JP3093265B2 - 遺伝子ファミリーのメンバーのヌクレオチドシーケンスを比較して遺伝子型を決定する方法とそのためのキット - Google Patents
遺伝子ファミリーのメンバーのヌクレオチドシーケンスを比較して遺伝子型を決定する方法とそのためのキットInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は遺伝子ファミリーのメンバーの比較によって
遺伝子型を決定する方法、およびまたは遺伝子ファミリ
ーにおける遺伝子変化を追跡するためのキットに関す
る。
遺伝子型を決定する方法、およびまたは遺伝子ファミリ
ーにおける遺伝子変化を追跡するためのキットに関す
る。
遺伝子系は順番に１またはそれ以上の遺伝子から成る
異なる遺伝子座からなり；これらの遺伝子は変異体、い
わゆる異なる対立遺伝子を各系に対して含むことができ
る。とりわけ、Ｔ−細胞受容体、免疫グロブリンおよび
HLA（＝ヒト白血球抗原）遺伝子系も含む免疫グロブリ
ン超遺伝子ファミリーは大きい変異体（多形性）の存在
によって特徴づけられる。遺伝子系の一部をなす各遺伝
子は、一面ではまたは他の面では免疫応答に含まれる。
免疫応答における欠陥は、既に述べた１またはそれ以上
の遺伝子系の種々の変異に帰すべきものであり、その結
果として病気になる。
異なる遺伝子座からなり；これらの遺伝子は変異体、い
わゆる異なる対立遺伝子を各系に対して含むことができ
る。とりわけ、Ｔ−細胞受容体、免疫グロブリンおよび
HLA（＝ヒト白血球抗原）遺伝子系も含む免疫グロブリ
ン超遺伝子ファミリーは大きい変異体（多形性）の存在
によって特徴づけられる。遺伝子系の一部をなす各遺伝
子は、一面ではまたは他の面では免疫応答に含まれる。
免疫応答における欠陥は、既に述べた１またはそれ以上
の遺伝子系の種々の変異に帰すべきものであり、その結
果として病気になる。
このように遺伝子変異体は病気または病気の徴候に関
連することができる。従って、遺伝子座／対立遺伝子の
同定は、例えば、HLAと関連した病気の危険を決定する
際にまたは偏向に帰する遺伝子系における変異体、およ
び後者がそのケースではない変異体を決定する際に重要
であるかも知れない。従って、HLA−B27抗原はリウマト
イド脊椎炎の患者全体の90％に発見され、そしてHLA−D
R3またはHLA−DR4、または両者はインスリン依存性糖尿
病に悩む患者の80％に発見される。HLA−B27を有する者
は誰でもリウマトイド脊椎炎にかかる機会がHLA−B27が
ない人の180倍である。表Ｉ（バイオテクノロジイ、ア
・ニュー・インダストリアル・レボリューション（Biot
echnologie,een nieuwe industriele revolutie）、ア
ンテビ・イーおよびフィシュロック・ティー、ナチュー
ル・アン・テクニーク発行、マーストリヒト／ブルッセ
ルズ（1987）91頁から引用）はHLA系と関連しているこ
とが知られている最も重要な病気を示している。これら
の遺伝子座と対立遺伝子の関係は臨床実施に大いに役立
たせることができる。それらはある場合には診断に、あ
る場合には特定の病気の治療に使用される。さらにそれ
らは予防の可能性を開く。特定の病気に最大の危険性を
もつ者を明らかにすることが可能である。これは予防ま
たは初期治療が可能であり、病気の発現を含むことがで
きる場合に極めて重要である。
連することができる。従って、遺伝子座／対立遺伝子の
同定は、例えば、HLAと関連した病気の危険を決定する
際にまたは偏向に帰する遺伝子系における変異体、およ
び後者がそのケースではない変異体を決定する際に重要
であるかも知れない。従って、HLA−B27抗原はリウマト
イド脊椎炎の患者全体の90％に発見され、そしてHLA−D
R3またはHLA−DR4、または両者はインスリン依存性糖尿
病に悩む患者の80％に発見される。HLA−B27を有する者
は誰でもリウマトイド脊椎炎にかかる機会がHLA−B27が
ない人の180倍である。表Ｉ（バイオテクノロジイ、ア
・ニュー・インダストリアル・レボリューション（Biot
echnologie,een nieuwe industriele revolutie）、ア
ンテビ・イーおよびフィシュロック・ティー、ナチュー
ル・アン・テクニーク発行、マーストリヒト／ブルッセ
ルズ（1987）91頁から引用）はHLA系と関連しているこ
とが知られている最も重要な病気を示している。これら
の遺伝子座と対立遺伝子の関係は臨床実施に大いに役立
たせることができる。それらはある場合には診断に、あ
る場合には特定の病気の治療に使用される。さらにそれ
らは予防の可能性を開く。特定の病気に最大の危険性を
もつ者を明らかにすることが可能である。これは予防ま
たは初期治療が可能であり、病気の発現を含むことがで
きる場合に極めて重要である。
さらにHLA系における遺伝子変異は器官及び組織移植
における受容が白血球内の同じHLA対立遺伝子の存在と
関連しているが、拒絶反応が白血球内の種々のHLA対立
遺伝子の存在に関連しているという事実から重要であ
る。
における受容が白血球内の同じHLA対立遺伝子の存在と
関連しているが、拒絶反応が白血球内の種々のHLA対立
遺伝子の存在に関連しているという事実から重要であ
る。
人ではHLA遺伝子ファミリーは1,500,000塩基対の領域
をカバーする。この領域は多くの遺伝子に対してコード
する。従って、この領域は、HLAクラスＩおよびHLAクラ
スIIの遺伝子に加えて、とりわけ、補体系の遺伝子、21
−ヒドロキシラーゼ遺伝子および腫瘍壞因子に対してコ
ードする遺伝子を含む。
をカバーする。この領域は多くの遺伝子に対してコード
する。従って、この領域は、HLAクラスＩおよびHLAクラ
スIIの遺伝子に加えて、とりわけ、補体系の遺伝子、21
−ヒドロキシラーゼ遺伝子および腫瘍壞因子に対してコ
ードする遺伝子を含む。
HLAクラスＩ領域は３個の“主”遺伝子座:HLA−Ａ、H
LA−ＢおよびHLA−Ｃを含む。前記遺伝子座がコードす
る分子は全ての核状細胞中に発現される。クラスＩの分
子は44,000Dの分子量（MW）を有する多形α−鎖および1
2,000DのMWを有するβ２−ミクログロブリンと呼ばれる
一定の鎖から成る。
LA−ＢおよびHLA−Ｃを含む。前記遺伝子座がコードす
る分子は全ての核状細胞中に発現される。クラスＩの分
子は44,000Dの分子量（MW）を有する多形α−鎖および1
2,000DのMWを有するβ２−ミクログロブリンと呼ばれる
一定の鎖から成る。
HLAクラスII領域は遺伝子座HLA−DR、HLA−DQおよびH
LA−DPを含む。前記遺伝子座に加えて、また上述の遺伝
子座のひとつに所属せず、そして当面は異なる遺伝子座
であると考えられる多数の遺伝子が記載されている（例
えば、HLA−E;HLA−F;HLA−DN;HLA−DZ）。クラスIIの
分子はα−鎖（MW34,000D）およびβ−鎖（MW29,000D）
から成る。HLA−DRのα−鎖は一定である。即ち、変異
体は未だ発見されていない。HLA−DRは３個のβ−遺伝
子を含み、そのうちの２個の遺伝子は生成物に対してコ
ードし、１個の遺伝子は発現されない偽遺伝子である。
β−鎖の各々はα−鎖と二量体分子を形成することがで
きる。HLA−DQ遺伝子座は４個（２個のα−と２個のβ
−）の遺伝子を含み、そのうちの２個は発現される。即
ちDQαおよびDQβ（最新の命名会議の勧告ではDQAおよ
びDQBと呼ばれる）である。前記遺伝子の構造は特徴の
ある偽遺伝子を示していないが、他の遺伝子（DXAおよ
びDQB）の分子は見出されていない。HLA−DP遺伝子座は
４個の遺伝子（２個のαおよび２個のβ）を含み、その
うちの２個が発現される。まだ多形性はDPAに対して示
されておらず、ほんの少数のDPBの対立遺伝子が記載さ
れているだけである。他の２個のDP遺伝子は偽遺伝子で
ある。
LA−DPを含む。前記遺伝子座に加えて、また上述の遺伝
子座のひとつに所属せず、そして当面は異なる遺伝子座
であると考えられる多数の遺伝子が記載されている（例
えば、HLA−E;HLA−F;HLA−DN;HLA−DZ）。クラスIIの
分子はα−鎖（MW34,000D）およびβ−鎖（MW29,000D）
から成る。HLA−DRのα−鎖は一定である。即ち、変異
体は未だ発見されていない。HLA−DRは３個のβ−遺伝
子を含み、そのうちの２個の遺伝子は生成物に対してコ
ードし、１個の遺伝子は発現されない偽遺伝子である。
β−鎖の各々はα−鎖と二量体分子を形成することがで
きる。HLA−DQ遺伝子座は４個（２個のα−と２個のβ
−）の遺伝子を含み、そのうちの２個は発現される。即
ちDQαおよびDQβ（最新の命名会議の勧告ではDQAおよ
びDQBと呼ばれる）である。前記遺伝子の構造は特徴の
ある偽遺伝子を示していないが、他の遺伝子（DXAおよ
びDQB）の分子は見出されていない。HLA−DP遺伝子座は
４個の遺伝子（２個のαおよび２個のβ）を含み、その
うちの２個が発現される。まだ多形性はDPAに対して示
されておらず、ほんの少数のDPBの対立遺伝子が記載さ
れているだけである。他の２個のDP遺伝子は偽遺伝子で
ある。
核酸中に存在する特異的ヌクレオチド変異体および遺
伝子多形体を検出する方法、そしてまた前記方法を実施
するためのキットはEP−Ａ−237,362に記載されてい
る。前記方法は、ヌクレオチド変異体、突然変異体およ
び多形体の存在が想定される核酸シーケンスを増幅し、
次にドットブロットを用いる対立遺伝子特異的オリゴヌ
クレオチドシーケンスを用いてそれを検出することから
成る。この方法では、検出すべき変異体をもつ少なくと
もDNAシーケンスを含み、検出すべきヌクレオチド変異
体に対して特異的でなければならない対立遺伝子特異的
オリゴヌクレオチドシーケンスが使用される（前記特許
出願の22頁を参照）。従って、遺伝子系の研究されるべ
きDNAシーケンスにおける異なった既知の変異体に対し
てコードする多くの異なるプライマーをキットは含む。
伝子多形体を検出する方法、そしてまた前記方法を実施
するためのキットはEP−Ａ−237,362に記載されてい
る。前記方法は、ヌクレオチド変異体、突然変異体およ
び多形体の存在が想定される核酸シーケンスを増幅し、
次にドットブロットを用いる対立遺伝子特異的オリゴヌ
クレオチドシーケンスを用いてそれを検出することから
成る。この方法では、検出すべき変異体をもつ少なくと
もDNAシーケンスを含み、検出すべきヌクレオチド変異
体に対して特異的でなければならない対立遺伝子特異的
オリゴヌクレオチドシーケンスが使用される（前記特許
出願の22頁を参照）。従って、遺伝子系の研究されるべ
きDNAシーケンスにおける異なった既知の変異体に対し
てコードする多くの異なるプライマーをキットは含む。
増幅したDNAの遺伝子分析のための固定化したシーケ
ンス特異的オリゴヌクレオチドプローブは国際特許出願
WO89/11548およびアール・ケイ・サイキらによるプロシ
ーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オ
ブ・サイアンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイ
ツ・オブ・アメリカ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA.86,6230
−6234（1989））に開示されている。
ンス特異的オリゴヌクレオチドプローブは国際特許出願
WO89/11548およびアール・ケイ・サイキらによるプロシ
ーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オ
ブ・サイアンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイ
ツ・オブ・アメリカ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA.86,6230
−6234（1989））に開示されている。
種々の部分に対して特異的な一連のプローブをもつ核
酸試料をハイブリッド形成することによってHLA−DP遺
伝子座中の対立遺伝子に関して遺伝子型を決定する方法
は国際特許出願WO89/11547によって開示されている。
酸試料をハイブリッド形成することによってHLA−DP遺
伝子座中の対立遺伝子に関して遺伝子型を決定する方法
は国際特許出願WO89/11547によって開示されている。
結合できるプローブを用いて増幅したDNAをハイブリ
ッド形成することによってヌクレオチドシーケンスを識
別する方法は国際特許出願WO90/01563によって開示され
ている。
ッド形成することによってヌクレオチドシーケンスを識
別する方法は国際特許出願WO90/01563によって開示され
ている。
これらの既知の方法は次の問題点を有する： ａ）特定の遺伝子系のDNAシーケンスにおいて既知の変
異体を見つけることだけが可能である。その結果、研究
すべき遺伝子系において任意のこれまでに知られていな
い変異体を前記方法で発見することができない。
異体を見つけることだけが可能である。その結果、研究
すべき遺伝子系において任意のこれまでに知られていな
い変異体を前記方法で発見することができない。
ｂ）キット中の既知の変異体各々に対して種々のオリゴ
ヌクレオチドを含むこと、そしてその方法にそれらを使
うことが必要であり、その結果、（例えば、HLA系のよ
うな）多くの可能な対立遺伝子を含む複雑な遺伝子系で
は、異なるオリゴヌクレオチドを各々の可能な対立遺伝
子に対して使用する必要があり、異なる交雑形成を行う
必要があり、煩わしく、時間の浪費であり費用がかか
る。
ヌクレオチドを含むこと、そしてその方法にそれらを使
うことが必要であり、その結果、（例えば、HLA系のよ
うな）多くの可能な対立遺伝子を含む複雑な遺伝子系で
は、異なるオリゴヌクレオチドを各々の可能な対立遺伝
子に対して使用する必要があり、異なる交雑形成を行う
必要があり、煩わしく、時間の浪費であり費用がかか
る。
HLA分類 クラスＩ血清学 HLAクラスＩ分子は対立遺伝子に対して特異的である
抗血清の補助で決定される。多くの場合、すべての対立
遺伝子形態に対してモノクローナル抗体を入手すること
ができないので、同種抗血清が使用される。種々の対立
遺伝子の多形性を特徴づける変異体がクラスＩ遺伝子の
小さい領域に集まっているので、短期間で入手可能にな
ることは起こりそうもない。
抗血清の補助で決定される。多くの場合、すべての対立
遺伝子形態に対してモノクローナル抗体を入手すること
ができないので、同種抗血清が使用される。種々の対立
遺伝子の多形性を特徴づける変異体がクラスＩ遺伝子の
小さい領域に集まっているので、短期間で入手可能にな
ることは起こりそうもない。
クラスＩ蛋白質 クラスＩの対立遺伝子の蛋白質化学の決定は分子の一
定のメンバーに対してモノクローナル抗血清を用いて免
疫沈降物によって、次いで等電点電気泳動（IEF）によ
って可能である。
定のメンバーに対してモノクローナル抗血清を用いて免
疫沈降物によって、次いで等電点電気泳動（IEF）によ
って可能である。
クラスＩ DNA クラスI cDNAプローブを使用する制限断片長多形（RF
LP）の決定によって制限された範囲まで分類が可能であ
る。さらに精製により遺伝子座特異的プローブを生成
し、その結果、対立遺伝子の集団および若干の別の対立
遺伝子を検出することができる。対立遺伝子特異的オリ
ゴハイブリッド形成（ASO）によるクラスＩ対立遺伝子
の分類は、多数の異なる対立遺伝子、従って必要な多数
のオリゴの結果として可能であるとは考えられない。DN
A水準での決まりきった分類はこの方法によって行うこ
とが難しい。
LP）の決定によって制限された範囲まで分類が可能であ
る。さらに精製により遺伝子座特異的プローブを生成
し、その結果、対立遺伝子の集団および若干の別の対立
遺伝子を検出することができる。対立遺伝子特異的オリ
ゴハイブリッド形成（ASO）によるクラスＩ対立遺伝子
の分類は、多数の異なる対立遺伝子、従って必要な多数
のオリゴの結果として可能であるとは考えられない。DN
A水準での決まりきった分類はこの方法によって行うこ
とが難しい。
クラスII血清学は実際に行うことが一層難しく、第１に
良く画定された抗血清が不足しているためであり、第２
に同定技術の精巧さ、即ち２色蛍光のためである。
良く画定された抗血清が不足しているためであり、第２
に同定技術の精巧さ、即ち２色蛍光のためである。
クラスII蛋白質はモノクローナル抗体の入手容易性の結
果としてIEFによって特徴づけることができるが、変異
と数の点からは対立遺伝子の多様性は、特にヘテロ接合
体固体において標準の分類を困難にする。
果としてIEFによって特徴づけることができるが、変異
と数の点からは対立遺伝子の多様性は、特にヘテロ接合
体固体において標準の分類を困難にする。
クラスII DNA RFLP分析を用いてDRA、DQA、DQBおよびDPB対立遺伝子
を同定することができる。この関係において、若干の対
立遺伝子は、個々に識別することができないので“超分
類グループ”に置かれるが、特定のRFLPパターンをもつ
対立遺伝子のグループとして他の対立遺伝子から突出し
ている。
を同定することができる。この関係において、若干の対
立遺伝子は、個々に識別することができないので“超分
類グループ”に置かれるが、特定のRFLPパターンをもつ
対立遺伝子のグループとして他の対立遺伝子から突出し
ている。
RFLPパターンに帰するサザンブロット分析の技術はク
ラスIIを分類するために容易に用いることができる。技
術的に見ると、このアプローチはその精巧さのために決
まりきったクラスIIの分類には適さない。
ラスIIを分類するために容易に用いることができる。技
術的に見ると、このアプローチはその精巧さのために決
まりきったクラスIIの分類には適さない。
ポリメラーゼ鎖反応（PCR）による増幅DNAの合成オリ
ゴヌクレオチドを用いるASO分類の開発は、今ではDQAの
決まりきった分類を可能にした。さらにまたDRB、DQBお
よびDPBのための分類が開発されるだろう。この方法の
短所は関係する遺伝子座の対立遺伝子の数が増加するに
つれて多数の対立遺伝子特異的オリゴが使用されなけれ
ばならないことである。
ゴヌクレオチドを用いるASO分類の開発は、今ではDQAの
決まりきった分類を可能にした。さらにまたDRB、DQBお
よびDPBのための分類が開発されるだろう。この方法の
短所は関係する遺伝子座の対立遺伝子の数が増加するに
つれて多数の対立遺伝子特異的オリゴが使用されなけれ
ばならないことである。
ワークショップ 毎年世界中に配布されたHLA分類センターの結果がワ
ークショップで試験され、血清が選択され参照血清とし
て規定される。蛋白質−化学決定方法によって分類が改
良されている。DNA/RFLPおよびDNA−ASO分析は抗血清を
用いて決定される対立遺伝子の標準化を容易にしてい
る。
ークショップで試験され、血清が選択され参照血清とし
て規定される。蛋白質−化学決定方法によって分類が改
良されている。DNA/RFLPおよびDNA−ASO分析は抗血清を
用いて決定される対立遺伝子の標準化を容易にしてい
る。
蛋白質分類に関して、ワークショップはどのモノクロ
ーナル抗体が使用されなければならないか、どのように
してデータを解釈しなければならないかを決定する。DN
A−RFLP分類については、DNA単離およびハイブリッド形
成の標準化に加えて、酵素−プローブの組合せを決定す
る。
ーナル抗体が使用されなければならないか、どのように
してデータを解釈しなければならないかを決定する。DN
A−RFLP分類については、DNA単離およびハイブリッド形
成の標準化に加えて、酵素−プローブの組合せを決定す
る。
DNA−ASO分類はパーキン・エルマー／コータス・コー
ポレイションの（キットとして特許され市販されてい
る）パッケージとして提供され、現在DQA分類のために
使用することができる。
ポレイションの（キットとして特許され市販されてい
る）パッケージとして提供され、現在DQA分類のために
使用することができる。
世界中の各分類センターによって均一に行うことがで
きる種々の方法の組合せを見出すための試みがなされて
いる。この関係において、各種の分類センターにおける
測定値の再現性、試薬（血清、プローブ、オリゴ）の均
一性および分類の品質コントロールを行う可能性が重要
な役割を演じている。
きる種々の方法の組合せを見出すための試みがなされて
いる。この関係において、各種の分類センターにおける
測定値の再現性、試薬（血清、プローブ、オリゴ）の均
一性および分類の品質コントロールを行う可能性が重要
な役割を演じている。
上述の場合において、分類へのアプローチは遺伝子座
の分子または遺伝子の多形部分の特徴の基づいている。
の分子または遺伝子の多形部分の特徴の基づいている。
遺伝子変異体を決定するための、多形系の側面に位置
する保護されたシーケンスを有利に使用できることが見
出された。
する保護されたシーケンスを有利に使用できることが見
出された。
従って、遺伝子系のメンバーのヌクレオチドシーケン
スを比較して遺伝子型を決定するための本発明による方
法は、多形性が遺伝子物質に配置されている強く保護さ
れた区画の遺伝子座または遺伝子のヌクレオチドシーケ
ンスを比較することを特徴とする。
スを比較して遺伝子型を決定するための本発明による方
法は、多形性が遺伝子物質に配置されている強く保護さ
れた区画の遺伝子座または遺伝子のヌクレオチドシーケ
ンスを比較することを特徴とする。
本発明による方法の重要な利点は、遺伝子系における
偏向、そして特に発現される偏向を、一層容易にしかも
それによって一層大きい確実性で追跡できることであ
る。さらに特に、本方法の利点は： − 新しい突然変異体を直接検出することができ、そし
て相関関係について一層詳細に研究することができる。
これは、多くの場合反応しないが良くても他の血清との
交叉反応が見られる血清学上の分類とは対照的である。
ASO分類はその対立遺伝子に対して陰性であることを特
徴とする。
偏向、そして特に発現される偏向を、一層容易にしかも
それによって一層大きい確実性で追跡できることであ
る。さらに特に、本方法の利点は： − 新しい突然変異体を直接検出することができ、そし
て相関関係について一層詳細に研究することができる。
これは、多くの場合反応しないが良くても他の血清との
交叉反応が見られる血清学上の分類とは対照的である。
ASO分類はその対立遺伝子に対して陰性であることを特
徴とする。
本方法は他の決定法と比べて既知の多形性とは無関係
である。
である。
− 系が簡単なため（世界中で高度の再現性）、分類の
標準化が簡単になるだろう。
標準化が簡単になるだろう。
− 本方法は血球、血清および対立遺伝子の発現におけ
る地理学的に決定された内部変異とは無関係である。
る地理学的に決定された内部変異とは無関係である。
− 同時に異なる遺伝子座の対立遺伝子を１回の試験で
決定することができ、その結果として病気との関連が一
層広い情況（もっと多い遺伝子座または遺伝子系）で知
られることになる。
決定することができ、その結果として病気との関連が一
層広い情況（もっと多い遺伝子座または遺伝子系）で知
られることになる。
− 遺伝子系に対する命名は本発明を用いることによっ
て遺伝子座／遺伝子の多形部分を規定する簡単な方法で
配置することができる。
て遺伝子座／遺伝子の多形部分を規定する簡単な方法で
配置することができる。
ヌクレオチドシーケンスを比較する遺伝子物質の強く
保護された区画は、本発明によれば、シーケンスを既知
の方法で比較する多形（少なく保護された）区画よりも
ホモロジーが大きい。ベースレベルでのホモロジー、即
ち、遺伝子座または遺伝子の対立遺伝子形態の特性を示
しているヌクレオチドのパーセンテージは少なくとも約
50％であり、好ましくは少なくとも58％である。
保護された区画は、本発明によれば、シーケンスを既知
の方法で比較する多形（少なく保護された）区画よりも
ホモロジーが大きい。ベースレベルでのホモロジー、即
ち、遺伝子座または遺伝子の対立遺伝子形態の特性を示
しているヌクレオチドのパーセンテージは少なくとも約
50％であり、好ましくは少なくとも58％である。
本発明による方法は特に遺伝子系のハプロタイプを決
定するために用いることができる。
定するために用いることができる。
特に、本発明は遺伝子系の遺伝子座および遺伝子系の
対立遺伝子、例えば組織適合性の系の遺伝子系を比較す
るために用いることができる。同時に、（例えば、骨髄
移植または血液輸血において）それは対立遺伝子の存在
の特異的分類／同定が要求される対立遺伝子の決まりき
った仕事の同定の問題であるかもしれない。
対立遺伝子、例えば組織適合性の系の遺伝子系を比較す
るために用いることができる。同時に、（例えば、骨髄
移植または血液輸血において）それは対立遺伝子の存在
の特異的分類／同定が要求される対立遺伝子の決まりき
った仕事の同定の問題であるかもしれない。
また本発明による方法を用いる研究に有利に適してい
る遺伝子系は免疫グロブリン超遺伝子ファミリー、特に
免疫グロブリン（Ig）遺伝子またはＴ細胞受容体（TC
R）の遺伝子の一員の遺伝子系である。
る遺伝子系は免疫グロブリン超遺伝子ファミリー、特に
免疫グロブリン（Ig）遺伝子またはＴ細胞受容体（TC
R）の遺伝子の一員の遺伝子系である。
また本発明による方法は分類のために特色あるものよ
りも簡単な多形シーケンスの決定が、他の保護されたフ
ランキングシーケンスの選択の結果として遺伝子内で可
能である研究目的に適している。
りも簡単な多形シーケンスの決定が、他の保護されたフ
ランキングシーケンスの選択の結果として遺伝子内で可
能である研究目的に適している。
本発明による方法を用いる遺伝子型の決定は、特に、
組織分類または細胞分類に関係する。これは、例えば、
移植の適合性の程度を決定するために行うことができ
る。もしも提供者と受け入れる者との間の多形領域にお
いて異常が見られないかまたは極めて少しである場合、
身体に適しないHLAsを基礎として拒絶反応が行われない
ので移植を受け入れる機会が高いだろう。また動物のHL
A関連の病気の危険性を決定するため組織分類または細
胞分類を行うことが可能である。この関係における特定
の局面は、例えばこれまでに血清学の技法によってのみ
決定することができたHLAクラスＩ対立遺伝子のための
分離可能性の導入および一様な実行性であうる。
組織分類または細胞分類に関係する。これは、例えば、
移植の適合性の程度を決定するために行うことができ
る。もしも提供者と受け入れる者との間の多形領域にお
いて異常が見られないかまたは極めて少しである場合、
身体に適しないHLAsを基礎として拒絶反応が行われない
ので移植を受け入れる機会が高いだろう。また動物のHL
A関連の病気の危険性を決定するため組織分類または細
胞分類を行うことが可能である。この関係における特定
の局面は、例えばこれまでに血清学の技法によってのみ
決定することができたHLAクラスＩ対立遺伝子のための
分離可能性の導入および一様な実行性であうる。
さらに、バクテリウム、ウィルスまたはリポ蛋白質の
遺伝子系を遺伝子変異を研究する遺伝子系として使用す
ることができる。
遺伝子系を遺伝子変異を研究する遺伝子系として使用す
ることができる。
本発明による方法を用いて強く保護された超領域のヌ
クレオチドシーケンスにおける可能な変異を調べること
は、調べるべき強く保護された区画が少なくとも片側、
そして好ましくは両側に、完全に保護されたシーケンス
によって、即ち、個体すべてにおいて完全に同一である
シーケンスによって結合されている場合に容易に行うこ
とができる。前記の完全に保護されたシーケンスは、特
に、長さが少なくとも５個のヌクレオチドであり、そし
て特に好ましくは長さが少なくとも10個のヌクレオチド
である。
クレオチドシーケンスにおける可能な変異を調べること
は、調べるべき強く保護された区画が少なくとも片側、
そして好ましくは両側に、完全に保護されたシーケンス
によって、即ち、個体すべてにおいて完全に同一である
シーケンスによって結合されている場合に容易に行うこ
とができる。前記の完全に保護されたシーケンスは、特
に、長さが少なくとも５個のヌクレオチドであり、そし
て特に好ましくは長さが少なくとも10個のヌクレオチド
である。
調べるべき強く保護されたヌクレオチドシーケンスは
完全に保護されたシーケンスを用いて増幅することがで
きる。強く保護されたヌクレオチドシーケンスを増幅す
るための利点を用いる方法はPCR（ポリメラーゼ鎖反
応）である（サイキ・アール・ケイ、ゲルファンド・デ
ィ・エイチ、ストッフェル・エス、シャーフ・エス・ジ
ェイ、ヒグチ・アール、ホーン・ジー・ティ、ムリス・
ケイ・ビーおよびエルリッチ・エイチ・エイ（1988）、
熱安定のDNAポリメラーゼを用いるDNAのプライマー指示
酵素による増幅、サイエンス、239,487−491）。また調
べるべきシーケンスを増幅する他の方法もまた本発明に
よる方法において使用することができる。
完全に保護されたシーケンスを用いて増幅することがで
きる。強く保護されたヌクレオチドシーケンスを増幅す
るための利点を用いる方法はPCR（ポリメラーゼ鎖反
応）である（サイキ・アール・ケイ、ゲルファンド・デ
ィ・エイチ、ストッフェル・エス、シャーフ・エス・ジ
ェイ、ヒグチ・アール、ホーン・ジー・ティ、ムリス・
ケイ・ビーおよびエルリッチ・エイチ・エイ（1988）、
熱安定のDNAポリメラーゼを用いるDNAのプライマー指示
酵素による増幅、サイエンス、239,487−491）。また調
べるべきシーケンスを増幅する他の方法もまた本発明に
よる方法において使用することができる。
この方法で増幅されるシーケンスを次に直接のシーケ
ンス分析、変性グラジエントゲルで電気泳動（DGGE）ま
たは温度グラジエントゲル電気泳動（TGGE）に委ねるこ
とができる。変性ゲル系が働く範囲は異なる対立遺伝子
の数に関してゲルの識別能力に依存する。言い換える
と、ゲル系は限られた数のみの遺伝子座の対立遺伝子、
例えばリポ蛋白質対立遺伝子、HLA−DQA対立遺伝子、HL
A−DPB対立遺伝子およびHLA−DQB対立遺伝子、およびウ
イルスタイプであるならば良き働き、異なる細胞または
組織において異なる遺伝子座の発現を決定するために使
用することができる。
ンス分析、変性グラジエントゲルで電気泳動（DGGE）ま
たは温度グラジエントゲル電気泳動（TGGE）に委ねるこ
とができる。変性ゲル系が働く範囲は異なる対立遺伝子
の数に関してゲルの識別能力に依存する。言い換える
と、ゲル系は限られた数のみの遺伝子座の対立遺伝子、
例えばリポ蛋白質対立遺伝子、HLA−DQA対立遺伝子、HL
A−DPB対立遺伝子およびHLA−DQB対立遺伝子、およびウ
イルスタイプであるならば良き働き、異なる細胞または
組織において異なる遺伝子座の発現を決定するために使
用することができる。
また増幅したDNAまたはRNAを直接のシーケンス決定方
法によって分析（＝分類）することもできる。決まりき
った仕事の分類決定のために、両者の分析は情報を与え
るように、再現するように、そして制御された方法で行
うことができる。複数の対立遺伝子を含む遺伝子系に対
しては、直接のシーケンス分析は解釈、従って種々のセ
ンターによって再現性を容易にするだろう。また直接の
シーケンス分析法は研究のために有利である。
法によって分析（＝分類）することもできる。決まりき
った仕事の分類決定のために、両者の分析は情報を与え
るように、再現するように、そして制御された方法で行
うことができる。複数の対立遺伝子を含む遺伝子系に対
しては、直接のシーケンス分析は解釈、従って種々のセ
ンターによって再現性を容易にするだろう。また直接の
シーケンス分析法は研究のために有利である。
これまでに変異の決定はサザン・ブロッティングによ
るDNAレベルで行われてきた。異なるファミリーのTCRお
よびIg遺伝子は特定の増幅およびシーケンシングまたは
DGGEによって検出することができるが、種々のファミリ
ーのメンバーは一セットのファミリー特異的プライマー
によって識別することができる。このアプローチに直接
適している他の遺伝子系は異なったウイルス、例えばHP
V1−16の決定である。
るDNAレベルで行われてきた。異なるファミリーのTCRお
よびIg遺伝子は特定の増幅およびシーケンシングまたは
DGGEによって検出することができるが、種々のファミリ
ーのメンバーは一セットのファミリー特異的プライマー
によって識別することができる。このアプローチに直接
適している他の遺伝子系は異なったウイルス、例えばHP
V1−16の決定である。
プライマーの選択 大多数の遺伝子の多くの対立遺伝子は研究を目的とし
て塩基配列決定されてきた。これらの配列決定はEMBLデ
ーターバンク（ヨーロッパ用）およびジーンバンク（US
A）において保存され、両方共に申込者が入手すること
ができる。これらのシーケンスに基づいて、対立遺伝子
特異的オリゴ（ASO）は、例えば、多形領域から選択さ
れ、そしてこれらを使用して異なる対立遺伝子を同定し
てきた。大抵の遺伝子系は突然変異を受けないか、殆ど
受けないかまたは極めて強く受けるシーケンスの領域を
含む。HLAクラスII遺伝子系に対しては、これは多形領
域を局部に制限するために詳細に研究されてきた。参考
文献：グスタフソン・ケイ、エンモス・イー、ラーハン
マー・ディ、ボーメ・ジェイ、ヒルジグ−ニールセン・
ジェイ・ジェイ、ピーターソン・ピー・エイ、およびラ
スク・エル（1984）、クラスIIの組織適合性抗原多形性
の発生における突然変異および選択。エンボ・ジェイ、
3,1655−1661;グスタフソ・ケイ、ウイマン・ケイ、ラ
ーハンマー・ディ、ラスク・エルおよびピーターソン・
ピー・エイ、（1984）、信号シーケンスは異なる遺伝子
座のクラスIIの組織適合性抗原ベーター鎖を識別する、
Scand.J.Immunol.19,91−97。
て塩基配列決定されてきた。これらの配列決定はEMBLデ
ーターバンク（ヨーロッパ用）およびジーンバンク（US
A）において保存され、両方共に申込者が入手すること
ができる。これらのシーケンスに基づいて、対立遺伝子
特異的オリゴ（ASO）は、例えば、多形領域から選択さ
れ、そしてこれらを使用して異なる対立遺伝子を同定し
てきた。大抵の遺伝子系は突然変異を受けないか、殆ど
受けないかまたは極めて強く受けるシーケンスの領域を
含む。HLAクラスII遺伝子系に対しては、これは多形領
域を局部に制限するために詳細に研究されてきた。参考
文献：グスタフソン・ケイ、エンモス・イー、ラーハン
マー・ディ、ボーメ・ジェイ、ヒルジグ−ニールセン・
ジェイ・ジェイ、ピーターソン・ピー・エイ、およびラ
スク・エル（1984）、クラスIIの組織適合性抗原多形性
の発生における突然変異および選択。エンボ・ジェイ、
3,1655−1661;グスタフソ・ケイ、ウイマン・ケイ、ラ
ーハンマー・ディ、ラスク・エルおよびピーターソン・
ピー・エイ、（1984）、信号シーケンスは異なる遺伝子
座のクラスIIの組織適合性抗原ベーター鎖を識別する、
Scand.J.Immunol.19,91−97。
本発明による方法に使用できるシーケンスの存在は、
シーケンスデータバンク（EMBLおよびジーンバンク）か
ら入手できたHLAクラスＩおよびIIのシーケンスの詳細
な分析によって検出することができ、自己決定シーケン
スによって補充される。クラスＩおよび他の遺伝子系に
対するプライマーはシーケンスデーターバンクから選択
され使用することができる。HLAクラスII遺伝子座DRB、
DQA、DQBおよびDPBに対して保護されたシーケンスに基
づくプライマーは既に知られているシーケンスに基づい
て選択することができる。幾つかの使用できるプライマ
ーは下記の実施例のひとつに報告されている。計画して
いる分類に適する完全に保護されたシーケンス（プライ
マー）を選択し試験することは、当業者の範囲内にあ
る。
シーケンスデータバンク（EMBLおよびジーンバンク）か
ら入手できたHLAクラスＩおよびIIのシーケンスの詳細
な分析によって検出することができ、自己決定シーケン
スによって補充される。クラスＩおよび他の遺伝子系に
対するプライマーはシーケンスデーターバンクから選択
され使用することができる。HLAクラスII遺伝子座DRB、
DQA、DQBおよびDPBに対して保護されたシーケンスに基
づくプライマーは既に知られているシーケンスに基づい
て選択することができる。幾つかの使用できるプライマ
ーは下記の実施例のひとつに報告されている。計画して
いる分類に適する完全に保護されたシーケンス（プライ
マー）を選択し試験することは、当業者の範囲内にあ
る。
応用 リポ蛋白質多形性を決定するため、ASOは放射活性に
より標識化し、リポ蛋白質Ｅに存在する種々の対立遺伝
子を分類するためのプローブとして使用される。３種の
頻繁に現われる対立遺伝子はまた、多形区画におけるこ
れら３種の対立遺伝子の場合において、その差は制限酵
素部位に集まっているので、制限酵素分析によって決定
することもできる。５種の対立遺伝子前部は直接、変性
ゲル電気泳動によって決定することができる。（シェフ
ィールドら、変性グラジエントゲル電気泳動によるDNA
多形性の同定、PCRプロトコルにおいて：方法と応用へ
のガイド、アカデミック・プレス・インコーポレイテッ
ド、1990、206−218頁）。異なる対立遺伝子の出現はヌ
クレオチドシーケンスの差に基づいているので、直接シ
ーケンシングによって異なる対立遺伝子を検出すること
ができるという指摘がある（マックブライトら、Cin.Ch
em.35,2196−2201（1989））。
より標識化し、リポ蛋白質Ｅに存在する種々の対立遺伝
子を分類するためのプローブとして使用される。３種の
頻繁に現われる対立遺伝子はまた、多形区画におけるこ
れら３種の対立遺伝子の場合において、その差は制限酵
素部位に集まっているので、制限酵素分析によって決定
することもできる。５種の対立遺伝子前部は直接、変性
ゲル電気泳動によって決定することができる。（シェフ
ィールドら、変性グラジエントゲル電気泳動によるDNA
多形性の同定、PCRプロトコルにおいて：方法と応用へ
のガイド、アカデミック・プレス・インコーポレイテッ
ド、1990、206−218頁）。異なる対立遺伝子の出現はヌ
クレオチドシーケンスの差に基づいているので、直接シ
ーケンシングによって異なる対立遺伝子を検出すること
ができるという指摘がある（マックブライトら、Cin.Ch
em.35,2196−2201（1989））。
HLA分類の場合には、“一定のプライマー”を使用し
て異常なHLAタイプが出現しているファミリーのDRB遺伝
子を増幅した。DRB遺伝子の増幅、ベクターのクローニ
ング、続いてシーケンス分析の後、“異常な"HLAタイプ
は実際に既知の技術では検出できない新しいハプロタイ
プであることが見出された。この分析において、種々の
対立遺伝子の同定は直接のシーケンシングおよび対立遺
伝子中に存在するチミジンヌクレオチドの位置決定によ
って簡単に行うことができることが見出された（Ｔ−ト
ラッキング）。自動的なシーケンス決定はすでにHLA−D
QAのシーケンシングのために行われている（マックブラ
イトら、1989、上記参照）。彼らによって追求された方
法は遺伝子座の対立遺伝子を分類するための自動シーケ
ンスシステムのために僅かに改変して直接使用すること
ができる。
て異常なHLAタイプが出現しているファミリーのDRB遺伝
子を増幅した。DRB遺伝子の増幅、ベクターのクローニ
ング、続いてシーケンス分析の後、“異常な"HLAタイプ
は実際に既知の技術では検出できない新しいハプロタイ
プであることが見出された。この分析において、種々の
対立遺伝子の同定は直接のシーケンシングおよび対立遺
伝子中に存在するチミジンヌクレオチドの位置決定によ
って簡単に行うことができることが見出された（Ｔ−ト
ラッキング）。自動的なシーケンス決定はすでにHLA−D
QAのシーケンシングのために行われている（マックブラ
イトら、1989、上記参照）。彼らによって追求された方
法は遺伝子座の対立遺伝子を分類するための自動シーケ
ンスシステムのために僅かに改変して直接使用すること
ができる。
プライマーを選択した後、“キット”は種々の遺伝子
系のために組み立てることができ、このキットは、とり
わけ、前記プライマーを含み、その結果として標準化さ
れた方法が種々の対立遺伝子を分類するために得られ
る。第一に、ApoEおよびHLA−DRB、DQA、DQBおよびDPB
対立遺伝子は変性ゲルを用いてシーケンス分析によって
一般応用のために調べられる。
系のために組み立てることができ、このキットは、とり
わけ、前記プライマーを含み、その結果として標準化さ
れた方法が種々の対立遺伝子を分類するために得られ
る。第一に、ApoEおよびHLA−DRB、DQA、DQBおよびDPB
対立遺伝子は変性ゲルを用いてシーケンス分析によって
一般応用のために調べられる。
従って本発明はまた遺伝子ファミリーにおける遺伝子
変異体を追跡するためのキットに関するもので、プライ
マーとして少なくとも５個のヌクレオチドの長さを有す
る１個または２個の完全に保護されたシーケンスおよび
できれば調べるべき遺伝子物質の強く保護された区画を
増幅および分析するための他の手段を含み、この区画は
完全に保護されたヌクレオチドシーケンスによって側面
を固められている。
変異体を追跡するためのキットに関するもので、プライ
マーとして少なくとも５個のヌクレオチドの長さを有す
る１個または２個の完全に保護されたシーケンスおよび
できれば調べるべき遺伝子物質の強く保護された区画を
増幅および分析するための他の手段を含み、この区画は
完全に保護されたヌクレオチドシーケンスによって側面
を固められている。
実施例１ 保護されたシーケンスに基づくプライマーはHLAクラ
スII遺伝子座DRB、DQA、DQBおよびDPBに対して選択しそ
して有用性について試験した。以下には増幅反応（PR
C）のために選択し試験した幾つかのプライマーのシー
ケンスが示されている。２個のプライマーが各反応につ
いて好ましく使用される。
スII遺伝子座DRB、DQA、DQBおよびDPBに対して選択しそ
して有用性について試験した。以下には増幅反応（PR
C）のために選択し試験した幾つかのプライマーのシー
ケンスが示されている。２個のプライマーが各反応につ
いて好ましく使用される。
実施例２ ファミリーＧ（両親、４人の子供）では交叉反応は従
来のHLA分類方法によって異なる分類血清をもつHLAクラ
スII対立遺伝子のための決定において見出された。この
方法による任意の分類を確立することはできなかった。
制限フラグメント長多形（RFLP）およびASO分類による
詳細な分析は、ファミリーの異なるメンバーにおいてこ
のファミリーに生じたHLA−DRBの２個の対立遺伝子はな
いが、３個はあるという仮定の結果として行い、そして
これは治療すべきファミリーのメンバーの一人の病気に
対して密接な関係をもった（チラヌス・エム・ジー・ジ
ェイ、バン・エッゲルモンド・エム・シー・ジェイ・エ
イ、フェイ・エイチ、シェウダー・ジー・エム・テイエ
イチ、およびジファート・エム・ジェイ（1989）、見か
けのHLA−DRトリプレットをもつファミリー：異なるハ
プロタイプ間の機能的HLA−DRベーター遺伝子の交換に
関する証拠、Exp.Clin.Immunogenetics6,162−168）。
このファミリーのDNAはこの現象についての遺伝子基礎
を確立することができるように詳細に研究された。これ
を行う際に使用したテクニックのひとつはHLAクラスII
遺伝子座の種々の対立遺伝子のシーケンス分析から成
る。
来のHLA分類方法によって異なる分類血清をもつHLAクラ
スII対立遺伝子のための決定において見出された。この
方法による任意の分類を確立することはできなかった。
制限フラグメント長多形（RFLP）およびASO分類による
詳細な分析は、ファミリーの異なるメンバーにおいてこ
のファミリーに生じたHLA−DRBの２個の対立遺伝子はな
いが、３個はあるという仮定の結果として行い、そして
これは治療すべきファミリーのメンバーの一人の病気に
対して密接な関係をもった（チラヌス・エム・ジー・ジ
ェイ、バン・エッゲルモンド・エム・シー・ジェイ・エ
イ、フェイ・エイチ、シェウダー・ジー・エム・テイエ
イチ、およびジファート・エム・ジェイ（1989）、見か
けのHLA−DRトリプレットをもつファミリー：異なるハ
プロタイプ間の機能的HLA−DRベーター遺伝子の交換に
関する証拠、Exp.Clin.Immunogenetics6,162−168）。
このファミリーのDNAはこの現象についての遺伝子基礎
を確立することができるように詳細に研究された。これ
を行う際に使用したテクニックのひとつはHLAクラスII
遺伝子座の種々の対立遺伝子のシーケンス分析から成
る。
このファミリーでは３個のDRB対立遺伝子が１人のDNA
中に同定された。即ち、対立遺伝子特異的オリゴを用い
る陽性同定に基づいて、DR1、DR2およびDRw6である（ト
リプレット）。この対立遺伝子特異的オリゴは蛋白質レ
ベルでも異なる領域について対応するシーケンスを検出
する。図１は３文字および１文字コードで誘導されたア
ミノ酸シーケンスをもつDR1のヌクレオチドシーケンス
を示す。下線領域は対立遺伝子特異的オリゴの位置を示
す。このファミリーに存在する他の対立遺伝子の対立遺
伝子特異的オリゴヌクレオチドのヌクレオチドシーケン
スおよび関連したアミノ酸シーケンスは図2aおよび2bに
示される。図１における下線領域に相当して、図2aは第
１の多形領域におけるヌクレオチド変異を示し、図2bは
第２の多形領域のそれを示す。DRB遺伝子のさらに詳細
な分析のために、記載されたユニバーサルプライマーDR
B5SおよびDRB3Eを使用した。コントロールの研究では、
DRB対立遺伝子DR1、DR2およびDRw6の同定のためのユニ
バーサルプライマーの使用を試験したが、これらのシー
ケンスにおいて偏向は認められなかった。コントロール
セルラインおよびファミリーＧのDNAのシーケンス分析
の結果は、それぞれ、１文字コードを用いるアミノ酸シ
ーケンスの形で図3aおよび3bに示される。
中に同定された。即ち、対立遺伝子特異的オリゴを用い
る陽性同定に基づいて、DR1、DR2およびDRw6である（ト
リプレット）。この対立遺伝子特異的オリゴは蛋白質レ
ベルでも異なる領域について対応するシーケンスを検出
する。図１は３文字および１文字コードで誘導されたア
ミノ酸シーケンスをもつDR1のヌクレオチドシーケンス
を示す。下線領域は対立遺伝子特異的オリゴの位置を示
す。このファミリーに存在する他の対立遺伝子の対立遺
伝子特異的オリゴヌクレオチドのヌクレオチドシーケン
スおよび関連したアミノ酸シーケンスは図2aおよび2bに
示される。図１における下線領域に相当して、図2aは第
１の多形領域におけるヌクレオチド変異を示し、図2bは
第２の多形領域のそれを示す。DRB遺伝子のさらに詳細
な分析のために、記載されたユニバーサルプライマーDR
B5SおよびDRB3Eを使用した。コントロールの研究では、
DRB対立遺伝子DR1、DR2およびDRw6の同定のためのユニ
バーサルプライマーの使用を試験したが、これらのシー
ケンスにおいて偏向は認められなかった。コントロール
セルラインおよびファミリーＧのDNAのシーケンス分析
の結果は、それぞれ、１文字コードを用いるアミノ酸シ
ーケンスの形で図3aおよび3bに示される。
このことから、このファミリーには組換えられたハロ
タイプがあり、DR1およびDR2対立遺伝子が含まれている
ことが明らかである。DRw6.w19およびDRw6.52c対立遺伝
子はコントロールシーケンスと同一である。DR1特異的
オリゴおよびDR2特異的オリゴによって検出される対立
遺伝子は互いに隣に生じることが明らかである（図
４）。従って３個の対立遺伝子がここに存在するがDRB
ハプロタイプは前もって同定されないことに問題はな
い。遺伝子の他の区画では、特異的シーケンスはこのDR
1＋２ハプロタイプに対して同定された。
タイプがあり、DR1およびDR2対立遺伝子が含まれている
ことが明らかである。DRw6.w19およびDRw6.52c対立遺伝
子はコントロールシーケンスと同一である。DR1特異的
オリゴおよびDR2特異的オリゴによって検出される対立
遺伝子は互いに隣に生じることが明らかである（図
４）。従って３個の対立遺伝子がここに存在するがDRB
ハプロタイプは前もって同定されないことに問題はな
い。遺伝子の他の区画では、特異的シーケンスはこのDR
1＋２ハプロタイプに対して同定された。
このファミリーの遺伝子座（DQB、DQAおよびDPB）に
ついて、２個だけの（突然変異していない）対立遺伝子
があることがユニバーサルプライマーを用いることによ
って確立された。さらに、前記ハプロタイプは保護され
た特異的シーケンスの存在によって特徴づけることがで
きる。
ついて、２個だけの（突然変異していない）対立遺伝子
があることがユニバーサルプライマーを用いることによ
って確立された。さらに、前記ハプロタイプは保護され
た特異的シーケンスの存在によって特徴づけることがで
きる。
フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/00 - 1/70 C12N 15/00 - 15/90 G01N 33/50 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (17)
- 【請求項１】核酸サンプル中の選択されたHLA遺伝子座
の遺伝子型を決定する方法であって、該サンプルは、HL
A遺伝子座の元の対立遺伝子の両方を含み、そして該HLA
遺伝子座は、HLA−Ａ、HLA−Ｂ、HLA−Ｃ、HLA−DP、HL
A−DQおよびHLA−DRから選択され、該方法は、 遺伝子座内の多型領域を、選択された遺伝子座中の第１
および第２のヌクレオチド領域に相補的である第１およ
び第２のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖増幅反
応により増幅する工程、ここで、該第１および第２領域
は、（ｉ）多型領域に隣接し、そして（ii）該遺伝子座
の対立遺伝子において完全に保護されている、および 該増幅された多型領域の元の対立遺伝子を、該第１およ
び第２のプライマーの少なくとも１つを使用して、元の
対立遺伝子を分離することなく直接配列決定し、選択さ
れた遺伝子座について遺伝子型を決定し、それによって
該遺伝子型をいずれかの対立遺伝子単独を独立して配列
決定することなく決定する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項２】前記プライマーが少なくとも10ヌクレオチ
ド長である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】前記第１または第２のプライマーが、配列
番号１で表される配列、すなわちCC AGC ACG TTT Cを有
する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】前記第１または第２のプライマーが、配列
番号２で表される配列、すなわちTT GTR TCT GCA（Ｒ＝
G/A）を有する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】前記第１または第２のプライマーが、配列
番号３で表される配列、すなわちCCA TGA ATT TGA TGG
AGAを有する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】前記第１または第２のプライマーが、配列
番号４で表される配列、すなわちATC GTT TAA TCAを有
する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】前記第１または第２のプライマーが、配列
番号５で表される配列、すなわちTGT TCA AGT TRT GTT
TT（Ｒ＝G/A）を有する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項８】前記第１または第２のプライマーが、配列
番号６で表される配列、すなわちACA GCS ATG TTT STC
AGT GCA（Ｓ＝G/C）を有する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項９】前記第１または第２のプライマーが、配列
番号７で表される配列、すなわちACA GCS ATA TTT STC
AGT GCA（Ｓ＝G/C）を有する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１０】前記第１または第２のプライマーが、配
列番号８で表される配列、すなわちTCT GCS GGT CAA AA
C Tを有する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１１】前記第１または第２のプライマーが、配
列番号９で表される配列、すなわちTGT GCT ACT TCA CC
A Aを有する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１２】前記第１または第２のプライマーが、配
列番号10で表される配列、すなわちGTA GTT GTG TCT GC
Aを有する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１３】前記第１または第２のプライマーが、配
列番号11表される配列、すなわちGCA GGA ATG CTA CGC
GTT TAを有する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１４】前記第１または第２のプライマーが、配
列番号12で表される配列、すなわちCCA GCT CGT AGT TG
T GTC TGCを有する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１５】前記第１または第２のプライマーが、配
列番号13で表される配列、すなわちTTG TAA AAC GAC GG
C CAG TCC AGC TCG TAG TTG TGT CTG Cを有する、請求
項１に記載の方法。 - 【請求項１６】前記第１または第２のプライマーが、配
列番号14で表される配列、すなわちACA GAA TTC GCC CC
G GCC TGG TAC ACを有する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１７】前記第１または第２のプライマーが、配
列番号15で表される配列、すなわちTAA GCT TGG CAC GG
C TGT CCA AGG Aを有する、請求項１に記載の方法。
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