KR100581002B1 - Ｈｌａ 유전자형 분석을 위한 올리고뉴크레오티드 조성물및 그 검사 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 HLA 유전자형 분석을 위한 올리고뉴크레오티드 조성물 및 그 검사 방법에 관한 발명이다.

Description

ＨＬＡ 유전자형 분석을 위한 올리고뉴크레오티드 조성물 및 그 검사 방법{Oligonucleotide composition for analyzing human leukocyte antigen (ＨＬＡ) genotype and detecting method thereof}
도 1은 HLA 올리고뉴크레오티드 칩의 전체 슬라이드 형태에 대한 사진이다. 즉, 하나의 슬라이드에서 HLA-A, -B, -Cw, -DRB 유전자형을 동시에 분석하기 위해 표시된 숫자와 같이 5개의 방으로 구성되어 있다. 이 슬라이드 위에 표에 나타낸 것과 같이 HLA-A 유전자형을 구분하는 38개의 프로브와 양성 컨트롤로 사용되는 2개의 프로브와 음성 컨트롤로 사용되는 1개의 프로브, HLA-B 유전자형을 구분하는 46개의 프로브와 음성 및 양성 컨트롤로 사용되는 각 1개의 프로브, HLA-Cw 유전자형을 구분하는 20개의 프로브와 양성 컨트롤로 사용되는 2개의 프로브와 음성 컨트롤로 사용되는 1개의 프로브, HLA-DRB1/3/4/5 유전자형을 구분하는 22개의 프로브와 음성 및 양성 컨트롤로 사용되는 각 1개의 프로브, HLA-DRB1/3/4/5 유전자형을 구분하는 프로브가 DRB3/4/5 유전자형에 의해 영향을 받아 HLADRB1 유전자형 분석이 일부 모호한 점을 보완하여 HLA-DRB1의 유전자형 구분의 분석능력을 향상시키기 위한 17개의 프로브와 음성 및 양성 컨트롤로 사용되는 각 1개의 프로브를 각 유전자 군을 구분하여 2중으로 총 155개를 찍었다. 그리고 이 위에 coverwell perfusion chamber (SIGMA, 미국)를 붙여서 각 유전자 군을 구분하는 프로브를 따 로 혼합 반응시킬 수 있도록 분리시켜서 HLA 올리고뉴크레오티드 칩을 제작한 것이다.
도2에서 도6까지는 HLA 올리고뉴크레오타이드 칩의 HLA-A*11/*31, B*27, Cw*06, DRB1*01/*11/DRB3 타입에 관한 형광 반응 결과 사진으로, 도1과 같은 슬라이드 형태의 5개의 방에서 일어난 반응을 이미지 확대하여 놓은 것이다.
도 2a는 HLA 올리고뉴크레오티드 칩의 HLA-A*11과 HLA-A*31형을 동시에 가진 시료에 대한 형광 반응 결과 사진으로 41개의 프로브 중에서 표 4의 "반응 HLA형"에 표시된 것과 같이 A*11형에 관련된 13번, 14번, 15번, 17번, 18번, 23번, 29번, 30번, 33번 프로브와 A*31형에 관련된 11번, 13번, 15번, 18번, 21번, 25번, 26번, 29번, 32번, 39번, 40번 프로브에 동시에 양성 반응이 일어난 것이다. 또한 프로브 01번과 41번은 양성 컨트롤로써 모든 반응에 나타나게 하고, 프로브 06번은 음성 컨트롤로써 모든 반응에서 나타나지 않게 함으로써 실험의 정확성을 확인하게 된다. 그리고 각각 2개의 동일한 점이 나타나게 한 것은 오류를 줄이고 정확성을 기하기 위하여 같은 프로브를 이중으로 찍어 놓은 것이다.
도 2b는 슬라이드 위에 찍은 프로브의 위치를 나타낸 것이다.
도 3a는 HLA 올리고뉴클레오티드 칩의 HLA-B*27형을 가진 시료에 대한 형광 반응표로 48개의 프로브 중에서 표 5의 "반응 HLA형"에 표시된 것과 같이 B*27에 관련된 09번, 12번, 21번, 30번, 31번, 32번, 36번, 37번, 42번, 47번 프로브에 양성 반응이 일어난 것이다. 또한 프로브 01번은 양성 컨트롤로써 모든 반응에 나타나게 하고, 프로브 06번은 음성 컨트롤로써 모든 반응에서 나타나지 않게 함으로써 실험의 정확성을 확인하게 된다. 그리고 각각 2개의 동일한 점이 나타나게 한 것은 오류를 줄이고 정확성을 기하기 위하여 같은 프로브를 이중으로 찍어 놓은 것이다.
도 3b는 슬라이드 위에 찍은 프로브의 위치를 나타낸 것이다.
도 4a는 HLA 올리고뉴크레오티드 칩의 HLA-Cw*06을 가진 시료에 대한 형광 반응표로 23개의 프로브 중에서 표 6의 "반응 HLA형"에 표시된 것과 같이 Cw*06과 관련된 06번, 08번, 13번, 17번 프로브에 양성 반응이 일어난 것이다. 또한 프로브 01번과 23번은 양성 컨트롤로써 모든 반응에 나타나게 하고, 프로브 04번은 음성 컨트롤로써 모든 반응에서 나타나지 않게 함으로써 실험의 정확성을 확인하게 된다. 그리고 각각 2개의 동일한 점이 나타나게 한 것은 오류를 줄이고 정확성을 기하기 위하여 같은 프로브를 이중으로 찍어 놓은 것이다.
도 4b는 슬라이드 위에 찍은 프로브의 위치를 나타낸 것이다.
도 5a는 HLA 올리고뉴크레오티드 칩의 HLA-DRB1*01타입과 HLA-DRB1*11 타입을 동시에 가진 시료에 대한 형광 반응 결과 사진으로 24개의 프로브 중에서 표 7의 "반응 HLA형"에 표시된 것과 같이 DRB1*01형에 관련된 07번, 10번 프로브와 DRB1*11형에 관련된 04번, 10번, 13번, 16번 프로브와 DRB1*11형과 함께 유전되는 DRB3형에 관련된 16번, 24번 프로브에 동시에 양성 반응이 일어난 것이다. 또한 프로브 01번은 양성 컨트롤로써 모든 반응에 나타나게 하고, 프로브 05번은 음성 컨트롤로써 모든 반응에서 나타나지 않게 함으로써 실험의 정확성을 확인하게 된다. 그리고 각각 2개의 동일한 점이 나타나게 한 것은 오류를 줄이고 정확성을 기하기 위하여 같은 프로브를 이중으로 찍어 놓은 것이다.
도 5b는 슬라이드 위에 찍은 프로브의 위치를 나타낸 것이다.
도 6a는 HLA 올리고뉴크레오티드 칩의 HLA-DRB1*01 타입과 HLA-DRB1*11 타입을 동시에 가진 시료에 대한 형광 반응 결과 사진으로 19개의 프로브 중에서 표 8의 "반응 HLA형"에 표시된 것과 같이 선택적으로 증폭되어지는 DRB1*11형에 관련된 07번, 10번, 13번 프로브에 동시에 양성 반응이 일어난 것이다. 또한 프로브 01번은 양성 컨트롤로써 모든 반응에 나타나게 하고, 프로브 04번은 음성 컨트롤로써 모든 반응에서 나타나지 않게 함으로써 실험의 정확성을 확인하게 된다. 그리고 각각 2개의 동일한 점이 나타나게 한 것은 오류를 줄이고 정확성을 기하기 위하여 같은 프로브를 이중으로 찍어 놓은 것이다.
도 6b는 슬라이드 위에 찍은 프로브의 위치를 나타낸 것이다.
PCR과 하이브리다이제이션 반응 시에 형광용 프라이머 및 프로브를 사용하였고, 결과 해석 시에 GenePiX4000 스캐너(Axon instruments사, 미국)를 사용하여 형광을 나타내는 프로브의 형태를 HLA 타이핑 프로그램을 사용하여 HLA 유전자형을 분석한 것이다.
본 발명은 올리고뉴크레오티드 칩 조성물 및 그 제조방법에 관한 발명으로, 더욱 상세하게는 조직이식 시 필요한 조직적합성검사를 시행하기 위해 HLA 유전자 형의 분석을 위한 올리고뉴크레오티드 칩 (oligonucleotide chip) 조성물 및 그 제조방법과 결과 분석법에 관한 발명이다.
주요조직적합성복합체 (Major Histocompatibility Complex : MHC)는 유전자 영역에서 지배되어지는 복잡한 항원계로 장기조직을 이식할 때 거부반응 (면역반응)에 관여하는 일련의 유전자군을 말하며 모든 포유동물에 존재한다. 사람의 MHC는 백혈구 표면의 항원을 인식하는 항 백혈구인자에서 처음 발견되어 인간 백혈구 항원 (human leukocyte antigen: HLA)이라고 하며, 6번 염색체의 단완에 위치한다. 이 HLA 유전자 좌는 면역학적 특성 및 분자구조, 유전자의 위치와 분포하는 세포의 종류에 따라 3군 (HLA-class Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ)으로 나누어지는데, 이중 제1군 항원 부위의 HLA-A, -B, -Cw 유전자좌와 제2군 항원부위의 HLA-DR이 조직거부 반응과 밀접한 관계가 있다.
HLA 유전자의 대표적인 특징은 다음과 같다. 첫째, HLA 유전자는 수십 개 이상의 대립유전자를 가지므로 인체 내의 많은 유전표지자 (genetic marker) 중에서 가장 높은 유전적 다형성 (genetic polymorphism)을 나타낸다. 둘째로 일배체형 (haplotype) 수준에서의 유전현상이다. HLA 유전자군에 속하는 여러 유전자는 제 6번 염색체 상에 매우 가까이 위치하므로 부모에서 자식에게 유전될 때 하나의 단위로 묶여져서 유전되며 이러한 대립유전자의 특정한 조합을 HLA 일배체형이라고 한다. 셋째로는 인종간의 HLA 유전적 다형성을 들 수 있다. HLA 대립유전자의 분포는 다른 유전자에 비해서 각 인종간에 매우 큰 차이를 나타내고 있다. 이러한 양상은 HLA 일배체형에서 인종간에 더 큰 차이를 나타내며 종족에 따라 어떤 HLA의 유전자 들은 강한 연쇄불균형 (linkage disequilibrium)을 나타내므로 특정한 종류의 HLA 일배체형은 어떤 인종에 특징적으로 존재하게 된다. 이러한 HLA의 유전적 다형성 현상으로 말미암아 종족간에 HLA 유전자의 유전자형 빈도 (gene frequency)와 일배체형 빈도 (haplotype frequency)가 달라지므로 인종간의 유전적 배경의 차이를 연구하는데 강력한 표지자 (marker)로 사용된다. 네번째, HLA 유전자의 또 다른 중요한 기능은 면역반응에 관여하는 것인데, 면역반응은 HLA-classⅠ 분자와 classⅡ 분자가 세포내에서 항원과 결합한 후 세포표면으로 표출되고 T 임파구 표면에 있는 T 세포항원 수용체가 HLA 분자와 결합된 항원을 인식함으로써 발생된다.
이와 같이 HLA 유전자의 높은 유전적 다형성과 면역반응에 깊이 관여하는 특성으로 인하여 장기이식, 질병과의 연관성, 수혈 그리고 법의학적으로 친자감별과 인류학적 연구에 이르기까지 널리 응용되고 있다. 현재 신장 및 골수 이식 프로그램에서는 HLA 검사는 필수적인데, 공여자와 수여자에 대한 ABO 혈액형 검사, HLA-A, -B, -Cw, 및 -DR형 검사를 실시하고 이식전 교차시험을 수행한다. 만일 골수, 신장 등을 이식할 때에 공여자와 수여자 간의 HLA 형이 서로 다를 경우 이식된 장기에 대하여 거부반응을 나타나게 된다. 보통 골수 이식은 면역세포 이식이라는 점에서 환자와 공여자간에 완벽한 유전적 일치가 요구되며, 이식 시 수여자와 동일한 HLA를 갖는 공여자를 미리 선정해야 한다는 것이 중요하다. 특히 급만성 백혈병이나 면역부전증 또는 재생불량성 빈혈 등에서 시도되는 골수이식에서는 HLA 유전자형이 완전히 일치해야 하므로 골수기증자로서는 같은 HLA 타입을 유전받은 형제가 가장 적합하다. 그러나 가족이 없는 경우에는 혈연관계가 없는 사람 중에서 기증할 사람을 찾아야 하며, 이때 많은 사람에게서 HLA 유전자형의 구분이 필수적으로 요구된다.
분자 생물학의 발달로 HLA 항원을 지배하는 대립 유전자의 염기 서열이 자세히 밝혀짐에 따라 염기서열의 차이로써 HLA의 다양성을 보는 HLA 유전자분석이 가능해졌다. 특히 PCR 방법의 도입으로 HLA의 DNA 타이핑 분야는 급진적으로 발전하였고 HLA 항원의 거의 모든 다형성이 DNA 수준에서 밝혀지고 있다. PCR을 이용한 HLA 대립유전자 구분에는 HLA 분자의 세포 표면의 표현량에 상관없이 모든 유핵 세포를 검체로 할 수 있어 T임파구와 B임파구의 분리가 불필요하며 임파구가 포함되지 않은 체액, 조직 등에서도 유전자형의 구분이 가능하다는 이점이 있다. 또한 DNA는 비교적 안정한 분자이므로 냉장 보관 시 수개월, 냉동에서는 거의 영구적으로 보관할 수 있으며, DNA 타이핑 방법이 가지고 있는 여러 가지 장점 중에서 가장 중요한 것은 많은 수의 HLA 대립유전자의 구분이 가능하다는 것이다.
현재 일반적으로 사용하고 있는 HLA DNA 타이핑 법을 살펴보면 첫째, PCR-SSP법이 있다. 이는 각각의 대립유전자의 염기배열에 특이한 프라이머를 합성하여 PCR을 실시하는 것으로 수십 개의 대립유전자를 구분하기 위해서는 수십 쌍의 프라이머가 필요하다. 이 방법은 분석시간이 짧으며 간편한 방법이나 프라이머를 합성할 때 세심한 주의와 지식 및 시간이 요구되며 대량 검체의 분석에는 다소 한계가 있다. 그리고 대립유전자가 많을수록 PCR-SSP의 수가 많아지므로 다량의 검체를 한번에 다루기에는 어려운 단점이 있다. 둘째, PCR-RFLP법을 이용한 HLA 유전자의 형별 구분은 대립유전자의 제한효소에 대한 반응 형태를 보는 비교적 간단한 방법으 로 여러가지 제한효소에 의해 절단된 DNA 단편의 크기로 대립유전자형을 구분한다. 이 방법은 결과의 판정이 쉽고 방법이 간단하나 제한 효소가 인식할 수 있는 부위가 한정된 경우에는 구분이 곤란하며 polyacrylamide gel을 사용해야 하므로 대량 검체나 수십 개의 대립유전자를 동시에 구분하는 것은 어려우므로 대립유전자 수가 적은 유전자형의 구분에 적합한 방법이다. 셋째, PCR-SSCP법은 PCR 산물을 formamide 등의 변성제를 첨가하여 single strand DNA (ssDNA)로 변성시켜 비변성 polyacrylamide gel에서 전기 영동하는 방법이다. ssDNA는 전기영동 중에 그 염기서열에 따라 특유한 고차구조를 가지며 전기영동시에 고유한 이동속도를 나타내어 각기 다른 밴드 형태로 이동된다. 이러한 성질을 이용하여 HLA 유전자 형별을 구분하는 방법으로 복잡하고 어려운 고도의 기술이 필요하며 결과 분석에도 경험과 지식이 필요하다. 넷째, 염기배열분석법은 HLA 유전자에 대하여 각각 PCR 한 후 DNA 염기 서열을 실시하여 알아내는 것인데, 이 방법을 이용한 키트로는 ABI사 (미국)의 HLA Sequence Based Typing (SBT)가 있으나 키트의 가격이 매우 비싸며 고가의 장비가 필요하며 실험 과정도 복잡하다. 다섯째, PCR-SSOP법은 유전적 다형성을 나타내는 영역의 염기배열에 상보적인 probe를 합성하고 probe와 PCR 증폭산물과의 교잡 여부로서 분석하는 방법이다. 이는 많은 수의 probe가 필요하며 염기 배열이 비슷한 다른 대립유전자와 교차반응이 쉽게 일어나므로 적절한 교잡온도와 반응 조건의 설정 등에 경험과 기술이 요구되는 방법이다. 이것은 프로브의 종류에 따라 정확한 결과를 얻을 수 있으나 필터를 사용함에 따라서 많은 수의 프로브를 찍는데 한계가 있으며, 하나의 필터에서 하나의 타입만을 분석해야 하기 때문에 많은 검체 를 처리하고 분석하는데 있어 시간과 노동력이 많이 소모가 된다. 이 방법을 이용하여 상용화되어 있는 상품으로는 HLA class Ⅰ과 class Ⅱ에 대하여 각각의 SSOP를 이용하여 reverse hybridization을 하는 Line Probe assay 방법인 INNOGENETICS사 (벨기에)의 INNO LiPA kit와 DYNAL Biotech사 (미국)의 Dynal RELITM SSO HLA Typing kit가 있다.
위에서 서술된 것과 같이 HLA 유전자를 분석하기 위해 여러 가지 타이핑 방법이 사용되고 있고 상품화되고 있으나 이 방법들의 공통된 단점은 HLA-A, -B, -Cw, -DR을 동시에 타이핑하기에는 많은 시간과 노동력이 요구되며 특히 대량의 검체를 분석하기에는 더욱 어렵다는 점이다.
가장 최근에 미세한 크기의 슬라이드글라스나 실리콘 등의 기판 위에 아주 적은 양의 DNA를 고밀도로 붙일 수 있고 또한, 동시에 많은 수를 검색할 수 있는 DNA chip 기술을 통해 유전자 발현분석, 유전자 진단, 유전자의 돌연변이 검색, 의약품의 검사 및 질병 진단 등에 폭넓게 이용될 수 있는 새로운 차원의 분석 시스템이 개발되었다. 본 발명은 이 DNA chip의 원리를 이용하여 HLA-A, -B, -Cw, -DR을 하나의 슬라이드 위에서 동시에 분석하는 것이다. 즉, 하나의 알데히드 글라스 슬라이드 위에 5개의 구역으로 각각의 프로브를 집적시키고, 비대칭 PCR 법을 사용하여 증폭시킨 HLA 유전자와 교잡반응을 시켜서, 반응이 나타난 프로브의 결과를 HLA 타이핑 프로그램을 사용하여 분석하므로써 HLA 유전자형을 구분하는 것이다.
본 발명은 상기한 방법의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 HLA 유전자형을 분석하기 위한 조성물을 포함하는 올리고뉴크레오티드 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기의 조성물을 이용하여 발전된 HLA 유전자형 분석방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열정보 1 에서 서열정보 41까지 기재된 HLA-A 유전자형 결정을 위한 둘 이상의 복수의 프로브 군; 서열정보 42에서 서열정보 89까지 기재된 HLA-B 유전자형 결정을 위한 둘 이상의 복수의 프로브 군; 서열정보 90에서 서열정보 112까지 기재된 HLA-Cw 유전자형 결정을 위한 둘 이상의 복수의 프로브 군; 및 서열정보 113에서 서열정보 140까지 기재된 HLA-DR 유전자형 결정을 위한 둘 이상의 복수의 프로브 군으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브 군을 포함하는 HLA 유전자형 결정을 위한 복수의 올리고뉴크레오티드 프로브 조성물을 제공한다.
또 본 발명은 서열정보 1 에서 서열정보 41까지 기재된 HLA-A 유전자형 결정을 위한 둘 이상의 복수의 프로브 군; 서열정보 42에서 서열정보 89까지 기재된 HLA-B 유전자형 결정을 위한 둘 이상의 복수의 프로브 군; 서열정보 90에서 서열정보 112까지 기재된 HLA-Cw 유전자형 결정을 위한 둘 이상의 복수의 프로브 군; 및 서열정보 113에서 서열정보 140까지 기재된 HLA-DR 유전자형 결정을 위한 둘 이상의 복수의 프로브 군으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브 군을 포함 하는 HLA 유전자형 결정을 위한 복수의 올리고뉴크레오티드 프로브 조성물이 고정화된 서포트를 포함하는 테스트 서포트를 제공한다.
본 발명의 상기의 서포트는 필터, 스트립, 마이크로스피어, 칩, 슬라이드, 멀티웰 플레이트, 멤브레인 및 광섬유로 구성된 군으로부터 선택된 서포트인 것이 바람직하다.
또 본 발명은 상기의 프로브와 목적 유전자와의 결합을 검출하는데 사용되는 서열정보 141에서 서열정보 157에 기재된 군으로부터 선택된 하나 이상의 HLA 유전자형 결정을 위한 프라이머를 포함한다.
본 발명의 프라이머 중 서열정보 142, 144, 146, 148, 150, 152 또는 154의 앤티센스 프라이머는 바이오틴 또는 로다민이 부착된 것을 특징으로 하는 프라이머인 것을 특징으로 하며, 상기의 프라이머 중 바이오틴 부착된 앤티센스 프라이머는 스트렙타비딘(Streptavidin)-시아닌(Cyanine)과 상호 작용하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 a) 혈액, 세포 및 조직으로부터 HLA DNA를 추출하는 단계; b) 추출한 DNA를 이용하여 비대칭 PCR을 실시하는 단계; c) 상기의 비대칭 PCR 부산물과 제1항 또는 제2항의 프로브를 결합시키는 단계; 및 d) 상기의 결합을 확인하는 단계를 포함하는 HLA 유전자형 분석방법을 제공한다.
본 발명에 있어서 상기의 확인단계는 로다민을 이용하거나 바이오틴과 결합하는 Streptavidin-Cyanine을 이용하고, 마이크로어레이 스캐너를 사용하여 결과를 확인하고, HLA 타이핑 프로그램을 이용하여 분석하므로써 HLA 유전자형을 편리하게 확인하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서는 최근에 개발된 DNA 마이크로어레이 기술을 이용하여 하나의 슬라이드 위에서 HLA-A, -B, Cw, DR을 동시에 분석할 수 있는 HLA 올리고뉴크레오티드 칩을 개발하였다. 즉, HLA 유전자형을 결정하기 위하여 HLA-A에서 21개 형에 특이적으로 반응할 수 있는 38개의 올리고뉴크레오티드, HLA-B에서 36개 형에 특이적으로 반응할 수 있는 46개의 올리고뉴크레오티드, HLA-Cw에서 14개 형에 특이적으로 반응할 수 있는 20개의 올리고뉴크레오티드, HLA-DRB1/3/4/5에서 16개 형에 특이적으로 반응할 수 있는 22개의 올리고뉴크레오티드, HLA-DRB1에서 B1*3, *8, *11, *12, *13, *14, *15, *16과 같이 총 8개 형에 특이적으로 반응할 수 있는 17개의 올리고뉴크레오티드를 제작하였으며, 이를 하나의 알데히드 글라스 슬라이드 위에 5개의 구역으로 집적하였다. 비대칭 PCR 법을 사용하여 증폭시킨 HLA 유전자를 슬라이드에 집적시킨 올리고뉴크레오티드 프로브와 교잡반응을 시켰다. 이를 형광반응법을 이용하여 반응이 나타난 프로브를 분석하여 총 HLA에 대한 87개의 유전자형을 구분하였다.
이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: HLA 프라이머의 합성 및 염기서열
비대칭 PCR에 사용한 HLA PCR 프라이머는 표 1에 나타난 것과 같이 HLA-A, - B, -Cw는 엑손 2와 3번에서, HLA-DRB1/3/4/5는 엑손 2번에서 공통적으로 반응할 수가 있는 부위, HLA-DRB1은 엑손 2번에서 B1*3, *8, *11, *12, *13, *14, *15, *16과 같이 총 8종의 특정 유전자형만을 특이적으로 증폭할 수 있는 부위를 분석하여 사용하였다.
비대칭 PCR에 사용하는 앤티센스 프라이머는 교잡반응 후에 형광반응으로 확인하기 위한 것으로 5' 말단에 로다민을 부착하여 제작하거나, 바이오틴이 부착되어 하이브리디제이션 과정후에 Streptavidin-Cyanine과 결합하도록 제작하여 사용하였다. 여기서 사용한 프라이머는 Molecular cloning 3판 (Sambrook과 Rusell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 2001년)의 10.42에 기술된 oligonucleotide 합성과 같은 방법을 사용하여 독일의 Metabion 사에 의뢰하여 합성하였다.
HLA 유전자형 분석을 위한 프라이머 염기 서열
프라이머 염기 서열 비고
HLA-A 엑손2 센스 (서열정보 141) AAACCGCCTCTGYGGGGAGAAGCAA PCR 크기 466bp
엑손2 안티센스 (서열정보 142) GATCTCGGACCCGGAGACTGTGG
엑손3 센스 (서열정보 143) TCSGGGCCAGGTTCTCACACC PCR 크기 374bp
엑손3 안티센스 (서열정보 144) GTGTTGGTCCCAATTGTCTCCCCTC
HLA-B 엑손2 센스 (서열정보 145) GCTCCCACTCCATGAGGTAT PCR 크기 420bp
엑손2 안티센스 (서열정보 146) TAAACGCGCCTGGGSCTCTCG 및 TAGACGCGCCTGGGGCTCTCG
엑손3 센스 (서열정보 147) TACCCGGTTTCATTTTCAGTTG PCR 크기 509bp
엑손3 안티센스 (서열정보 148) ATTCTCCATTCAASGGAGGGCGAC
HLA-Cw 엑손2 센스 (서열정보 149) CTCCCACTCCATGARGTATTT PCR 크기 419bp
엑손2 안티센스 (서열정보 150) TAAAGGYGACTGGGGCTCTCT
엑손3 센스 (서열정보 151) TTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTT PCR 크기 480bp
엑손3 안티센스 (서열정보 152) GCTGATCCCATTTTCCTCCCCTC
HLA-DRB1/3/4/5 엑손2 센스 (서열정보 153) TCCCCACAGCACGTTTCTTG PCR 크기 276bp
엑손2 안티센스 (서열정보 154) CCGCTGCACTGTGAAGCTCT
HLA-DRB1 엑손2 센스-1 (서열정보 155) TCCTGTGGCAGCCTAAGAGG PCR 크기 276bp
엑손2 센스-2 (서열정보 156) AGCACGTTTCTTGGAGTACTCTACGTC
엑손2 센스-3 (서열정보 157) GCACGTTTCTTGGAGTACTCTACGGG
엑손2 안티센스 (서열정보 154) CCGCTGCACTGTGAAGCTCT
실시예 2: HLA DNA의 추출과 비대칭 PCR 반응
1) HLA DNA는 Gentra systems사의 PUREGENETM DNA isolation kit을 사용하여 추출하였다. RBC lysis solution 900 ㎕와 혈액 300㎕를 섞어서 상온에서 1분간 10번 정도 흔들면서 반응시킨 후, 13,000 rpm으로 20초간 원심분리하고 상등액을 20 ㎕정도 남기고 제거하였다.
2) 남아 있는 상등액으로 10초간 vortex하여 백혈구세포를 재부유시킨 후 cell lysis solution 300 ㎕를 더한 후 pippet으로 세포를 용해시켰다.
3) 세포가 용해된 용액에 단백질 침전용액 100 ㎕를 더하고 20초간 vortex하여 섞은 후 13,000 rpm으로 1분간 원심 분리하였다.
4) DNA가 포함된 상등액을 100% isopropanol과 섞은 후 tube를 50회 흔들어서 혼합한 후에 13,000 rpm으로 1분간 원심 분리하였다.
5) 상등액을 버린 후 70% ethanol 300 ㎕로 pellet을 세척하고, 13,000 rpm으로 1분간 원심 분리하였다.
6) 상등액을 버리고 pellet을 건조시킨 후 DNA hydration solution 100 ㎕로 pellet을 resuspend하였다.
7) 표 2와 같은 방법으로 비대칭 PCR 반응을 GeneAmp PCR system 9600 thermal cycler (Perkin Elmer Cetus사, 미국)에서 시행하였다.
8) 비대칭 PCR이 끝난 산물 5 ㎕에 젤 로딩 버퍼(0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol FF, 15% Ficoll 400) 1 ㎕를 넣고 1 ㎍/㎖ ethidium bromide (EtBr)가 함유된 2% 아가로스 젤에서 전기영동한 후 UV transilluminator가 부착된 Image analyzer (Vilber Lourmat사, 프랑스)에서 PCR 밴드를 확인하였다.
HLA 비대칭 PCR 반응 조건
반응 조성물 조건 반응 온도 조건
멸균 증류수 10.0 95℃, 5.0 분 1 회
10X buffer 2.0
2mM dNTP 1.0 94℃, 45 초 62℃, 1.0 분 72℃, 20 초 35 회
1 - 3 p㏖ 센스 프라이머 1.0
7 - 15 p㏖ 앤티센스 프라이머 1.0
1U Taq 0.5
추출된 DNA 4.5
합 계 20 ㎕ 72℃, 5.0 분 1 회
실시예 3: HLA 올리고뉴크레오티드 칩 제작을 위한 프로브 합성 및 염기서열
알데히드 글라스 위에 공유결합을 시키기 위하여 모든 프로브의 5' 말단에 아미노 링크를 붙이고 교잡 반응시 반응을 용이하게 하기 위하여 10-20개의 올리고(dT)를 부착한 다음 표 3과 같은 염기서열을 붙여 합성하였다. 즉, "Amino link-Oligo(dT)10-20-프로브 염기서열"의 순서로 하여 독일의 Metabion 사에 의뢰하여 합성하였다. 이때 결정한 HLA 유전자형의 염기서열은 표 3에서 나타낸 것 같이 HLA-A는 21종, HLA-B는 36종, HLA-Cw는 14종, HLA-DR은 16종의 유전자를 분석하여 결정하였다.
표 4에서 7까지 나타낸 염기서열에서 중앙에 대문자로 표기된 염기서열이 가장 중요 부분으로 이를 중심으로 하여 약 13 bp에서 30 bp의 크기로 하고 Tm 값과 GC%를 고려하여 60-65℃를 전후하여 합성하였다.
분석한 HLA 유전자형 및 종류
HLA 형 HLA 종류
HLA-A A*01, A*02, A*23, A*24, A*25, A*26, A*34, A*66, A*29, A*30, A*31, A*32, A*33, A*74, A*68, A*69, A*03, A*11, A*36, A*43, A*80
HLA-B B*07, B*08, B*13, B*14, B*15, B*18, B*27, B*35, B*37, B*38, B*39, B*40, B*41, B*42, B*44, B*45, B*46, B*47, B*48, B*49, B*50, B*51, B*52, B*53, B*54, B*55, B*56, B*57, B*58, B*59, B*67, B*73, B*78, B*81, B*82, B*83
HLA-Cw C*01, C*02, C*03, C*04, C*05, C*06, C*07, C*08, C*12, C*14, C*15, C*16, C*17, C*18
HLA-DR DRB1*01, B1*03, B1*04, B1*07, B1*08, B1*09, B1*10, B1*11, B1*12, B1*13, B1*14, B1*15, B1*16, DRB3, DRB4, DRB5
HLA-A 유전자형 결정을 위한 프로브 염기서열
프로브 이름 염 기 서 열 반응 HLA 형
HLA-A 01 (서열정보 1) gtgggctacgtggacgaca 모든형에 반응 (양성 컨트롤,exon2)
HLA-A 02 (서열정보 2) gcgagccagaAgatggagcc A*01, A*36
HLA-A 03 (서열정보 3) ctgaccgagCgAAcctg A*01, A*26, A*29, A*36, A*43
HLA-A 04 (서열정보 4) attgggacGGggagaca A*02, A*23, A*24, A*80
HLA-A 05 (서열정보 5) attgggacCgggagaca A*0246, A*6813
HLA-A 06 (서열정보 6) tgcgctctGTgaccgc 모든형에 무반응 (음성 컨트롤)
HLA-A 07 (서열정보 7) attgggacgAggagaca A*23, A*24, A*80
HLA-A 08 (서열정보 8) ggaTcGCgcTcCgctacta A*23, A*24, A*25, A*32
HLA-A 09 (서열정보 9) gggaccGgAaCacacgg A*25, A*26, A*34, A*66, A*33, A*68, A*69
HLA-A 10 (서열정보 10) ttgggaccTgCagacacgg A*29, A*43
HLA-A 11 (서열정보 11) gcaggagAggccTgagtat A*30, A*31
HLA-A 12 (서열정보 12) ctgaccgagAgaGcctg A*25, A*32
HLA-A 13 (서열정보 13) cagaTtgaccgagTgGacctg A*03, A*11, A*30, A*31, A*33, A*34, A*66, A*68, A*69, A*74
HLA-A 14 (서열정보 14) cagaCtgaccgagtggacctg A*03, A*11, A*30, A*34, A*66, A*68, A*69, A*74
HLA-A 15 (서열정보 15) ctgaccgaGtgGacctg A*02, A*30, A*31, A*33, A*34, A*66, A*74, A*68, A*69, A*03, A*11
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HLA-A 16 (서열정보 16) acTcgcagttcgtgcAgtt A*80
HLA-A 17 (서열정보 17) gagggcCGgtgcgt A*01, A*25, A*26, A*66, A*11, A*43
HLA-A 18 (서열정보 18) cgtggaGTggctccgc A*02, A*25, A*26, A*34, A*66, A*29, A*30, A*31, A*32, A*33, A*74, A*68, A*69, A*03, A*11, A*36, A*43
HLA-A 19 (서열정보 19) tacctggaTggcACgtgc A*03
HLA-A 20 (서열정보 20) ccagatGatgtTtggctgc A*23, A*24
HLA-A 21 (서열정보 21) tggagggcACgtgcgt A*02, A*03, A*23, A*24, A*34, A*29, A*30, A*31, A*32, A*33, A*74, A*68, A*69, A*36
HLA-A 22 (서열정보 22) tggaTggcACgtgcgt A*03
HLA-A 23 (서열정보 23) ggagcagcAgagagCcta A*24, A*11
HLA-A 24 (서열정보 24) caccatccagaGGatgtatggc A*02, A*25, A*26, A*66, A*43, A*29, A*31일부, A*32, A*33, A*34, A*68, A*69, A*74
HLA-A 25 (서열정보 25) caccatccagaTgatgtatggc A*29, A*31, A*32, A*33, A*68, A*74
HLA-A 26 (서열정보 26) cagatcaccCagcgcaag A*23, A*25, A*26, A*34, A*66, A*29, A*30, A*31, A*32, A*33, A*74, A*43
HLA-A 27 (서열정보 27) gagAcggCccatgAggc A*25, A*26, A*34, A*66, A*43
HLA-A 28 (서열정보 28) gagGcggcccatgaggc A*03
HLA-A 29 (서열정보 29) ttacatcgccTtgaacgagg A*29, A*31, A*32, A*33, A*74, A*01, A*03, A*11, A*25, A*26, A*30, A*34, A*36, A*43, A*66, A*80
HLA-A 30 (서열정보 30) ttacatcgccCtgaacgagg A*01, A*03, A*11, A*25, A*26, A*30, A*34, A*36, A*43, A*66, A*80
HLA-A 31 (서열정보 31) gcgggtaTGAAcagCacgc A*30
HLA-A 32 (서열정보 32) ccatccagatGatgtatggc A*29, A*31, A*32, A*33, A*74, A*68
HLA-A 33 (서열정보 33) ccatccagatAatgtatggc A*01, A*03, A*11, A*30, A*80, A*34, A*36
HLA-A 34 (서열정보 34) agcagTggagagCctacc A*25, A*26, A*66, A*68, A*43
HLA-A 35 (서열정보 35) ctcagaCcaccaagcAcaagtg A*02, A*68, A*69
HLA-A 36 (서열정보 36) tcacaccGtccagaGGatgtatg A*02, A*69
HLA-A 37 (서열정보 37) tcacaccCtccagaggatgtatg A*02 일부
HLA-A 38 (서열정보 38) tcacaccAtccagaggatgtatg A*25, A*26, A*66, A*43
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HLA-A 39 (서열정보 39) gggTcggacTggcgc A*02, A*69, A*03, A*23, A*24, A*29, A*30, A*31, A*33, A*34, A*68, A*80
HLA-A 40 (서열정보 40) gggtcggacGggcgc A*03, A*23, A*24, A*29, A*30, A*31, A*33, A*34, A*68, A*80
HLA-A 41 (서열정보 41) ctgcgctcttggaccgcg 모든형에 반응 (양성 컨트롤,exon3)
HLA-B 유전자형 결정을 위한 프로브 염기서열
프로브 이름 염 기 서 열 반응 HLA 형
HLA-B 01 (서열정보 42) gccctcccgttgattggag 모든형에 반응 (양성 컨트롤)
HLA-B 02 (서열정보 43) gcagcTgagaAcctacctg B*1548, B*1569, B*3535, B*39, B*4429, B*5119, B*67
HLA-B 03 (서열정보 44) tatttcGacaccGccAtgtc B*0729, B*08
HLA-B 04 (서열정보 45) cacccagcTcaagtggg B*13
HLA-B 05 (서열정보 46) ggccggaAtattgggacc B*14, B*3526, B*38 일부분, B*670101
HLA-B 06 (서열정보 47) agacggcacgattgagaca 모든형에 무반응 (음성 컨트롤)
HLA-B 07 (서열정보 48) agGATggCgccCcg B*13, B*15일부, B*4021, B*4408, B*46, B*5202, B*57
HLA-B 08 (서열정보 49) tagagcaAgaggggccg B*18
HLA-B 09 (서열정보 50) atctGcaaggccAaggc B*27, B*7301
HLA-B 10 (서열정보 51) gactTaccgagagGAcctg B*37, B*0727, B*1543, B*47010101, B*47010102, B*5303
HLA-B 11 (서열정보 52) gtatttcCacaccGccAtgt B*40일부, B*41, B*45, B*49, B*50, B*4415, B*4418
HLA-B 12 (서열정보 53) ggtatttcCacacctccgtg B*40일부, B*18, B*27, B*37, B*4202, B*5402, B*7301
HLA-B 13 (서열정보 54) CgctgGagcgcgcG B*41, B*42, B*08
HLA-B 14 (서열정보 55) caagGccCaGGcacag B*07일부, B*42, B*54, B*55, B*56, B*670101, B*670102, B*81, B*82, B*83
HLA-B 15 (서열정보 56) cgggTatgaccagGacg B*0728, B*44, B*5704, B*8301
HLA-B 16 (서열정보 57) gtggagtCgctccgc B*0720, B*1514, B*44, B*45, B*5002, B*5123, B*5707, B*82, B*83
HLA-B 17 (서열정보 58) acagaAGtacaagCGccag B*0713, B*46, B*6702
HLA-B 18 (서열정보 59) tccagagGatgtTTggctg B*1506, B*1527, B*3523, B*4410, B*47, B*82
HLA-B 19 (서열정보 60) tcTcccagcgcaagtTgg B*40일부, B*4431, B*48, B*8101
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HLA-B 20 (서열정보 61) acgacggcaaAgattacatcg B*150102, B*1509, B*4026, B*4028, B*51, B*52, B*5605, B*5606, B*78
HLA-B 21 (서열정보 62) cggGaGacacagatctCc B*13, B*15일부, B*1812, B*27, B*35일부, B*37, B*38일부, B*40, B*41, B*44, B*45, B*47, B*48, B*49, B*50, B*52, B*7805
HLA-B 22 (서열정보 63) gacCtggggccCgac B*0712, B*1520, B*1562, B*35, B*4024, B*4104, B*44일부, B*45, B*4802, B*49, B*50일부분, B*53, B*5609, B*5705, B*58, B*82
HLA-B 23 (서열정보 64) gttcgtgCggttcgaca B*150104, B*54
HLA-B 24 (서열정보 65) cacaTcAtccagGTGatgtaTgg B*4030, B*4034, B*57
HLA-B 25 (서열정보 66) agcgaggAcgggtctc B*73
HLA-B 26 (서열정보 67) ctacaccGcTAtgtcccG B*82
HLA-B 27 (서열정보 68) ggaaggacaAgctggagc B*07
HLA-B 28 (서열정보 69) tggacgGcacccag B*18
HLA-B 29 (서열정보 70) ctacaccGccgtgtcc B*14, B*3805
HLA-B 30 (서열정보 71) gcttcatcAcCgtgggcta B*13, B*1553, B*27, B*40일부, B*41, B*44일부, B*45, B*49일부, B*50, B*73
HLA-B 31 (서열정보 71) ggacctgAgctcctgg B*13, B*14, B*15일부, B*18, B*27일부, B*35일부, B*37, B*38, B*4026, B*4028, B*4035, B*44일부, B*45, B*46, B*47, B*4802, B*49, B*50, B*51일부, B*52, B*53, B*54, B*55일부, B*56, B*57, B*58, B*59, B*67, B*78, B*82, B*83
HLA-B 32 (서열정보 71) cGCgcTcCgctactaca B*13일부, B*1513, B*1516, B*15170101, B*15170102, B*1523, B*1524, B*1536, B*1567, B*1809, B*2701, B*2702, B*38, B*4013, B*4019, B*44일부, B*49, B*51, B*52, B*53일부, B*5607, B*57, B*58, B*59
HLA-B 33 (서열정보 74) ggagggcACgtgcgt B*0719, B*0731, B*08일부, B*1306, B*14, B*1542, B*1544, B*1550, B*1569, B*18일부, B*2715, B*3535, B*37일부, B*38일부, B*4039, B*41, B*42, B*4404, B*5121, B*54, B*55일부, B*5610, B*5805, B*59, B*67
HLA-B 34 (서열정보 75) cgagagaAcctgcggaTc B*1513, B*1516, B*15170101, B*151702, B*1523, B*1524, B*1567, B*2702, B*3801, B*3805, B*3806, B*3807, B*3809, B*4013, B*4019, B*4406, B*4418, B*4425, B*49일부, B*51, B*52, B*53일부, B*57, B*58, B*59
(다음페이지 표 5 계속)
프로브 이름 염 기 서 열 반응 HLA 형
HLA-B 35 (서열정보 76) caccctccagTgGatgtatcc B*14 일부, B*58일부
HLA-B 36 (서열정보 77) accctccagaATatgtaTggctg B*27 일부, B*3702, B*4704
HLA-B 37 (서열정보 78) agtccgagAGAggagccg B*07, B*08, B*14, B*15 일부, B*27, B*38 일부, B*39, B*4012, B*42, B*48, B*55, B*56, B*59, B*67 일부, B*73, B*81, B*82, B*83
HLA-B 38 (서열정보 79) agaggatgtCTggctgcga B*37 일부, B*1532, B*1818, B*3909, B*5307
HLA-B 39 (서열정보 80) tatttcTacaccTccGtgtccc B*07, B*38, B*42 일부, B*48, B*5510, B*81
HLA-B 40 (서열정보 81) ggagcagGACagagccta B*07 일부, B*08, B*3538, B*37 일부, B*41, B*42, B*44 일부, B*51 일부, B*5709, B*82, B*83
HLA-B 41 (서열정보 82) ggagcagCGGagagccta B*07, B*0806, B*1403, B*15 일부, B*1813, B*35 일부, B*40 일부, B*44일부, B*51 일부, B*5509, B*57일부
HLA-B 42 (서열정보 83) cgTgtggcggagcagcTgaga B*0726, B*13, B*15 일부, B*18, B*27, B*35, B*3702, B*38, B*39, B*40, B*44 일부, B*47, B*48, B*51 일부, B*5203, B*53, B*54, B*55 일부, B*56 일부, B*57 일부, B*58 일부, B*59, B*7804, B*81
HLA-B 43 (서열정보 84) ggagcagTggagagccta B*15 일부, B*2725, B*35 일부, B*3918, B*5603
HLA-B 44 (서열정보 85) gacgccAcgagtccgagGAT B*13, B*15 일부, B*40 일부, B*41, B*44 일부, B*45, B*47, B*49 일부, B*50
HLA-B 45 (서열정보 86) tccgcagaCacctggag B*14, B*15 일부, B*18 일부, B*35 일부, B*3704, B*4028, B*51 일부, B*52 일부, B*53 일부, B*56 일부, B*73, B*78 일부
HLA-B 46 (서열정보 87) cGgaAcATGaaggccTCC B*15 일부, B*57, B*58
HLA-B 47 (서열정보 88) gggTaCCaccagGacgcc B*15 일부, B*27 일부, B*3702, B*47
HLA-B 48 (서열정보 89) gagGACggagccCcgg B*18, B*35, B*37, B*39 일부, B*51, B*52, B*53, B*58, B*78
HLA-Cw 유전자형 결정을 위한 프로브 염기서열
프로브 이름 염 기 서 열 반응 HLA 형
HLA-Cw 01 (서열정보 90) cggagtattgggaccgggagaca 모든형에 반응 (양성 컨트롤,exon2)
HLA-Cw 02 (서열정보 91) catgaAgtatttctTcacATCcgtgtcc Cw*01
HLA-Cw 03 (서열정보 92) gaggtatttctCcacatccgtgt Cw*04 일부, Cw*14
HLA-Cw 04 (서열정보 93) agacggcacgattgagaca 모든형에 무반응 (음성 컨트롤)
HLA-Cw 05 (서열정보 94) tccgtgtccTggcccggc Cw*04 일부
HLA-Cw 06 (서열정보 95) cgcttcatcTcagtgggcta Cw*01, Cw*0311, Cw*06, Cw*07, Cw*18
HLA-Cw 07 (서열정보 96) agttcgtgcAgttcgacag Cw*05, Cw*0605, Cw*08
HLA-Cw 08 (서열정보 97) tgaAcctgcggaaActgcg Cw*02, Cw*03 일부, Cw*04, Cw*05, Cw*06, Cw*07 일부, Cw*12 일부, Cw*15, Cw*1602, Cw*17, Cw*18
HLA-Cw 09 (서열정보 98) gggccaggTtctcacaccA Cw*17
HLA-Cw 10 (서열정보 99) cgcgggCatgaccag Cw*15
HLA-Cw 11 (서열정보 100) cgccctgaaTgaggacc Cw*05, Cw*08
HLA-Cw 12 (서열정보 101) gcggacaAGgcggctcag Cw*05, Cw*08 일부
HLA-Cw 13 (서열정보 102) ggagcagTggagagcc Cw*01 일부, Cw*02 일부, Cw*06 일부, Cw*12, Cw*160401
HLA-Cw 14 (서열정보 103) gagggcGAgtgcgtg Cw*02, Cw*0608, Cw*0715, Cw*17
HLA-Cw 15 (서열정보 104) gctccgcGgatacctg Cw*17
HLA-Cw 16 (서열정보 105) gatacctgAagaaTgggaagga Cw*03
HLA-Cw 17 (서열정보 106) aggtatttcGAcacCGccgt Cw*06, Cw*07, Cw*18
HLA-Cw 18 (서열정보 107) cggcccgtACggcggagc Cw*08 일부
HLA-Cw 19 (서열정보 108) agacacagaaCtacaagcgcc Cw*0308, Cw*07 일부, Cw*1208, Cw*15
HLA-Cw 20 (서열정보 109) cagAggatgtTtggctgcg Cw*04, Cw*0708, Cw*1210, Cw*18
HLA-Cw 21 (서열정보 110) gtctcacaTcctccagAggat Cw*03 일부, Cw*07 일부
HLA-Cw 22 (서열정보 111) tggaccgcGgcggacacg Cw*120302, Cw*17
HLA-Cw 23 (서열정보 112) caaggattacatcgccctgaa 모든형에 반응 (양성 컨트롤,exon3)
HLA-DRB1/3/4/5 유전자형 결정을 위한 프로브 염기서열
프로브 이름 염 기 서 열 반응 HLA 형
HLA-DRN 01 (서열정보 113) gacagcgacgtgggggagt 모든형에 반응 (양성 컨트롤)
HLA-DRN 02 (서열정보 114) ctggagcagGcgcggg B1*15
HLA-DRN 03 (서열정보 115) cggtatctgCacagaggca B1*09
HLA-DRN 04 (서열정보 116) ggcctgatgAGgagtactg B1*11
HLA-DRN 05 (서열정보 117) acagcgacCAgggggag 모든형에 무반응 (음성 컨트롤)
HLA-DRN 06 (서열정보 118) caggataagtAtgagtgtcat DRB5, B1*15, B1*16
HLA-DRN 07 (서열정보 119) gttgctggaaagatGcatctataaccaag B1*01
HLA-DRN 08 (서열정보 120) ggaaagacgcGtccataacca B1*10
HLA-DRN 09 (서열정보 121) aggaggagCTcctgcgctt B1*12
HLA-DRN 10 (서열정보 122) TataaccaAgaggagtAcgtgcg DRB4, B1*01, B1*04, B1*08, B1*09, B1*10, B1*11, B1*13 일부
HLA-DRN 11 (서열정보 123) ggagcgagtgTggaacctgat DRB4, B1*04, B1*07, B1*09,
HLA-DRN 12 (서열정보 124) tttcttcaaCgggacggag DRB5, B1*04, B1*07, B1*09, B1*10
HLA-DRN 13 (서열정보 125) tggagtactctacgKStgagtgt B1*03, B1*08, B1*11, B1*12, B1*13, B1*14
HLA-DRN 14 (서열정보 126) ggaagacGAgcgggcc B1*13 일부
HLA-DRN 15 (서열정보 127) cctgCtgcGgagCactg B1*14 일부
HLA-DRN 16 (서열정보 128) ggtggacaATtactgcagaca DRB3, B1*03, B1*11, B1*12, B1*13, B1*14
HLA-DRN 17 (서열정보 129) tgGAgcagGttaaACAtgaGtgt B1*04
HLA-DRN 18 (서열정보 130) gGcCGggtggacaAc B1*03
HLA-DRN 19 (서열정보 131) ccgAggtggacacctaTTg DRB4, B1*12, B1*14 일부
HLA-DRN 20 (서열정보 132) aaccaGgaggagAAcgtgc B1*03, B1*14 일부, B1*13 일부
HLA-DRN 21 (서열정보 133) gcagcctaagAgggagtgtca B1*15, B1*16
HLA-DRN 22 (서열정보 134) tcctggaaagaCTcttctataacca B1*07
HLA-DRN 23 (서열정보 135) cgggccCTggtggac B1*08
HLA-DRN 24 (서열정보 136) gacagatacttcCataaccaggagg DRB3, B1*03, B1*12, B1*13 일부, B1*14, B1*15, B1*16
HLA-DRB1 유전자형 결정을 위한 프로브 염기서열
프로브 이름 염 기 서 열 반응 HLA 형
HLA-DRS 01 (서열정보 113) gacagcgacGTgggggagt 모든형에 반응 (양성 컨트롤)
HLA-DRS 02 (서열정보 130) gGcCGggtggacaAc B1*03
HLA-DRS 03 (서열정보 126) ggaagacGAgcgggcc B1*13 일부
HLA-DRS 04 (서열정보 117) acagcgacCAgggggag 모든형에 무반응 (음성 컨트롤)
HLA-DRS 05 (서열정보 133) gcagcctaagAgggagtgtca B1*15, B1*16
HLA-DRS 06 (서열정보 135) cgggccCTggtggac B1*08
HLA-DRS 07 (서열정보 122) TataaccaAgaggagtAcgtgcg B1*08, B1*11, B1*13 일부
HLA-DRS 08 (서열정보 137) CataaccaGgaggagtTcgtg B1*15, B1*16, B1*14 일부
HLA-DRS 09 (서열정보 114) ctggagcagGcgcggg B1*15
HLA-DRS 10 (서열정보 116) ggcctgatgAGgagtactg B1*11
HLA-DRS 11 (서열정보 132) aaccaGgaggagAAcgtgc B1*03, B1*14 일부, B1*13 일부
HLA-DRS 12 (서열정보 138) cagaaggacCtcctggagc B1*03, B1*14 일부
HLA-DRS 13 (서열정보 139) cctggaAGaCaggcgc B1*16, B1*08, B1*11, B1*12, B1*13 일부
HLA-DRS 14 (서열정보 121) aggaggagCTcctgcgctt B1*12
HLA-DRS 15 (서열정보 140) cagaaggacAtcctggaagac B1*12 B1*13 일부
HLA-DRS 16 (서열정보 131) ccgAggtggacacctaTTg B1*12 일부, B1*14 일부
HLA-DRS 17 (서열정보 125) tggagtactctacgKStgagtgt B1*08, B1*12
HLA-DRS 18 (서열정보 136) gacagatacttcCataaccaggagg B1*03, B1*12, B1*15, B1*16, B1*13 일부, B1*14
HLA-DRS 19 (서열정보 127) cctgCtgcGgagCactg B1*14 일부
실시예 4: HLA 올리고뉴크레오티드 칩의 제작
1) 올리고뉴크레오티드 칩을 제작하기 위하여 누리셀사(한국) 또는 셀사(미국)의 알데히드 글라스 슬라이드를 사용하였다. 100 pmole/㎕의 아미노기가 붙어있는 프로브와 동량의 3X SSC를 잘 혼합하여 슬라이드위에 찍고, 16시간동안 실온에 서 반응시킨 후 0.2% SDS로 5분 동안 2회 세척한 후, 증류수로 5분간 2회 세척하였다. 그리고 95℃로 가열된 증류수로 2분간 1회 세척한 후 실온에서 증류수로 5분간 1회 세척하였다.
2) 소디움 보로하이드리드(1.3g NaBH4, 375㎖ PBS, 125㎖ 100% EtOH)에 슬라이드를 5분간 반응시킨 다음, 0.2% SDS로 1분간 3회 세척하고 증류수로 1분간 2회 세척한 후 실온에서 건조시켰다.
3) 5개의 HLA PCR 반응물을 분리하여 반응시키도록 하기 위하여 SIGMA 사의 coverwell perfusion chamber를 붙여서 각각을 분리시켰다. 이와 같이 완성된 HLA 올리고뉴크레오티드 칩은 사용 전까지 실온의 암소에서 보관하였다.
실시예 5: HLA PCR 산물과의 결합 반응
1) 로다민 또는 바이오틴으로 결합된 HLA PCR 산물을 하이브리다이제이션 용액(3X SSC, 0.3% SDS)과 l:9의 비율로 혼합하였다. 형광반응을 일으키기 위하여 바이오틴을 사용한 경우에는 Streptavidin-Cyanine을 1㎍/㎖ 농도로 첨가하여 반응시켰다.
2) 챔버를 덮은 채로 90㎕의 하이브리다이제이션 버퍼를 슬라이드 위의 챔버에 채우고, 62℃에서 1시간 동안 반응시켰다.
3) 1X SSC로 실온에서 5분간 세척하고 0.1X SSC로 2분간 세척한 후에 실온에서 건조시켰다.
4) 결과 확인
Scanner (GenePiX4000, Axon instruments, U.S.A.)를 사용하여 형광을 나타내는 프로브를 당사에서 개발한 HLA 타이핑 프로그램을 이용하여 HLA 유전자형을 분석하였다.
그 결과를 도2에서 도6에 나타내었다. 도면에서 PCR과 하이브리다이제이션 반응 시에 형광용 프라이머 및 프로브를 사용하였고, 결과 해석 시에 GenePiX4000 스캐너 (Axon instruments사, 미국)를 사용하여 형광을 나타내는 프로브의 형태를 당사에서 개발한 HLA 타이핑 프로그램을 이용하여 HLA 유전자형을 분석한 것이다.
HLA 타이핑 프로그램은 개발된 HLA 올리고뉴크레오티드 칩의 각 방에 위치한 프로브들의 결과를 분석하여 적합한 normalization 방법을 생성하였으며, 음양성을 구분할 수 있는 경계값 등의 개념을 도입한 intermediate zone을 생성하였다. 경계값을 기준으로 각 프로브의 음양성을 판단하였으며, 프로브의 음양성 형태를 프로그램 안에 제작되어진 음양성 형태 비교표와 비교하여 일치되는 HLA 유전자형을 분석할 수 있도록 개발하였다.
본 발명에서는 HLA 유전자를 분석하여 HLA-A, -B, -Cw, -DR 유전자형을 진단하는 올리고뉴크레오티드 칩을 개발하였다. 이를 이용한 HLA 유전자형의 분석은 기존의 상용화된 키트에 비해 인건비, 시약비 및 시간이 매우 많이 절감이 된다. 즉, 기존에 나온 검사 방법이나 키트는 HLA typing에 있어서 HLA-A, -B, -Cw, -DR 유전자형을 동시에 분석할 수 없어 각기 따로 따로 실험을 해야 하는 번거로움이 있으나, 본 HLA DNA chip을 이용하면 한번의 실험으로 HLA-A, -B, -Cw, -DR 유전자형을 알 수 있을 뿐만 아니라 HLA 대립유전자의 수가 많아지더라도 슬라이드위에 고밀도로 찍는 것이기 때문에 한 개의 슬라이드 만으로도 충분하다. 또한 이 방법은 형광 물질을 사용하는 것이므로 발색단계가 필요 없을 뿐만 아니라 다른 방법의 실험에서 필요로 하는 단계 즉, 세척, 발색반응 등이 생략되어 결과를 보기까지의 시간이 많이 단축된다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (7)

  1. 서열정보 1 에서 서열정보 41까지 기재된 HLA-A 유전자형 결정을 위한 둘 이상의 복수의 프로브 군; 서열정보 42에서 서열정보 89까지 기재된 HLA-B 유전자형 결정을 위한 둘 이상의 복수의 프로브 군; 서열정보 90에서 서열정보 112까지 기재된 HLA-Cw 유전자형 결정을 위한 둘 이상의 복수의 프로브 군; 및 서열정보 113에서 서열정보 140까지 기재된 HLA-DR 유전자형 결정을 위한 둘 이상의 복수의 프로브 군으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브 군을 포함하는 HLA 유전자형 결정을 위한 복수의 올리고뉴크레오티드 프로브 조성물.
  2. 제 1항의 프로브 조성물 및 상기 조성물이 고정화된 서포트를 포함하는 테스트 서포트.
  3. 제 2항에 있어서, 상기의 서포트는 필터, 스트립, 마이크로스피어, 칩, 슬라이드, 멀티웰 플레이트, 멤브레인 및 광섬유로 구성된 군으로부터 선택된 서포트인 것을 특징으로 하는 서포트.
  4. 제 1항 또는 제 2항의 프로브와 목적 유전자와의 결합을 검출하는데 사용되는 서열정보 141에서 서열정보 151, 서열정보 153, 서열정보 156 및 서열정보 157에 기재된 군으로부터 선택된 하나 이상의 HLA 유전자형 결정을 위한 프라이머.
  5. 제 4항에 있어서, 상기의 프라이머 중 서열정보 142, 144, 146, 148 또는 150의 앤티센스 프라이머는 바이오틴 또는 로다민이 부착된 것을 특징으로 하는 프라이머.
  6. 제 5항에 있어서, 상기의 프라이머 중 바이오틴 부착된 앤티센스 프라이머는 스트렙타비딘(Streptavidin)-시아닌(Cyanine)과 상호 작용하는 것을 특징으로 하는 프라이머.
  7. a) 혈액, 세포 및 조직으로부터 HLA DNA를 추출하는 단계;
    b) 추출한 DNA를 이용하여 비대칭 PCR을 실시하는 단계;
    c) 상기의 비대칭 PCR 부산물과 제1항 또는 제2항의 프로브를 결합시키는 단계;
    d) 상기의 결합을 확인하는 단계; 및
    e) 확인된 반응을 HLA 타이핑 프로그램을 사용하여 HLA 유전자형을 분석하는 단계를 포함하는 HLA 유전자형 분석 방법.
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