JPH06511380A - 遺伝子ファミリーのメンバーのヌクレオチドシーケンスを比較して遺伝子型を決定する方法とそのためのキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子ファミリーのメンバーのヌクレオチドシーケンスを比較して遺伝子型を決 定する方法とそのためのキット本発明は遺伝子ファミリーのメンバーの比較によ って遺伝子型を決定する方法、およびまた遺伝子ファミリーにおける遺伝子変化 を追跡するためのキットに関する。

遺伝子系は順番に１またはそれ以上の遺伝子から成る異なる遺伝子座からなり； これらの遺伝子は変異体、いわゆる異なる対立遺伝子を各基に対して含むことが できる。とりわけ、Ｔ−細胞受容体、免疫グロブリンおよびＨＬＡ　（−ヒト白 血球抗原）遺伝子系も含む免疫グロブリン超遺伝子ファミリーは大きい変異体（ 多形性）の存在によって特徴づけられる。遺伝子系の一部をなす各遺伝子は、− 面ではまたは他の面では免疫応答に含まれる。免疫応答における欠陥は、既に述 べた１またはそれ以上の遺伝子系の種々の変異に帰すべきものであり、その結果 として病気になる。

このように遺伝子変異体は病気または病気の徴候に関連することができる。従っ て、遺伝子座／対立遺伝子の同定は、例えば、ＨＬＡと関連した病気の危険を決 定する際にまたは偏向に帰する遺伝子系における変異体、および後者がそのケー スではない変異体を決定する際に重要であるかも知れない、従って、ＨＬＡ−８ ２７抗原はりウマトイドを椎炎の患者全体の９０％に発見され、そしてＨＬＡ− ＤＲ３またはＨＬＡ−ＤＲ４、または両者はインスリン依存性糖尿病に悩む患者 の８０％に発見される。ＨＬＡ−８２７を有する者は誰でもリウマトイドを椎炎 にかかる機会がＨＬＡ−８２７がない人の１８０倍である。表Ｉ　（バイオチク ノロシイ、ア・二ニー・インダストリアル・レボリューシラン（Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｉｅ、　ｅｅｎ　ｎｉｅｕｗｅ　１ｎｄｕｓｔｒｉｅｌｅ　ｒｅｖｏ ｌｕｔｉｅ）　、アンテビ・イーおよびフィシュロック・ディー、ナチュール・ アン・テクニーク発行、マーストリヒト／プル７セルズ（１９８７）　９１頁か ら引用）はＨＬＡ系と関連していることが知られている最も重要な病気を示して いる。これらの遺伝子座と対立遺伝子の関係は臨床実施に大いに役立たせること ができる。それらはある場合には診断に、ある場合には特定の病気の治療に使用 される。さらにそれらは予防の可能性を開く、特定の病気に最大の危険性をもつ 者を明らかにすることが可能である。これは予防または初期治療が可能であり、 病気の発現を含むことができる場合に極めて重要である。

表Ｉ ＨＬＡ系と関係した最も重要な病気 ＨＬＡ　病理　相対的危険性０ Ａｌ　ポジキン病　１．４ Ａ３　特発性血色症　８．２ ８５　バーチエツト病　６．３ Ｂ１４．８４７　先天的副腎過形成　１５．４８２７　リウマトイドを椎炎　８ ７．４８３５　亜急性甲状腺炎　１３．７ Ｃｗ６　乾揖　１３．３ ＤＲ２多発性硬化症　４．１ ＤＲ３全身性紅斑性狼ｆ５．８ ＤＲ３アジフン病　６．３ ＤＲ３バセドウ病　３．７ ＤＲ３重症性筋無力症　２．５ ＤＲ３膜外性糸球体症　１２．０ ＤＲ３およσ／れはＤＲ４インスリン依存性糖尿病　６．４ＤＲ３ＦＪよＵ／ま たはＤＲ７セリアツク病　４．８ＤＲ４リウマトイド関節炎　４．０ ＤＲ４天庖疹　１４．４ ＤＲ５ビールメル貧血　５．４ ＤＲ５橋本病　５．６ ＤＲ５，ＤＲｗ８　幼年性関節炎　５．２１相対的危険性は病気にかかる危険性 が関係するＨＬＡを有する人に対して増加するファクターを示す。グループＨＬ Ａ−Ｃｗ６をもつ各人は、例えば、前記抗原をもたない人の１３．３倍の乾廖に かかる機会をもつ。

さらにＨＬＡ系における遺伝子変異は器官及び組織移植における受容が白血球内 の同じＨＬＡ対立遺伝子の存在と関連しているが、拒絶反応が白血球内の種々の ＨＬＡ対立遺伝子の存在に関連しているという事実から重要である。

人ではＨＬＡ遺伝子ファミリーは１，５００，０００塩基対の領域をカバーする 。この領域は多（の遺伝子に対してコードする。従って、この領域は、ＨＬＡク ラス■およびＨＬＡクラスＩＩの遺伝子に加えて、とりわけ、補体系の遺伝子、 ２１−ヒドロキシラーゼ遺伝子および腫瘍壊死因子に対してコードする遺伝子を 含む。

ＨＬＡクラス■領域は３個の“主”遺伝子座：　ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂおよび ＨＬＡ−Ｃを含む、前記遺伝子座がコードする分子は全ての核状細胞中に発現さ れる。クラスＩの分子は４４，０ＯＯＤの分子量（ＭＷ）を育する多形α−鎖お よび１２，０ＯＯＤのＭＷを有するβ２−ミクログロブリンと呼ばれる一定の鎖 から成る。

ＨＬＡクラス１１領域は遺伝子座ＨＬＡ−ＤＲ，ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−Ｄ Ｐを含む。前記遺伝子座に加えて、また上述の遺伝子座のひとつに所属せず、そ して当面は異なる遺伝子座であると考えられる多数の遺伝子が記載されている（ 例えば、ＨＬＡ−Ｅ　；　ＨＬＡ−Ｆ　；　ＨＬＡ−ＤＮ　、ＨＬＡ−ＤＺ）、 クラスＩＴの分子はα−鎖（ＭＷ３４．０ＯＯＤ）およびβ−１（ＭＷ２９，０ ＯＯＤ）から成る。ＨＬＡ−ＤＲのα−鎖は一定である。即ち、変異体は未だ発 見されていない、ＨＬＡ−ＤＲは３個のβ−遺伝子を含み、そのうちの２個の遺 伝子は生成物に対してコードし、１個の遺伝子は発現されない偽遺伝子である。

β−鎖の各々はα−鎖と二量体分子を形成することができる。ＨＬＡ−ＤＱ遺伝 子座は４個（２個のα−と２個のβ−）の遺伝子を含み、そのうちの２個は発現 される。即ちＤＱαおよびＤＱＢ（最新の命名会議の勧告ではＤＱＡおよびＤＱ Ｂと呼ばれる）である、前記遺伝子の構造は特徴のある偽遺伝子を示していない が、他の遺伝子（ＤＸＡおよびＤＱＢ）の分子は見出されていない、ＨＬＡ−Ｄ Ｐ遺伝子座は４個の遺伝子（２個のαおよび２個のβ）を含み、そのうちの２個 が発現される。まだ多形性はＤＰＡに対して示されておらず、はんの少数のＤＰ Ｂの対立遺伝子が記載されているだけである。他の２個のＤＰ遺伝子は偽遺伝子 である。

核酸中に存在する特異的ヌクレオチド変異体および遺伝子多形体を検出する方法 、そしてまた前記方法を実施するためのキットはＥ　Ｐ　−Ａ−２３７，３６２ に記載されている。前記方法は、ヌクレオチド変異体、突然変異体および多形体 の存在が想定される核酸シーケンスを増幅し、次にドツトプロットを用いる対立 遺伝子特異的オリゴヌクレオチドシーケンスを用いてそれを検出することから成 る。この方法では、検出すべき変異体をもつ少なくともＤＮＡシーケンスを含み 、検出すべきヌクレオチド変異体に対して特異的でなければならない対立遺伝子 特異的オリゴヌクレオチドシーケンスが使用される（前記特許出願の２２頁を参 照）、従って、遺伝子系の研究されるべきＤＮＡシーケンスにおける異なった既 知の変異体に対してコードする多くの異なるプライマーをキットは含む。

増幅したＤＮＡの遺伝子分析のための固定化したシーケンス特異的オリゴヌクレ オチドプローブは国際特許出１ｉＷＯ８９ノ１１５４８およびアール・ケイ・サ イキらによるプロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オプ・ サイアンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・スティク・オブ・アメリカ（Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｅｔ、　ＵＳＡ、　８６．６２３０−６２３４　（１９８９））に開示されて いる。

種々の部分に対して特異的な一連のプローブをもつ核酸試料をハイブリッド形成 することによってＨＬＡ−ＤＰ遺伝子座中の対立遺伝子に関して遺伝子型を決定 する方法は国際特許出１１ＷＯ８９／１１５４７によって開示されている。

結合できるプローブを用いて増幅したＤＮＡをハイブリッド形成することによっ てヌクレオチドシーケンスを識別する方法は国際特許出＠　Ｗ　Ｏ９０１０１５ ６３によって開示されている。

これらの既知の方法は次の問題点を有する：ａ）特定の遺伝子系のＤＮＡシーケ ンスにおいて既知の変異体を見つけることだけが可能である。その結果、研究す べき遺伝子系において任意のこれまでに知られていない変異体を前記方法で発見 することができない。

ｂ）キット中の既知の変異体各々に対して種々のオリゴヌクレオチドを含むこと 、そしてその方法にそれらを使うことが必要であり、その結果、（例えば、ＨＬ Ａ系のような）多くの可能な対立遺伝子を含む複雑な遺伝子系では、異なるオリ ゴヌクレオチドを各々の可能な対立遺伝子に対して使用する必要があり、異なる 交雑形成を行う必要があり、煩わしく、時間の浪費であり費用がかかる。

ＨＬＡ分類 ｌラノＬ口【１７ ＨＬＡクラスＩ分子は各対立遺伝子に対して特異的である抗血清の補助で決定さ れる。多くの場合、すべての対立遺伝子形態に対してモノクローナル抗体を入手 することができないので、同種抗血清が使用される０種々の対立遺伝子の多形性 を特徴づける変異体がクラス■遺伝子の小さい領域に集まっているので、短期間 で入手可能になることは起こりそうもない。

Ｌ旦ス土Ｉ亘！ クラスＩの対立遺伝子の蛋白質化学の決定は分子の一定のメンバーに対してモノ クローナル抗血清を用いて免疫沈降物によって、次いで等電点電気泳動（ＩＥＦ ）によって可能である。

ワークＴ　ＤＮＡ クラスＩＣＤＮＡプローブを使用する制限断片製多形（ＲＦＬＰ）の決定によっ て制限された範囲まで分類が可能である。さらに精製により遺伝子座特異的プロ ーブを生成し、その結果、対立遺伝子の集団および若干の別の対立遺伝子を検出 することができる。対立遺伝子特異的オリゴハイブリッド形成（Ａ、ＳＯ）によ るクラスＩ対立遺伝子の分類は、多数の異なる対立遺伝子、従って必要な多数の オリゴの結果として可能であるとは考えられない。

ＤＮＡ水準での決まりきった分類はこの方法によって行うことが難しい。

久立入旦１１望は実際に行うことが一層難しく、第１に良く画定された抗血清が 不足しているためであり、第２に同定技術の精巧さ、即ち２色蛍光のためである 。

えｊ久旦ｔｍはモノクローナル抗体の入手容易性の結果としてＩＥＦによって特 徴づけることができるが、変異と数の点からは対立遺伝子の多様性は、特にヘテ ロ接合体個体において標準の分類を困難にする。

ワークＩＩＤＮＡ ＲＦＬＰ分析を用いてＤＲＡ、ＤＱＡ、ＤＱＢおよびＤＰＢ対立遺伝子を同定す ることができる。この関係において、若干の対立遺伝子は、個々に識別すること ができないので“超分類グループ”に置かれるが、特定のＲＦＬＰパターンをも つ対立遺伝子のグループとして他の対立遺伝子から突出している。

ＲＦＬＰパターンに帰するサザンプロット分析の技術はクラスＩＩを分類するた めに容易に用いることができる。技術的に見ると、このアプローチはその精巧さ のために決まりきったクラスＩＩの分類には遺さない。

ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）による増幅ＤＮＡの合成オリゴヌクレオチドを用 いるＡ３０分類の開発は、今ではＤＱＡの決まりきった分類を可能にした。さら にまたＤＲＢ、、ＤＱＢおよびＤＰＢのための分類が開発されるだろう、この方 法の短所は関係する遺伝子座の対立遺伝子の数が増加するにつれて多数の対立遺 伝子特異的オリゴが使用されなければならないことである。

ワークショップ 毎年世界中に配布されたＨＬＡ分類センターの結果がワークショップで試験され 、血清が選択され参照血清として規定される。

蛋白質−化学決定方法によって分類が改良されている。ＤＮＡ／ＲＦＬＰおよび ＤＮＡ−ＡＳＯ分析は抗血清を用いて決定される対立遺伝子の標準化を容易にし ている。

蛋白質分類に関して、ワークショップはどのモノクローナル抗体が使用されなけ ればならないか、どのようにしてデータを解釈しなければならないかを決定する 。ＤＮＡ−ＲＦＬＰ分類については、ＤＮＡ単離およびハイブリッド形成の標準 化に加えて、酵素−プローブの組合せを決定する。

ＤＮＡ−Ａ３０分１１はパーキン・エルマー／コークス・コーポレイションの（ キットとして特許され市販されている）パッケージとして提供され、現在ＤＱＡ 分類のために使用することができる。

世界中の各分類センターによって均一に行うことができる種々の方法の組合せを 見出すための試みがなされている。この関係において、各種の分類センターにお ける測定値の再現性、試薬（血清、プローブ、オリゴ）の均一性および分類の品 質コントロールを行う可能性が重要な役割を演じている。

上述の場合において、分類へのアプローチは遺伝子座の分子または遺伝子の多形 部分の特徴に基づいている。

遺伝子変異体を決定するため、多形系の側面に位置する保護されたシーケンスを 有利に使用できることが見出された。

従って、遺伝子系のメンバーのヌクレオチドシーケンスを比較して遺伝子型を決 定するための本発明による方法は、多形性が遺伝子物質に配置されている強く保 護された区画の遺伝子座または遺伝子のヌクレオチドシーケンスを比較すること を特徴とする。

本発明による方法の重要な利点は、遺伝子系における偏向、そして特に発現され る偏向を、一層容易にしかもそれによって一層大きい確実性で追跡できることで ある。さらに特に、本方法の利点はニ ー　新しい突然変異体を直接検出することができ、そして相関関係について一層 詳細に研究することができる。これは、多くの場合反応しないが良くても他の血 清との交叉反応が見られる血清学上の分類とは対照的である。Ａ３０分類はその 対立遺伝子に対して陰性であることを特徴とする。

本方法は他の決定法と比べて既知の多形性とは蓋聚兎である。

−系が簡単なため（世界中で高度の再現性）、分類の標準化が簡単になるだろう 。

−本方法は血球、血清および対立遺伝子の発現における地理学的に決定された内 部変異とは無関係である。

−同時に異なる遺伝子座の対立遺伝子を１回の試験で決定することができ、その 結果として病気との関連が一層広い情況（もつと多い遺伝子座または遺伝子系） で知られることになる。

−遺伝子系に対する命名は本発明を用いることによって遺伝子座／遺伝子の多形 部分を規定する簡単な方法で配置することができる。

ヌクレオチドシーケンスを比較する遺伝子物質の強く保護された区画は、本発明 によれば、シーケンスを既知の方法で比較する多形（少なく保護された）区画よ りもホモロジーが大きい、ベースレベルでのホモロジー、即ち、遺伝子座または 遺伝子の対立遺伝子形態の特性を示しているヌクレオチドの１ｉ−センテージ番 よ少なくとも約５０％であり、好ましくは少な（とも５８％である。

本発明による方法は特に遺伝子系の）＼プロタイプを決定するために用いること ができる。

特に、本発明は遺伝子系の遺伝子座および遺伝子系の対立遺伝子・例えば組織適 合性の系の遺伝子系を比較するために用し）ることができる、同時に、（例えば 、骨髄移植または血液輸血において）それは対立遺伝子の存在の特異的分類／同 定が要求される対立遺伝子の決まりきった仕事の同定の問題であるかもしれない 。

また本発明による方法を用いる研究に有利に適している遺伝子系は免疫グロブリ ン超遺伝子ファミリー、特に免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子またはＴ細胞受容体 （ＴＣＲ）の遺伝子の一員の遺伝子系である。

また本発明による方法は分類のために特色あるものよりも簡単な多形シーケンス の決定が、他の保護されたフランキングシーケンスの選択の結果として遺伝子内 で可能である研究目的に適している。

本発明による方法を用いる遺伝子型の決定は、特に、組織分類または細胞分類に 関係する。これは、例えば、移植の適合性の程度を決定するために行うことがで きる。もしも提供者と受け入れる者との間の多形領域において異常が見られない かまたは極めて少しである場合、身体に適しないＨＬＡｓを基礎として拒絶反応 が行われないので移植を受け入れる機会が高いだろう。また動物のＨＬＡ関連の 病気の危険性を決定するため組織分類または細胞分類を行うことが可能である。

この関係における特定の局面は、例えばこれまでに血清学の技法によってのみ決 定することができたＨＬＡクラス■対立遺伝子のための分類可能性の導入および 一様な実行性である。

さらに、バタテリウム、ウィルスまたはリボ蛋白質の遺伝子系を遺伝子変異を研 究する遺伝子系として使用することができる。

本発明による方法を用いて強く保護された領域のヌクレオチドシーケンスにおけ る可能な変異を調べることは、調べるべき強く保護された区画が少なくとも片側 、そして好ましくは両側に、完全に保護されたシーケンスによって、即ち、個体 すべてにおいて完全に同一であるシーケンスによって結合されている場合に容易 に行うことができる。前記の完全に保護されたシーケンスは、特に、長さが少な くとも５個のヌクレオチドであり、そして特に好ましくは長さが少なくとも１０ 個のヌクレオチドである。

調べるべき強く保護されたヌクレオチドシーケンスは完全に保護されたシーケン スを用いて増幅することができる０強く保護されたヌクレオチドシーケンスを増 幅するための利点を用いる方法はＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応）である（サイキ ・アール・ケイ、ゲルファント・ディ・エイチ、ストラフエル・ニス、シャー７ ・ニス・ジェイ、ヒグチ・アール、ホーン・ジー・ティ、ムリス・ケイ・ビーお よびエルリッチ・エイチ・エイ（１９８Ｂ）　、熱安定のＤＮＡポリメラーゼを 用いるＤＮＡのプライマー指示酵素による増幅、サイエンス、２３９．４８７− ４９１）　、また調べるべきシーケンスを増幅する他の方法もまた本発明による 方法において使用することができる。

この方法で増幅されるシーケンスを次に直接のシーケンス分析、変性グラジェン トゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）または温度グラジェントゲル電気泳動（ＴＧＧＥ） に委ねることができる。変性ゲル系が働く範囲は異なる対立遺伝子の数に関して ゲルの識別能力に依存する。言い換えると、ゲル系は限られた数のみの遺伝子座 の対立遺伝子、例えばリボ蛋白質対立遺伝子、ＨＬＡ−ＤＱＡ対立遺伝子、ＨＬ Ａ−ＤＰＢ対立遺伝子およびＨＬＡ−ＤＱＢ対立遺伝子、およびウィルスタイプ であるならば良く働き、異なる細胞または組織において異なる遺伝子座の発現を 決定するために使用することができる。

また増幅したり、ＮＡまたはＲＮＡを直接のシーケンス決定方法によって分析（ ＝分類）することもできる。決まりきった仕事の分類決定のために、両者の分析 は情報を与えるように、再現するように、そして制御された方法で行うことがで きる。複数の対立遺伝子を含む遺伝子系に対しては、直接のシーケンス分析は解 釈、従って種々のセンターによって再現性を容易にするだろう。また直接のシー ケンス分析法は研究のために有利である。

これまでに変異の決定はサザン・ブロッティングによるＤＮＡレベルで行われて きた。異なるファミリーのＴＣＲおよび１ｇ遺伝子は特定の増幅およびシーケン シングまたはＤＧＧＥによって検出することができるが、種々のファミリーのメ ンバーは一セントのファミリー特異的プライマーによって識別することができる 、このアプローチに直接適している他の遺伝子系は異なったウィルス、例えばＨ ＰＶＩ−１６の決定である。

プライマーの選択 大多数の遺伝子の多くの対立遺伝子は研究を目的として塩基配列決定されてきた 。これらの配列決定はＥＭＢＬデーターバンク（ヨーロッパ用）およびシーンバ ンク（ＵＳＡ）において保存され、両方共に申込者が入手することができる。こ れらのシーケンスに基づいて、対立遺伝子特異的オリゴ（Ａ　Ｓ　Ｏ）は、例え ば、多形領域から選択され、そしてこれらを使用して異なる対立遺伝子を同定し てきた。大抵の遺伝子系は突然変異を受けないか、殆ど受けないかまたは極めて 強く受けるシーケンスの領域を含む。

ＨＬＡクラス■■遺伝子系に対しては、これは多形領域を局部に制限するために 詳細に研究されてきた。参考文献：グスタフソン・ケイ、エンモス・イー、ラー ハンマー・ディ、ボーメ・ジエイ、ヒルジグ−ニールセン・ジェイ・ジエイ、ピ ーダーリン・ビー・エイ、およびラスタ・エル（１９８４）　、クラスＩＩの組 織適合性抗原多形性の発生における突然変異および選択、メンバ・ジエイ、ム１ ６５５−１６６１　；グスタフソン・ケイ、ライマン・ケイ、ラーハンマー°デ ィ、ラスタ・エルおよびピーダーリン・ビー・エイ、（１９８４）、信号シーケ ンスは異なる遺伝子座のクラスＩＩの組織適合性抗原ベーター鎖を識別する、５ ｃａｎｄ、　Ｊ、　ｆｎｕｎｏｌ、　１９．９ｌ−９７ｅ本発明による方法に使 用できるシーケンスの存在は、シーケンスデータバンク（ＥＭＢＬおよびシーン バンク）から入手できたＨＬＡクラス！およびＩＩのシーケンスの詳細な分析に よって検出することができ、自己決定シーケンスによって補充される。クラス■ および他の遺伝子系に対するプライマーはシーケンスデーターバンクから選択さ れ使用することができる。ＨＬＡクラスＩＩ遺伝子座ＤＲＢ、ＤＱＡ、ＤＱＢお よびＤＰＢに対して保護されたシーケンスに基づくプライマーは既に知られてい るシーケンスに基づいて選択することができる。幾つかの使用できるプライマー は下記の実施例のひとつに報告されている。計画している分類に適する完全に保 護されたシーケンス（プライマー）を選択し試験することは、当業者の範囲内に ある。

応用 リボ蛋白質多形性を決定するため、ＡＳＯは放射活性により標識化し、リポ蛋白 質已に存在する種々の対立遺伝子を分類するためのプローブとして使用される。

３種の頻繁に現われる対立遺伝子はまた、多形区画におけるこれら３種の対立遺 伝子の場合において、その差は制限酵素部位に集まっているので、制限酵素分析 によって決定することもできる。５種の対立遺伝子全部は直接・変性ゲル電気泳 動によって決定することができる。（シェフィールドら、変性グラジェントゲル 電気泳動によるＤＮＡ多形性の同定、ＰＣＲプロトコルにおいて：方法と応用へ のガイド、アカデミツク・プレス・インコーホレイテッド、１９９０．２０６− ２１８頁）。

異なる対立遺伝子の出現はヌクレオチドシーケンスの差に基づいているので、直 接シーケンシングによって異なる対立遺伝子を検出することができるという指摘 がある（マックブライトら、（：ｉｎ。

Ｃｈｅｗ、３５．　２１９６−２２０１　（１９８９））。

ＨＬＡ分類の場合には、“一定のプライマー”を使用して異常なＨＬＡタイプが 出現しているファミリーのＤＲＢ遺伝子を増幅した。ＤＲＢ遺伝子の増幅、ベク ターのクローニング、続いてシーケンス分析の後、“異常な”ＨＬＡタイプは実 際に既知の技術では検出できない新しいハブロタイブであることが見出された。

この分析において、種々の対立遺伝子の同定は直接のシーケンシングおよび対立 遺伝子中に存在するチミジンヌクレオチドの位置決定によって簡単に行うことが できることが見出された（Ｔ−トラッキング）、自動的なシーケンス決定はすで にＨＬＡ−ＤＱＡのシーケンシングのために行われている（マンクブライトら、 １９８９、上記参照）、彼らによって追求された方法は遺伝子座の対立遺伝子を 分類するための自動シーケンスシステムのために僅かに改変して直接使用するこ とができる。

プライマーを選択した後、“キット”は種々の遺伝子系のために組み立てること ができ、このキットは、とりわけ、前記プライマーを含み、その結果として標準 化された方法が種々の対立遺伝子を分類するために得られる。第一に、ＡｐｏＥ およびＨＬＡ−ＤＲＢ、ＤＱＡ、ＤＱＢおよびＤＰＢ対立遺伝子は変性ゲルを用 いてシーケンス分析によって一般応用のために調べられる。

従って本発明はまた遺伝子ファミリーにおける遺伝子変異体を追跡するためのキ ットに関するもので、プライマーとして少なくとも５個のヌクレオチドの長さを 存する１個または２個の完全に保護されたシーケンスおよびできれば調べるべき 遺伝子物質の強く保護された区画を増幅および分析するための他の手段を含み、 この区画は完全に保護されたヌクレオチドシーケンスによって側面を固められて いる。

実施例Ｉ 保護されたシーケンスに基づくプライマーはＨＬＡクラスＩＩ遺伝子座ＤＲＢＳ ＤＱＡ、ＤＱＢおよびＤＰＢに対して選択しそして有用性について試験した。以 下には増幅反応（ＰＲＣ）のために選択し試験した幾つかのプライマーのシーケ ンスが示されている。２個のプライマーが各反応について好ましく使用される。

ＤＲＢ５：　５°ＣＣＡＧＣＡＣＧ　ＴＴＴ　Ｃ３’Ｄ　ＲＢ　３　：　５’　 ＴＴ　ＧＴＲＴＣＴ　ＧＣＡ　３’　（Ｒ，Ｇ／Ａ）Ｄ　ＱＡ　５　：　５’　 ＣＣＡ　ＴＧＡ　ＡＴＴ　ＴＧＡ　ＴＧＧ　ＡＧＡ　３゜Ｄ　ＱＡ　３　：　５ ’　ＡＴＣＧＴＴ　ＴＡＡ　ＴＣＡ　３’ＤＱＡ３．１：　５’ＴＧＴＴＣＡＡ ＧＴＴＲＴＧＴＴＴＴ３’（Ｒ，Ｇ／＾）ＤＱＡ３．２：　５’ＡＣＡＧＣ５Ａ ＴＧＴＴＴＳＴＣＡＧＴＧＣＡ３°（Ｓ＝Ｇ／Ｃ）注、ＤＱＡ５はＤＱＡ３、Ｄ ＱＡ３．１またはＤＱＡ３．２を組合せて使用される。

ＤＸＡ　３．２７　５’　ＡＣＡ　ＧＣ５ＡＴＡ　ＴＴＴ　ＳＴＣＡＧＴ　ＧＣ Ａ　３’　（Ｓ−Ｇ／Ｃ）ＤＸＡ３　：　５’　ＴＣＴ　ＧＣ５ＧＧＴ　ＣＡＡ 　ＡＡＣＴ　３’注、ＤＸＡ３およびＤＸＡ３．２はＤＱＡ５と組合せて使用さ れＤＱＢ５：　５°　ＴＧＴ　ＧＣＴ　ＡＣＴ　ＴＣＡ　ＣＣＡ　Ａ　３゜ＤＱ Ｂ３：　５°　ＧＴＡ　ＧＴＴ　ＧＴＧ　ＴＣＴ　ＧＣＡ　３’Ｄ　Ｐ　Ｂ　５ 　：　５’　ＧＣＡ　ＧＧＡ　ＡＴＧ　ＣＴＡ　ＣＧＣＧＴＴ　ＴＡ　３’Ｄ　 Ｐ　Ｂ　３　：　５’　ＣＣＡ　ＧＣＴ　ＣＧＴ　ＡＧＴ　ＴＧＴ　ＧＴＣＴＧ Ｃ３’ＤＰＢ３３Ｐ　（ＤＰＢ３の代替）： ５’　ＴＴＧ　ＴＡＡ　ＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ　ＴＣＣＡＧＣＴＣＧ　ＴＡ Ｇ　ＴＴＧ　ＴＧＴ　ＣＴＧ　Ｃ３’Ａ　Ｐ　ＯＥ、Ｆ　４　：　５’　ＡＣＡ 　ＧＡＡ　ＴＴＣＧＣＣＣＣＧ　ＧＣＣＴＧＧ　ＴＡＣＡＣ３’ＡＰＯＥ、Ｆ６ 　：　５°　ＴＡＡ　ＧＣＴ　ＴＧＧ　ＣＡＣＧＧＣＴＧＴ　ＣＣＡ　ＡＧＧ　 ＾３゛ＤＲＢ５／ＤＲＢ３、ＤＱＡ５／ＤＱＡ３．２およびＤＰＢ５／ＤＰＢ３ ＳＰの組合せはシーケンスのためにうまく使用された。

実施例２ ファミリーＧ（両親、４人の子供）では交叉反応は従来のＨＬＡ分類方法によっ て異なる分類血清をもつＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子のための決定において見出 された。この方法による任意の分類を確立することはできなかった。制限フラグ メント長多形（ＲＦＬＰ）およびＡ３０分類による詳細な分析は、ファミリーの 異なるメンバーにおいてこのファミリーに生じたＨＬＡ−ＤＲＢの２個の対立遺 伝子はないが、３個はあるという仮定の結果として行い、そしてこれは治療すべ きファミリーのメンバーの一人の病気に対して密接な関係をもった（チラヌス・ エム・ジー・ジエイ、パン・エフゲルモンド・エム・シー・ジエイ・エイ、フエ イ・エイチ、シェウダー・ジー・エム・テイエイチ、およびシフアート・エム・ ジェイ　（１９８９）　、見かけのＨＬＡ−ＤＲトリプレットをもつファミリー ：異なるハブロタイブ間の機能的ＨＬＡ−ＤＲベーター遺伝子の交換に関する証 拠、Ｅｘｐ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ６、１６２−１６８ ）。このファミリーのＤＮＡはこの現象についての遺伝子基礎を確立することが できるように詳細に研究された。これを行う際に使用したテクニックのひとつは ＨＬＡクラスＩＩ遺伝子座の種々の対立遺伝子のシーケンス分析から成る。

このファミリーでは３個のＤＲＢ対立遺伝子が１人のＤＮＡ中に同定された。即 ち、対立遺伝子特異的オリゴを用いる陽性同定に基づいて、ＤＲＩ、ＤＲ２およ びＤＲｗ６である（トリプレット）、この対立遺伝子特異的オリゴは蛋白質レベ ルでも異なる領域について対応するシーケンスを検出する０図１は３文字および １文字コードで誘導されたアミノ酸シーケンスをもつＤＲｌのヌクレオチドシー ケンスを示す、下ｗＡ領領域対立遺伝子特異的オリゴの位置を示す。このファミ リーに存在する他の対立遺伝子の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドのヌクレ オチドシーケンスおよび関連したアミノ酸シーケンスは図２ａおよび２ｂに示さ れる。

図工における下線領域に相当して、図２ａは第１の多形領域におけるヌクレオチ ド変異を示し、図２ｂは第２の多形領域のそれを示す。ＤＲＢ遺伝子のさらに詳 細な分析のために、記載されたユニバーサルブライマーＤＲＢ　５ＳおよびＤＲ Ｂ　３Ｅを使用した。

コントロールの研究では、ＤＲＢ対立遺伝子ＤＲＩ、ＤＲ２およびＤＲＷ６の同 定のためのユニバーサルブライマーの使用を試験したが、これらのシーケンスに おいて偏向は認められなかった。

コントロールセルラインおよびファミリーＧのＤＮＡのシーケンス分析の結果は 、それぞれ、１文字コードを用いるアミノ酸シーケンスの形で図３ａおよび３ｂ に示される。

このことから、このファミリーには組換えられたハロタイプがあり、ＤＲＩおよ びＤＲ２対立遺伝子が含まれていることが明らかである。ＤＲｗ６．ｗｌ　９お よびＤＲＷ６．５２Ｃ対立遺伝子はコントロールシーケンスと同一である。ＤＲ Ｉ特異的オリゴおよびＤＲ２特異的オリゴによって検出される対立遺伝子は互い に四に生じることが明らかである（図４）、従って３個の対立遺伝子がここに存 在するがＤＲＢハブロタイブは前もって同定されないことに問題はない、遺伝子 の他の区画では、特異的シーケンスはこのＤＲ１＋２ハブロタイブに対して同定 された。

このファミリーの遺伝子座（ＤＱＢ、ＤＱＡおよびＤＰＢ）について、２個だけ の（突然変異していない）対立遺伝子があることがユニバーサルプライマーを用 いることによって確立された。

さらに、前記ハブロタイブは保護された特異的シーケンスの存在によって特徴づ けることができる。

Ｆｉｇ、　２ａ ０日１ ＣＧＴ　丁ＴＣＴｒＧ　ＴＧＧ　ＣＡＧ　ＣＴｒ　ＡＡＧ　ｍ　ＧＡＡ　ＴＧＴ 　Ｃ日　Ｆ　ＬＷＱ　ＬＫＦＥＣ Ｄ日２會１ ＣＧＴ　ＴＴＣＣＴＧ　ＴＧＧ　ＣＡＧ　ＣＣＴ　ＡＡＧ　ＡＧＧ　ＧＡＧ　Ｔ ＧＴ　Ｃ日　Ｆ　ＬＷＱ　ＰＫ　ＲＥＣ Ｄ日２−５ ＣＧＴ　ＴＴＣＴｒＧ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＧＡＴ　ＡＡＧ　ＴＡＴ　ＧＡＧ　Ｔ ＧＴ　Ｃ日　Ｆ　ＬＱＱ　ＤＫＹＥＣ Ｄ日ｗ６．ｗｌ９ ＣＧＴ　ｒｒＣＴＴＧ　ＧＡＧ　ＴＡＣＴＣＴ　ＡＣＧ　ＴＣＴ　ＧＡＧ　ＴＧ Ｔ　Ｃ日　Ｆ　ＬＥＹＳＴＳＥＣ ＤＲｗ６．５２０ ＣＧＴ　ＴＴＣＴＴＧ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＣＴｒ　ＡＡＧ　ＴＣＴ　ＧＡＧ　Ｔ ＧＴ　Ｃ日　Ｆ　ＬＥ　Ｌ　ＬＫＳ　ＥＣ Ｆｉｇ、　２ｂ ＤＲＩ ＴｒＧ　ＣＴＧ　ＧＡＡ　ＡＧＡ　ＴＧＣＡＴＣＴＡＴ　ＡＡＣＣＡＡ　ＧＡＧ ＬＬＥ　日　ＣＩＹＮＱＥ Ｄ日２−１ ＴｒＣＣＴＧ　ＧＡＣＡＧＡ　ＴＡＣＴｒＣＴＡＴ　ＡＡＣＣＡＧ　ＧＡＧＦＬ Ｄ　日　ＹＦＹＮＱＥ ＤＲ２−５ ｎｃ　ＣＴＧ　ＣＡＣＡＧＡ　ＧＡＣＡＴＣＴＡＴ　ＡＡＣＣＡＡ　ＧＡＧＦＬ ）Ｉ　日　Ｄ！ＹＮＱＥ Ｄ日ｗ６．ｗｌ９ ＴｒＣＣＴＧ　ＧＡＣＡＧＡ　ＴＡＣＴｒＣＣＡＴ　ＡＡＣＣＡＧ　ＧＡＧＦＬ Ｏ日　Ｙ　Ｆ　ＨＮ　Ｑ　Ｅ ＤＲｗ６．５２゜ ＴＴＣＣＴＧ　ＧＡＣＡＧＡ　ＴＡＣＴＴＣＣＡＴ　ＡＡＣ、ＣＡＧ　ＧＡＧＦ ＬＤ　日　Ｙ　Ｆ　ＨＮ　Ｑ　Ｅ Ｆｉｇ、３ａ　−１７）０−／Ｌ／ＤＮＡＤＲ２−１−−−−−Ｐ−８−−−− −−−−−−−−Ｆ−Ｄ−ＹＦ−−−−−−−−−−ＯＲ２＠５　−−−Ｑ−Ｄ −Ｙ−−−−−−−−−−−−Ｆ−Ｈ−Ｄ−−一−−−ＤＬ−−−ＤＲｗ６．ｗ １９　−一−ＥＹＳＴＳ−−−−−一−−−−−−Ｆ−Ｄ−ＹＦＨ−−−−Ｎ− −−−Ｏ日Ｗ６５２°　−−−ＥＬ−８−一−−−−−−−−−−Ｆ−Ｄ−ＹＦ Ｈ−−−−Ｆ−−−−Ｆｉｇ、　３ｂ　ＤＮＡファミリーＧ ＤＲ１−−−−−一−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−一一−− −−−Ｄ日１−１ｉｋｅ　−−−−−−−−−−−−−一−−−−−−Ｆ−Ｈ− Ｄ−−−−−−ＤＬ−−−ＯＲ２−Ｉｉｋθ　−−Ｅ−Ａ−Ｃ−−−１−−−− 一−−−Ｆ−Ｈ−Ｄ−−−−−−ＤＬ−−−０日ｗ６．ｗ１９　−−−　ＥＹＳ ＴＳ−−−−−−−−−−−−Ｆ−Ｄ−ＹＦＨ−−−−Ｎ−一−−０日ｗ６．５ ２　−−−　ＥＬ−−８−−一−−−−−−−−−Ｆ−Ｄ−ＹＦＨ−−−−Ｆ− −−一−８その位置でＤＲＩと同じアミノ酸 −＝　ＡＳＯ分類のための領域 国際調査報告

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．遺伝子物質の強く保護された区画のヌクレオチドシーケンスを比較すること を特徴とする、遺伝子系のメンバーのヌクレオチドシーケンスを比較することに よって遺伝子型を決定する方法。
2. ２．遺伝子物質の強く保護された区画が少なくとも５８％のホモロジーを有する ことを特徴とする、請求項１記載の方法。
3. ３．遺伝子糸のハプロタイプを決定することを特徴とする、請求項１または２記 載の方法。
4. ４．遺伝子系の遺伝子座を比較することを特徴とする、請求項３記載の方法。
5. ５．遺伝子系の対立遺伝子を比較することを特徴とする、請求項４記載の方法。
6. ６．組織適合系の遺伝子系を遺伝子系として使用することを特徴とする、請求項 ３〜５のいずれか１項記載の方法。
7. ７．免疫グロブリン超遺伝子ファミリーのメンバーのひとつの遺伝子系を遺伝子 系として使用することを特徴とする請求項１または２記載の方法。
8. ８．免疫グロブリンの遺伝子系を遺伝子系として使用することを特徴とする、請 求項７記載の方法。
9. ９．Ｔ細胞受容体の遺伝子系を遺伝子系として使用することを特徴とする、請求 項７記載の方法。
10. １０．組織分類または細胞分類を行うことを特徴とする、請求項１または２記載 の方法。
11. １１．移植物または細胞の適合性の度合を決定することを特徴とする、請求項１ ０記載の方法。
12. １２．ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）またはＭＨＣ（主要組織適合抗原系）と関連し た病気のヒトまたは動物についてリスクを決定することを特徴とする、請求項１ ０記載の方法。
13. １３．バクテリアまたはウイルスの遺伝子系を遺伝子系として使用することを特 徴とする、請求項１または２記載の方法。
14. １４．強く保護された区画が少なくとも５個のヌクレオチドの完全に保護された シーケンスによって側面が守られていることを特徴とする、請求項１〜１３のい ずれか１項記載の方法。
15. １５．完全に保護されたシーケンスが少なくとも１０個のヌクレオチドを含むこ とを特徴とする、請求項１４記載の方法。
16. １６．強く保護されたヌクレオチドシーケンスが完全に保護されたシーケンスを 使用して増幅されることを特徴とする請求項１４または１５記載の方法。
17. １７．強く保護されたヌクレオチドシーケンスがＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応） を用いて増幅されることを特徴とする、請求項１６記載の方法。
18. １８．増幅されたシーケンスが直接シーケンス分析に委ねられることを特徴とす る、請求項１６または１７記載の方法。
19. １９．増幅されたシーケンスが変性グラジエントゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）に委 ねられることを特徴とする、請求項１６または１７記載の方法。
20. ２０．増幅されたシーケンスが温度グラジエントゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）に委 ねられることを特徴とする、請求項１６または１７記載の方法。
21. ２１．プライマーとして少なくとも５個のヌクレオチドの長さを有する１個また は２個の完全に保護されたヌクレオチドシーケンス、およびあるいは完全に保護 されたヌクレオチドシーケンスによって側面を守られている調べるべき遺伝子物 質の強く保護された区画を増幅および分析するための他の手段を含む遺伝子ファ ミリーにおける遺伝子変異体を追跡するためのキット。