１４３：配列番号５８記載の核酸塩基配列 Ｆ２２：配列番号５９記載の核酸塩基配列 Ｆ２９：配列番号６０記載の核酸塩基配列 Ｆ３０：配列番号１２記載の核酸塩基配列 Ｆ４２：配列番号６１記載の核酸塩基配列 Ｆ４４：配列番号１３記載の核酸塩基配列 Ｆ４５：配列番号１４記載の核酸塩基配列 Ｆ４６：配列番号６２記載の核酸塩基配列 Ｆ１４１：配列番号６３記載の核酸塩基配列 Ｆ１５８：配列番号６４記載の核酸塩基配列 Ｆ８６３：配列番号１５記載の核酸塩基配列 Ｆ８５１：配列番号１６記載の核酸塩基配列 ………［Ｂ］ 上記配列番号１乃至配列番号８に示した核酸塩基配列お
よび配列番号９乃至配列番号１６に示した新規なオリゴ
ヌクレオチドＤＮＡプローブを含む上記式［Ａ］に記載
した塩基配列群を検出する核酸プローブ群および上記式
［Ｂ］に記載したオリゴヌクレオチドであるＤＮＡプロ
ーブ群において、交雑反応を起こすために必要な連続し
た少なくとも１０塩基の核酸塩基配列を含むことを特徴
とするＨＬＡのＤＲタイピング用の核酸プローブが使用
され得るのである。
的配列は、なるべく少ない数のオリゴヌクレオチドを使
用し、なるべく多くのＤＲ型を同定できるように、また
オリゴヌクレオチドプローブと非標的ＤＲＢ型との間で
間違ったペアを生じさせる主要な原因であるＧＴミスマ
ッチのチャンスを減らすようにコーディングストランド
および非コーディングストランド双方を対象として特異
的な配列を選択した。このようにして選択したオリゴヌ
クレオチドプローブの標的配列群を以下に列挙する。 ＯＡ３：配列番号１記載の核酸塩基配列 ＯＦ１０：配列番号２記載の核酸塩基配列 ＯＡ１４１６：配列番号３記載の核酸塩基配列 ＯＫ１４０６：配列番号６８記載の核酸塩基配列 ＯＦ３０：配列番号４記載の核酸塩基配列 ＯＦ４４：配列番号５記載の核酸塩基配列 ＯＦ４５：配列番号６記載の核酸塩基配列 ＯＦ８６３：配列番号７記載の核酸塩基配列 ＯＦ８５１：配列番号８記載の核酸塩基配列 上記の塩基配列を検出するためのオリゴヌクレオチドプ
ローブは下記のとおりである。 Ａ３：配列番号９記載の核酸塩基配列 Ｆ１０：配列番号１０記載の核酸塩基配列 Ａ１４１６：配列番号１１記載の核酸塩基配列 Ｋ１４０６：配列番号６９記載の核酸塩基配列 Ｆ３０：配列番号１２記載の核酸塩基配列 Ｆ４４：配列番号１３記載の核酸塩基配列 Ｆ４５：配列番号１４記載の核酸塩基配列 Ｆ８６３：配列番号１５記載の核酸塩基配列 Ｆ８５１：配列番号１６記載の核酸塩基配列 これらのオリゴヌクレオチドプローブを使用することに
より、下記の遺伝子型の判定が容易に行えるようになっ
た。 Ａ３ ：配列番号９に記載の核酸塩基配列 ：B1*0
301, B1*0302 Ｆ１０ ：配列番号１０に記載の核酸塩基配列：B1*1
001 Ａ１４１６：配列番号１１に記載の核酸塩基配列：B1*0
302, B1*1402, B1-JX6,B3*0301 Ｋ１４０６：配列番号６９に記載の核酸塩基配列：B1*0
302, B1*1402, B1-JX6,B3*0301 Ｆ３０ ：配列番号１２に記載の核酸塩基配列：B1*1
103 Ｆ４４ ：配列番号１３に記載の核酸塩基配列：B1*0
401 Ｆ４５ ：配列番号１４に記載の核酸塩基配列：B1*0
403, B1*0406, B1*0407 Ｆ８６３ ：配列番号１５に記載の核酸塩基配列：B1*0
102, B1*1201, B1-12b,B5*0201, B5*0202 Ｆ８５１ ：配列番号１６に記載の核酸塩基配列：B1*0
101, B1*0102, B1*0103,B1*0301, B1*0302, B1*0401,B1
*0402, B1*0403, B1*0404,B1*0406, B1*0407, B1*0408,
B1*0802, B1*1001, B1*1301,B1*1302, B1*1402, B1-JX
6,B1-PEV, B3*0201, B3*0202 これら新規なオリゴヌクレオチドプローブを含めて、日
本人のＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子タイピングの為に３２
種の異なったオリゴヌクレオチドプローブを合成し、Ｄ
Ｒ型およびＤＲＢ型を識別することが可能でなった。 ＯＦ１：配列番号１７記載の核酸塩基配列 ＯＦ２：配列番号１８記載の核酸塩基配列 ＯＦ３：配列番号１９記載の核酸塩基配列 ＯＡ３：配列番号１記載の核酸塩基配列 ＯＦ４：配列番号２０記載の核酸塩基配列 ＯＦ７：配列番号２１記載の核酸塩基配列 ＯＦ８：配列番号２２記載の核酸塩基配列 ＯＦ９：配列番号２３記載の核酸塩基配列 ＯＦ１０：配列番号２記載の核酸塩基配列 ＯＦ１１：配列番号２４記載の核酸塩基配列 ＯＦ１３：配列番号２５記載の核酸塩基配列 ＯＦ５２：配列番号２６記載の核酸塩基配列 ＯＦ５２ｃ：配列番号２７記載の核酸塩基配列 ＯＡ１４１６：配列番号３記載の核酸塩基配列 ＯＦ５３：配列番号２８記載の核酸塩基配列 ＯＦ１２０：配列番号２９記載の核酸塩基配列 ＯＦ１２１：配列番号３０記載の核酸塩基配列 ＯＦ１２２：配列番号３１記載の核酸塩基配列 ＯＦ１２３：配列番号３２記載の核酸塩基配列 ＯＦ１４２：配列番号３３記載の核酸塩基配列 ＯＦ１４３：配列番号３４記載の核酸塩基配列 ＯＦ２２：配列番号３５記載の核酸塩基配列 ＯＦ２９：配列番号３６記載の核酸塩基配列 ＯＦ３０：配列番号４記載の核酸塩基配列 ＯＦ４２：配列番号３７記載の核酸塩基配列 ＯＦ４４：配列番号５記載の核酸塩基配列 ＯＦ４５：配列番号６記載の核酸塩基配列 ＯＦ４６：配列番号３８記載の核酸塩基配列 ＯＦ１４１：配列番号３９記載の核酸塩基配列 ＯＦ１５８：配列番号４０記載の核酸塩基配列 ＯＦ８６３：配列番号７記載の核酸塩基配列 ＯＦ８５１：配列番号８記載の核酸塩基配列 ……………［Ａ］ Ｆ１：配列番号４１記載の核酸塩基配列 Ｆ２：配列番号４２記載の核酸塩基配列 Ｆ３：配列番号４３記載の核酸塩基配列 Ａ３：配列番号９記載の核酸塩基配列 Ｆ４：配列番号４４記載の核酸塩基配列 Ｆ７：配列番号４５記載の核酸塩基配列 Ｆ８：配列番号４６記載の核酸塩基配列 Ｆ９：配列番号４７記載の核酸塩基配列 Ｆ１０：配列番号１０記載の核酸塩基配列 Ｆ１１：配列番号４８記載の核酸塩基配列 Ｆ１３：配列番号４９記載の核酸塩基配列 Ｆ５２：配列番号５０記載の核酸塩基配列 Ｆ５２ｃ：配列番号５１記載の核酸塩基配列 Ａ１４１６：配列番号１１記載の核酸塩基配列 Ｆ５３：配列番号５２記載の核酸塩基配列 Ｆ１２０：配列番号５３記載の核酸塩基配列 Ｆ１２１：配列番号５４記載の核酸塩基配列 Ｆ１２２：配列番号５５記載の核酸塩基配列 Ｆ１２３：配列番号５６記載の核酸塩基配列 Ｆ１４２：配列番号５７記載の核酸塩基配列 Ｆ１４３：配列番号５８記載の核酸塩基配列 Ｆ２２：配列番号５９記載の核酸塩基配列 Ｆ２９：配列番号６０記載の核酸塩基配列 Ｆ３０：配列番号１２記載の核酸塩基配列 Ｆ４２：配列番号６１記載の核酸塩基配列 Ｆ４４：配列番号１３記載の核酸塩基配列 Ｆ４５：配列番号１４記載の核酸塩基配列 Ｆ４６：配列番号６２記載の核酸塩基配列 Ｆ１４１：配列番号６３記載の核酸塩基配列 Ｆ１５８：配列番号６４記載の核酸塩基配列 Ｆ８６３：配列番号１５記載の核酸塩基配列 Ｆ８５１：配列番号１６記載の核酸塩基配列 ………［Ｂ］ 上記配列番号１乃至配列番号８に示した核酸塩基配列お
よび配列番号９乃至配列番号１６に示した新規なオリゴ
ヌクレオチドＤＮＡプローブを含む上記式［Ａ］に記載
した塩基配列群を検出する核酸プローブ群および上記式
［Ｂ］に記載したオリゴヌクレオチドであるＤＮＡプロ
ーブ群において、交雑反応を起こすために必要な連続し
た少なくとも１０塩基の核酸塩基配列を含むことを特徴
とするＨＬＡのＤＲタイピング用の核酸プローブが使用
され得るのである。
【００２４】これらのプローブ群を使用すると、血清学
的に決定されたＤＲ型は、上記３２種のオリゴヌクレオ
チドの内少なくとも一つで陽性として判定される。ま
た、特殊な細胞Ｄ特異性に伴うＤＲＢ型のほとんどは一
種のオリゴヌクレオチドあるいはオリゴヌクレオチドの
組合せで同定可能である。また更に、例えばＤＲＢ１−
１２ｂ、ＤＲＢ１−１４ｃ、ＤＲＢ１−ＪＸ６などいく
つかのＤＲＢ型は現時点で容易に入手できる免疫学的試
薬では同定困難であるが、これらも含めて我々のオリゴ
ヌクレオチドタイピングによって同定可能となる。以下
に本発明において使用されるオリゴヌクレオチドである
ＤＮＡプローブが同定できるＤＲ型を纏めて記載した。
的に決定されたＤＲ型は、上記３２種のオリゴヌクレオ
チドの内少なくとも一つで陽性として判定される。ま
た、特殊な細胞Ｄ特異性に伴うＤＲＢ型のほとんどは一
種のオリゴヌクレオチドあるいはオリゴヌクレオチドの
組合せで同定可能である。また更に、例えばＤＲＢ１−
１２ｂ、ＤＲＢ１−１４ｃ、ＤＲＢ１−ＪＸ６などいく
つかのＤＲＢ型は現時点で容易に入手できる免疫学的試
薬では同定困難であるが、これらも含めて我々のオリゴ
ヌクレオチドタイピングによって同定可能となる。以下
に本発明において使用されるオリゴヌクレオチドである
ＤＮＡプローブが同定できるＤＲ型を纏めて記載した。
【００２５】Ｆ１：配列番号４１記載の核酸塩基配列：
ＤＲ１、Ｂ１＊０１０１、Ｂ１＊０１０２、Ｂ１＊０１
０３ Ｆ２：配列番号４２記載の核酸塩基配列：ＤＲ２、Ｂ５
＊０１０１、Ｂ５＊０１０２、Ｂ５＊０２０１、Ｂ５＊
０２０２、（Ｏｂａｔａ Ｆ．， Ａｂｅ Ａ．， Ｏ
ｈｋｕｂｏ Ｍ．ら、 Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７
巻 ２６９頁−２８４頁 １９９０年） Ａ３：配列番号９記載の核酸塩基配列（Ｆ３：配列番号
４３記載の核酸塩基配列）：ＤＲ３、Ｂ１＊０３０１、
Ｂ１＊０３０２ Ｆ４：配列番号４４記載の核酸塩基配列：ＤＲ４、Ｂ１
＊０４０１、Ｂ１＊０４０２、Ｂ１＊０４０３、Ｂ１＊
０４０４、Ｂ１＊０４０５、Ｂ１＊０４０６、Ｂ１＊０
４０７、Ｂ１＊０４０８、（Ｏｂａｔａ Ｆ．， Ａｂ
ｅ Ａ．， Ｏｈｋｕｂｏ Ｍ．ら、 Ｈｕｍ Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ ２７巻 ２６９頁−２８４頁１９９０年） Ｆ７：配列番号４５記載の核酸塩基配列：ＤＲ７、Ｂ１
＊０７０１、Ｂ１＊０７０２、 Ｆ８：配列番号４６記載の核酸塩基配列：ＤＲｗ８、Ｊ
Ｘ６、Ｂ１＊０８０１、Ｂ１＊０８０２、Ｂ１＊０８０
３、Ｂ１−ＪＸ６、（Ａｂｅ Ａ．， ＩｔｏＩ．，
Ｏｈｋｕｂｏ Ｍ．ら、 Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ ３０巻４２２頁−４２６頁 １９８９年） Ｆ９：配列番号４７記載の核酸塩基配列：ＤＲ９、Ｂ１
＊０９０１ Ｆ１０：配列番号１０記載の核酸塩基配列：ＤＲｗ１
０、Ｂ１＊１００１ Ｆ１１：配列番号４８記載の核酸塩基配列：ＤＲｗ１
１、Ｂ１＊１１０１、Ｂ１＊１１０２、Ｂ１＊１１０
３、Ｂ１＊１１０４ Ｆ１３：配列番号４９記載の核酸塩基配列：ＤＲｗ１
３、ＤＲ４−Ｄｗ１０、Ｂ１＊０１０３、Ｂ１＊０４０
２、Ｂ１＊１１０２、Ｂ１＊１３０２ Ｆ５２：配列番号５０記載の核酸塩基配列：ＤＲｗ１
１、ＤＲｗ１２、ＤＲｗ１３、ＤＲｗ１４、ＪＸ６、Ｄ
Ｒ３−Ｄｗ３、Ｂ３＊０１０１、Ｂ３＊０２０１、Ｂ３
＊０２０２、Ｂ３＊０３０１、（Ｏｂａｔａ Ｆ．，
Ａｂｅ Ａ．，Ｏｈｋｕｂｏ Ｍ．ら、 Ｈｕｍ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ ２７巻 ２６９頁−２８４頁 １９９０
年） Ａ１４１６：配列番号１１記載の核酸塩基配列および／
あるいはＫ１４０６：配列番号６９記載の核酸塩基配列
（Ｆ５２ｃ：配列番号５１記載の核酸塩基配列）：ＤＲ
ｗ１４−Ｄｗ１６、ＤＲ３、ＪＸ６、ＤＲｗ１３、Ｂ１
＊０３０２、Ｂ１＊１４０２、Ｂ１−ＪＸ６、Ｂ３＊０
３０１、（Ｏｂａｔａ Ｆ．， ＩｔｏＩ．， Ｉｔｏ
Ｋ．ら、 Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３２巻
３１３頁−３２０頁 １９９０年）） Ｆ５３：配列番号５２記載の核酸塩基配列：ＤＲ４、Ｄ
Ｒ７、ＤＲ９、（Ｏｂａｔａ Ｆ．， Ａｂｅ Ａ．，
Ｏｈｋｕｂｏ Ｍ．， Ｉｔｏ Ｉ．， Ｋａｎｅｋ
ｏ Ｔ．， Ｏｔａｎｉ Ｆ．， Ｗａｔａｎａｂｅ
Ｋ．， Ｋａｓｈｉｗａｇｉ Ｎ．ら、 Ｈｕｍ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ ２７巻 ２６９頁−２８４頁 １９９０
年） Ｆ１２０：配列番号５３記載の核酸塩基配列：ＤＲｗ１
２ａ、ＤＲｗ１２ｂ、Ｂ１＊１２０１、Ｂ１−１２ｂ、
（Ａｂｅ Ａ．， Ｉｔｏ Ｉ．， Ｏｈｋｕｂｏ
Ｍ．ら、 Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３０巻 ４
２２頁−４２６頁１９８９年） Ｆ１２１：配列番号５４記載の核酸塩基配列：ＤＲｗ１
２ａ、Ｂ１＊０８０３、Ｂ１＊１２０１、（Ａｂｅ
Ａ．， Ｉｔｏ Ｉ．ら、 Ｏｈｋｕｂｏ Ｍ．ら、Ｉ
ｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３０巻 ４２２頁−４２
６頁 １９８９年） Ｆ１２２：配列番号５５記載の核酸塩基配列：ＤＲｗ１
２ｂ、Ｂ１＊０８０１、Ｂ１＊０８０２、Ｂ１＊１１０
１、Ｂ１＊１１０４、Ｂ１＊１２ｂ、Ｂ１−ＰＥＶ，
Ｂ１＊１６０１， Ｂ５＊０１０１， Ｂ５＊０１０
２、（ＡｂｅＡ．， Ｉｔｏ Ｉ．， Ｏｈｋｕｂｏ
Ｍ．ら、 Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３０巻 ４
２２頁−４２６頁 １９８９年） Ｆ１２３：配列番号５６記載の核酸塩基配列：ＪＸ６、
ＤＲ２−Ｄｗ２２、Ｂ１＊１６０２、Ｂ１−ＪＸ６、
（Ｏｂａｔａ Ｆ．， Ａｂｅ Ａ．， Ｏｈｋｕｂｏ
Ｍ．ら、 Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７巻 ２６９
頁−２８４頁 １９９０年） Ｆ１４２：配列番号５７記載の核酸塩基配列：ＤＲｗ１
４ｃ、Ｂ１−１４ｃ、（Ｏｂａｔａ Ｆ．， Ｉｔｏ
Ｉ．， Ｉｔｏ Ｋ．ら、 Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ ３２巻 ３１３頁−３２０頁 １９９０年） Ｆ１４３：配列番号５８記載の核酸塩基配列：ＤＲｗ１
４−Ｄｗ９、Ｂ１＊１４０１、（ Ｏｂａｔａ Ｆ．，
Ｉｔｏ Ｉ．， Ｉｔｏ Ｋ．ら、 Ｉｍｍｕｎｏｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ ３２巻 ３１３頁−３２０頁 １９９
０年） Ｆ２２：配列番号５９記載の核酸塩基配列：Ｂ５＊０１
０１、（ＯｂａｔａＦ．， Ｉｔｏ Ｉ．， Ｋａｎｅ
ｋｏ Ｔ．ら Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ３３
巻 ５５０頁−５５８頁 １９８９年） Ｆ２９：配列番号６０記載の核酸塩基配列：Ｂ１＊０９
０１、Ｂ５＊０１０２、Ｂ５＊０２０１、Ｂ５＊０２０
２、（Ｏｂａｔａ Ｆ．， Ｉｔｏ Ｉ．，Ｋａｎｅｋ
ｏ Ｔ．ら、 Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ３３
巻 ５５０頁−５５８頁 １９８９年） Ｆ３０：配列番号１２記載の核酸塩基配列：Ｂ１＊１１
０３、 Ｆ４２：配列番号６１記載の核酸塩基配列：Ｂ１＊０４
０６、（ＯｂａｔａＦ．， Ｉｔｏ Ｉ．， Ｋａｎｅ
ｋｏ Ｔ．ら、 Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ３
３巻 ５５０頁−５５８頁 １９８９年） Ｆ４４：配列番号１３記載の核酸塩基配列：Ｂ１＊０４
０１、 Ｆ４５：配列番号１４記載の核酸塩基配列：Ｂ１＊０４
０３、Ｂ１＊０４０６、Ｂ１＊０４０７、 Ｆ４６：配列番号６２記載の核酸塩基配列：Ｂ１＊０１
０１、Ｂ１＊０１０２、Ｂ１＊０４０４、Ｂ１＊０４０
５、Ｂ１＊０４０８、Ｂ１＊１４０２、（Ｏｂａｔａ
Ｆ．， Ｉｔｏ Ｉ．， Ｉｔｏ Ｋ．ら、 Ｉｍｍｕ
ｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３２巻 ３１３頁−３２０頁
１９９０年） Ｆ１４１：配列番号６３記載の核酸塩基配列：Ｂ１＊０
７０１、Ｂ１＊０７０２、Ｂ１＊１４０１、Ｂ１−１４
ｃ、Ｂ３＊０３０１、（Ｏｂａｔａ Ｆ．，Ｉｔｏ
Ｉ．， Ｉｔｏ Ｋ．ら、 Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ ３２巻３１３頁−３２０頁 １９９０年） Ｆ１５８：配列番号６４記載の核酸塩基配列：Ｂ１＊０
４０５、Ｂ１＊０８０１、Ｂ１＊０８０３、Ｂ１＊１３
０３、（Ｏｂａｔａ Ｆ．， Ｉｔｏ Ｉ．，Ｋａｎｅ
ｋｏ Ｔ．ら、 Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ３
３巻 ５５０頁−５５８頁 １９８９年） Ｆ８６３：配列番号１５記載の核酸塩基配列：Ｂ１＊０
１０２、Ｂ１＊１２０１、Ｂ１−１２ｂ、Ｂ５＊０２０
１、Ｂ５＊０２０２、 Ｆ８５１：配列番号１６記載の核酸塩基配列：Ｂ１＊０
１０１、Ｂ１＊０１０２、Ｂ１＊０１０３、Ｂ１＊０３
０１、Ｂ１＊０３０２、Ｂ１＊０４０１、Ｂ１＊０４０
２、Ｂ１＊０４０３、Ｂ１＊０４０４、Ｂ１＊０４０
６、Ｂ１＊０４０７、Ｂ１＊０４０８、Ｂ１＊０８０
２、Ｂ１＊１００１、Ｂ１＊１３０１、Ｂ１＊１３０
２、Ｂ１＊１４０２、Ｂ１−ＪＸ６、Ｂ１−ＰＥＶ、Ｂ
３＊０２０１、Ｂ３＊０２０２ これらのプローブによって得られるタイピング結果につ
いて、表１に遺伝子型および判明しているＤＲおよびＤ
フェノタイプを記載した。
ＤＲ１、Ｂ１＊０１０１、Ｂ１＊０１０２、Ｂ１＊０１
０３ Ｆ２：配列番号４２記載の核酸塩基配列：ＤＲ２、Ｂ５
＊０１０１、Ｂ５＊０１０２、Ｂ５＊０２０１、Ｂ５＊
０２０２、（Ｏｂａｔａ Ｆ．， Ａｂｅ Ａ．， Ｏ
ｈｋｕｂｏ Ｍ．ら、 Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７
巻 ２６９頁−２８４頁 １９９０年） Ａ３：配列番号９記載の核酸塩基配列（Ｆ３：配列番号
４３記載の核酸塩基配列）：ＤＲ３、Ｂ１＊０３０１、
Ｂ１＊０３０２ Ｆ４：配列番号４４記載の核酸塩基配列：ＤＲ４、Ｂ１
＊０４０１、Ｂ１＊０４０２、Ｂ１＊０４０３、Ｂ１＊
０４０４、Ｂ１＊０４０５、Ｂ１＊０４０６、Ｂ１＊０
４０７、Ｂ１＊０４０８、（Ｏｂａｔａ Ｆ．， Ａｂ
ｅ Ａ．， Ｏｈｋｕｂｏ Ｍ．ら、 Ｈｕｍ Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ ２７巻 ２６９頁−２８４頁１９９０年） Ｆ７：配列番号４５記載の核酸塩基配列：ＤＲ７、Ｂ１
＊０７０１、Ｂ１＊０７０２、 Ｆ８：配列番号４６記載の核酸塩基配列：ＤＲｗ８、Ｊ
Ｘ６、Ｂ１＊０８０１、Ｂ１＊０８０２、Ｂ１＊０８０
３、Ｂ１−ＪＸ６、（Ａｂｅ Ａ．， ＩｔｏＩ．，
Ｏｈｋｕｂｏ Ｍ．ら、 Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ ３０巻４２２頁−４２６頁 １９８９年） Ｆ９：配列番号４７記載の核酸塩基配列：ＤＲ９、Ｂ１
＊０９０１ Ｆ１０：配列番号１０記載の核酸塩基配列：ＤＲｗ１
０、Ｂ１＊１００１ Ｆ１１：配列番号４８記載の核酸塩基配列：ＤＲｗ１
１、Ｂ１＊１１０１、Ｂ１＊１１０２、Ｂ１＊１１０
３、Ｂ１＊１１０４ Ｆ１３：配列番号４９記載の核酸塩基配列：ＤＲｗ１
３、ＤＲ４−Ｄｗ１０、Ｂ１＊０１０３、Ｂ１＊０４０
２、Ｂ１＊１１０２、Ｂ１＊１３０２ Ｆ５２：配列番号５０記載の核酸塩基配列：ＤＲｗ１
１、ＤＲｗ１２、ＤＲｗ１３、ＤＲｗ１４、ＪＸ６、Ｄ
Ｒ３−Ｄｗ３、Ｂ３＊０１０１、Ｂ３＊０２０１、Ｂ３
＊０２０２、Ｂ３＊０３０１、（Ｏｂａｔａ Ｆ．，
Ａｂｅ Ａ．，Ｏｈｋｕｂｏ Ｍ．ら、 Ｈｕｍ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ ２７巻 ２６９頁−２８４頁 １９９０
年） Ａ１４１６：配列番号１１記載の核酸塩基配列および／
あるいはＫ１４０６：配列番号６９記載の核酸塩基配列
（Ｆ５２ｃ：配列番号５１記載の核酸塩基配列）：ＤＲ
ｗ１４−Ｄｗ１６、ＤＲ３、ＪＸ６、ＤＲｗ１３、Ｂ１
＊０３０２、Ｂ１＊１４０２、Ｂ１−ＪＸ６、Ｂ３＊０
３０１、（Ｏｂａｔａ Ｆ．， ＩｔｏＩ．， Ｉｔｏ
Ｋ．ら、 Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３２巻
３１３頁−３２０頁 １９９０年）） Ｆ５３：配列番号５２記載の核酸塩基配列：ＤＲ４、Ｄ
Ｒ７、ＤＲ９、（Ｏｂａｔａ Ｆ．， Ａｂｅ Ａ．，
Ｏｈｋｕｂｏ Ｍ．， Ｉｔｏ Ｉ．， Ｋａｎｅｋ
ｏ Ｔ．， Ｏｔａｎｉ Ｆ．， Ｗａｔａｎａｂｅ
Ｋ．， Ｋａｓｈｉｗａｇｉ Ｎ．ら、 Ｈｕｍ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ ２７巻 ２６９頁−２８４頁 １９９０
年） Ｆ１２０：配列番号５３記載の核酸塩基配列：ＤＲｗ１
２ａ、ＤＲｗ１２ｂ、Ｂ１＊１２０１、Ｂ１−１２ｂ、
（Ａｂｅ Ａ．， Ｉｔｏ Ｉ．， Ｏｈｋｕｂｏ
Ｍ．ら、 Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３０巻 ４
２２頁−４２６頁１９８９年） Ｆ１２１：配列番号５４記載の核酸塩基配列：ＤＲｗ１
２ａ、Ｂ１＊０８０３、Ｂ１＊１２０１、（Ａｂｅ
Ａ．， Ｉｔｏ Ｉ．ら、 Ｏｈｋｕｂｏ Ｍ．ら、Ｉ
ｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３０巻 ４２２頁−４２
６頁 １９８９年） Ｆ１２２：配列番号５５記載の核酸塩基配列：ＤＲｗ１
２ｂ、Ｂ１＊０８０１、Ｂ１＊０８０２、Ｂ１＊１１０
１、Ｂ１＊１１０４、Ｂ１＊１２ｂ、Ｂ１−ＰＥＶ，
Ｂ１＊１６０１， Ｂ５＊０１０１， Ｂ５＊０１０
２、（ＡｂｅＡ．， Ｉｔｏ Ｉ．， Ｏｈｋｕｂｏ
Ｍ．ら、 Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３０巻 ４
２２頁−４２６頁 １９８９年） Ｆ１２３：配列番号５６記載の核酸塩基配列：ＪＸ６、
ＤＲ２−Ｄｗ２２、Ｂ１＊１６０２、Ｂ１−ＪＸ６、
（Ｏｂａｔａ Ｆ．， Ａｂｅ Ａ．， Ｏｈｋｕｂｏ
Ｍ．ら、 Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７巻 ２６９
頁−２８４頁 １９９０年） Ｆ１４２：配列番号５７記載の核酸塩基配列：ＤＲｗ１
４ｃ、Ｂ１−１４ｃ、（Ｏｂａｔａ Ｆ．， Ｉｔｏ
Ｉ．， Ｉｔｏ Ｋ．ら、 Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ ３２巻 ３１３頁−３２０頁 １９９０年） Ｆ１４３：配列番号５８記載の核酸塩基配列：ＤＲｗ１
４−Ｄｗ９、Ｂ１＊１４０１、（ Ｏｂａｔａ Ｆ．，
Ｉｔｏ Ｉ．， Ｉｔｏ Ｋ．ら、 Ｉｍｍｕｎｏｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ ３２巻 ３１３頁−３２０頁 １９９
０年） Ｆ２２：配列番号５９記載の核酸塩基配列：Ｂ５＊０１
０１、（ＯｂａｔａＦ．， Ｉｔｏ Ｉ．， Ｋａｎｅ
ｋｏ Ｔ．ら Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ３３
巻 ５５０頁−５５８頁 １９８９年） Ｆ２９：配列番号６０記載の核酸塩基配列：Ｂ１＊０９
０１、Ｂ５＊０１０２、Ｂ５＊０２０１、Ｂ５＊０２０
２、（Ｏｂａｔａ Ｆ．， Ｉｔｏ Ｉ．，Ｋａｎｅｋ
ｏ Ｔ．ら、 Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ３３
巻 ５５０頁−５５８頁 １９８９年） Ｆ３０：配列番号１２記載の核酸塩基配列：Ｂ１＊１１
０３、 Ｆ４２：配列番号６１記載の核酸塩基配列：Ｂ１＊０４
０６、（ＯｂａｔａＦ．， Ｉｔｏ Ｉ．， Ｋａｎｅ
ｋｏ Ｔ．ら、 Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ３
３巻 ５５０頁−５５８頁 １９８９年） Ｆ４４：配列番号１３記載の核酸塩基配列：Ｂ１＊０４
０１、 Ｆ４５：配列番号１４記載の核酸塩基配列：Ｂ１＊０４
０３、Ｂ１＊０４０６、Ｂ１＊０４０７、 Ｆ４６：配列番号６２記載の核酸塩基配列：Ｂ１＊０１
０１、Ｂ１＊０１０２、Ｂ１＊０４０４、Ｂ１＊０４０
５、Ｂ１＊０４０８、Ｂ１＊１４０２、（Ｏｂａｔａ
Ｆ．， Ｉｔｏ Ｉ．， Ｉｔｏ Ｋ．ら、 Ｉｍｍｕ
ｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３２巻 ３１３頁−３２０頁
１９９０年） Ｆ１４１：配列番号６３記載の核酸塩基配列：Ｂ１＊０
７０１、Ｂ１＊０７０２、Ｂ１＊１４０１、Ｂ１−１４
ｃ、Ｂ３＊０３０１、（Ｏｂａｔａ Ｆ．，Ｉｔｏ
Ｉ．， Ｉｔｏ Ｋ．ら、 Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ ３２巻３１３頁−３２０頁 １９９０年） Ｆ１５８：配列番号６４記載の核酸塩基配列：Ｂ１＊０
４０５、Ｂ１＊０８０１、Ｂ１＊０８０３、Ｂ１＊１３
０３、（Ｏｂａｔａ Ｆ．， Ｉｔｏ Ｉ．，Ｋａｎｅ
ｋｏ Ｔ．ら、 Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ３
３巻 ５５０頁−５５８頁 １９８９年） Ｆ８６３：配列番号１５記載の核酸塩基配列：Ｂ１＊０
１０２、Ｂ１＊１２０１、Ｂ１−１２ｂ、Ｂ５＊０２０
１、Ｂ５＊０２０２、 Ｆ８５１：配列番号１６記載の核酸塩基配列：Ｂ１＊０
１０１、Ｂ１＊０１０２、Ｂ１＊０１０３、Ｂ１＊０３
０１、Ｂ１＊０３０２、Ｂ１＊０４０１、Ｂ１＊０４０
２、Ｂ１＊０４０３、Ｂ１＊０４０４、Ｂ１＊０４０
６、Ｂ１＊０４０７、Ｂ１＊０４０８、Ｂ１＊０８０
２、Ｂ１＊１００１、Ｂ１＊１３０１、Ｂ１＊１３０
２、Ｂ１＊１４０２、Ｂ１−ＪＸ６、Ｂ１−ＰＥＶ、Ｂ
３＊０２０１、Ｂ３＊０２０２ これらのプローブによって得られるタイピング結果につ
いて、表１に遺伝子型および判明しているＤＲおよびＤ
フェノタイプを記載した。
【００２６】
【表１】
【００２７】なお、ＤＲＢ１アレルのペアがＤＲＢ１＊
０４０３−ＤＲＢ１＊０４０７、ＤＲＢ１＊０４０４−
ＤＲＢ１＊０４０８、ＤＲＢ１＊１１０１−ＤＲ Ｂ１
＊１１０４、およびＤＲＢ１＊１３０１−ＤＲＢ１＊１
３０２の間で分別するにはオリゴヌクレオチドは使用で
きない。これらのＤＲＢ１ドメインの配列は互いにアミ
ノ酸＃８６（グリシンあるいはバリン）のみが異なって
おり、この部位の配列が実に多くのＤＲＢアレルに共有
され過ぎているため、特殊なＤＲＢの型を同定する事は
本発明に記載ののオリゴヌクレオチドによるタイピング
では不可能だからである。
０４０３−ＤＲＢ１＊０４０７、ＤＲＢ１＊０４０４−
ＤＲＢ１＊０４０８、ＤＲＢ１＊１１０１−ＤＲ Ｂ１
＊１１０４、およびＤＲＢ１＊１３０１−ＤＲＢ１＊１
３０２の間で分別するにはオリゴヌクレオチドは使用で
きない。これらのＤＲＢ１ドメインの配列は互いにアミ
ノ酸＃８６（グリシンあるいはバリン）のみが異なって
おり、この部位の配列が実に多くのＤＲＢアレルに共有
され過ぎているため、特殊なＤＲＢの型を同定する事は
本発明に記載ののオリゴヌクレオチドによるタイピング
では不可能だからである。
【００２８】また、ＤＲＢ１＊０７０１とＤＲＢ１＊０
７０２は同一のＤＲＢ１ドメイン配列を持っており、区
別することは不可能である。本特許においてはこれらの
ＤＲＢ１型のペアを任意の単独なＤＲ型として記載す
る。即ちＤＲＢ１＊０４０３およびＤＲＢ１＊０４０７
はＤＲＢ１＊０４（０３／０７）、ＤＲＢ１＊０４０４
およびＤＲＢ１＊０４０８はＤＲＢ１＊０４（０４／０
８）、ＤＲＢ１＊０７０１およびＤＲＢ１＊０７０２は
ＤＲ Ｂ１＊０７（０１／０２）、ＤＲＢ１＊１１０１
およびＤＲＢ１＊１１０４は ＤＲＢ１＊１１（０１／
０４）、ＤＲＢ１＊１３０１およびＤＲＢ１＊１３０２
はＤＲＢ１＊１３（０１／０２）と表わす。
７０２は同一のＤＲＢ１ドメイン配列を持っており、区
別することは不可能である。本特許においてはこれらの
ＤＲＢ１型のペアを任意の単独なＤＲ型として記載す
る。即ちＤＲＢ１＊０４０３およびＤＲＢ１＊０４０７
はＤＲＢ１＊０４（０３／０７）、ＤＲＢ１＊０４０４
およびＤＲＢ１＊０４０８はＤＲＢ１＊０４（０４／０
８）、ＤＲＢ１＊０７０１およびＤＲＢ１＊０７０２は
ＤＲ Ｂ１＊０７（０１／０２）、ＤＲＢ１＊１１０１
およびＤＲＢ１＊１１０４は ＤＲＢ１＊１１（０１／
０４）、ＤＲＢ１＊１３０１およびＤＲＢ１＊１３０２
はＤＲＢ１＊１３（０１／０２）と表わす。
【００２９】ＤＲｗ１５関連のＤＲＢ型の同定にはＤＲ
Ｂ５アレル、ＤＲＢ５＊０１０１とＤＲＢ５＊０１０２
をオリゴヌクレオチドの標的に選んだ。この場合にはＤ
ＲＢ５ローカスはＤＲＢ１ローカスよりもより多型性に
富むからである。（Ｗｕ Ｓ．， Ｓａｕｎｄｅｒｓ
Ｔ．Ｌ．， Ｂａｃｈ Ｆ．Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ３２
４巻 ６７６頁−６７９頁 １９８６年． Ｌｅｅ
Ｂ．Ｓ．Ｍ．， Ｒｕｓｔ Ｎ．Ａ．， ＭｃＭｉｃｈ
ａｅｌ Ａ．Ｊ．， ＭｃＤｖｉｔｔ Ｈ．Ｏ．ら、Ｐ
ｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４巻
４５９１頁−４５９５頁 １９８７年） 一方、ＤＲ
ｗ１６関連のＤＲＢ型の場合にはＤＲＢ１とＤＲＢ５を
遺伝子タイピングの情報ローサイとして選択した。
Ｂ５アレル、ＤＲＢ５＊０１０１とＤＲＢ５＊０１０２
をオリゴヌクレオチドの標的に選んだ。この場合にはＤ
ＲＢ５ローカスはＤＲＢ１ローカスよりもより多型性に
富むからである。（Ｗｕ Ｓ．， Ｓａｕｎｄｅｒｓ
Ｔ．Ｌ．， Ｂａｃｈ Ｆ．Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ３２
４巻 ６７６頁−６７９頁 １９８６年． Ｌｅｅ
Ｂ．Ｓ．Ｍ．， Ｒｕｓｔ Ｎ．Ａ．， ＭｃＭｉｃｈ
ａｅｌ Ａ．Ｊ．， ＭｃＤｖｉｔｔ Ｈ．Ｏ．ら、Ｐ
ｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４巻
４５９１頁−４５９５頁 １９８７年） 一方、ＤＲ
ｗ１６関連のＤＲＢ型の場合にはＤＲＢ１とＤＲＢ５を
遺伝子タイピングの情報ローサイとして選択した。
【００３０】これらの事情および特殊なＤＲＢ１アレル
と特殊なＤＲＢ５アレルの間の強い連鎖不平衡のため
（Ｂｏｄｍｅｒ Ｊ．Ｇ．， Ｍａｒｓｈ Ｓ．Ｇ．
Ｅ．，Ｐａｒｈａｍ Ｐ．ら、 Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔ
ｉｇｅｎｓ ３５巻 １頁−８頁 １９９０年． Ｗｕ
Ｓ．， Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｔ．Ｌ．， Ｂａｃｈ
Ｆ．Ｈ．ら、 Ｎａｔｕｒｅ ３２４巻 ６７６頁−６
７９頁 １９８６年．Ｌｅｅ Ｂ．Ｓ．Ｍ．， Ｒｕｓ
ｔ Ｎ．Ａ．， ＭｃＭｉｃｈａｅｌ Ａ．Ｊ．， Ｍ
ｃＤｖｉｔｔ Ｈ．Ｏ．ら、Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃ
ｉ ＵＳＡ８４巻 ４５９１頁−４５９５頁 １９８７
年． Ｌｉｕ Ｃ−Ｐ， ＢａｃｈＦ．Ｈ．， Ｗｕ
Ｓ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４０巻 ３６３１頁−
３６３９頁 １９８８年． Ｋｎｏｗｌｅｓ Ｒ．
Ｗ．、 Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅ
ｓｔｉｎｇ １９８７年 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｓｐｒ
ｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， ４４頁−４６頁 １９８
９年）、ＤＲＢ１とＤＲＢ５型あるいはハプロタイプを
ＤＲＢ１型と同等のＤＲＢ型の一つと考えて、ＤＲＢ１
＊１５０１−Ｂ５＊０１０１、ＤＲＢ１＊１５０２−Ｂ
５＊０１０２、ＤＲＢ１＊１６０１−Ｂ５＊０２０１、
およびＤＲＢ１＊１６０２−Ｂ５＊０２０２と表現して
いる。（表２）
と特殊なＤＲＢ５アレルの間の強い連鎖不平衡のため
（Ｂｏｄｍｅｒ Ｊ．Ｇ．， Ｍａｒｓｈ Ｓ．Ｇ．
Ｅ．，Ｐａｒｈａｍ Ｐ．ら、 Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔ
ｉｇｅｎｓ ３５巻 １頁−８頁 １９９０年． Ｗｕ
Ｓ．， Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｔ．Ｌ．， Ｂａｃｈ
Ｆ．Ｈ．ら、 Ｎａｔｕｒｅ ３２４巻 ６７６頁−６
７９頁 １９８６年．Ｌｅｅ Ｂ．Ｓ．Ｍ．， Ｒｕｓ
ｔ Ｎ．Ａ．， ＭｃＭｉｃｈａｅｌ Ａ．Ｊ．， Ｍ
ｃＤｖｉｔｔ Ｈ．Ｏ．ら、Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃ
ｉ ＵＳＡ８４巻 ４５９１頁−４５９５頁 １９８７
年． Ｌｉｕ Ｃ−Ｐ， ＢａｃｈＦ．Ｈ．， Ｗｕ
Ｓ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４０巻 ３６３１頁−
３６３９頁 １９８８年． Ｋｎｏｗｌｅｓ Ｒ．
Ｗ．、 Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅ
ｓｔｉｎｇ １９８７年 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｓｐｒ
ｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， ４４頁−４６頁 １９８
９年）、ＤＲＢ１とＤＲＢ５型あるいはハプロタイプを
ＤＲＢ１型と同等のＤＲＢ型の一つと考えて、ＤＲＢ１
＊１５０１−Ｂ５＊０１０１、ＤＲＢ１＊１５０２−Ｂ
５＊０１０２、ＤＲＢ１＊１６０１−Ｂ５＊０２０１、
およびＤＲＢ１＊１６０２−Ｂ５＊０２０２と表現して
いる。（表２）
【００３１】
【表２】
【００３２】４種のＤＲＢ１−Ｂ５型のペア、あるいは
ＤＲｗ１５およびＤＲｗ１６特異的に結合しているハプ
ロタイプを含む、３３種の異なったＤＲＢ型が我々のオ
リゴヌクレオチドタイピングにより同定可能であるの
で、検体で現われる２種のＤＲＢ型の可能な組合せは全
部で５６１通りになる。コンピュータ検索によれば、こ
れらの内、２８ケースでオリゴヌクレオチドタイピング
によってはＤＲＢ型の２つの組合せのどれに相当するか
は判別不能である。この内、７ケースではＤＲＢ型の判
定は、ＤＲｗ１１、ＤＲｗ１２、ＤＲｗ１３、ＤＲｗ１
４、ＤＲｗ１７、およびＤＲｗ１８からなるＤＲｗ５２
ファミリーのＤＲＢ１アレルが常に４種のＤＲＢ３アレ
ル（＊０１０１、＊０２０１、＊０２０２、および＊０
３０１）にリンクしており（Ｂｏｄｍｅｒ Ｊ．Ｇ．，
Ｍａｒｓｈ Ｓ．Ｇ．Ｅ．， Ｐａｒｈａｍ Ｐ．ら、
Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ３５巻 １頁
−８頁 １９９０年． Ａｂｅ Ａ．， ＩｔｏＩ．，
Ｏｈｋｕｂｏ Ｍ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ ３０巻４２２頁−４２６頁 １９８９年． Ｏｂ
ａｔａ Ｆ． Ａｂｅ Ａ． Ｏｈｋｕｂｏ Ｍ．ら、
Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７巻 ２６９頁−２８
４頁１９９０年． Ｐｅｔｅｒｓｄｏｒｆ Ｅ．Ｗ．，
Ｇｒｉｆｆｉｔｈ Ｒ．Ｌ．， Ｅｒｌｉｃｈ Ｈ．
Ａ．ら、 Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｔｉｃｓ ３２巻９６
頁−１０３頁 １９９０年． Ｏｂａｔａ Ｆ．，
Ｉｔｏ Ｉ．， Ｉｔｏ Ｋ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ ３２巻 ３１３頁−３２０頁１９９０年．
Ｋｎｏｗｌｅｓ Ｒ．Ｗ．， Ｄｕｐｏｎｔ Ｂ．
ら、 Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓ
ｔｉｎｇ １９８７年． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 Ｓｐｒ
ｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、 ４４頁−６頁 １９８９
年．Ｔｉｅｒｃｙ Ｊ−Ｍ， Ｇｏｒｓｋｉ Ｊ．，
Ｊｅａｎｎｅｔ Ｍ．， Ｍａｃｈ Ｂ．ら、 Ｐｒｏ
ｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５巻１９
８頁−２０２頁 １９８８年． Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−
Ｖｉｎａ Ｍ．，Ｓｈｕｍｗａｙ Ｗ．， Ｓｔａｓｔ
ｎｙ Ｐ．ら、 Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ２８巻 ５１
頁−６４頁 １９９０年）、これら全てがＤＲＢ３アレ
ルの一定の配列に対して作られている一種のオリゴヌク
レオチドであるＦ５２によって検出されるのでタイピン
グ可能となる。
ＤＲｗ１５およびＤＲｗ１６特異的に結合しているハプ
ロタイプを含む、３３種の異なったＤＲＢ型が我々のオ
リゴヌクレオチドタイピングにより同定可能であるの
で、検体で現われる２種のＤＲＢ型の可能な組合せは全
部で５６１通りになる。コンピュータ検索によれば、こ
れらの内、２８ケースでオリゴヌクレオチドタイピング
によってはＤＲＢ型の２つの組合せのどれに相当するか
は判別不能である。この内、７ケースではＤＲＢ型の判
定は、ＤＲｗ１１、ＤＲｗ１２、ＤＲｗ１３、ＤＲｗ１
４、ＤＲｗ１７、およびＤＲｗ１８からなるＤＲｗ５２
ファミリーのＤＲＢ１アレルが常に４種のＤＲＢ３アレ
ル（＊０１０１、＊０２０１、＊０２０２、および＊０
３０１）にリンクしており（Ｂｏｄｍｅｒ Ｊ．Ｇ．，
Ｍａｒｓｈ Ｓ．Ｇ．Ｅ．， Ｐａｒｈａｍ Ｐ．ら、
Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ３５巻 １頁
−８頁 １９９０年． Ａｂｅ Ａ．， ＩｔｏＩ．，
Ｏｈｋｕｂｏ Ｍ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ ３０巻４２２頁−４２６頁 １９８９年． Ｏｂ
ａｔａ Ｆ． Ａｂｅ Ａ． Ｏｈｋｕｂｏ Ｍ．ら、
Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７巻 ２６９頁−２８
４頁１９９０年． Ｐｅｔｅｒｓｄｏｒｆ Ｅ．Ｗ．，
Ｇｒｉｆｆｉｔｈ Ｒ．Ｌ．， Ｅｒｌｉｃｈ Ｈ．
Ａ．ら、 Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｔｉｃｓ ３２巻９６
頁−１０３頁 １９９０年． Ｏｂａｔａ Ｆ．，
Ｉｔｏ Ｉ．， Ｉｔｏ Ｋ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ ３２巻 ３１３頁−３２０頁１９９０年．
Ｋｎｏｗｌｅｓ Ｒ．Ｗ．， Ｄｕｐｏｎｔ Ｂ．
ら、 Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓ
ｔｉｎｇ １９８７年． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 Ｓｐｒ
ｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、 ４４頁−６頁 １９８９
年．Ｔｉｅｒｃｙ Ｊ−Ｍ， Ｇｏｒｓｋｉ Ｊ．，
Ｊｅａｎｎｅｔ Ｍ．， Ｍａｃｈ Ｂ．ら、 Ｐｒｏ
ｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５巻１９
８頁−２０２頁 １９８８年． Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−
Ｖｉｎａ Ｍ．，Ｓｈｕｍｗａｙ Ｗ．， Ｓｔａｓｔ
ｎｙ Ｐ．ら、 Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ２８巻 ５１
頁−６４頁 １９９０年）、これら全てがＤＲＢ３アレ
ルの一定の配列に対して作られている一種のオリゴヌク
レオチドであるＦ５２によって検出されるのでタイピン
グ可能となる。
【００３３】その結果、表２に示された２１ケースが我
々のオリゴヌクレオチドタイピングでは同定不能として
残される。 検出対象物質 本特許において提案しているオリゴヌクレオチドプロー
ブ群は細胞表面に表現されている膜タンパク質を形成す
るＤＮＡ塩基配列の一部に相当している。従って、染色
体ＤＮＡを検出対象とすることはもちろん、メッセンジ
ャーＲＮＡ、Ｃ−ＤＮＡに対しても有効である。これら
３種類の核酸類の採取には既知の方法が用いられる。こ
れらの検出対象の内いづれを選択するかは、検査が行わ
れる環境により変化する。
々のオリゴヌクレオチドタイピングでは同定不能として
残される。 検出対象物質 本特許において提案しているオリゴヌクレオチドプロー
ブ群は細胞表面に表現されている膜タンパク質を形成す
るＤＮＡ塩基配列の一部に相当している。従って、染色
体ＤＮＡを検出対象とすることはもちろん、メッセンジ
ャーＲＮＡ、Ｃ−ＤＮＡに対しても有効である。これら
３種類の核酸類の採取には既知の方法が用いられる。こ
れらの検出対象の内いづれを選択するかは、検査が行わ
れる環境により変化する。
【００３４】また、本発明において使用される検体ＤＮ
Ａは、ヒトの種々の部分から採取することが可能であ
る。その例としては、末梢血、口腔粘膜、髪の毛など体
毛および毛根、爪などを挙げることができる。これらの
内末梢血、口腔粘膜、体毛および毛根から染色体ＤＮＡ
を採取する場合には、塩化カリウム、塩化マグネシウ
ム、ゼラチン、界面活性剤、プロテナーゼＫを含むこと
を特徴とするトリス塩酸緩衝液が好んで使用される。ま
た、爪から染色体ＤＮＡを採取する場合には、塩化ナト
リウム、ＥＤＴＡ、ドデシル硫酸ナトリウム、ジチオス
レイトール、およびプロテナーゼＫを含むトリス塩酸緩
衝液が好んで用いられる。この溶液において界面活性剤
の例としてはイオン性のドデシル硫酸ナトリウム、非イ
オン性のツイーン２０あるいはノニデートＰ４０を挙げ
ることができるが、中でもツイーン２０が好んで使用さ
れる。この溶液を使用することによって３７℃〜６０℃
の温度で０．１時間〜１時間加熱処理し、その後さらに
９０℃以上の温度で１分〜１０分間加熱処理した後、氷
冷してフェノール抽出、クロロホルム洗浄を経て染色体
ＤＮＡの水溶液を得ることができる。本操作によって得
られたＤＮＡは、その染色体ＤＮＡ量が多い場合にはそ
のままハイブリダイゼーションに使用することができ
る。
Ａは、ヒトの種々の部分から採取することが可能であ
る。その例としては、末梢血、口腔粘膜、髪の毛など体
毛および毛根、爪などを挙げることができる。これらの
内末梢血、口腔粘膜、体毛および毛根から染色体ＤＮＡ
を採取する場合には、塩化カリウム、塩化マグネシウ
ム、ゼラチン、界面活性剤、プロテナーゼＫを含むこと
を特徴とするトリス塩酸緩衝液が好んで使用される。ま
た、爪から染色体ＤＮＡを採取する場合には、塩化ナト
リウム、ＥＤＴＡ、ドデシル硫酸ナトリウム、ジチオス
レイトール、およびプロテナーゼＫを含むトリス塩酸緩
衝液が好んで用いられる。この溶液において界面活性剤
の例としてはイオン性のドデシル硫酸ナトリウム、非イ
オン性のツイーン２０あるいはノニデートＰ４０を挙げ
ることができるが、中でもツイーン２０が好んで使用さ
れる。この溶液を使用することによって３７℃〜６０℃
の温度で０．１時間〜１時間加熱処理し、その後さらに
９０℃以上の温度で１分〜１０分間加熱処理した後、氷
冷してフェノール抽出、クロロホルム洗浄を経て染色体
ＤＮＡの水溶液を得ることができる。本操作によって得
られたＤＮＡは、その染色体ＤＮＡ量が多い場合にはそ
のままハイブリダイゼーションに使用することができ
る。
【００３５】また、本発明に用いられる上記の核酸は必
要に応じて、特にその量が少ない場合にはＰＣＲ（ポリ
メラーゼチェインリアクション）にかけて特定領域を増
幅した後にハイブリダイゼーションに使用することがで
きる。この場合には検体量が増加するので検出が容易に
なるとの利点がある。染色体ＤＮＡの特定領域をＰＣＲ
に掛ける場合には上記の操作中、加熱処理後のフェノー
ル抽出、クロロホルム洗浄を行なわずに単に遠心分離し
た後に、その上清液を使用することも行なわれる。
要に応じて、特にその量が少ない場合にはＰＣＲ（ポリ
メラーゼチェインリアクション）にかけて特定領域を増
幅した後にハイブリダイゼーションに使用することがで
きる。この場合には検体量が増加するので検出が容易に
なるとの利点がある。染色体ＤＮＡの特定領域をＰＣＲ
に掛ける場合には上記の操作中、加熱処理後のフェノー
ル抽出、クロロホルム洗浄を行なわずに単に遠心分離し
た後に、その上清液を使用することも行なわれる。
【００３６】ＰＣＲ ＰＣＲの方法をＤＲＢ型のタイピングに適用するには、
可能な全てのＤＲＢ型の全ての遺伝子を一揃いのプライ
マーを使用して一段階で増幅する一般的な方法と、一種
のＤＲＢ型あるいは一種のＤＲＢ遺伝子のみを増幅する
グループ特異的増幅法が考えられる。
可能な全てのＤＲＢ型の全ての遺伝子を一揃いのプライ
マーを使用して一段階で増幅する一般的な方法と、一種
のＤＲＢ型あるいは一種のＤＲＢ遺伝子のみを増幅する
グループ特異的増幅法が考えられる。
【００３７】この２方法の内、グループ特異的増幅法は
グループ特異的な増幅法であるが故に、先ず標的ＤＲＢ
型を同定しておくことが必要であること、また一段階で
グループ特異的増幅を行なうためには、分離した個別の
チューブ中で可能性がある全てのプライマーを使用し増
幅を行なわねばならないとの問題がある。グループ特異
的増幅法を採用するか、あるいは一般的増幅法を採用す
るかは、どの程度精密な遺伝子タイピングが必要かに掛
かっている。即ち、グループ特異的増幅法は全ての知ら
れているＤＲＢ型を同定するのに有用であり、一方、一
般的増幅法は多くの検体について、プローブの選択しだ
いで一気にタイピングを行える得られる点で有用であ
る。 従って、本特許の目的であるＤＲＢ型のタイピン
グの為には、これらの方法の内、おもに一般的な方法が
使用される。
グループ特異的な増幅法であるが故に、先ず標的ＤＲＢ
型を同定しておくことが必要であること、また一段階で
グループ特異的増幅を行なうためには、分離した個別の
チューブ中で可能性がある全てのプライマーを使用し増
幅を行なわねばならないとの問題がある。グループ特異
的増幅法を採用するか、あるいは一般的増幅法を採用す
るかは、どの程度精密な遺伝子タイピングが必要かに掛
かっている。即ち、グループ特異的増幅法は全ての知ら
れているＤＲＢ型を同定するのに有用であり、一方、一
般的増幅法は多くの検体について、プローブの選択しだ
いで一気にタイピングを行える得られる点で有用であ
る。 従って、本特許の目的であるＤＲＢ型のタイピン
グの為には、これらの方法の内、おもに一般的な方法が
使用される。
【００３８】なお、本特許が提供するオリゴヌクレオチ
ドプローブ群は、グループ特異的増幅法を使用してタイ
ピングを行なう際にも有用であることは言うまでもな
い。 ＰＣＲ用オリゴヌクレオチドプライマー 本発明において適宜使用されるＰＣＲに用いられるオリ
ゴヌクレオチドプライマーの塩基配列は以下の通りであ
る。 ＦＰＲ１：配列番号６５記載の核酸塩基配列：（Ｏｂａ
ｔａ Ｆ．， ＩｔｏＩ．， Ｋａｎｅｋｏ Ｔ．，
Ｏｈｋｕｂｏ Ｍ．， Ｉｓｈｉｍｏｔｏ Ａ．Ｌ．，
Ａｂｅ Ａ．， Ｋａｓｈｉｗａｇｉ Ｎ．ら、 Ｔ
ｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ３３巻 ５５０−５５
８頁 １９８９年） ＧＨ４６：配列番号６７記載の核酸塩基配列：（Ｓｃｈ
ａｒｆ Ｓ．Ｊ．， Ｌｏｎｇ Ｃ．Ｍ．， Ｅｒｌｉ
ｃｈ Ｈ．Ａ．ら、 Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ２２巻
６１−６９頁 １９８８年） ＤＲβＡＭＰ１：配列番号６６記載の核酸塩基配列：
（Ｔｏｄｄ Ｊ．Ａ．，Ｂｅｌｌ Ｊ．Ｉ．， ＭｃＤ
ｅｖｉｔｔ Ｈ．Ｏ．ら、 Ｎａｔｕｒｅ ３２９巻
５９９−６０４頁 １９８７年） これらの内、オリゴヌクレオチドプライマー、ＦＰＲ１
−ＤＲβＡＭＰ１の組み合せによればＤＲＢ遺伝子の第
２エクソン部の第２および第３の超可変領域（２３８ｂ
ｐ）を増幅することができる（Ｏｂａｔａ Ｆ．， Ａ
ｂｅ Ａ．，Ｏｈｋｕｂｏ Ｍ．， Ｉｔｏ Ｉ．，
Ｋａｎｅｋｏ Ｔ．， ＯｔａｎｉＦ．， Ｗａｔａｎ
ａｂｅ Ｋ．， Ｋａｓｈｉｗａｇｉ Ｎ．ら、Ｈｕｍ
Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７巻 ２６９−２８４頁 １９９
０年）ので最も好ましい。
ドプローブ群は、グループ特異的増幅法を使用してタイ
ピングを行なう際にも有用であることは言うまでもな
い。 ＰＣＲ用オリゴヌクレオチドプライマー 本発明において適宜使用されるＰＣＲに用いられるオリ
ゴヌクレオチドプライマーの塩基配列は以下の通りであ
る。 ＦＰＲ１：配列番号６５記載の核酸塩基配列：（Ｏｂａ
ｔａ Ｆ．， ＩｔｏＩ．， Ｋａｎｅｋｏ Ｔ．，
Ｏｈｋｕｂｏ Ｍ．， Ｉｓｈｉｍｏｔｏ Ａ．Ｌ．，
Ａｂｅ Ａ．， Ｋａｓｈｉｗａｇｉ Ｎ．ら、 Ｔ
ｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ３３巻 ５５０−５５
８頁 １９８９年） ＧＨ４６：配列番号６７記載の核酸塩基配列：（Ｓｃｈ
ａｒｆ Ｓ．Ｊ．， Ｌｏｎｇ Ｃ．Ｍ．， Ｅｒｌｉ
ｃｈ Ｈ．Ａ．ら、 Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ２２巻
６１−６９頁 １９８８年） ＤＲβＡＭＰ１：配列番号６６記載の核酸塩基配列：
（Ｔｏｄｄ Ｊ．Ａ．，Ｂｅｌｌ Ｊ．Ｉ．， ＭｃＤ
ｅｖｉｔｔ Ｈ．Ｏ．ら、 Ｎａｔｕｒｅ ３２９巻
５９９−６０４頁 １９８７年） これらの内、オリゴヌクレオチドプライマー、ＦＰＲ１
−ＤＲβＡＭＰ１の組み合せによればＤＲＢ遺伝子の第
２エクソン部の第２および第３の超可変領域（２３８ｂ
ｐ）を増幅することができる（Ｏｂａｔａ Ｆ．， Ａ
ｂｅ Ａ．，Ｏｈｋｕｂｏ Ｍ．， Ｉｔｏ Ｉ．，
Ｋａｎｅｋｏ Ｔ．， ＯｔａｎｉＦ．， Ｗａｔａｎ
ａｂｅ Ｋ．， Ｋａｓｈｉｗａｇｉ Ｎ．ら、Ｈｕｍ
Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７巻 ２６９−２８４頁 １９９
０年）ので最も好ましい。
【００３９】増幅反応の条件 オリゴヌクレオチドプローブを膜、粒、板状の物質に固
定した状態で使用し、不均一系での交雑反応を行なうの
であれば、この増幅反応を行なう際には、該オリゴヌク
レオチドプライマーがラジオアイソトープおよび／また
は蛍光、発色、発光のいずれかの現象をおこし得る物質
で標識されている、あるいは該物質により標識され得る
ように修飾されていること、および／またはオリゴヌク
レオチドプライマーを使用して検体遺伝子のＤＮＡ増幅
反応を行うに際し、その反応の少なくとも一部にラジオ
アイソトープおよび／または蛍光、発色、発光のいずれ
かの現象をおこし得る物質で標識されている、あるいは
該物質により標識され得るように修飾されている核酸を
使用することが必要である。
定した状態で使用し、不均一系での交雑反応を行なうの
であれば、この増幅反応を行なう際には、該オリゴヌク
レオチドプライマーがラジオアイソトープおよび／また
は蛍光、発色、発光のいずれかの現象をおこし得る物質
で標識されている、あるいは該物質により標識され得る
ように修飾されていること、および／またはオリゴヌク
レオチドプライマーを使用して検体遺伝子のＤＮＡ増幅
反応を行うに際し、その反応の少なくとも一部にラジオ
アイソトープおよび／または蛍光、発色、発光のいずれ
かの現象をおこし得る物質で標識されている、あるいは
該物質により標識され得るように修飾されている核酸を
使用することが必要である。
【００４０】一方、検体ＤＮＡを膜、粒、棒状の物質に
固定した後に標識したオリゴヌクレオチドプローブを用
いてハイブリダイゼーションさせるのであれば、増幅反
応において検体ＤＮＡを標識することは不用であり、標
識したあるいは標識可能な状態に修飾した反応基質を用
いる必要はなくなる。上記の増幅反応を円滑に起こすた
めには酵素に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用い、塩化カ
リウム、塩化マグネシウム、ゼラチン、ｄＧＴＰ、ｄＣ
ＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰおよびオリゴヌクレオチドプ
ライマーを含むトリス・塩酸緩衝液中で反応させること
が好ましい。なおオリゴヌクレオチドプローブを固定し
た膜等を使用してハイブリダイゼーションさせるのであ
れば検体となるＤＮＡを標識しておくことが必要であ
り、ラジオアイソトープを含む核酸、あるいはビオチン
化など非放射性物質で修飾したｄＡＴＰ、ｄＵＴＰなど
の核酸、あるいはラジオアイソトープあるいはビオチン
化など非放射性物質で修飾したオリゴヌクレオチドプラ
イマーを添加する方法を採用することになる。この中で
は、ラジオアイソトープを使用するよりもビオチン化な
ど非放射性物質で修飾した物質を使用する方法が検査の
安全対策上好んで用いられる。ビオチン化した核酸の中
ではハイブリダイゼーションを円滑に行なわせるために
ビオチン化−１４−ｄＡＴＰが好んで用いられる。例え
ばビオチン化−１４−ｄＡＴＰの代わりにビオチン化−
２１−ｄＵＴＰを使用するとハイブリダイゼーション強
度にばらつきが認められることがある。
固定した後に標識したオリゴヌクレオチドプローブを用
いてハイブリダイゼーションさせるのであれば、増幅反
応において検体ＤＮＡを標識することは不用であり、標
識したあるいは標識可能な状態に修飾した反応基質を用
いる必要はなくなる。上記の増幅反応を円滑に起こすた
めには酵素に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用い、塩化カ
リウム、塩化マグネシウム、ゼラチン、ｄＧＴＰ、ｄＣ
ＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰおよびオリゴヌクレオチドプ
ライマーを含むトリス・塩酸緩衝液中で反応させること
が好ましい。なおオリゴヌクレオチドプローブを固定し
た膜等を使用してハイブリダイゼーションさせるのであ
れば検体となるＤＮＡを標識しておくことが必要であ
り、ラジオアイソトープを含む核酸、あるいはビオチン
化など非放射性物質で修飾したｄＡＴＰ、ｄＵＴＰなど
の核酸、あるいはラジオアイソトープあるいはビオチン
化など非放射性物質で修飾したオリゴヌクレオチドプラ
イマーを添加する方法を採用することになる。この中で
は、ラジオアイソトープを使用するよりもビオチン化な
ど非放射性物質で修飾した物質を使用する方法が検査の
安全対策上好んで用いられる。ビオチン化した核酸の中
ではハイブリダイゼーションを円滑に行なわせるために
ビオチン化−１４−ｄＡＴＰが好んで用いられる。例え
ばビオチン化−１４−ｄＡＴＰの代わりにビオチン化−
２１−ｄＵＴＰを使用するとハイブリダイゼーション強
度にばらつきが認められることがある。
【００４１】この際に、検体となる組織の量、血液の量
などにより異なるが、ＰＣＲ反応は２０回以上の降温お
よび昇温のサイクルを繰り返し行われ、検体ＤＮＡはほ
ぼ１μｇ程度に増幅されることが、引き続く検査を円滑
に行なうためには好ましい。なお、検体量が少ない場合
には３０回のＰＣＲを行なった後、その反応液に酵素を
添加し、さらにＰＣＲを繰り返し行なうことも有効であ
る。
などにより異なるが、ＰＣＲ反応は２０回以上の降温お
よび昇温のサイクルを繰り返し行われ、検体ＤＮＡはほ
ぼ１μｇ程度に増幅されることが、引き続く検査を円滑
に行なうためには好ましい。なお、検体量が少ない場合
には３０回のＰＣＲを行なった後、その反応液に酵素を
添加し、さらにＰＣＲを繰り返し行なうことも有効であ
る。
【００４２】具体的には、髪の毛などの体毛から採取し
たＤＮＡ溶液を使用する場合には、１回目の反応を先ず
９４℃で３分間加熱し、引続き５８℃で２分間、更に７
２℃で２分間行い、２回目以降のＰＣＲは９４℃で１分
間、５８℃で１分間、７２℃で２分間、最後が７２℃で
２分間という条件で行なうことが好ましい。また口腔粘
膜細胞ほぼ３万個から採取したＤＮＡ溶液を使用する場
合には、１回目の反応を先ず９４℃で３分間加熱し、引
続き５８℃で２分間、更に７２℃で２分間行い、２回目
以降のＰＣＲは９４℃で１０秒間、５８℃で３０秒間、
７２℃で１分間、最後が７２℃で２分間という条件で行
なうことが好ましい。
たＤＮＡ溶液を使用する場合には、１回目の反応を先ず
９４℃で３分間加熱し、引続き５８℃で２分間、更に７
２℃で２分間行い、２回目以降のＰＣＲは９４℃で１分
間、５８℃で１分間、７２℃で２分間、最後が７２℃で
２分間という条件で行なうことが好ましい。また口腔粘
膜細胞ほぼ３万個から採取したＤＮＡ溶液を使用する場
合には、１回目の反応を先ず９４℃で３分間加熱し、引
続き５８℃で２分間、更に７２℃で２分間行い、２回目
以降のＰＣＲは９４℃で１０秒間、５８℃で３０秒間、
７２℃で１分間、最後が７２℃で２分間という条件で行
なうことが好ましい。
【００４３】オリゴヌクレオチドプローブの使用形態 オリゴヌクレオチドプローブは該プローブを適当な基材
に化学的に結合させ、該基材に固定するか、あるいは物
理的に吸着させ固定するかのいづれかの形態、あるいは
溶液中において溶解あるいは懸濁した状態で使用するこ
とが可能であり、これらのいづれの形態をとってもよ
い。しかし、ハイブリダイゼーション時には一般には大
過剰量のオリゴヌクレオチドプローブを使用するため、
オリゴヌクレオチドプローブを溶液中に溶解した状態あ
るいは懸濁状態でハイブリダイゼーションする場合に
は、通常未交雑のオリゴヌクレオチドプローブを除去し
ハイブリダイゼーションの有無を検知しなければならな
いので、検体となる遺伝子あるいは遺伝子の断片を核酸
固定用の膜などの基材に予め固定しておき、該基材を使
用してハイブリダイゼーションさせる方法、あるいは、
逆にオリゴヌクレオチドプローブを固定しておき検体Ｄ
ＮＡあるいはその断片を溶解あるいは鹸濁した液を使用
してハイブリダイゼーションさせる方法、また後者の方
法の変法として該オリゴヌクレオチドプローブに加え、
検体中の該オリゴヌクレオチドプローブに相当するＤＮ
Ａ塩基配列以外の部分の塩基配列に相当する少なくとも
もう１種類のオリゴヌクレオチドプローブを用い、この
プローブを核酸固定用の膜に固定しておき、ハイブリダ
イゼーションを行う方法、オリゴヌクレオチドの３’末
端あるいは５’末端に特定の配列を連結しておき、この
塩基配列に相補な配列を予め膜などの固定用該基材に固
定しておきハイブリダイゼーションを行う方法などが採
用される。
に化学的に結合させ、該基材に固定するか、あるいは物
理的に吸着させ固定するかのいづれかの形態、あるいは
溶液中において溶解あるいは懸濁した状態で使用するこ
とが可能であり、これらのいづれの形態をとってもよ
い。しかし、ハイブリダイゼーション時には一般には大
過剰量のオリゴヌクレオチドプローブを使用するため、
オリゴヌクレオチドプローブを溶液中に溶解した状態あ
るいは懸濁状態でハイブリダイゼーションする場合に
は、通常未交雑のオリゴヌクレオチドプローブを除去し
ハイブリダイゼーションの有無を検知しなければならな
いので、検体となる遺伝子あるいは遺伝子の断片を核酸
固定用の膜などの基材に予め固定しておき、該基材を使
用してハイブリダイゼーションさせる方法、あるいは、
逆にオリゴヌクレオチドプローブを固定しておき検体Ｄ
ＮＡあるいはその断片を溶解あるいは鹸濁した液を使用
してハイブリダイゼーションさせる方法、また後者の方
法の変法として該オリゴヌクレオチドプローブに加え、
検体中の該オリゴヌクレオチドプローブに相当するＤＮ
Ａ塩基配列以外の部分の塩基配列に相当する少なくとも
もう１種類のオリゴヌクレオチドプローブを用い、この
プローブを核酸固定用の膜に固定しておき、ハイブリダ
イゼーションを行う方法、オリゴヌクレオチドの３’末
端あるいは５’末端に特定の配列を連結しておき、この
塩基配列に相補な配列を予め膜などの固定用該基材に固
定しておきハイブリダイゼーションを行う方法などが採
用される。
【００４４】これらの方法の中では、オリゴヌクレオチ
ドプローブを不均一相においてより容易に検体ＤＮＡと
交雑反応を行えるよう、該プローブを化学的に結合した
状態で、あるいは物理的に吸着した状態でのいづれかの
状態で固定した形状で使用する方法が好んで使用され
る。この方法において、交雑反応に支障が無い形式で化
学的に結合した状態で使用することが好ましいことは言
うまでもない。この際にプローブを結合させる物質とし
ては膜状の物質、粒状の物質、板状の物質があり、これ
らのいづれかから選択されることになる。交雑反応時の
操作性を良好にするために、これらの中では膜状あるい
は板状の物質が好んで用いられ、なかでも膜状の物質が
最も好んで用いられる。
ドプローブを不均一相においてより容易に検体ＤＮＡと
交雑反応を行えるよう、該プローブを化学的に結合した
状態で、あるいは物理的に吸着した状態でのいづれかの
状態で固定した形状で使用する方法が好んで使用され
る。この方法において、交雑反応に支障が無い形式で化
学的に結合した状態で使用することが好ましいことは言
うまでもない。この際にプローブを結合させる物質とし
ては膜状の物質、粒状の物質、板状の物質があり、これ
らのいづれかから選択されることになる。交雑反応時の
操作性を良好にするために、これらの中では膜状あるい
は板状の物質が好んで用いられ、なかでも膜状の物質が
最も好んで用いられる。
【００４５】プローブをこれらの物質に固定するには、
固定量を増加させるために、また該基材上での交雑反応
の阻害を抑制するために、固定する前に一般的には核酸
のホモポリマーでテーリングしておき、このテーリング
したプローブを固定することが好ましい。そのために
は、一般的には、酵素にターミナルデオキシヌクレオチ
ジルトランスフェラーゼを、反応基質としてｄＴＴＰ、
あるいはｄＡＴＰ、あるいはｄＣＴＰ、あるいはｄＧＴ
Ｐを使用して行なうプローブの３’末端のテーリング処
理が採用される。
固定量を増加させるために、また該基材上での交雑反応
の阻害を抑制するために、固定する前に一般的には核酸
のホモポリマーでテーリングしておき、このテーリング
したプローブを固定することが好ましい。そのために
は、一般的には、酵素にターミナルデオキシヌクレオチ
ジルトランスフェラーゼを、反応基質としてｄＴＴＰ、
あるいはｄＡＴＰ、あるいはｄＣＴＰ、あるいはｄＧＴ
Ｐを使用して行なうプローブの３’末端のテーリング処
理が採用される。
【００４６】この処理においては、カコジル酸ナトリウ
ム、塩化コバルト、ジチオスレイトール、ｄＴＴＰ、あ
るいはｄＡＴＰ、あるいはｄＣＴＰ、あるいはｄＧＴＰ
およびプローブを含むトリス塩酸緩衝液が用いられる。
この際にホモポリマーとしてはｄＴＴＰを反応基質に用
いるポリｄＴが好んで形成され、その長さは５０塩基長
以上２０００塩基以下、好ましくは１００塩基長以上１
０００塩基以下、より好ましくは２００塩基長以上５０
０塩基以下の塩基長で形成される。
ム、塩化コバルト、ジチオスレイトール、ｄＴＴＰ、あ
るいはｄＡＴＰ、あるいはｄＣＴＰ、あるいはｄＧＴＰ
およびプローブを含むトリス塩酸緩衝液が用いられる。
この際にホモポリマーとしてはｄＴＴＰを反応基質に用
いるポリｄＴが好んで形成され、その長さは５０塩基長
以上２０００塩基以下、好ましくは１００塩基長以上１
０００塩基以下、より好ましくは２００塩基長以上５０
０塩基以下の塩基長で形成される。
【００４７】このようにして得られるテーリングしたオ
リゴヌクレオチドプローブはセルロースあるいはナイロ
ンを成分として含有する膜に加熱法あるいは紫外線照射
法あるいは他の方法で化学結合を形成させて固定する。
これらの膜の具体例としては、ＨｙｂｏｎｄTM−Ｃ、Ｈ
ｙｂｏｎｄTM−Ｃ ｅｘｔｒａ、ＨｙｂｏｎｄTM −Ｅ
ＣＬ、ＨｙｂｏｎｄTM−Ｎ、ＨｙｂｏｎｄTM−Ｎ+(Amer
sham社) 、Ｗｈａｔｍａｎ５４１ｆｉｌｔｅｒ(Whatman
社) 、ＤｕｒａｌｏｎTMＵＶ、Ｄｕｒａｌｏｓｅ−ＵＶ
TM(Stratagene 社) 、ＰｈｏｔｏＧｅｎｅ Ｎｙｌｏｎ
Ｍｅｍｂｒａｎｅ(BRL社) などを挙げることができる
が、これら以外を使用しても遺伝子あるいはオリゴヌク
レオチドプローブを結合させ得るものであれば差し支え
ない。これらの膜に遺伝子あるいはオリゴヌクレオチド
プローブを固定する際には加熱処理、あるいはＵＶ照射
処理などの方法によるが、このいづれかあるいは別の方
法によるかについては、使用する膜の性質によって適宜
変更することになる。例えば、Ｄｕｒａｌｏｎ ＵＶ、
Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ+ を使用する場合にはＵＶ照射法によ
り固定し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃ ｅｘｔｒａを使用する場
合には真空中８０℃に加熱する方法が好んで採用され
る。
リゴヌクレオチドプローブはセルロースあるいはナイロ
ンを成分として含有する膜に加熱法あるいは紫外線照射
法あるいは他の方法で化学結合を形成させて固定する。
これらの膜の具体例としては、ＨｙｂｏｎｄTM−Ｃ、Ｈ
ｙｂｏｎｄTM−Ｃ ｅｘｔｒａ、ＨｙｂｏｎｄTM −Ｅ
ＣＬ、ＨｙｂｏｎｄTM−Ｎ、ＨｙｂｏｎｄTM−Ｎ+(Amer
sham社) 、Ｗｈａｔｍａｎ５４１ｆｉｌｔｅｒ(Whatman
社) 、ＤｕｒａｌｏｎTMＵＶ、Ｄｕｒａｌｏｓｅ−ＵＶ
TM(Stratagene 社) 、ＰｈｏｔｏＧｅｎｅ Ｎｙｌｏｎ
Ｍｅｍｂｒａｎｅ(BRL社) などを挙げることができる
が、これら以外を使用しても遺伝子あるいはオリゴヌク
レオチドプローブを結合させ得るものであれば差し支え
ない。これらの膜に遺伝子あるいはオリゴヌクレオチド
プローブを固定する際には加熱処理、あるいはＵＶ照射
処理などの方法によるが、このいづれかあるいは別の方
法によるかについては、使用する膜の性質によって適宜
変更することになる。例えば、Ｄｕｒａｌｏｎ ＵＶ、
Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ+ を使用する場合にはＵＶ照射法によ
り固定し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃ ｅｘｔｒａを使用する場
合には真空中８０℃に加熱する方法が好んで採用され
る。
【００４８】一方、検体遺伝子を固定するためには、検
体ＤＮＡをそのまま加熱処理あるいは紫外線照射する方
法などが採用される。また検出に必要となる塩基配列以
外の部位に、例えば５’末端あるいは３’末端をポリｄ
Ｔ等で修飾することが好ましい場合があり、これらの場
合には検体遺伝子を修飾することも行われる。これらの
ための方法として、３’末端の修飾には核酸とターミナ
ルデオキシヌクレオチディルトランスフェラーゼによる
伸長反応あるいは修飾に必要な塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチドとリガーゼを用いる伸長反応がある。ま
た、５’末端の修飾にはＰＣＲに用いるプライマーの
５’末端部分に予め適当な塩基配列を結合させておく方
法などが採用される。
体ＤＮＡをそのまま加熱処理あるいは紫外線照射する方
法などが採用される。また検出に必要となる塩基配列以
外の部位に、例えば５’末端あるいは３’末端をポリｄ
Ｔ等で修飾することが好ましい場合があり、これらの場
合には検体遺伝子を修飾することも行われる。これらの
ための方法として、３’末端の修飾には核酸とターミナ
ルデオキシヌクレオチディルトランスフェラーゼによる
伸長反応あるいは修飾に必要な塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチドとリガーゼを用いる伸長反応がある。ま
た、５’末端の修飾にはＰＣＲに用いるプライマーの
５’末端部分に予め適当な塩基配列を結合させておく方
法などが採用される。
【００４９】交雑の有無を調べるには、ハイブリダイゼ
ーションの方法によって異なるが、オリゴヌクレオチド
プローブあるいは検体ＤＮＡをラジオアイソトープおよ
び／または蛍光、発色、発光のいずれかの現象をおこし
得る物質で標識しておく、あるいは該物質により標識さ
れ得るように修飾しておくことにより、該標識物質を検
出することで行なわれる。
ーションの方法によって異なるが、オリゴヌクレオチド
プローブあるいは検体ＤＮＡをラジオアイソトープおよ
び／または蛍光、発色、発光のいずれかの現象をおこし
得る物質で標識しておく、あるいは該物質により標識さ
れ得るように修飾しておくことにより、該標識物質を検
出することで行なわれる。
【００５０】ここで用いられる標識物質としては、32
Ｐ、35Ｓ、125 Ｉのようなラジオアイソトープ、あるい
はフルオレッセインイソチオシネート（ＦＩＴＣ）のよ
うな蛍光色素あるいはビオチン、ジゴキシゲニンなどの
ようなを非ラジオアイソトープを挙げることができる。
検出に当たっては、ラジオアイソトープはＸ線フィルム
に感光させるなど公知の方法が、蛍光物質の場合には蛍
光光度計による測定が、ビオチン、ジゴキシゲニンの場
合には各々ストレプトアビジンあるいは抗ジコギシゲニ
ン抗体に結合した酵素などにより発光現象あるいは呈色
現象などを起こし、これらを光度計により測定する方
法、Ｘ線フィルムに感光させる方法が採用される。ここ
で使用される酵素としては例えばアルカリフォスファタ
ーゼ、ワサビ過酸化酵素を挙げることができる。
Ｐ、35Ｓ、125 Ｉのようなラジオアイソトープ、あるい
はフルオレッセインイソチオシネート（ＦＩＴＣ）のよ
うな蛍光色素あるいはビオチン、ジゴキシゲニンなどの
ようなを非ラジオアイソトープを挙げることができる。
検出に当たっては、ラジオアイソトープはＸ線フィルム
に感光させるなど公知の方法が、蛍光物質の場合には蛍
光光度計による測定が、ビオチン、ジゴキシゲニンの場
合には各々ストレプトアビジンあるいは抗ジコギシゲニ
ン抗体に結合した酵素などにより発光現象あるいは呈色
現象などを起こし、これらを光度計により測定する方
法、Ｘ線フィルムに感光させる方法が採用される。ここ
で使用される酵素としては例えばアルカリフォスファタ
ーゼ、ワサビ過酸化酵素を挙げることができる。
【００５１】これらの標識物質は、オリゴヌクレオチド
の合成時に、あるいは検体遺伝子の調製時あるいは増幅
時に、これらの目的に合った修飾を施した核酸を使用す
ることによりこれらの塩基配列中に挿入することも、ま
た、５’末端部あるいは３’末端部に付加することも可
能である。このようにして得られた標識化オリゴヌクレ
オチドあるいは標識化検体遺伝子はいづれもＨＬＡ−Ｄ
Ｒのタイピングに使用することができる。
の合成時に、あるいは検体遺伝子の調製時あるいは増幅
時に、これらの目的に合った修飾を施した核酸を使用す
ることによりこれらの塩基配列中に挿入することも、ま
た、５’末端部あるいは３’末端部に付加することも可
能である。このようにして得られた標識化オリゴヌクレ
オチドあるいは標識化検体遺伝子はいづれもＨＬＡ−Ｄ
Ｒのタイピングに使用することができる。
【００５２】ハイブリダイゼーション 本発明では、ハイブリダイゼーションを必要な種類のプ
ローブを固定した膜状物質あるいは粒状物質あるいは板
状物質、および検体から増幅したＤＮＡ断片をアルカリ
変性した検体ＤＮＡを使用して行うことを推奨する。こ
の交雑反応には、３Ｍ 塩化テトラメチルアンモニウ
ム、２ｍＭ ＥＤＴＡ、５×デンハルト溶液、０．１重
量％ ＳＤＳ（ドデシルスルホン酸ナトリウム）、更に
１００μｇ／ｍｌの濃度の変性ＤＮＡを含む５０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）が好んで用いられる。
しかし、この他の組成の液も使用されることは言うまで
もなく、その例としては、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ 塩化
ナトリウム、０．０９Ｍ クエン酸ナトリウム）、０．
５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの濃度の変性ＤＮＡを含
む液などが挙げられる。
ローブを固定した膜状物質あるいは粒状物質あるいは板
状物質、および検体から増幅したＤＮＡ断片をアルカリ
変性した検体ＤＮＡを使用して行うことを推奨する。こ
の交雑反応には、３Ｍ 塩化テトラメチルアンモニウ
ム、２ｍＭ ＥＤＴＡ、５×デンハルト溶液、０．１重
量％ ＳＤＳ（ドデシルスルホン酸ナトリウム）、更に
１００μｇ／ｍｌの濃度の変性ＤＮＡを含む５０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）が好んで用いられる。
しかし、この他の組成の液も使用されることは言うまで
もなく、その例としては、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ 塩化
ナトリウム、０．０９Ｍ クエン酸ナトリウム）、０．
５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの濃度の変性ＤＮＡを含
む液などが挙げられる。
【００５３】上記の溶液中で４２℃の温度で３０分乃至
１０時間ハイブリダイゼーションを行なう。ハイブリダ
イゼーション後は通常、プローブを固定し、ハイブリダ
イゼーションにかけた膜を室温下、組成が６×ＳＳＣお
よび０．１％ ＳＤＳである洗浄溶液の中で５分間づつ
２回乃至５回洗浄し、引続きハイブリダイゼーション時
の温度である４０℃乃至６５℃の温度で５分乃至３０分
間洗浄する。その後、２×ＳＳＣ溶液中で１回室温下洗
浄する。ここで洗浄液に組成が６×ＳＳＣおよび０．１
％ ＳＤＳの溶液の代わりに２×ＳＳＰＥ（０．３Ｍ
塩化ナトリウム、０．０２Ｍ 燐酸１ナトリウム、２ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ）および０．１％ＳＤＳの溶液、あるいは
塩化テトラメチルアンモニウム溶液を使用することもで
きる。
１０時間ハイブリダイゼーションを行なう。ハイブリダ
イゼーション後は通常、プローブを固定し、ハイブリダ
イゼーションにかけた膜を室温下、組成が６×ＳＳＣお
よび０．１％ ＳＤＳである洗浄溶液の中で５分間づつ
２回乃至５回洗浄し、引続きハイブリダイゼーション時
の温度である４０℃乃至６５℃の温度で５分乃至３０分
間洗浄する。その後、２×ＳＳＣ溶液中で１回室温下洗
浄する。ここで洗浄液に組成が６×ＳＳＣおよび０．１
％ ＳＤＳの溶液の代わりに２×ＳＳＰＥ（０．３Ｍ
塩化ナトリウム、０．０２Ｍ 燐酸１ナトリウム、２ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ）および０．１％ＳＤＳの溶液、あるいは
塩化テトラメチルアンモニウム溶液を使用することもで
きる。
【００５４】上記したように、本発明ではハイブリダイ
ゼーションを必要な種類のオリゴヌクレオチドプローブ
を固定した膜状物質あるいは粒状物質あるいは板状物
質、および検体から増幅したＤＮＡ断片をアルカリ変性
した検体ＤＮＡを使用して行うことを推奨するが、検体
から増幅したＤＮＡ断片を前記の方法で固定した膜状物
質あるいは粒状物質あるいは板状物質および溶液中に溶
解したオリゴヌクレオチドプローブを用いて行なうこと
も可能である。
ゼーションを必要な種類のオリゴヌクレオチドプローブ
を固定した膜状物質あるいは粒状物質あるいは板状物
質、および検体から増幅したＤＮＡ断片をアルカリ変性
した検体ＤＮＡを使用して行うことを推奨するが、検体
から増幅したＤＮＡ断片を前記の方法で固定した膜状物
質あるいは粒状物質あるいは板状物質および溶液中に溶
解したオリゴヌクレオチドプローブを用いて行なうこと
も可能である。
【００５５】この時のハイブリダイゼーションは、例え
ば以下のように行なわれる。先ず、膜を一片に１個のド
ットがあるようにして１２片に切取り、各片をまず１２
種の32Ｐラベルしたオリゴヌクレオチドプローブ（Ｆ
１、Ｆ２、Ｆ４、Ｆ７、Ｆ８、Ｆ９、 Ｆ１１、Ｆ１２
０、Ｆ１３、Ｆ１２３、Ｆ１４２、Ｆ１４３、各２ｎｇ
／ｍｌ） で６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム、クエン酸ナ
トリウム）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト液の混合
液中、３７℃で２〜３時間ハイブリダイズさせ、膜は下
記の条件で洗浄する。ここで先ずこれらのオリゴヌクレ
オチドプローブに対する結果を調べる。
ば以下のように行なわれる。先ず、膜を一片に１個のド
ットがあるようにして１２片に切取り、各片をまず１２
種の32Ｐラベルしたオリゴヌクレオチドプローブ（Ｆ
１、Ｆ２、Ｆ４、Ｆ７、Ｆ８、Ｆ９、 Ｆ１１、Ｆ１２
０、Ｆ１３、Ｆ１２３、Ｆ１４２、Ｆ１４３、各２ｎｇ
／ｍｌ） で６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム、クエン酸ナ
トリウム）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト液の混合
液中、３７℃で２〜３時間ハイブリダイズさせ、膜は下
記の条件で洗浄する。ここで先ずこれらのオリゴヌクレ
オチドプローブに対する結果を調べる。
【００５６】この結果が得られた後に、膜を０．４ＭＮ
ａＯＨ中、１５分間３７℃で処理し、続いて０．１×Ｓ
ＳＣ（１５ｍＭ塩化ナトリウム、１．９ｍＭクエン酸ナ
トリウム、ｐＨ７．０）０．０１％ＳＤＳからなる水溶
液中、更に１５分間３７℃で処理してオリゴヌクレオチ
ドプローブを除き、他の異なった１４種のオリゴヌクレ
オチドプローブ（Ｆ３、Ｆ１０、Ｆ２２、Ｆ２９、Ｆ４
２、Ｆ４４、Ｆ４５、Ｆ４６、Ｆ１２１、Ｆ１２２、Ｆ
１５８、Ｆ５２ｃ、Ａ１４１６、Ｋ１４０６）と上記の
方法でハイブリダイズさせる。また、上記のハイブリダ
イズでは完全に決めれないものには、上記のオリゴヌク
レオチドプローブに加えてＦ３０、Ｆ５２、Ｆ１４１、
Ｆ８５１、Ｆ８６３を使用する。
ａＯＨ中、１５分間３７℃で処理し、続いて０．１×Ｓ
ＳＣ（１５ｍＭ塩化ナトリウム、１．９ｍＭクエン酸ナ
トリウム、ｐＨ７．０）０．０１％ＳＤＳからなる水溶
液中、更に１５分間３７℃で処理してオリゴヌクレオチ
ドプローブを除き、他の異なった１４種のオリゴヌクレ
オチドプローブ（Ｆ３、Ｆ１０、Ｆ２２、Ｆ２９、Ｆ４
２、Ｆ４４、Ｆ４５、Ｆ４６、Ｆ１２１、Ｆ１２２、Ｆ
１５８、Ｆ５２ｃ、Ａ１４１６、Ｋ１４０６）と上記の
方法でハイブリダイズさせる。また、上記のハイブリダ
イズでは完全に決めれないものには、上記のオリゴヌク
レオチドプローブに加えてＦ３０、Ｆ５２、Ｆ１４１、
Ｆ８５１、Ｆ８６３を使用する。
【００５７】ハイブリダイズ後の洗浄溶液組成および洗
浄温度は以下の通りである。 Ｆ１、Ｆ２、Ｆ７、Ｆ９、Ｆ２９、Ｆ１４３、Ｆ１５
８：６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウ
ム）、０．１％ＳＤＳ、５４℃ Ｆ４、Ｆ８、Ｆ１０、
Ｆ２２、Ｆ５２、Ｆ５２ｃ、Ａ１４１６、Ｋ１４０６、
Ｆ１２１、Ｆ８５１、Ｆ８６３：６×ＳＳＣ（塩化ナト
リウム、クエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ、５７
℃： Ｆ１１、Ｆ１３、Ｆ３０、Ｆ４２、Ｆ１２０、Ｆ
１２２、Ｆ１２３、Ｆ１４１、Ｆ１４２：６×ＳＳＣ
（塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、）０．１％Ｓ
ＤＳ、６２℃： Ｆ４５、Ｆ４６：３Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム、
５７℃： Ｆ３、Ｆ４４：３Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム、６
２℃ 上記洗浄の全ての場合に、膜の断片を上記の温度で洗浄
する前に、洗浄液をもちいて室温下で５分間洗浄する。
浄温度は以下の通りである。 Ｆ１、Ｆ２、Ｆ７、Ｆ９、Ｆ２９、Ｆ１４３、Ｆ１５
８：６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウ
ム）、０．１％ＳＤＳ、５４℃ Ｆ４、Ｆ８、Ｆ１０、
Ｆ２２、Ｆ５２、Ｆ５２ｃ、Ａ１４１６、Ｋ１４０６、
Ｆ１２１、Ｆ８５１、Ｆ８６３：６×ＳＳＣ（塩化ナト
リウム、クエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ、５７
℃： Ｆ１１、Ｆ１３、Ｆ３０、Ｆ４２、Ｆ１２０、Ｆ
１２２、Ｆ１２３、Ｆ１４１、Ｆ１４２：６×ＳＳＣ
（塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、）０．１％Ｓ
ＤＳ、６２℃： Ｆ４５、Ｆ４６：３Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム、
５７℃： Ｆ３、Ｆ４４：３Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム、６
２℃ 上記洗浄の全ての場合に、膜の断片を上記の温度で洗浄
する前に、洗浄液をもちいて室温下で５分間洗浄する。
【００５８】この場合のハイブリダイゼーションはハイ
ブリダイズさせようとするオリゴヌクレオチドプローブ
ごとに個別の容器で実施することが必要となり、使用す
るオリゴヌクレオチドプローブの数だけの反応容器、お
よび検体ＤＮＡを固定した膜状物質あるいは粒状物質あ
るいは板状物質を用いねばならないこと、従って検査実
施者の操作が煩雑になることは言うまでもない。
ブリダイズさせようとするオリゴヌクレオチドプローブ
ごとに個別の容器で実施することが必要となり、使用す
るオリゴヌクレオチドプローブの数だけの反応容器、お
よび検体ＤＮＡを固定した膜状物質あるいは粒状物質あ
るいは板状物質を用いねばならないこと、従って検査実
施者の操作が煩雑になることは言うまでもない。
【００５９】このような操作により得られるハイブリダ
イゼーションの結果の例を図２、図３および図４に示し
た。 検査結果 上記のオリゴヌクレオチドプローブおよびオリゴヌクレ
オチドプライマーを使用して血清学的なＤＲ型あるいは
細胞学的なＤ型が不明な健康な日本人３７５人のＤＲＢ
遺伝子タイピングを行なった。
イゼーションの結果の例を図２、図３および図４に示し
た。 検査結果 上記のオリゴヌクレオチドプローブおよびオリゴヌクレ
オチドプライマーを使用して血清学的なＤＲ型あるいは
細胞学的なＤ型が不明な健康な日本人３７５人のＤＲＢ
遺伝子タイピングを行なった。
【００６０】既に記した通り、本特許に記載のオリゴヌ
クレオチドプローブ群によっても、理論的には２１種の
同定不可能なケースがある。しかし、これらの２１種の
同定不能なケースの内、１５ケースは日本人では滅多に
見られないＤＲＢ型であり、例えば、ＤＲＢ１＊０１０
２、ＤＲＢ１＊０１０３、ＤＲＢ１＊０３０１、ＤＲＢ
１＊０３０２、ＤＲＢ−ＰＥＶおよびＤＲＢ１＊１６０
１、ＤＲＢ５＊０２０１は今回調べた３７５人の日本人
では認められなかった。従って、最終的に６ケース１１
人（ケース５、６、９、１６、１７、１８）が同定不能
であったにすぎない。即ち３７５人中３６４人（９７
％）の型判定が行えたことになる。
クレオチドプローブ群によっても、理論的には２１種の
同定不可能なケースがある。しかし、これらの２１種の
同定不能なケースの内、１５ケースは日本人では滅多に
見られないＤＲＢ型であり、例えば、ＤＲＢ１＊０１０
２、ＤＲＢ１＊０１０３、ＤＲＢ１＊０３０１、ＤＲＢ
１＊０３０２、ＤＲＢ−ＰＥＶおよびＤＲＢ１＊１６０
１、ＤＲＢ５＊０２０１は今回調べた３７５人の日本人
では認められなかった。従って、最終的に６ケース１１
人（ケース５、６、９、１６、１７、１８）が同定不能
であったにすぎない。即ち３７５人中３６４人（９７
％）の型判定が行えたことになる。
【００６１】表３には、上記の結果から得られた遺伝子
頻度を、表４には血清学的なタイピングから得られた遺
伝子頻度との比較を、また表５には細胞学的なタイピン
グから得られた遺伝子頻度との比較を示した。この値か
ら、本特許により提供されるプローブ群およびこのプロ
ーブ群を使用するタイピング法では、従来のタイピング
法によるよりも帰属不可能な型を示すブランクの値が小
さくなり、型分け精度が向上していることが明らかであ
る。
頻度を、表４には血清学的なタイピングから得られた遺
伝子頻度との比較を、また表５には細胞学的なタイピン
グから得られた遺伝子頻度との比較を示した。この値か
ら、本特許により提供されるプローブ群およびこのプロ
ーブ群を使用するタイピング法では、従来のタイピング
法によるよりも帰属不可能な型を示すブランクの値が小
さくなり、型分け精度が向上していることが明らかであ
る。
【００６２】
【表３】
【００６３】
【表４】
【００６４】
【表５】
【００６５】検査試薬キットの内容 上記したように、ＨＬＡ−ＤＲのオリゴヌクレオチドプ
ローブを用いるタイピングにおいて良好な結果を得るた
めには、該プローブあるいは該プローブを固定した膜状
物質、あるいは粒状物質あるいは板状物質が必須であ
り、さらに該プローブを使用して行なう交雑反応、さら
に洗浄を行うために必要な試薬、更に検体からＤＮＡを
採取する試薬を含むことが望ましい。また該タイピング
を円滑に実施するためにはＰＣＲに使用されるオリゴヌ
クレオチドプライマーが含まれることが望ましい。
ローブを用いるタイピングにおいて良好な結果を得るた
めには、該プローブあるいは該プローブを固定した膜状
物質、あるいは粒状物質あるいは板状物質が必須であ
り、さらに該プローブを使用して行なう交雑反応、さら
に洗浄を行うために必要な試薬、更に検体からＤＮＡを
採取する試薬を含むことが望ましい。また該タイピング
を円滑に実施するためにはＰＣＲに使用されるオリゴヌ
クレオチドプライマーが含まれることが望ましい。
【００６６】従って、該タイピングに供される試薬キッ
トには検査に必要となる試薬類および器具類が含まれる
ことが望ましく、具体的にはオリゴヌクレオチドプロー
ブ群あるいはこれらをテーリング処理したオリゴヌクレ
オチドプローブ群あるいはテーリング処理したオリゴヌ
クレオチドプローブ群を固定処理した膜、粒、板、標識
用の試薬、検体ＤＮＡの遺伝子増幅反応用の試薬、ハイ
ブリダイゼーション用の試薬、ハイブリダイゼーション
後に行う洗浄用の試薬、ハイブリダイゼーション操作用
および洗浄操作用の器具、交雑の有無を判定するための
ポジティブコントロールおよびネガティブコントロール
の標準試薬、判定結果の表現例、検査の各操作に必要な
器具類などが含まれ、これらの全てあるいはオリゴヌク
レオチドプローブを必須として他の物品の一部から構成
される。
トには検査に必要となる試薬類および器具類が含まれる
ことが望ましく、具体的にはオリゴヌクレオチドプロー
ブ群あるいはこれらをテーリング処理したオリゴヌクレ
オチドプローブ群あるいはテーリング処理したオリゴヌ
クレオチドプローブ群を固定処理した膜、粒、板、標識
用の試薬、検体ＤＮＡの遺伝子増幅反応用の試薬、ハイ
ブリダイゼーション用の試薬、ハイブリダイゼーション
後に行う洗浄用の試薬、ハイブリダイゼーション操作用
および洗浄操作用の器具、交雑の有無を判定するための
ポジティブコントロールおよびネガティブコントロール
の標準試薬、判定結果の表現例、検査の各操作に必要な
器具類などが含まれ、これらの全てあるいはオリゴヌク
レオチドプローブを必須として他の物品の一部から構成
される。
【００６７】標識用の試薬としては、PhotoGeneTM Nucl
eic Acid Detection System （BRL,Life Technologi-es
Inc.）、Southern Light Kit（Boheringermamhaim ）
あるいはDIG systemTM（Boehringer Mannheim ）を例に
挙げることができる。また器具としては、BIO-BIK サン
プリングチューブ（BioPlastic Co,Ltd.）などのプラス
チック製チューブ、ボロシリケート処理したガラス製試
験管（Corning GlassWorks ）などの試験管、PipetmanT
M（Gilson）などの容量可変デジタル式ピペットおよび
それ用のチップ、加熱シール可能なプラスチックバッグ
（コスモバイオ製など）、検査時に生じる発光、蛍光、
色を検出する光度計、Ｘ線フィルム、露光用カセット、
フィルムハンガー（富士メディカルシステム）および恒
温槽、水浴槽を挙げることができる。
eic Acid Detection System （BRL,Life Technologi-es
Inc.）、Southern Light Kit（Boheringermamhaim ）
あるいはDIG systemTM（Boehringer Mannheim ）を例に
挙げることができる。また器具としては、BIO-BIK サン
プリングチューブ（BioPlastic Co,Ltd.）などのプラス
チック製チューブ、ボロシリケート処理したガラス製試
験管（Corning GlassWorks ）などの試験管、PipetmanT
M（Gilson）などの容量可変デジタル式ピペットおよび
それ用のチップ、加熱シール可能なプラスチックバッグ
（コスモバイオ製など）、検査時に生じる発光、蛍光、
色を検出する光度計、Ｘ線フィルム、露光用カセット、
フィルムハンガー（富士メディカルシステム）および恒
温槽、水浴槽を挙げることができる。
【００６８】各種の試薬類は必要に応じて濃度を制御で
きるように使用濃度よりも濃厚な溶液として提供される
のが一般的であるが、検査時の必要濃度に調製しておい
ても差し支えない。
きるように使用濃度よりも濃厚な溶液として提供される
のが一般的であるが、検査時の必要濃度に調製しておい
ても差し支えない。
【００６９】
【発明の効果】本発明により提供されるオリゴヌクレオ
チドプローブ群は、ＨＬＡ−ＤＲ抗原をコードする遺伝
子の遺伝子型を明確に型分けすることが可能であり、該
オリゴヌクレオチドプローブを使用することにより、従
来は型分け不可能であった遺伝子型を型分け可能とし
た。また公知のオリゴヌクレオチドプローブを併せて使
用することにより、日本人の場合には、その９７％と高
率でＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子型を型分け可能とした。
このように本発明により提供されるオリゴヌクレオチド
プローブならびにそれを使用する遺伝子型分けの方法に
よれば、従来の型分けによるよりも高精度な型分けが可
能となる。特に抗血清によるタイピングが不能なＤＲの
型を含めて判定する為には本発明のオリゴヌクレオチド
プローブの使用が必須の要件である。
チドプローブ群は、ＨＬＡ−ＤＲ抗原をコードする遺伝
子の遺伝子型を明確に型分けすることが可能であり、該
オリゴヌクレオチドプローブを使用することにより、従
来は型分け不可能であった遺伝子型を型分け可能とし
た。また公知のオリゴヌクレオチドプローブを併せて使
用することにより、日本人の場合には、その９７％と高
率でＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子型を型分け可能とした。
このように本発明により提供されるオリゴヌクレオチド
プローブならびにそれを使用する遺伝子型分けの方法に
よれば、従来の型分けによるよりも高精度な型分けが可
能となる。特に抗血清によるタイピングが不能なＤＲの
型を含めて判定する為には本発明のオリゴヌクレオチド
プローブの使用が必須の要件である。
【００７０】上記のように、本発明により提供されるオ
リゴヌクレオチドプローブならびにそれを使用する遺伝
子型分けの方法により、更に新たな診断手法の開発ある
いはその他の医学上の研究の進展も期待できるものであ
る。
リゴヌクレオチドプローブならびにそれを使用する遺伝
子型分けの方法により、更に新たな診断手法の開発ある
いはその他の医学上の研究の進展も期待できるものであ
る。
【００７１】
【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。ただし、これら実施例は本発明の技術的範囲を限定
するものではない。
る。ただし、これら実施例は本発明の技術的範囲を限定
するものではない。
【００７２】
【実施例１】 オリゴヌクレオチドの合成 オリゴヌクレオチドは、Applied Biosystem 社（Foster
City ）製の自動ＤＮＡ合成機を使用して合成し、変性
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。
City ）製の自動ＤＮＡ合成機を使用して合成し、変性
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。
【００７３】ＰＣＲプライマーの塩基配列は既に報告さ
れている下記の２種類である。 ＦＰＲ１、ＤＲβＡＭＰ１ また、オリゴヌクレオチドプローブの内、以下の分は既
に報告されている配列を用いている。 Ｆ２２、Ｆ２９、Ｆ４２、Ｆ１５８ Ｆ８、Ｆ１２０、Ｆ１２１、Ｆ１２２ Ｆ２、Ｆ４、Ｆ１２３、Ｆ５２ Ｆ４６、Ｆ５２ｃ、Ｆ１４１、Ｆ１４２、Ｆ１４３ 他のオリゴヌクレオチドプローブは既に報告されている
ＤＲＢアレルの塩基配列に従って合成した。
れている下記の２種類である。 ＦＰＲ１、ＤＲβＡＭＰ１ また、オリゴヌクレオチドプローブの内、以下の分は既
に報告されている配列を用いている。 Ｆ２２、Ｆ２９、Ｆ４２、Ｆ１５８ Ｆ８、Ｆ１２０、Ｆ１２１、Ｆ１２２ Ｆ２、Ｆ４、Ｆ１２３、Ｆ５２ Ｆ４６、Ｆ５２ｃ、Ｆ１４１、Ｆ１４２、Ｆ１４３ 他のオリゴヌクレオチドプローブは既に報告されている
ＤＲＢアレルの塩基配列に従って合成した。
【００７４】
【実施例２】 検体からの染色体ＤＮＡの採取−１ １５μｌのヒト抹消血あるいは口腔粘膜（約２８０００
個の細胞を含む）を５００μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ７．４）、１ｍＭＥＤＴＡ）に鹸濁
し、１０秒間、エッペンドルフ社製卓上遠心分離機を用
いて１３０００ｒｐｍで遠心分離した。遠心分離後、上
清液を取り去り、固体物質を残した。ここに５００μｌ
のＴＥ緩衝液を加えてよく攪拌し、固体物質を鹸濁さ
せ、再度遠心分離した。遠心分離後、上清液を取り去
り、固体物質を残した。この操作を引続き２回行い、得
た固体物質に、５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭトリス
塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、
０．００１％ゼラチン、０．０５％ツイーン２０、１０
μｇプロテナーゼＫからなる溶液１００μｌを加えて鹸
濁させ、５６℃で４５分反応させ、さらに５分間沸騰条
件下で加熱処理した後、氷浴中で急冷した。その後、先
と同様に遠心分離して染色体ＤＮＡを含む上清液を得
た。この上清液から５μｌを採り、染色体ＤＮＡ溶液と
してＰＣＲに供した。
個の細胞を含む）を５００μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ７．４）、１ｍＭＥＤＴＡ）に鹸濁
し、１０秒間、エッペンドルフ社製卓上遠心分離機を用
いて１３０００ｒｐｍで遠心分離した。遠心分離後、上
清液を取り去り、固体物質を残した。ここに５００μｌ
のＴＥ緩衝液を加えてよく攪拌し、固体物質を鹸濁さ
せ、再度遠心分離した。遠心分離後、上清液を取り去
り、固体物質を残した。この操作を引続き２回行い、得
た固体物質に、５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭトリス
塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、
０．００１％ゼラチン、０．０５％ツイーン２０、１０
μｇプロテナーゼＫからなる溶液１００μｌを加えて鹸
濁させ、５６℃で４５分反応させ、さらに５分間沸騰条
件下で加熱処理した後、氷浴中で急冷した。その後、先
と同様に遠心分離して染色体ＤＮＡを含む上清液を得
た。この上清液から５μｌを採り、染色体ＤＮＡ溶液と
してＰＣＲに供した。
【００７５】
【実施例３】 検体からの染色体ＤＮＡの採取−２ １０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ塩化ナ
トリウム、１ｍＭＥＤＴＡからなる溶液１００μｌにジ
チオスレイトール１．５ｍｇ、１０％ＳＤＳ２５μｌを
加えて、ヒトの爪を鹸濁させ、更に１００ｍｇのプロテ
ナーゼＫを含む溶液１０μｌを添加して、５６℃で５分
〜４５分反応させ、さらに９５℃で１０分間加熱処理し
た後、氷浴中で急冷した。その後、実施例１におけると
同様に遠心分離して染色体ＤＮＡを含む上清液を得た。
この上清液から５μｌ採り、染色体ＤＮＡ溶液としてＰ
ＣＲに供した。
トリウム、１ｍＭＥＤＴＡからなる溶液１００μｌにジ
チオスレイトール１．５ｍｇ、１０％ＳＤＳ２５μｌを
加えて、ヒトの爪を鹸濁させ、更に１００ｍｇのプロテ
ナーゼＫを含む溶液１０μｌを添加して、５６℃で５分
〜４５分反応させ、さらに９５℃で１０分間加熱処理し
た後、氷浴中で急冷した。その後、実施例１におけると
同様に遠心分離して染色体ＤＮＡを含む上清液を得た。
この上清液から５μｌ採り、染色体ＤＮＡ溶液としてＰ
ＣＲに供した。
【００７６】〔比較例１〕５０μｌの血液を５％ＥＤＴ
Ａ溶液５０μｌに鹸濁し、５秒間実施例１におけると同
様に遠心分離した後、上清液を取り除いた。残った固体
物質に水２００μｌを添加して溶解し、５分間沸騰条件
下で加熱処理した。得られた溶液を上記と同様に遠心分
離して、上清液を採取した。この上清液から４０μｌを
採り、染色体ＤＮＡ溶液としてＰＣＲに供した。
Ａ溶液５０μｌに鹸濁し、５秒間実施例１におけると同
様に遠心分離した後、上清液を取り除いた。残った固体
物質に水２００μｌを添加して溶解し、５分間沸騰条件
下で加熱処理した。得られた溶液を上記と同様に遠心分
離して、上清液を採取した。この上清液から４０μｌを
採り、染色体ＤＮＡ溶液としてＰＣＲに供した。
【００７７】〔比較例２〕５０μｌのヒト血液を５％Ｅ
ＤＴＡ溶液５０μｌに鹸濁し、この鹸濁液を注射筒と注
射針（２２ゲージ）を用いて、注射筒への出し入れを５
分間行なった。この後、５分間沸騰条件下で加熱処理し
た。得られた溶液を実施例１と同様に遠心分離して、上
清液を採取した。この上清液から４０μｌを採り、染色
体ＤＮＡ溶液としてＰＣＲに供した。
ＤＴＡ溶液５０μｌに鹸濁し、この鹸濁液を注射筒と注
射針（２２ゲージ）を用いて、注射筒への出し入れを５
分間行なった。この後、５分間沸騰条件下で加熱処理し
た。得られた溶液を実施例１と同様に遠心分離して、上
清液を採取した。この上清液から４０μｌを採り、染色
体ＤＮＡ溶液としてＰＣＲに供した。
【００７８】〔比較例３〕１００μｌの血液を、水１０
０μｌ及び５％ＥＤＴＡ５０μｌからなる溶液に鹸濁
し、実施例１におけると同様に遠心分離した後、残った
固体物質を０．０５％のノニデートＰ４０の水溶液２０
０μｌに鹸濁し、５分間沸騰条件下で加熱処理した。得
られた溶液を上記と同様に遠心分離して、上清液を採取
した。この上清液から４０μｌを採り、染色体ＤＮＡ溶
液としてＰＣＲに供した。
０μｌ及び５％ＥＤＴＡ５０μｌからなる溶液に鹸濁
し、実施例１におけると同様に遠心分離した後、残った
固体物質を０．０５％のノニデートＰ４０の水溶液２０
０μｌに鹸濁し、５分間沸騰条件下で加熱処理した。得
られた溶液を上記と同様に遠心分離して、上清液を採取
した。この上清液から４０μｌを採り、染色体ＤＮＡ溶
液としてＰＣＲに供した。
【００７９】
【実施例４】ビオチン化−２１−ｄＵＴＰを使用するポ
リメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）によるビオ
チン化 １０×ＰＣＲ緩衝液（２００ｍＭトリス塩酸、
１５ｍＭＭｇＣｌ、２５０ｍＭＫＣｌ、０. ５％Ｔｗｅ
ｅｎ２０、１００μｇ／ｍｌＢＳＡ）を５μｌ、２. ５
ｍＭｄＡＴＰ、２. ５ｍＭｄＣＴＰ、２. ５ｍＭｄＧＴ
Ｐを各々１μｌ、１. ５ｍＭｄＴＴＰを１μｌ、０. ５
ｍＭビオチン化−２１−ｄＵＴＰを１. ２５μｌ、１０
μＭプライマー液（ＦＰＲ１プライマーとＤＲβＡＭＰ
１プライマーの等量混合溶液）を１μｌ、実施例２にお
いて得たＤＮＡ溶液を５μｌ、さらに水を混合し全容量
を４９μｌとした。この液を混合し、９５℃にて５分間
加熱し、室温に放置冷却した。この液に２. ５ユニット
／μｌのＴａｑ．ＤＮＡ ポリメラーゼ溶液１μｌを加
え攪拌した後、４０μｌのミネラルオイルを重層した。
この液をＡＳＴＥＣ製ＰＣ−５００を使用し、ＰＣＲを
３０回行った。
リメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）によるビオ
チン化 １０×ＰＣＲ緩衝液（２００ｍＭトリス塩酸、
１５ｍＭＭｇＣｌ、２５０ｍＭＫＣｌ、０. ５％Ｔｗｅ
ｅｎ２０、１００μｇ／ｍｌＢＳＡ）を５μｌ、２. ５
ｍＭｄＡＴＰ、２. ５ｍＭｄＣＴＰ、２. ５ｍＭｄＧＴ
Ｐを各々１μｌ、１. ５ｍＭｄＴＴＰを１μｌ、０. ５
ｍＭビオチン化−２１−ｄＵＴＰを１. ２５μｌ、１０
μＭプライマー液（ＦＰＲ１プライマーとＤＲβＡＭＰ
１プライマーの等量混合溶液）を１μｌ、実施例２にお
いて得たＤＮＡ溶液を５μｌ、さらに水を混合し全容量
を４９μｌとした。この液を混合し、９５℃にて５分間
加熱し、室温に放置冷却した。この液に２. ５ユニット
／μｌのＴａｑ．ＤＮＡ ポリメラーゼ溶液１μｌを加
え攪拌した後、４０μｌのミネラルオイルを重層した。
この液をＡＳＴＥＣ製ＰＣ−５００を使用し、ＰＣＲを
３０回行った。
【００８０】ＰＣＲにおける最初の反応は５５℃で２分
間、７２℃で３分間の条件で、２回目以降２９回までは
９４℃で５０秒、５５℃で１分間、７２℃で２分間の条
件で、３０回目は７２℃３分間の条件で行った。反応液
を５０μｌとり、そこへグリコーゲン（１０ｍｇ／μ
ｌ）１μｌ、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５. ５）を５μ
ｌ、エタノールを１６５μｌ混合し、攪拌した後に−２
０℃で３０分間冷却した。冷却後５分間１２０００ｒｐ
ｍの条件で遠心し、固形沈澱物を得た。得た沈澱物に７
０％エタノールを加え、固形沈澱物を洗浄しその後、減
圧下にて乾燥した。このようにして得られたＵがビオチ
ン化されたＤＮＡからなる固形物を１０８μｌの水に溶
解し、ＤＮＡ濃度が０. ０１μｇ／μｌの溶液を調製し
た。ＰＣＲによる生成ＤＮＡの長さはＤＮＡ溶液８μｌ
を１. ０％アガロースゲルにかけて確認した。
間、７２℃で３分間の条件で、２回目以降２９回までは
９４℃で５０秒、５５℃で１分間、７２℃で２分間の条
件で、３０回目は７２℃３分間の条件で行った。反応液
を５０μｌとり、そこへグリコーゲン（１０ｍｇ／μ
ｌ）１μｌ、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５. ５）を５μ
ｌ、エタノールを１６５μｌ混合し、攪拌した後に−２
０℃で３０分間冷却した。冷却後５分間１２０００ｒｐ
ｍの条件で遠心し、固形沈澱物を得た。得た沈澱物に７
０％エタノールを加え、固形沈澱物を洗浄しその後、減
圧下にて乾燥した。このようにして得られたＵがビオチ
ン化されたＤＮＡからなる固形物を１０８μｌの水に溶
解し、ＤＮＡ濃度が０. ０１μｇ／μｌの溶液を調製し
た。ＰＣＲによる生成ＤＮＡの長さはＤＮＡ溶液８μｌ
を１. ０％アガロースゲルにかけて確認した。
【００８１】〔比較例４〕実施例４において実施例２に
おいて得られたＤＮＡ溶液の代わりに比較例１において
得られたＤＮＡ溶液を使用した以外は実施例４と同様に
操作した。その結果、アガロースゲルでは明確なバンド
が認められず、比較例１において得られたＤＮＡ溶液は
使用できないことが明らかとなった。
おいて得られたＤＮＡ溶液の代わりに比較例１において
得られたＤＮＡ溶液を使用した以外は実施例４と同様に
操作した。その結果、アガロースゲルでは明確なバンド
が認められず、比較例１において得られたＤＮＡ溶液は
使用できないことが明らかとなった。
【００８２】〔比較例５〕実施例４において実施例２に
おいて得られたＤＮＡ溶液の代わりに比較例２において
得られたＤＮＡ溶液を使用した以外は実施例４と同様に
操作した。その結果、アガロースゲルでは明確なバンド
が認められず、比較例１において得られたＤＮＡ溶液は
使用できないことが明らかとなった。
おいて得られたＤＮＡ溶液の代わりに比較例２において
得られたＤＮＡ溶液を使用した以外は実施例４と同様に
操作した。その結果、アガロースゲルでは明確なバンド
が認められず、比較例１において得られたＤＮＡ溶液は
使用できないことが明らかとなった。
【００８３】〔比較例６〕実施例４において実施例２に
おいて得られたＤＮＡ溶液の代わりに比較例３において
得られたＤＮＡ溶液を使用した以外は実施例４と同様に
操作した。その結果、アガロースゲルでは明確なバンド
が認められず、比較例１において得られたＤＮＡ溶液は
使用できないことが明らかとなった。
おいて得られたＤＮＡ溶液の代わりに比較例３において
得られたＤＮＡ溶液を使用した以外は実施例４と同様に
操作した。その結果、アガロースゲルでは明確なバンド
が認められず、比較例１において得られたＤＮＡ溶液は
使用できないことが明らかとなった。
【００８４】
【実施例５】 ビオチン化−１４−ｄＡＴＰを使用するＰＣＲによるビ
オチン化 容量が５０μｌ、実施例２において得られたＤＮＡ溶液
を５μｌを含み、さらに塩化カリウム、トリス塩酸緩衝
液（ｐＨ８．３）、塩化マグネシウム、ゼラチン、ｄＧ
ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ビオチン−１４
−ｄＡＴＰ、プライマー、ベントＤＮＡポリメラーゼ
（ＮＥＢ社製）の濃度を各々５０ｍＭ、１０ｍＭ、１．
５ｍＭ、０．００１％、５０μＭ、５０μＭ、５０μ
Ｍ、３０μＭ、１２μＭ、２０μＭ、０．０２ｕ／μｌ
とした水溶液を調製した。この溶液を、９５℃にて５分
間加熱し、室温に放置冷却した。この液に２. ５ユニッ
ト／μｌのＴａｑ．ＤＮＡ ポリメラーゼ溶液１μｌを
加え攪拌した後、４０μｌのミネラルオイルを重層し
た。この液をＡＳＴＥＣ製ＰＣ−５００を使用し、ＰＣ
Ｒを３０回行った。
オチン化 容量が５０μｌ、実施例２において得られたＤＮＡ溶液
を５μｌを含み、さらに塩化カリウム、トリス塩酸緩衝
液（ｐＨ８．３）、塩化マグネシウム、ゼラチン、ｄＧ
ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ビオチン−１４
−ｄＡＴＰ、プライマー、ベントＤＮＡポリメラーゼ
（ＮＥＢ社製）の濃度を各々５０ｍＭ、１０ｍＭ、１．
５ｍＭ、０．００１％、５０μＭ、５０μＭ、５０μ
Ｍ、３０μＭ、１２μＭ、２０μＭ、０．０２ｕ／μｌ
とした水溶液を調製した。この溶液を、９５℃にて５分
間加熱し、室温に放置冷却した。この液に２. ５ユニッ
ト／μｌのＴａｑ．ＤＮＡ ポリメラーゼ溶液１μｌを
加え攪拌した後、４０μｌのミネラルオイルを重層し
た。この液をＡＳＴＥＣ製ＰＣ−５００を使用し、ＰＣ
Ｒを３０回行った。
【００８５】ＰＣＲにおける最初の反応は５５℃で２分
間、７２℃で３分間の条件で、２回目以降２９回までは
９４℃で５０秒、５５℃で１分間、７２℃で２分間の条
件で、３０回目は７２℃３分間の条件で行った。反応液
を５０μｌとり、そこへグリコーゲン（１０ｍｇ／μ
ｌ）１μｌ、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５.５）を５μ
ｌ、エタノールを１６５μｌ混合し、攪拌した後に−２
０℃で３０分間冷却した。冷却後５分間１２０００ｒｐ
ｍの条件で遠心し、固形沈澱物を得た。得た沈澱物に７
０％エタノールを加え、固形沈澱物を洗浄しその後、減
圧下にて乾燥した。このようにして得られたＵがビオチ
ン化されたＤＮＡからなる固形物を１０８μｌの水に溶
解し、ＤＮＡ濃度が０. ０１μｇ／μｌの溶液を調製し
た。ＰＣＲによる生成ＤＮＡの長さはＤＮＡ溶液８μｌ
を１. ０％アガロースゲルにかけて確認した。
間、７２℃で３分間の条件で、２回目以降２９回までは
９４℃で５０秒、５５℃で１分間、７２℃で２分間の条
件で、３０回目は７２℃３分間の条件で行った。反応液
を５０μｌとり、そこへグリコーゲン（１０ｍｇ／μ
ｌ）１μｌ、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５.５）を５μ
ｌ、エタノールを１６５μｌ混合し、攪拌した後に−２
０℃で３０分間冷却した。冷却後５分間１２０００ｒｐ
ｍの条件で遠心し、固形沈澱物を得た。得た沈澱物に７
０％エタノールを加え、固形沈澱物を洗浄しその後、減
圧下にて乾燥した。このようにして得られたＵがビオチ
ン化されたＤＮＡからなる固形物を１０８μｌの水に溶
解し、ＤＮＡ濃度が０. ０１μｇ／μｌの溶液を調製し
た。ＰＣＲによる生成ＤＮＡの長さはＤＮＡ溶液８μｌ
を１. ０％アガロースゲルにかけて確認した。
【００８６】
【実施例６】 オリゴヌクレオチドプローブのテーリングと膜への固定 １０×テーリング緩衝液（１Ｍカコジル酸ナトリウム
（ｐＨ７．６）、２５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．６）、２ｍＭジチオスレイトール）を１０μｌ、１
００ｍＭｄＴＴＰを４μｌ、プローブを２００ｐｍｏｌ
混合し、そこへ１０ｍＭＣｏＣｌ2を１０μｌ添加し、
混合した。さらにそこへ２５ユニット／μｌのターミナ
ルデオキシヌクレオチジイルトランスフェラーゼ（ＴＯ
ＹＯＢＯ製）を２μｌ添加し、全容量を１００μｌとし
た。この液を３７℃にて２時間反応させた後、フェノー
ルとクロロホルムの１／１混合液１００μｌにより２回
抽出した。抽出残液に３Ｍ酢酸ナトリウム溶液を１０μ
ｌ、エタノールを３３０μｌを添加し攪拌混合し、−２
０℃にて３０分放置した。その後、遠心し、得られた固
形沈澱物を７０％エタノールで洗浄した。得られた固形
沈澱物を減圧下で乾燥した。
（ｐＨ７．６）、２５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．６）、２ｍＭジチオスレイトール）を１０μｌ、１
００ｍＭｄＴＴＰを４μｌ、プローブを２００ｐｍｏｌ
混合し、そこへ１０ｍＭＣｏＣｌ2を１０μｌ添加し、
混合した。さらにそこへ２５ユニット／μｌのターミナ
ルデオキシヌクレオチジイルトランスフェラーゼ（ＴＯ
ＹＯＢＯ製）を２μｌ添加し、全容量を１００μｌとし
た。この液を３７℃にて２時間反応させた後、フェノー
ルとクロロホルムの１／１混合液１００μｌにより２回
抽出した。抽出残液に３Ｍ酢酸ナトリウム溶液を１０μ
ｌ、エタノールを３３０μｌを添加し攪拌混合し、−２
０℃にて３０分放置した。その後、遠心し、得られた固
形沈澱物を７０％エタノールで洗浄した。得られた固形
沈澱物を減圧下で乾燥した。
【００８７】このようにして得られた固形物を水５０μ
ｌに溶解し、内４２μｌの溶液を６５℃にて５分加熱
し、直ちに氷中で冷却した。この溶液に１１５８μｌの
１０×ＳＳＣ溶液（１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．１９
Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）を加え、攪拌し
た。この溶液を１００μｌづつミリポア製ＭｉｌｌｉＢ
ｌｏｔ−Ｄを使用してナイロン膜Ｄｕｌａｒｏｎ ＵＶ
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）にブロットした。さらに
ＭｉｌｌｉＢｌｏｔ−Ｄのウエルを１０×ＳＳＣ（塩化
ナトリウム、クエン酸ナトリウム溶液で洗浄し、ストラ
リンカーを使用し、紫外線を１２００００マイクロジュ
ール照射した。
ｌに溶解し、内４２μｌの溶液を６５℃にて５分加熱
し、直ちに氷中で冷却した。この溶液に１１５８μｌの
１０×ＳＳＣ溶液（１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．１９
Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）を加え、攪拌し
た。この溶液を１００μｌづつミリポア製ＭｉｌｌｉＢ
ｌｏｔ−Ｄを使用してナイロン膜Ｄｕｌａｒｏｎ ＵＶ
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）にブロットした。さらに
ＭｉｌｌｉＢｌｏｔ−Ｄのウエルを１０×ＳＳＣ（塩化
ナトリウム、クエン酸ナトリウム溶液で洗浄し、ストラ
リンカーを使用し、紫外線を１２００００マイクロジュ
ール照射した。
【００８８】得られた膜を５×ＳＳＰＥ（０．９Ｍ 塩
化ナトリウム、５０ｍＭ 燐酸二水素ナトリウム（ｐＨ
７．４））、５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４））溶液、
０.５％ＳＤＳからなる水溶液中、３７℃で１５分間洗
浄した。その後、純水中で５分間洗浄した。このように
して得た膜を室温下で風乾した。
化ナトリウム、５０ｍＭ 燐酸二水素ナトリウム（ｐＨ
７．４））、５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４））溶液、
０.５％ＳＤＳからなる水溶液中、３７℃で１５分間洗
浄した。その後、純水中で５分間洗浄した。このように
して得た膜を室温下で風乾した。
【００８９】
【実施例７】 ビオチン化−２１−ｄＵＴＰを使用しないＰＣＲによる
遺伝子増幅 実施例３において０．５ｍＭビオチン化−２１−ｄＵＴ
Ｐを使用せず、さらに添加するｄＴＴＰの濃度を２．５
ｍＭとした以外は、実施例３と同様に操作してＡがビオ
チン化されたＤＮＡを得た。
遺伝子増幅 実施例３において０．５ｍＭビオチン化−２１−ｄＵＴ
Ｐを使用せず、さらに添加するｄＴＴＰの濃度を２．５
ｍＭとした以外は、実施例３と同様に操作してＡがビオ
チン化されたＤＮＡを得た。
【００９０】
【実施例８】 ＤＮＡプローブのハイブリダイゼーション 健康な日本人ドナーから採取した染色体ＤＮＡ１μｇを
ＦＰＲ１およびＤＲβＡＭＰ１をプライマーに用いて３
０サイクルのＰＣＲにかけ増幅した。増幅したＤＲＢ遺
伝子の第２エクソン部の第２および第３超可変領域を含
む２３８塩基対のフラグメントをアルカリ変性し、ナイ
ロン膜に１２ドット固定した。
ＦＰＲ１およびＤＲβＡＭＰ１をプライマーに用いて３
０サイクルのＰＣＲにかけ増幅した。増幅したＤＲＢ遺
伝子の第２エクソン部の第２および第３超可変領域を含
む２３８塩基対のフラグメントをアルカリ変性し、ナイ
ロン膜に１２ドット固定した。
【００９１】膜を一片に１個のドットがあるようにして
１２片に切取り、各片をまず１２種の32Ｐラベルしたオ
リゴヌクレオチドプローブ（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ４、Ｆ７、
Ｆ８、Ｆ９、 Ｆ１１、Ｆ１２０、Ｆ１３、Ｆ１２３、
Ｆ１４２、Ｆ１４３、各２ｎｇ／ｍｌ） で６×ＳＳＣ
（塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム）、０．５％Ｓ
ＤＳ、５×デンハルト液中、３７℃で２〜３時間ハイブ
リダイズさせ、膜は下記の条件で洗浄し、オートラジオ
グラフィーにかけた。
１２片に切取り、各片をまず１２種の32Ｐラベルしたオ
リゴヌクレオチドプローブ（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ４、Ｆ７、
Ｆ８、Ｆ９、 Ｆ１１、Ｆ１２０、Ｆ１３、Ｆ１２３、
Ｆ１４２、Ｆ１４３、各２ｎｇ／ｍｌ） で６×ＳＳＣ
（塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム）、０．５％Ｓ
ＤＳ、５×デンハルト液中、３７℃で２〜３時間ハイブ
リダイズさせ、膜は下記の条件で洗浄し、オートラジオ
グラフィーにかけた。
【００９２】この結果が得られた後に、膜を０．４ＭＮ
ａＯＨ中、１５分間３７℃で処理し、続いて０．１×Ｓ
ＳＣ（１５ｍＭ塩化ナトリウム、１．９ｍＭクエン酸ナ
トリウム、ｐＨ７．０）、０．０１％ＳＤＳからなる水
溶液中、更に１５分間３７℃で処理してオリゴヌクレオ
チドプローブを除き、他の異なった１２種のオリゴヌク
レオチドプローブ（Ｆ３、Ｆ１０、Ｆ２２、Ｆ２９、Ｆ
４２、Ｆ４４、Ｆ４５、Ｆ４６、Ｆ１２１、Ｆ１２２、
Ｆ１５８、Ｆ５２ｃ）と上記の方法でハイブリダイズさ
せた。また、上記のハイブリダイズでは完全に決めれな
いものには、上記のオリゴヌクレオチドプローブに加え
てＦ３ ０、Ｆ５２、Ｆ１４１、Ｆ８５１、Ｆ８６３を
使用した。
ａＯＨ中、１５分間３７℃で処理し、続いて０．１×Ｓ
ＳＣ（１５ｍＭ塩化ナトリウム、１．９ｍＭクエン酸ナ
トリウム、ｐＨ７．０）、０．０１％ＳＤＳからなる水
溶液中、更に１５分間３７℃で処理してオリゴヌクレオ
チドプローブを除き、他の異なった１２種のオリゴヌク
レオチドプローブ（Ｆ３、Ｆ１０、Ｆ２２、Ｆ２９、Ｆ
４２、Ｆ４４、Ｆ４５、Ｆ４６、Ｆ１２１、Ｆ１２２、
Ｆ１５８、Ｆ５２ｃ）と上記の方法でハイブリダイズさ
せた。また、上記のハイブリダイズでは完全に決めれな
いものには、上記のオリゴヌクレオチドプローブに加え
てＦ３ ０、Ｆ５２、Ｆ１４１、Ｆ８５１、Ｆ８６３を
使用した。
【００９３】ハイブリダイズ後の洗浄溶液組成および洗
浄温度は以下の通りである。 Ｆ１、Ｆ２、Ｆ７、Ｆ９、Ｆ２９、Ｆ１４３、Ｆ１５
８：６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウ
ム）、０．１％ＳＤＳ、５４℃ Ｆ４、Ｆ８、Ｆ１０、
Ｆ２２、Ｆ５２、Ｆ５２ｃ、Ｆ１２１、Ｆ８５１、Ｆ８
６３：６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウ
ム）、０．１％ＳＤＳ、５７℃： Ｆ１１、Ｆ１３、Ｆ３０、Ｆ４２、Ｆ１２０、Ｆ１２
２、Ｆ１２３、Ｆ１４１、Ｆ１４２：６×ＳＳＣ（塩化
ナトリウム、クエン酸ナトリウム、）０．１％ＳＤＳ、
６２℃： Ｆ４５、Ｆ４６：３Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム、
５７℃： Ｆ３、Ｆ４４：３Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム、６
２℃ 上記洗浄の全ての場合に、膜の断片を上記の温度で洗浄
する前に、洗浄液をもちいて室温下で５分間洗浄した。
結果を図２に示す。
浄温度は以下の通りである。 Ｆ１、Ｆ２、Ｆ７、Ｆ９、Ｆ２９、Ｆ１４３、Ｆ１５
８：６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウ
ム）、０．１％ＳＤＳ、５４℃ Ｆ４、Ｆ８、Ｆ１０、
Ｆ２２、Ｆ５２、Ｆ５２ｃ、Ｆ１２１、Ｆ８５１、Ｆ８
６３：６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウ
ム）、０．１％ＳＤＳ、５７℃： Ｆ１１、Ｆ１３、Ｆ３０、Ｆ４２、Ｆ１２０、Ｆ１２
２、Ｆ１２３、Ｆ１４１、Ｆ１４２：６×ＳＳＣ（塩化
ナトリウム、クエン酸ナトリウム、）０．１％ＳＤＳ、
６２℃： Ｆ４５、Ｆ４６：３Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム、
５７℃： Ｆ３、Ｆ４４：３Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム、６
２℃ 上記洗浄の全ての場合に、膜の断片を上記の温度で洗浄
する前に、洗浄液をもちいて室温下で５分間洗浄した。
結果を図２に示す。
【００９４】
【実施例９】 プローブ固定膜を使用するハイブリダイゼーション プローブを固定した膜をハイブリダイゼーション用プラ
スチックバッグに入れ、そこへ２ｍｌのハイブリダイゼ
ーション用液（５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８.０）、３
Ｍテトラメチルアンモニウムクロライド、２ｍＭＥＤＴ
Ａ（ｐＨ８.０）、５×デンハルト液、０.１％ＳＤＳ、
１００μｇ変性鮭精子ＤＮＡ）２ｍｌを加え、４２℃で
５０分間加熱した。その後、増幅し、さらに並行してビ
オチン化−２１−ｄＵＴＰあるいはビオチン化−１４−
ｄＡＴＰにより標識したＤＮＡを１００ｎｇ（１００μ
ｌ）添加し、４２℃で振盪しながら３時間加熱を続け
た。
スチックバッグに入れ、そこへ２ｍｌのハイブリダイゼ
ーション用液（５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８.０）、３
Ｍテトラメチルアンモニウムクロライド、２ｍＭＥＤＴ
Ａ（ｐＨ８.０）、５×デンハルト液、０.１％ＳＤＳ、
１００μｇ変性鮭精子ＤＮＡ）２ｍｌを加え、４２℃で
５０分間加熱した。その後、増幅し、さらに並行してビ
オチン化−２１−ｄＵＴＰあるいはビオチン化−１４−
ｄＡＴＰにより標識したＤＮＡを１００ｎｇ（１００μ
ｌ）添加し、４２℃で振盪しながら３時間加熱を続け
た。
【００９５】ハイブリダイゼーション後に緩衝液を捨
て、バッグから膜を取り出し、洗浄液Ｉ（２×ＳＳＰ
Ｅ、０. １％ＳＤＳ）中室温下、５分間の間隔で２回洗
浄した。次に膜を洗浄液II（５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ
８. ０）、３Ｍテトラメチルアンモニウムクロライド、
２ｍＭＥＤＴＡ、５×デンハルト液、０. １％ＳＤＳ）
中室温下、５分間洗浄し、さらに洗浄液II中５８℃で２
０分間洗浄し、引続き２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム、ク
エン酸ナトリウム）溶液中室温下で５分間洗浄した。
て、バッグから膜を取り出し、洗浄液Ｉ（２×ＳＳＰ
Ｅ、０. １％ＳＤＳ）中室温下、５分間の間隔で２回洗
浄した。次に膜を洗浄液II（５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ
８. ０）、３Ｍテトラメチルアンモニウムクロライド、
２ｍＭＥＤＴＡ、５×デンハルト液、０. １％ＳＤＳ）
中室温下、５分間洗浄し、さらに洗浄液II中５８℃で２
０分間洗浄し、引続き２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム、ク
エン酸ナトリウム）溶液中室温下で５分間洗浄した。
【００９６】
【実施例10】 プローブ固定膜を使用するハイブリダイゼーション プローブを固定した膜をハイブリダイゼーション用プラ
スチックバッグに入れ、そこへ２ｍｌのハイブリダイゼ
ーション緩衝液（成分および濃度は以下の通り、５０ｍ
Ｍトリス塩酸（ｐＨ８. ０）、３Ｍ塩化テトラメチルア
ンモニウム、２ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８. ０）、５×デン
ハルト（０．１％フィコール、０．２１％ポリビニルピ
ロリドン、０．１％ＢＳＡ）、０. １％ＳＤＳ、１００
μｇ／ｍｌ変性鮭精子ＤＮＡ）２ｍｌを加え、４２℃で
５０分間加熱した。その後、そこへ増幅したＤＮＡを１
００ｎｇ（１００μｌ）添加し、４２℃で振盪しながら
３時間加熱を続け、ハイブリダイゼーションさせた。
スチックバッグに入れ、そこへ２ｍｌのハイブリダイゼ
ーション緩衝液（成分および濃度は以下の通り、５０ｍ
Ｍトリス塩酸（ｐＨ８. ０）、３Ｍ塩化テトラメチルア
ンモニウム、２ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８. ０）、５×デン
ハルト（０．１％フィコール、０．２１％ポリビニルピ
ロリドン、０．１％ＢＳＡ）、０. １％ＳＤＳ、１００
μｇ／ｍｌ変性鮭精子ＤＮＡ）２ｍｌを加え、４２℃で
５０分間加熱した。その後、そこへ増幅したＤＮＡを１
００ｎｇ（１００μｌ）添加し、４２℃で振盪しながら
３時間加熱を続け、ハイブリダイゼーションさせた。
【００９７】ハイブリダイゼーション後にハイブリダイ
ゼーション液を捨て、バッグから膜を取り出し、洗浄液
Ｉ（２×ＳＳＰＥ（０．３６Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍ
Ｍ隣酸水素ナトリウム、（ｐＨ７．４））、ＥＤＴＡ
（ｐＨ７．４））、０. １％ＳＤＳ）中室温下、５分間
の間隔で２回洗浄した。次に膜を洗浄液II（５０ｍＭト
リス塩酸（ｐＨ８.０）、３Ｍテトラメチルアンモニウ
ムクロライド、２ｍＭＥＤＴＡ、５×デンハルト溶液、
０. １％ＳＤＳ）中室温下、５分間洗浄し、さらに洗浄
液II中５８℃で２０分間洗浄し、引続き２×ＳＳＣ（塩
化ナトリウム、クエン酸ナトリウム溶液中室温下で５分
間洗浄した。
ゼーション液を捨て、バッグから膜を取り出し、洗浄液
Ｉ（２×ＳＳＰＥ（０．３６Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍ
Ｍ隣酸水素ナトリウム、（ｐＨ７．４））、ＥＤＴＡ
（ｐＨ７．４））、０. １％ＳＤＳ）中室温下、５分間
の間隔で２回洗浄した。次に膜を洗浄液II（５０ｍＭト
リス塩酸（ｐＨ８.０）、３Ｍテトラメチルアンモニウ
ムクロライド、２ｍＭＥＤＴＡ、５×デンハルト溶液、
０. １％ＳＤＳ）中室温下、５分間洗浄し、さらに洗浄
液II中５８℃で２０分間洗浄し、引続き２×ＳＳＣ（塩
化ナトリウム、クエン酸ナトリウム溶液中室温下で５分
間洗浄した。
【００９８】
【実施例11】 検出 （ＢＲＬ社製 PhotoGeneTM Nucleic Acid Detection Sy
stemを使用）ハイブリダイゼーションおよび洗浄後の膜
をＴＢＳーＴｗｅｅｎ２０（１００ｍＭトリス塩酸、１
５０ｍＭＮａＣｌ、０. ０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中で室
温下で１分間洗浄した。続いて、膜１ｃｍ2 当り０. ７
５ｍｌのブロッキング溶液（３％ＢＳＡ、ＴＢＳーＴｗ
ｅｅｎ２０）中で室温下５０分間処理した。
stemを使用）ハイブリダイゼーションおよび洗浄後の膜
をＴＢＳーＴｗｅｅｎ２０（１００ｍＭトリス塩酸、１
５０ｍＭＮａＣｌ、０. ０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中で室
温下で１分間洗浄した。続いて、膜１ｃｍ2 当り０. ７
５ｍｌのブロッキング溶液（３％ＢＳＡ、ＴＢＳーＴｗ
ｅｅｎ２０）中で室温下５０分間処理した。
【００９９】ストレプトアビジン−アルカリフォスファ
ターゼ結合体の溶液をＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０を用いて
３０００倍に希釈した液中で膜を室温下１０分間処理し
た。その後、膜１ｃｍ2あたり１ｍｌのＴＢＳ−Ｔｗｅ
ｅｎ２０溶液中室温下１５分間づつ２回洗浄した。さら
に最終緩衝液の１０倍希釈液中、室温下１時間洗浄し
た。膜をワットマン３ＭＭ濾紙上に置き過剰の緩衝液を
除いた後、膜を現像ホルダー中に置いた。ホルダー中の
膜に検出試薬を滴下し、膜をホルダーで覆った。そのま
ま２時間反応させ、Ｘ線フィルムあるいはＨｙｐｅｒ
Ｆｉｌｍ（アマシャム社）を挟み、１５分間露光させ、
現像し、第３図および第４図に示される結果を得た。
ターゼ結合体の溶液をＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０を用いて
３０００倍に希釈した液中で膜を室温下１０分間処理し
た。その後、膜１ｃｍ2あたり１ｍｌのＴＢＳ−Ｔｗｅ
ｅｎ２０溶液中室温下１５分間づつ２回洗浄した。さら
に最終緩衝液の１０倍希釈液中、室温下１時間洗浄し
た。膜をワットマン３ＭＭ濾紙上に置き過剰の緩衝液を
除いた後、膜を現像ホルダー中に置いた。ホルダー中の
膜に検出試薬を滴下し、膜をホルダーで覆った。そのま
ま２時間反応させ、Ｘ線フィルムあるいはＨｙｐｅｒ
Ｆｉｌｍ（アマシャム社）を挟み、１５分間露光させ、
現像し、第３図および第４図に示される結果を得た。
【０１００】型分け結果 血清学的に明らかにされたＤＲの型とプローブによって
決定されたＤＲの型を比較して図２乃至図４ならびに表
４および表５に示した。この結果から、検体ＤＮＡを固
定した膜にプローブをハイブリダイズさせた場合、およ
びプローブを固定した膜に検体ＤＮＡをバイブリダイズ
させた場合のいづれの場合においても血清学的に決定さ
れたＤＲの型およびサブタイプを示す結果が得られた。
また、血清学的には決定できない型の場合においても、
その型を決定できた。
決定されたＤＲの型を比較して図２乃至図４ならびに表
４および表５に示した。この結果から、検体ＤＮＡを固
定した膜にプローブをハイブリダイズさせた場合、およ
びプローブを固定した膜に検体ＤＮＡをバイブリダイズ
させた場合のいづれの場合においても血清学的に決定さ
れたＤＲの型およびサブタイプを示す結果が得られた。
また、血清学的には決定できない型の場合においても、
その型を決定できた。
【０１０１】
配列番号：１ （１）配列の長さ：１８ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＡ３と記載される。X
は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴを
表わす。 （８）配列 AGXAGXXGXC CACCCGGC 18 配列番号：２ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ１０と記載される。
X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴ
を表わす。 （８）配列 XGGAAAGACG CGXCCAXAA 19 配列番号：３ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＡ１４１６と記載され
る。X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合
はＴを表わす。 （８）配列 CAGGAGGAGA ACGXGCGCX 19 配列番号：４ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ３０と記載される。
X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴ
を表わす。 （８）配列 GACXXCCXGG AAGACGAGC 19 配列番号：５ （１）配列の長さ：１８ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ４４と記載される。
X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴ
を表わす。 （８）配列 CGCGGCCCGC XXCXGCXC 18 配列番号：６ （１）配列の長さ：１８ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ４５と記載される。
X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴ
を表わす。 （８）配列 CCXCGGCCCG CCXCXGCX 18 配列番号：７ （１）配列の長さ：１８ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ８６３と記載され
る。X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合
はＴを表わす。 （８）配列 GCXCXCCACA GCCCCGXA 18 配列番号：８ （１）配列の長さ：１８ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ８５１と記載され
る。X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合
はＴを表わす。 （８）配列 GCGGCCXGAX GCCGAGXA 18 配列番号：９ （１）配列の長さ：１８ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＡ３と記載される。 （８）配列 GCCGGGTGGA CAACTACT 18 配列番号：１０ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ１０と記載される。 （８）配列 TTATGGACGC GTCTTTCCA 19 配列番号：１１ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＡ１４１６と記載され
る。 （８）配列 AGCGCACGTT CTCCTCCTG 19 配列番号：１２ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ３０と記載される。 （８）配列 GCTCGTCTTC CAGGAAGTC 19 配列番号：１３ （１）配列の長さ：１８ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ４４と記載される。 （８）配列 GAGCAGAAGC GGGCCGCG 18 配列番号：１４ （１）配列の長さ：１８ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ４５と記載される。 （８）配列 AGCAGAGGCG GGCCGAGG 18 配列番号：１５ （１）配列の長さ：１８ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ８６３と記載される。 （８）配列 TACGGGGCTG TGGAGAGC 18 配列番号：１６ （１）配列の長さ：１８ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ８５１と記載される。 （８）配列 TACTCGGCAT CAGGCCGC 18 配列番号：１７ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ１と記載される。X
は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴを
表わす。 （８）配列 GCXGGAAAGA XGCAXCXAX 19 配列番号：１８ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ２と記載される。X
は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴを
表わす。 （８）配列 CXCXGXGCAG GAACCGCAC 19 配列番号：１９ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ３と記載される。X
は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴを
表わす。 （８）配列 GXCXGCAGXA GXXGXCCAC 19 配列番号：２０ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ４と記載される。X
は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴを
表わす。 （８）配列 CCXCXXGGXG AXAGAAGXA 19 配列番号：２１ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ７と記載される。X
は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴを
表わす。 （８）配列 CCXGGAAAGA CXCXXCXAX 19 配列番号：２２ （１）配列の長さ：１８ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ８と記載される。X
は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴを
表わす。 （８）配列 GGCCCXGGXG GACACCXA 18 配列番号：２３ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ９と記載される。X
は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴを
表わす。 （８）配列 GGXGCGGXAX CXGCACAGA 19 配列番号：２４ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ１１と記載される。
X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴ
を表わす。 （８）配列 CCAGXACXCC XCAXCAGGC 19 配列番号：２５ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ１３と記載される。
X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴ
を表わす。 （８）配列 CGCXCGXCXX CCAGGAXGX 19 配列番号：２６ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ５２と記載される。
X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴ
を表わす。 （８）配列 XGGACAAXXA CXGCAGACA 19 配列番号：２７ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ５２ｃと記載され
る。X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合
はＴを表わす。 （８）配列 GAAGXAXCXC XCCAGGAAC 19 配列番号：２８ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ５３と記載される。
X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴ
を表わす。 （８）配列 CXGAXCAGGX XCCACACXC 19 配列番号：２９ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ１２０と記載され
る。X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合
はＴを表わす。 （８）配列 AAGCGCAGGA GCXCCXCCX 19 配列番号：３０ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ１２１と記載され
る。X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合
はＴを表わす。 （８）配列 GCCXGXCXXC CAGGAXGXC 19 配列番号：３１ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b)株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ１２２と記載され
る。X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合
はＴを表わす。 （８）配列 CGCCXGXCXX CCAGGAAGX 19 配列番号：３２ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ１２３と記載され
る。X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合
はＴを表わす。 （８）配列 GCCXGXCXXC CAGGAGGXC 19 配列番号：３３ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ１４２と記載され
る。X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合
はＴを表わす。 （８）配列 CGGCCXGAXG CXGAGXACX 19 配列番号：３４ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ１４３と記載され
る。X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合
はＴを表わす。 （８）配列 GXXCCAGXGC XCCGCAGCA 19 配列番号：３５ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ２２と記載される。
X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴ
を表わす。 （８）配列 CAACAGGAGG ACXXGCGCX 19 配列番号：３６ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ２９と記載される。
X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴ
を表わす。 （８）配列 XGCACAGAGG CAXCXAXAA 19 配列番号：３７ （１）配列の長さ：２０ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ４２と記載される。
X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴ
を表わす。 （８）配列 ACGGACXCCX CXXGGXGAXA 20 配列番号：３８ （１）配列の長さ：１８ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ４６と記載される。
X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴ
を表わす。 （８）配列 ACCGCGGCCC GCCXCXGC 18 配列番号：３９ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ１４１と記載され
る。X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合
はＴを表わす。 （８）配列 CAGGAGGAGX XCGXGCGCX 19 配列番号：４０ （１）配列の長さ：１８ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ１５８と記載され
る。X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合
はＴを表わす。 （８）配列 AGXACXCGGC GCXAGGCC 18 配列番号：４１ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ１と記載される。 （８）配列 ATAGATGCAT CTTTCCAGC 19 配列番号：４２ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ２と記載される。 （８）配列 GTGCGGTTCC TGCACAGAG 19 配列番号：４３ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ３と記載される。 （８）配列 GTGGACAACT ACTGCAGAC 19 配列番号：４４ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ４と記載される。 （８）配列 TACTTCTATC ACCAAGAGG 19 配列番号：４５ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ７と記載される。 （８）配列 ATAGAAGAGT CTTTCCAGG 19 配列番号：４６ （１）配列の長さ：１８ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ８と記載される。 （８）配列 TAGGTGTCCA CCAGGGCC 18 配列番号：４７ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ９と記載される。 （８）配列 TCTGTGCAGA TACCGCACC 19 配列番号：４８ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ１１と記載される。 （８）配列 GCCTGATGAG GAGTACTGG 19 配列番号：４９ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ１３と記載される。 （８）配列 ACATCCTGGA AGACGAGCG 19 配列番号：５０ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ５２と記載される。 （８）配列 TGTCTGCAGT AATTGTCCA 19 配列番号：５１ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ５２ｃと記載される。 （８）配列 GTTCCTGGAG AGATACTTC 19 配列番号：５２ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ５３と記載される。 （８）配列 GAGTGTGGAA CCTGATCAG 19 配列番号：５３ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ１２０と記載される。 （８）配列 AGGAGGAGCT CCTGCGCTT 19 配列番号：５４ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ１２１と記載される。 （８）配列 GACATCCTGG AAGACAGGC 19 配列番号：５５ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ１２２と記載される。 （８）配列 ACTTCCTGGA AGACAGGCG 19 配列番号：５６ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ１２３と記載される。 （８）配列 GACCTCCTGG AAGACAGGC 19 配列番号：５７ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ１４２と記載される。 （８）配列 AGTACTCAGC ATCAGGCCG 19 配列番号：５８ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ１４３と記載される。 （８）配列 TGCTGCGGAG CACTGGAAC 19 配列番号：５９ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ２２と記載される。 （８）配列 AGCGCAAGTC CTCCTGTTG 19 配列番号：６０ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ２９と記載される。 （８）配列 TTATAGATGC CTCTGTGCA 19 配列番号：６１ （１）配列の長さ：２０ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ４２と記載される。 （８）配列 TATCACCAAG AGGAGTCCGT 20 配列番号：６２ （１）配列の長さ：１８ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ４６と記載される。 （８）配列 GCAGAGGCGG GCCGCGGT 18 配列番号：６３ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ１４１と記載される。 （８）配列 AGCGCACGAA CTCCTCCTG 19 配列番号：６４ （１）配列の長さ：１８ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ１５８と記載される。 （８）配列 GGCCTAGCGC CGAGTACT 18 配列番号：６５ （１）配列の長さ：２５ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖（４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦＰＲ１と記載される。
は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴを
表わす。 （８）配列 AGXAGXXGXC CACCCGGC 18 配列番号：２ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ１０と記載される。
X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴ
を表わす。 （８）配列 XGGAAAGACG CGXCCAXAA 19 配列番号：３ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＡ１４１６と記載され
る。X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合
はＴを表わす。 （８）配列 CAGGAGGAGA ACGXGCGCX 19 配列番号：４ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ３０と記載される。
X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴ
を表わす。 （８）配列 GACXXCCXGG AAGACGAGC 19 配列番号：５ （１）配列の長さ：１８ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ４４と記載される。
X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴ
を表わす。 （８）配列 CGCGGCCCGC XXCXGCXC 18 配列番号：６ （１）配列の長さ：１８ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ４５と記載される。
X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴ
を表わす。 （８）配列 CCXCGGCCCG CCXCXGCX 18 配列番号：７ （１）配列の長さ：１８ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ８６３と記載され
る。X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合
はＴを表わす。 （８）配列 GCXCXCCACA GCCCCGXA 18 配列番号：８ （１）配列の長さ：１８ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ８５１と記載され
る。X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合
はＴを表わす。 （８）配列 GCGGCCXGAX GCCGAGXA 18 配列番号：９ （１）配列の長さ：１８ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＡ３と記載される。 （８）配列 GCCGGGTGGA CAACTACT 18 配列番号：１０ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ１０と記載される。 （８）配列 TTATGGACGC GTCTTTCCA 19 配列番号：１１ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＡ１４１６と記載され
る。 （８）配列 AGCGCACGTT CTCCTCCTG 19 配列番号：１２ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ３０と記載される。 （８）配列 GCTCGTCTTC CAGGAAGTC 19 配列番号：１３ （１）配列の長さ：１８ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ４４と記載される。 （８）配列 GAGCAGAAGC GGGCCGCG 18 配列番号：１４ （１）配列の長さ：１８ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ４５と記載される。 （８）配列 AGCAGAGGCG GGCCGAGG 18 配列番号：１５ （１）配列の長さ：１８ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ８６３と記載される。 （８）配列 TACGGGGCTG TGGAGAGC 18 配列番号：１６ （１）配列の長さ：１８ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ８５１と記載される。 （８）配列 TACTCGGCAT CAGGCCGC 18 配列番号：１７ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ１と記載される。X
は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴを
表わす。 （８）配列 GCXGGAAAGA XGCAXCXAX 19 配列番号：１８ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ２と記載される。X
は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴを
表わす。 （８）配列 CXCXGXGCAG GAACCGCAC 19 配列番号：１９ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ３と記載される。X
は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴを
表わす。 （８）配列 GXCXGCAGXA GXXGXCCAC 19 配列番号：２０ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ４と記載される。X
は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴを
表わす。 （８）配列 CCXCXXGGXG AXAGAAGXA 19 配列番号：２１ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ７と記載される。X
は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴを
表わす。 （８）配列 CCXGGAAAGA CXCXXCXAX 19 配列番号：２２ （１）配列の長さ：１８ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ８と記載される。X
は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴを
表わす。 （８）配列 GGCCCXGGXG GACACCXA 18 配列番号：２３ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ９と記載される。X
は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴを
表わす。 （８）配列 GGXGCGGXAX CXGCACAGA 19 配列番号：２４ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ１１と記載される。
X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴ
を表わす。 （８）配列 CCAGXACXCC XCAXCAGGC 19 配列番号：２５ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ１３と記載される。
X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴ
を表わす。 （８）配列 CGCXCGXCXX CCAGGAXGX 19 配列番号：２６ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ５２と記載される。
X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴ
を表わす。 （８）配列 XGGACAAXXA CXGCAGACA 19 配列番号：２７ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ５２ｃと記載され
る。X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合
はＴを表わす。 （８）配列 GAAGXAXCXC XCCAGGAAC 19 配列番号：２８ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ５３と記載される。
X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴ
を表わす。 （８）配列 CXGAXCAGGX XCCACACXC 19 配列番号：２９ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ１２０と記載され
る。X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合
はＴを表わす。 （８）配列 AAGCGCAGGA GCXCCXCCX 19 配列番号：３０ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ１２１と記載され
る。X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合
はＴを表わす。 （８）配列 GCCXGXCXXC CAGGAXGXC 19 配列番号：３１ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b)株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ１２２と記載され
る。X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合
はＴを表わす。 （８）配列 CGCCXGXCXX CCAGGAAGX 19 配列番号：３２ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ１２３と記載され
る。X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合
はＴを表わす。 （８）配列 GCCXGXCXXC CAGGAGGXC 19 配列番号：３３ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ１４２と記載され
る。X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合
はＴを表わす。 （８）配列 CGGCCXGAXG CXGAGXACX 19 配列番号：３４ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ１４３と記載され
る。X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合
はＴを表わす。 （８）配列 GXXCCAGXGC XCCGCAGCA 19 配列番号：３５ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ２２と記載される。
X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴ
を表わす。 （８）配列 CAACAGGAGG ACXXGCGCX 19 配列番号：３６ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ２９と記載される。
X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴ
を表わす。 （８）配列 XGCACAGAGG CAXCXAXAA 19 配列番号：３７ （１）配列の長さ：２０ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ４２と記載される。
X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴ
を表わす。 （８）配列 ACGGACXCCX CXXGGXGAXA 20 配列番号：３８ （１）配列の長さ：１８ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ４６と記載される。
X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合はＴ
を表わす。 （８）配列 ACCGCGGCCC GCCXCXGC 18 配列番号：３９ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ１４１と記載され
る。X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合
はＴを表わす。 （８）配列 CAGGAGGAGX XCGXGCGCX 19 配列番号：４０ （１）配列の長さ：１８ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＦ１５８と記載され
る。X は核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合
はＴを表わす。 （８）配列 AGXACXCGGC GCXAGGCC 18 配列番号：４１ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ１と記載される。 （８）配列 ATAGATGCAT CTTTCCAGC 19 配列番号：４２ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ２と記載される。 （８）配列 GTGCGGTTCC TGCACAGAG 19 配列番号：４３ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ３と記載される。 （８）配列 GTGGACAACT ACTGCAGAC 19 配列番号：４４ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ４と記載される。 （８）配列 TACTTCTATC ACCAAGAGG 19 配列番号：４５ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ７と記載される。 （８）配列 ATAGAAGAGT CTTTCCAGG 19 配列番号：４６ （１）配列の長さ：１８ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ８と記載される。 （８）配列 TAGGTGTCCA CCAGGGCC 18 配列番号：４７ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ９と記載される。 （８）配列 TCTGTGCAGA TACCGCACC 19 配列番号：４８ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ１１と記載される。 （８）配列 GCCTGATGAG GAGTACTGG 19 配列番号：４９ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ１３と記載される。 （８）配列 ACATCCTGGA AGACGAGCG 19 配列番号：５０ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ５２と記載される。 （８）配列 TGTCTGCAGT AATTGTCCA 19 配列番号：５１ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ５２ｃと記載される。 （８）配列 GTTCCTGGAG AGATACTTC 19 配列番号：５２ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ５３と記載される。 （８）配列 GAGTGTGGAA CCTGATCAG 19 配列番号：５３ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ１２０と記載される。 （８）配列 AGGAGGAGCT CCTGCGCTT 19 配列番号：５４ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ１２１と記載される。 （８）配列 GACATCCTGG AAGACAGGC 19 配列番号：５５ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ１２２と記載される。 （８）配列 ACTTCCTGGA AGACAGGCG 19 配列番号：５６ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ１２３と記載される。 （８）配列 GACCTCCTGG AAGACAGGC 19 配列番号：５７ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ１４２と記載される。 （８）配列 AGTACTCAGC ATCAGGCCG 19 配列番号：５８ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ１４３と記載される。 （８）配列 TGCTGCGGAG CACTGGAAC 19 配列番号：５９ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ２２と記載される。 （８）配列 AGCGCAAGTC CTCCTGTTG 19 配列番号：６０ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ２９と記載される。 （８）配列 TTATAGATGC CTCTGTGCA 19 配列番号：６１ （１）配列の長さ：２０ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ４２と記載される。 （８）配列 TATCACCAAG AGGAGTCCGT 20 配列番号：６２ （１）配列の長さ：１８ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ４６と記載される。 （８）配列 GCAGAGGCGG GCCGCGGT 18 配列番号：６３ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ１４１と記載される。 （８）配列 AGCGCACGAA CTCCTCCTG 19 配列番号：６４ （１）配列の長さ：１８ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦ１５８と記載される。 （８）配列 GGCCTAGCGC CGAGTACT 18 配列番号：６５ （１）配列の長さ：２５ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖（４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＦＰＲ１と記載される。
【０１０２】配列中、T(C)はTとCの混合物を意味する。 （８）配列 AGTGTCATTT CTTCAAT(C)GGG ACCCA 25 配列番号：６６ （１）配列の長さ：２０ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＤＲβＡＭＰ１と記載さ
れる。 （８）配列 CGCTGCACTG TCAAGCTCTC 20 配列番号：６７ （１）配列の長さ：２７ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＧＨ４６と記載される。 （８）配列 CCGGATCCTT CGTGTCCCCA CAGCACG 27 配列番号：６８ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a)生物名：ヒト (b)株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＫ１４０６と記載され
る。Ｘは核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合
にはＴを表わす。 （８）配列 AACCAGGAGG AGAACGXGC 19 配列番号：６９ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源（ａ）生物名：ヒト (b)株名： （７）配列の特徴：本文中ではＫ１４０６と記載され
る。 （８）配列： GCACGTTCTC CTCCTGGTT 19
れる。 （８）配列 CGCTGCACTG TCAAGCTCTC 20 配列番号：６７ （１）配列の長さ：２７ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源 (a) 生物名：ヒト (b) 株名： （７）配列の特徴：本文中ではＧＨ４６と記載される。 （８）配列 CCGGATCCTT CGTGTCCCCA CAGCACG 27 配列番号：６８ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：genomic DNA （６）起源 (a)生物名：ヒト (b)株名： （７）配列の特徴：本文中ではＯＫ１４０６と記載され
る。Ｘは核酸がＲＮＡの場合はＵ、核酸がＤＮＡの場合
にはＴを表わす。 （８）配列 AACCAGGAGG AGAACGXGC 19 配列番号：６９ （１）配列の長さ：１９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成オリゴヌクレオチド DNA （６）起源（ａ）生物名：ヒト (b)株名： （７）配列の特徴：本文中ではＫ１４０６と記載され
る。 （８）配列： GCACGTTCTC CTCCTGGTT 19
【図１】オリゴヌクレオチドプローブでＨＬＡ抗原遺伝
子の構造を示す図。
子の構造を示す図。
【図２】オリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリ
ダイゼーションによるタイピングの結果を示す図。
ダイゼーションによるタイピングの結果を示す図。
【図３】オリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリ
ダイゼーションによるタイピングの結果を示す図。
ダイゼーションによるタイピングの結果を示す図。
【図４】オリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリ
ダイゼーションによるタイピングの結果を示す。
ダイゼーションによるタイピングの結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ Ｋ 8310−2Ｊ (72)発明者 宮越 照一 千葉県袖ヶ浦市長浦字拓二号580番32
Claims (21)
- 【請求項１】 下記の配列番号１乃至配列番号８で表わ
される核酸塩基配列の１種または２種以上を検出するた
めのＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子タイピング用のオリゴヌ
クレオチドプローブ。 ＯＡ３：配列番号１記載の核酸塩基配列 ＯＦ１０：配列番号２記載の核酸塩基配列 ＯＡ１４１６：配列番号３記載の核酸塩基配列 ＯＫ１４０６：配列番号６８記載の核酸塩基配列 ＯＦ３０：配列番号４記載の核酸塩基配列 ＯＦ４４：配列番号５記載の核酸塩基配列 ＯＦ４５：配列番号６記載の核酸塩基配列 ＯＦ８６３：配列番号７記載の核酸塩基配列 ＯＦ８５１：配列番号８記載の核酸塩基配列 - 【請求項２】 下記の配列番号９乃至配列番号１６で表
される核酸塩基配列の１種または２種以上を含むＨＬＡ
−ＤＲ抗原の遺伝子タイピング用のオリゴヌクレオチド
プローブ。 Ａ３：配列番号９記載の核酸塩基配列 Ｆ１０：配列番号１０記載の核酸塩基配列 Ａ１４１６：配列番号１１記載の核酸塩基配列 Ｋ１４０６：配列番号６９記載の核酸塩基配列 Ｆ３０：配列番号１２記載の核酸塩基配列 Ｆ４４：配列番号１３記載の核酸塩基配列 Ｆ４５：配列番号１４記載の核酸塩基配列 Ｆ８６３：配列番号１５記載の核酸塩基配列 Ｆ８５１：配列番号１６記載の核酸塩基配列 - 【請求項３】 請求項１記載の核酸塩基配列に加えて下
記の配列番号１７乃至配列番号４０で表わされる核酸塩
基配列の１種または２種以上をも検出することを特徴と
するＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子タイピング用のオリゴヌ
クレオチドプローブ。 ＯＦ１：配列番号１７記載の核酸塩基配列 ＯＦ２：配列番号１８記載の核酸塩基配列 ＯＦ３：配列番号１９記載の核酸塩基配列 ＯＦ４：配列番号２０記載の核酸塩基配列 ＯＦ７：配列番号２１記載の核酸塩基配列 ＯＦ８：配列番号２２記載の核酸塩基配列 ＯＦ９：配列番号２３記載の核酸塩基配列 ＯＦ１１：配列番号２４記載の核酸塩基配列 ＯＦ１３：配列番号２５記載の核酸塩基配列 ＯＦ５２：配列番号２６記載の核酸塩基配列 ＯＦ５２ｃ：配列番号２７記載の核酸塩基配列 ＯＦ５３：配列番号２８記載の核酸塩基配列 ＯＦ１２０：配列番号２９記載の核酸塩基配列 ＯＦ１２１：配列番号３０記載の核酸塩基配列 ＯＦ１２２：配列番号３１記載の核酸塩基配列 ＯＦ１２３：配列番号３２記載の核酸塩基配列 ＯＦ１４２：配列番号３３記載の核酸塩基配列 ＯＦ１４３：配列番号３４記載の核酸塩基配列 ＯＦ２２：配列番号３５記載の核酸塩基配列 ＯＦ２９：配列番号３６記載の核酸塩基配列 ＯＦ４２：配列番号３７記載の核酸塩基配列 ＯＦ４６：配列番号３８記載の核酸塩基配列 ＯＦ１４１：配列番号３９記載の核酸塩基配列 ＯＦ１５８：配列番号４０記載の核酸塩基配列 - 【請求項４】 請求項２記載のオリゴヌクレオチドプロ
ーブに加えて下記の配列番号４１乃至配列番号６４の核
酸塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドプローブの１
種または２種以上をも含むＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子タ
イピング用のオリゴヌクレオチドプローブ。 Ｆ１：配列番号４１記載の核酸塩基配列 Ｆ２：配列番号４２記載の核酸塩基配列 Ｆ３：配列番号４３記載の核酸塩基配列 Ｆ４：配列番号４４記載の核酸塩基配列 Ｆ７：配列番号４５記載の核酸塩基配列 Ｆ８：配列番号４６記載の核酸塩基配列 Ｆ９：配列番号４７記載の核酸塩基配列 Ｆ１１：配列番号４８記載の核酸塩基配列 Ｆ１３：配列番号４９記載の核酸塩基配列 Ｆ５２：配列番号５０記載の核酸塩基配列 Ｆ５２ｃ：配列番号５１記載の核酸塩基配列 Ｆ５３：配列番号５２記載の核酸塩基配列 Ｆ１２０：配列番号５３記載の核酸塩基配列 Ｆ１２１：配列番号５４記載の核酸塩基配列 Ｆ１２２：配列番号５５記載の核酸塩基配列 Ｆ１２３：配列番号５６記載の核酸塩基配列 Ｆ１４２：配列番号５７記載の核酸塩基配列 Ｆ１４３：配列番号５８記載の核酸塩基配列 Ｆ２２：配列番号５９記載の核酸塩基配列 Ｆ２９：配列番号６０記載の核酸塩基配列 Ｆ４２：配列番号６１記載の核酸塩基配列 Ｆ４６：配列番号６２記載の核酸塩基配列 Ｆ１４１：配列番号６３記載の核酸塩基配列 Ｆ１５８：配列番号６４記載の核酸塩基配列 - 【請求項５】 請求項１乃至４のいずれかに記載のオリ
ゴヌクレオチドプローブにおいて、少なくとも連続した
１０塩基の塩基配列を含むことを特徴とするＨＬＡ−Ｄ
Ｒ抗原の遺伝子タイピング用のオリゴヌクレオチドプロ
ーブ。 - 【請求項６】 該オリゴヌクレオチドプローブがＨＬＡ
−ＤＲをコードする以外の染色体遺伝子、あるいは相補
ＤＮＡの塩基配列に交雑しないことを特徴とする請求項
２、４、５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプロ
ーブ。 - 【請求項７】 該オリゴヌクレオチドプローブがラジオ
アイソトープあるいは／および蛍光、発光、発色のいず
れかの現象を起こし得る物質で標識されている、あるい
は該物質により標識され得るように修飾されていること
を特徴とする請求項２、４、５、６のいずれかに記載の
オリゴヌクレオチドプローブ。 - 【請求項８】 該オリゴヌクレオチドプローブの少なく
とも連続した10塩基の塩基配列を含むオリゴヌクレオチ
ドが膜などに固定されていることを特徴とする請求項
２、４、５、６、７のいずれかに記載のオリゴヌクレオ
チドプローブ。 - 【請求項９】 該オリゴヌクレオチドプローブを、人の
血液あるいは／および口腔粘膜あるいは／および髪の毛
あるいは／および爪を検体とした検出に用いることを特
徴とするＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子タイピングの方法。 - 【請求項10】 ＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子タイピングを
行なうための検体からＤＮＡを得る際に使用するもので
あって、塩化カリウム、塩化マグネシウム、ゼラチン、
界面活性剤、プロテナーゼＫを含むことを特徴とするト
リス塩酸緩衝液。 - 【請求項11】 請求項９に記載の検体から得られるＨＬ
Ａ−ＤＲ抗原をコードするＤＮＡの内、少なくとも請求
項１乃至６に記載のいずれかのオリゴヌクレオチドプロ
ーブの塩基配列を含む領域であり、且つ少なくともその
一部がラジオアイソトープあるいは／および蛍光、発
光、発色のいずれかの現象を起こし得る物質で標識され
ている、あるいは該物質により標識され得るように修飾
されていることを特徴とする検体ＤＮＡおよび該ＤＮＡ
を含む溶液。 - 【請求項12】 ＨＬＡ−ＤＲ抗原をコードするＤＮＡの
内、請求項１乃至６項のいずれかに記載のオリゴヌクレ
オチドの塩基配列を含む部分領域を下記の方法で増幅す
るＨＬＡ−ＤＲ抗原をコードするＤＮＡの増幅方法。 (1) 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ存在下に、オリゴヌクレ
オチドプライマーと加熱処理によってデネイチャーした
ＨＬＡ−ＤＲをコードする染色体ＤＮＡをアニールし、
(2) アニールしたＤＮＡを加熱処理してプライマーイク
ステンションさせ、(3) (1) および(2) のステップを繰
り返す。 - 【請求項13】 増幅反応をラジオアイソトープおよび／
あるいは蛍光、発光、発色のいずれかの現象を起こし得
る物質で標識されている、あるいは該物質により標識さ
れ得るように修飾されているオリゴヌクレオチドプライ
マーを用いて行うことを特徴とする請求項１２に記載の
増幅方法。 - 【請求項14】 該増幅反応をラジオアイソトープおよび
／あるいは蛍光、発色、発光のいずれかの現象を起こし
得る物質で標識されている、あるいは該物質により標識
され得るように修飾されている核酸を用いて行ない請求
項２、４、５、６、８のいずれかに記載のオリゴヌクレ
オチドとハイブリダイゼーションさせることを特徴とす
る請求項１２または１３に記載の増幅方法。 - 【請求項15】 該オリゴヌクレオチドプライマーの塩基
配列が配列番号６５または配列番号６６で表わされる請
求項１２または１３に記載のオリゴヌクレオチドプライ
マー。 ＦＰＲ１：配列番号６５に記載の核酸塩基配列 ＤＲβＡＭＰ１：配列番号６６に記載の核酸塩基配列 - 【請求項16】 ＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子タイピングを
行なうためにＤＮＡ増幅反応を行なう際に使用するもの
であって、塩化カリウム、塩化マグネシウム、ゼラチ
ン、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰおよび請
求項１５記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含むこ
とを特徴とするトリス・塩酸緩衝液。 - 【請求項17】 請求項８に記載のオリゴヌクレオチドプ
ローブに請求項11に記載のＤＮＡをハイブリダイゼーシ
ョンさせる際に使用するものであって、テトラメチルア
ンモニウム、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム、デン
ハルト液、ドデシル硫酸ナトリウム、キャリヤーＤＮＡ
を含むことを特徴とするトリス塩酸緩衝液。 - 【請求項18】 請求項８に記載の物質に請求項１１に記
載のＤＮＡをハイブリダイゼーションさせた後の洗浄に
使用するものであって、テトラメチルアンモニウム、エ
チレンジアミン四酢酸ナトリウム、デンハルト液、ドデ
シル硫酸ナトリウムを含むことを特徴とするトリス塩酸
緩衝液。 - 【請求項19】 請求項１乃至８のいずれかに記載のオリ
ゴヌクレオチドプローブ、および請求項１５に記載のオ
リゴヌクレオチドプライマー、請求項１０、１６、１
７、１８のいずれかに記載の緩衝液の内、該オリゴヌク
レオチドロープを含む少なくとも２種類以上の構成物か
らなることを特徴とするＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子タイ
ピング用の試薬キット。 - 【請求項20】 請求項19に記載の試薬キットに、遺伝子
採取処理用、ＤＮＡ増幅反応用、ハイブリダイゼーショ
ン用、ハイブリダイゼーション後の洗浄用、検出反応用
チューブなどの必要な器具のすべてあるいは一部を加え
て構成されることを特徴とするＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝
子タイピング用の検査キット。 - 【請求項21】 ＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子タイピングを
行なうに際し、請求項１乃至８のいずれかに記載の塩基
配列で表わされるオリゴヌクレオチドプローブ群あるい
は請求項１９または２０に記載の試薬キットあるいは検
査キットを使用することを特徴とするＨＬＡ−ＤＲ抗原
の遺伝子タイピングの方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4224432A JPH0690757A (ja) | 1991-08-23 | 1992-08-24 | Ｈｌａ−ｄｒタイピング用塩基配列群とそれを用いた ｈｌａ−ｄｒタイピング法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21247291 | 1991-08-23 | ||
| JP3-212472 | 1991-08-23 | ||
| JP4224432A JPH0690757A (ja) | 1991-08-23 | 1992-08-24 | Ｈｌａ−ｄｒタイピング用塩基配列群とそれを用いた ｈｌａ−ｄｒタイピング法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0690757A true JPH0690757A (ja) | 1994-04-05 |
Family
ID=26519251
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4224432A Pending JPH0690757A (ja) | 1991-08-23 | 1992-08-24 | Ｈｌａ−ｄｒタイピング用塩基配列群とそれを用いた ｈｌａ−ｄｒタイピング法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0690757A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2793809A1 (fr) * | 1999-05-20 | 2000-11-24 | Biomerieux Sa | Procede d'analyse de la predisposition genetique d'un patient a au moins une maladie et amplification adaptee a un tel procede |
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1992
- 1992-08-24 JP JP4224432A patent/JPH0690757A/ja active Pending
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